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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación

Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016

Memorias

Papel de la cinasa Erk en la traslocación nuclear de Rac1 en la línea

celular HaCaT y C33-A

Vianney Pineda Escalante (Becaria).

Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas de la UAGro.

Programa de Verano UAGro.

[email protected]

Área III: Medicina y Ciencias de la Salud.

Dr. C. Eduardo Castañeda Saucedo (Asesor)

Profesor-Investigador del Laboratorio de Biología Celular del Cáncer de la Unidad

Académica de Ciencias Químico Biológicas [email protected]

Resumen

Rac1 es una proteína perteneciente a la familia de las GTPasas Rho, que funciona como

transductor de señales en el citoplasma, participa en la regulación del tráfico vesicular,

polimerización de los filamentos de actina, adhesión, proliferación celular, migración axonal,

fagocitosis y en procesos de hematopoyesis. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que

Rac1 puede traslocarse al núcleo, donde podría jugar un papel funcional. Investigaciones han

demostrado que los estrógenos pueden favorecer la traslocación de Rac1 en el núcleo en ciertas

líneas celulares, probablemente a través de la activación de la cinasa ERK. En este trabajo se

utilizó la línea celular HaCaT, la cual de manera normal expresa a Rac1 en el citoplasma. Las

células fueron tratadas con estrógenos para inducir la acumulación de Rac1 en el núcleo. La

actividad de ERK fue inhibida utilizando el inhibidor químico de ERK. La localización

subcelular de Rac1 se determinó mediante fraccionamiento celular, Western blot, y por

inmunocitoquímica. Los cambios en el citoesqueleto se evaluaron mediante inmunofluorescencia.

Encontramos que la acumulación nuclear de Rac1 en células HaCaT estimuladas con estrógenos

depende de la cinasa ERK. El tratamiento con estrógenos por 8 horas induce cambios en la

morfología nuclear, mayor concentración de células en mitosis, un aumento en la formación de

fibras de estrés, perdidas de las uniones celulares y reorganización de los filamentos de tubulina.

Palabras Clave: GTