Resumen

En este informe se registraron los

resultados obtenidos de la

observación e identificación de

hongos y bacterias, partiendo de los

cultivos sembrados en la Práctica No

4 (Aislamiento de hongos y bacterias

Fitopatógenos a partir de material

vegetal enfermo), se tomaron

improntas y muestras del material que

creció a partir de la siembra de

Sphaerotheca pannosa de hojas de

fresa (Fragaria ananassa),

Sphaerotheca pannosa de hojas de

una planta ornamental de jardín,

Colletortichum spp de fruto de fresa (F.

ananassa), Fusarium oxiporum en

tallo de clavel (Dianthus caryophyllus

L.) y Xanthomonas spp en follaje de

fresa (F. ananassa). Para la

identificación y observación de

Hongos y Bacterias, es indispensable

observar las estructuras reproductivas

y el uso de claves taxonómicas para

su descripción. Para observar las

estructuras reproductivas se hizo una

coloración con Azul de lactofenol, las

improntas se tomaron con cinta

transparente y su montaje en seco y

con una gota de agua, las claves

taxonómicas para la descripción

morfológica utilizadas Barnett y Hunter

(1998). Este trabajo se llevó a cabo en

el laboratorio de fitopatología de la

universidad de Cundinamarca

extensión Facatativá, teniendo en

cuenta las normas de bioseguridad.

Palabras clave: Impronta, tinción,

claves taxonómicas, observación,

identificación.

Abstract

In this report the results of the

observation and identification of fungi

and bacteria were recorded, based on

crops planted in Practice No 4

(Isolation of fungi and bacteria from

sick Phytopathogenic plant material)

imprints and material samples were

taken which grew from the seed of

Sphaerotheca pannosa leaves of

strawberry (Fragaria ananassa),

Sphaerotheca pannosa leaves of an

ornamental garden plant,

Colletortichum spp fruit strawberry (F.

ananassa), Fusarium oxiporum in

stem carnation (Dianthus caryophyllus

L.) and Xanthomonas spp in foliage of

strawberry (F. ananassa). For the

identification and observation of fungi

and bacteria, it is essential to observe

the reproductive structures and the

use of taxonomic keys to their

description. To observe the

reprouctive structures made a

Lactophenol blue staining, the imprints

were made with transparent tape and

mounting in dry and with a drop of

water, taxonomic keys used for

morphological description Barnett and

Hunter (1998). This work was

conducted in the laboratory of plant

pathology at the University of

Cundinamarca, Facatativá extension,

taking into account biosafety

standards.

Keywords: Imprint, staining,

taxonomic keys, observation,

identification.

Introducción

Los hongos fitopatógenos son de gran

importancia debido a que reducen el

valor del producto en el mercado. La

mayoría de los hongos fitopatógenos

afectan cultivos de gran importancia

económica, debido a esto se aplican

miles de toneladas de agroquímicos

en todo el mundo, con la necesidad de

establecer un sistema de control, sin

conocer el agente causal de la

enfermedad. (Becerra, Sosa, & Lopez,

2010)

Para controlar una enfermedad es de

vital importancia reconocer el agente

causal, si no se reconoce es probable

que los métodos de control sean

infructuosos. Para evitar esto es

indispensable realizar un correcto

diagnostico que provea de una

cantidad de información básica y

verídica, con la cual podemos

seleccionar el método de control

acorde con el agente cusal. (Deras,

2014).

Materiales

1. Cámara de flujo laminar.

2. Nevera.

3. Mecheros.

4. Incubadora.

5. Plantas enfermas o anormales.

6. Lupas.

7. Bisturí y cuchillas.

8. Servilletas.

9. Marcadores.

10. Pinzas estériles.

11. Papel vinipel.

12. Cajas de Petri con los

microorganismos aislados en medios

de cultivo (Agar – agua y PDA).

13. Láminas y laminillas

14. Tinciones de Gram y azul de

lactofenol.

15. Microscopio

16. Hipoclorito de sodio (Clorox).

Tener en cuenta los siguientes

materiales para así cumplir las

normas de bioseguridad:

1. Protector naso-bucal.

2. Bata manga larga, cerrada color

blanco.

3. Zapato cerrado en suela anti-

deslizante.

4. Pantalón largo holgado.

5. Gorro desechable.

6. Gafas de laboratorio.

7. Guntes de nitrilo o vinilo.

Metodología

Esta práctica se llevó a cabo en el

laboratorio de Fitopatología de la

Universidad de Cundinamarca

extensión Facatativá, a una altura de

2.586 msnm. Esta localidad presenta

una temperatura promedio de 19°C y

una humedad relativa promedio de 60-

90%, la precipitación media anual es

de 200 - 300 mm (IDEAM, 2015).

En primer lugar se realizó la

desinfección de los mesones y de la

cámara de flujo con la ayuda de

hipoclorito, agua y las toallas estériles.

Ya con el espacio desinfectado, se

tomaron los medios de cultivo PDA y

Agar Nutritivo esterilizados y

preparados en la práctica anterior, se

colocaron en la cámara de flujo

mientras se realizaban los repiques

para purificar las muestras.

Luego de esto se realizaron los

montajes de hongos y bacterias para

observaciones microscópicas en los

que se hicieron:

Montaje coloreado directo con

azul de lactofenol y una porción

del hongo con aguja de

disección y se observó a 4X,

10X y 40X

Montaje de impronta con cinta

transparente con ayuda de

azul de lactofenol, observando

a 4x, 10X y 40X)

Cortes de cuerpos fructiferos

cortes a mano alzada, en los

que se realizaron cortes

transversales para observar la

forma y ubicación interna de las

esporas, con ayuda de azul de

lactofenol. Se observa al

microscopio.

Cuestionario

1. Por qué hay que hacer

tinciones para observar al

microscopio?

Las técnicas de tinción destacan las

características morfológicas de los

microorganismos para lograr ser

vistas con mayor nitidez en el

microscopio y lograr observar todos

sus detalles, aunque los

microorganismos vivos se pueden

observar directamente en fresco al

microscopio óptico, la mayoría de las

veces es necesario teñirlos para que

por medio del uso de colorantes, sea

mucho más fácil su identificación,

Existe una gran variedad de tinciones

que pueden ser aplicadas dentro de

este campo. Las tinciones están

compuestas por un colorante la cual

es capaz de dar color a células, tejidos

o fibras. (López , Hernández, Colín, &

Cendejas, 2013)

Químicamente, el colorante está

constituido de un componente

cromóforo y un auxócromo. El

cromóforo tiene la capacidad de que

sus electrones absorban energía o luz

visible y emitan diversos colores de

acuerdo con la longitud de emitida

como resultado del cambio en el nivel

energético. Los auxócromos son

grupos funcionales o radicales que

constituyen una molécula y poseen

carga parcial positiva; tienen la función

de intensificar la formación de color

mediante la acción de grupos de

átomos no saturados; su función es

desplazar a los cromóforo hacia

longitudes de ondas largas para

aumentar la intensidad. (López ,

Hernández, Colín, & Cendejas, 2013)

Los colorantes tienen las siguientes

funciones:

1. Permiten hacer visibles a los objetos

microscópicos y transparentes.

2. Revelan su forma y tamaño.

3. Muestran la presencia de

estructuras internas y externas.

4. Produce reacciones químicas

específicas.

2. Realice una descripción de los

géneros fúngicos encontrados

y mencione por lo menos dos

cultivos en los que causan

enfermedades, diferentes al

cultivo del que fueron aislados.

La descripción de los géneros se

encuentra en las tablas de análisis de

muestras (ver tablas de análisis de

muestra)

En cuanto a los cultivos que son

afectados por las enfermedades

encontramos.

Para phytophthora fragarie.

fresa y mora

Para Xanthomonas:

Ornamental (Begonia dregei),

Árbol de caucho (Ficus

elástica), Filodendro de hoja

acorazonada. (Philodendron

scandens)

Para Colletotrichum, tomate de

arbol (Solanum betaceum),

tomate de guiso (Lycopersicon

esculentum L.), aguacate

(Persea americana. Mill.)

El hongo de marchitamiento

bascular (Fusarium oxysporum)

causa infección en plantas de

clavel y de rábano, tomate.

Tabla 1. ANÁLISIS DE MUESTRAS

1. Observación de Colletortichum spp

Observaciones

Luego del aislamiento del hongo

Colletortichum sp, (Identificado por los síntomas en el fruto y formas de colonia) a través de los explantes de fruto en papa dextrosa agar (PDA), (ver figura 1) , en los que se forman colonias

blancas, variando a gris salmón, se realizaron improntas para ver las estructuras de los hongos y confirmación la identificación del hongo.

La producción de conidios es característicamente abundante y muestran en masa un color salmón-anaranjado (Farrera , Zambrano, & Ortiz , 2007) (Cordero, Muñoz, Onorato, & Contreras), lo que se puede corroborar con lo observado en el microscopio a 40 x (Ver figura 2) Conidios lisos, unicelulares, aseptados, fusiformes y de aproximadamente 10-14 x 4- µm. (Cedeño & Carrero, 2000), conidios que se pudieron observar en la impronta del micelio de Colletotrichum, además de confirmar la forma fusiforme de sus conidios a través del microscopio a 40 x, además de la observación de la posible formación de un haustorio (ver figura 3) Por lo anterior y según la literatura se confirma que el aislamiento realizado del hongo pertenece al género Colletotrichum

Figura 2. Agrupación de conidios fusiformes

(tomado por Alarcón, 2015)

Figura 3. forma fusiformes de conidios

encontrados en Colletotrichum (tomado por

Alarcón, 2015) Hifas sin septos, presencia de poros

Formación de haustorios

Figura 1. Aislamiento de Colletotrichum en

fresa, tomado por (Barrantes 2015)

Agrupación de conidios

Tabla2. ANÁLISIS DE MUESTRAS

1. Fresa (Fragaria ananassa) - Xanthomonas sp.

Fotografía Observaciones

Se puede observar en la figura 4 manchas irregulares, necróticas en el follaje de la planta de un color café a rojizo oscuro. Por lo general localizadas al borde de las hojas (foliolos). Según lo observado corresponde a síntomas provocados por Xanthomonas, en fresa la enfermedad es “bacterial leaf blight” o en español “tizón bacteriano”. Siendo sus síntomas manchas foliares necróticas de color café (secas) (Figura 1) y lesiones grandes en forma de “V” a lo largo del borde de la hoja (Ustun et al., 2007). Aún no se tiene información disponible sobre las vías de diseminación de la enfermedad, sin embargo la diseminación a grandes distancias ocurre con la movilización de material propagativo entre países. (EPPO, 2011). En la caja Petri con el medio nutritivo se observa el crecimiento de las colonias de la bacterias Xanthomonas sp, identificada anteriormente gracias a las rutas taxonómicas de la enfermedad y la forma de la colonia, (ver figura 5) a las cuales se les hicieron una impronta para observar sus estructuras al microscopio.

Figura 5, medio de cultivo nutritivo con

crecimiento de colonias de Xanthomonas

sp, para realizar las improntas en el

microscopio. (Atuesta 2015).

Figura 4, daño provocado por

Xanthomonas spp, en foliolos de fresa

(Atuesta 2015).

Observación en el microscopio

Se observa en la figura 6 la gran cantidad de bacilos pertenecientes al género de Xanthomonas que aunque sin aplicar ningún tipo de colorante para hacer tinción muestran una coloración entre amarilla y rojiza vista al microscopio en el objetivo 40x. Posición Taxonómica: Dominio: Bacteria. Phylum: Proteobacteria. Clase: Grammaproteobacteria. Orden: Xanthomonadales. Familia: Xanthomonadaceae. Género: Xanthomonas. (CAB International, 2011). Según BACMAP Genome Atlas, las Xanthomonadaceae son una familia de bacterias Gram negativas pertenecientes a los Xanthomonadales orden del Grammaproteobacteria. Por lo general se caracterizan como organismos ambientales que se encuentran en el suelo y el agua, así como en tejidos vegetales. Son Bacilos en forma de bastones rectos que pueden llegar a medir 0.4 a 1.0 x 1.2 a 3 um. Se han reportado observaciones hechas al microscopio y lo que se ha podido observar son bacterias en forma de bacilos con un flagelo polar la cual es una característica propia del genero de las Xanthomonas (Janse et al., 2001). (Figura 7). También se ha observado que este tipo de bacterias tiene un tipo de pigmentación basado en carotenos llamados “Xanthomonadins”, estos pigmentos son bromados y compuestos por un grupo arilo-polieno los cuales, son compuestos orgánicos que componen conjugados como los carotenos, en este caso amarillos, insolubles en agua y que están asociados a la membrana externa de la pared celular de las bacterias. Estos pigmentos son marcadores

Figura 6, Xanthomonas sp observadas al

microscopio en 40x por medio de una

impronta al medio de cultivo anteriormente

mencionado (Atuesta, 2015).

Figura 7, Micrografía de

Xanthomonas arborícola pv.

fragariae, que muestra la forma de

bacilo de la bacteria y su flagelo

polar. (Fuente: Janse et al., 2001).

quimiotaxonómicos útiles para la identificación de estas bacterias, según sus características, por medio de diferencias y similitudes de sus componentes bioquímicos. La producción de Xanthomonadins, es una característica principal de las Xanthomonas spp. (American Physical

Society, 2002). Entre las especies de este género hay grandes similitudes, se ha reportado que en 1993 se llegó a confundir algunas cepas de Xanthomonas arboricola pv. fragariae fueron identificadas como Xanthomonas fragariae (Janse et al.,

2001; Weller et al., 2007).

Tabla 3. ANÁLISIS DE MUESTRAS

1. Fresa (Fragaria ananassa) - Sphaerotheca pannosa

Fotografía Observaciones

Se observan en la Figura 8 principalmente manchas de color café necróticas en las hojas de fresa. Aunque también las manchas se pueden observar en algunas partes localizadas de toda la planta, también se observan manchones blancos, amarillos crema o grisáceos de forma continúa. Según lo observado corresponde a lesiones provocadas por el hongo Mildeo polvoso (Sphaerotheca pannosa), que

causa manchas polvorientas en un principio blancas, amarillas color crema y en el transcurso que se manifiesta mas la enfermedad comienzan a tornarse colores cafés o grises muy oscuros en la planta de fresa (Villate, 2014). Posición taxonómica de Sphaerotheca pannosa más conocido como Mildeo Polvoso Reino: Fungí División: Ascomycota Clase: Leotiomycetes Orden: Erysiphales Familia: Erysiphaceae

Figura 8. Ataque de Sphaerotheca

pannosa, en los hojas de fresa

(Calderón, 2015).

Género: Sphaeroteca Especie: Sphaerotheca pannosa (Bayer, 2014). Se observa la caja Petri con el medio PDA ( ver figura 9) este medio incluye dextrosa e infusión de papa blanca (Solanum tuberosum), haciendo que los hongos crezcan más y se reproduzcan fácilmente (Pérez, 2012). Con la muestra de Sphaerotheca pannosa conocido como Mildeo polvoso en este se observa el crecimiento del hongo, su apariencia fue algodonosa color blanca y color amarillo crema.

Morfología microscópica del hongo Sphaerotheca pannosa

Se puede observar el crecimiento del hongo, Mildeo polvoso (Sphaerotheca pannosa), donde se observa el micelio un poco algodonoso, con una superficie pareja y un borde liso. (ver figura 9) En la impronta se observan Hifas que son estructuras filamentosas cilíndricas, (ver figura 10), que son característica principal de los hongos de tipo vegetativo, donde la reunión de estas hifas forma el micelio (Rodríguez, 2014)

Figura 9, observación de Sphaerotheca

pannosa, en medio de cultivo PDA

(Calderón, 2015).

Figura 10. Morfología microscópica

de Sphaerotheca pannosa.

(Calderón, 2015).

Tabla 4. ANÁLISIS DE MUESTRAS

1. Fusarium oxysporum

Generalidad

Fusarium oxysporum es un hongo cosmopolita que existe en muchas formas patogénicas, parasitando más de 100 especies de plantas Gimnospermas y Angiospermas, gracias a los diversos mecanismos que tiene el hongo para vencer las defensas de muchas plantas. Se caracteriza por producir colonias de rápido crecimiento, con una tasa diaria cercana a un centímetro en medio papa- dextrosa agar (PDA) a 25ºC (Garcés et al., 2001)

Se presenta principalmente como saprófito en el suelo, o también como patógeno especializado, denominado forma especial (f. sp.), según la planta hospedante u hospedantes relacionados que afecte. Es posible distinguir patotipos o razas fisiológicas de una misma forma especial (Bosland, 1988) Esta enfermedad es la más limitante y la más importante en el cultivo del clavel en Colombia (Figura 11), debido a la fácil propagación del patógeno a través de esquejes infectados, a la resistencia del hongo a condiciones adversas y al alto costo y relativa baja eficiencia de las medidas de control utilizadas (Garcés et al., 2001)

Figura 11. Ataque de Fusarium

oxysporum, en tallo de clavel.

2. Fusarium oxysporum en cultivo PDA

Observaciones

En el medio de cultivo PDA (Figura 12), se observó un crecimiento micelial aéreo, su apariencia fue algodonosa, de coloración entre blanco a rosado salmón. También se puede observar que el crecimiento que tuvo fue concéntrico (Booth, 1970)

3. Morfología microscópica de Fusarium oxysporum. Azul lactofenol, 40x. Observaciones

Se observan hifas ramificadas hialinas y septadas, (ver figura 13) clamidosporas hialinas esféricas y grandes corroborado por (Amaro, 2014). Se observan macroconidios, en forma elipsoidal, hialinos y septados (C., 2011).

Figura 12. Cultivo de Fusarium

oxysporum, en medio de cultivo

PDA.

Figura 13. Morfología

microscópica de Fusarium

oxysporum. Azul lactofenol, 40x.

Tabla 5. ANÁLISIS DE MUESTRAS

Aislamiento de hojas de fresa

Observaciones

De acuerdo con las caracteristicas del sintoma y de micelio, presentado en informes anteriores, esta muestra se habia identificado como mildiu en fresa. Pero observando las estructuras vistas se puede determinar que posiblemente es Phytophthora fragrarie. Dado que:

1. Según la autora (Echemedina, 2004) En los medios de cultivo el micelio se presenta aéreo, el cual puede ser marcadamente radiado o ligeramente estrellado, presentándose los bordes de la colonia redondeados o sinuosos y sumergido en el medio siendo. (ver figura 14 ).

2. Muestra del micelio visto al microscopio

El autor (Bolda, 2010) menciona que las hifas no son septadas, además de ser hialinas. (Ver figura 15). Todas las especies del género poseen un micelio hialino, continuo, de paredes paralelas o irregularmente calibradas, donde pueden observarse abundantes gotas oleaginosas. El micelio es cenocítico, observándose solo raramente la presencia de algunos tabiques que normalmente se encuentran separando las partes viejas carentes de protoplasma. (Echemedina, 2004).

Figura 14: aislamiento de hoja enferma de

fresa (Alarcon, 2015)

Figura 15: hifas de Phytophthora fragrarie.

(Bolda, 2010)

3. Morfología microscópica. Azul lactofenol, 40x. Observaciones

En esta grafica se puede observar que las hifas no presentan septos. No se pudo observar otras estructuras del hongo (ver figura 16)razón por la cual no se pude dar afirmar la especie de hongo que sea aunque se supone que por la apariencia sea Phytophthora fragrarie

Conclusiones:

Gracias a la observación de los

signos, la planta y la parte de la

planta que está afectada por el

patógeno, y las rutas taxonómicas

para identificar la enfermedad, se

puede dar un estimado del

patógeno que está atacando, pero

en muchos casos estos se

parecen, hasta el punto de tejer la

misma forma y color de la colonia,

por eso es indispensable

complementar estas labores con

la observación de las estructuras

de los hongos y bacterias al

microscopio, logrando así realizar

una mejor identificación del

patógeno casi llegando al géneros

a los que pertenece.

Para lograr una buena

observación de las estructuras

tanto de hongos como de

bacterias, es necesario realizar

tinciones, de acuerdo al tipo de

organismo que se quiera observar

y hasta donde se quiera llegar a

identificar, como es el caso de la

tinción de gran, utilizada para la

clasificación de bacterias gran

positivas y gran negativas,

practicas indispensables para la

identificación del patógeno.

Bibliografía

Alarcon, K. 2015. Fotografias de la

practica de laboatorio 5 de

fitopatologia de la universidad

de Cundinamarca. Facatativá.

Amaro, C. T. 2014. Genero Fusarium.

Retrato Microbiológico, 85 - 86.

APS. 2002. Xanthomonadins, Unique Yellow Pigments of the Genus Xanthomonas.

The Plant Health Instructor. University of Idaho, Moscow. En línea: http://www.apsnet.org/edcenter/a

Figura 16: hifas de Phytophthora fragrarie.

(Ortiz, 2015)

dvanced/topics/Pages/Xanthomonadins.aspx.

Bayer cropscience. 2014. Problemas biologicos. Mildeo. Laboratorios Bayer Centro

América y del Caribe. En línea http://www.bayercropscience- ca.com/contenido.php?id=241&cod_afeccion=51

Bolda, M. 29 de Abril de 2010. Fresas

y moras. Obtenido de Lluvias

primaverales fomentan

pudrición de Phytophthora de

la fruta de fresa en Watsonville

y Salinas:

http://ucanr.edu/blogs/fresamor

a/index.cfm?tagname=Phytoph

thora

Booth, C. 1970. Fusarium oxysporum

CMI descriptions of plant

pathogenic fungi and bacteria.

Commonwealth Agricultural

Bureaux, 211.

Bosland, P. W. 1988. Fusarium

oxysporum a pathogen of

many plant species. Advances

in plant pathology, 281 - 289.

CAB International. 2011. Crop

Protection Compendium, 2011 Edition.

Wallingford,

UK: CAB International. En

línea: http://www.cabi.org/cpc.

Cedeño, l., & Carrero, C. 2000. Primer

reporte en Venezuela de

Colletotrichum acutatum

causando antracnosis en frutos

de fresa. Venezuela.

Cordero, F. T., Muñoz, F. R.,

Onorato, J. M., & Contreras, A.

S. (n.d.). Antracnosis en fresa:

Sintomatología y desarrollo de

la infección . Universidad de

Sevilla.

C., V. T. 2011. Fusarium spp. Escuela de Microbiología, Universidad de Antioquia. Echemedina, Y. 2004. FAO. Obtenido

de Phytophthora:

Características, diagnóstico y

daños que:

http://www.fao.org/docs/eims/u

pload/cuba/1060/cuf0022s.pdf

Emira Garcés De Granada., M. O.

(Julio de 2001). Fusarium

oxysporum, el hongo que nos

falta conocer. Acta Biológica

Colombiana, 6, 8-25.

EPPO. 2011. Xanthomonas arboricola pv. fragariae. Bacterial leaf blight –A new

disease of strawberry. En línea: http://www.eppo.org/QUARANTINE/Alert_List/bacteria/XANTAF.htm.

Farrera , P., Zambrano, V., & Ortiz ,

M. 2007. Identificación de

hongos asociados a

enfermedades del fruto de la

fresa en el municipio Jáuregui

del estado Táchira. Tachira:

Scielo.

López , L., Hernández, M., Colín, C.,

& Cendejas, R. 2013. Las

tinciones básicas en el

laboratorio de microbiologia .

Mexico: Laboratorio de

Infectología, Centro Nacional

de Investigación y Atención a

Quemados.

Ortiz, C. 2015. Fotografias de la

practica de laboratorio 5 de

fitopatologia de la Universida

de Cundinamarca. Facatativá.

Pérez Yago, 2012, Medio de cultivo

para hongos: Agar PDA.. Blog

naturaleza

España. En Línea:

http://www.blog.naturaleza.eldi

etista.es/2012/01/medio-de-

cultivo-para-hongos.html

Rodríguez Gloria, 2014, Micología. Unidad De infectologia. Universidad de la

Frontera Chile.. En línea: http://www.med.ufro.cl/clases_apuntes/medicina

interna/infectologia/docs/micologia.pdf

Villate Paola, 2014, Mildeo polvoso.

Presentación prezi. En línea:

https://prezi.com/mrbbr8886giu

/mildeo-polvoso/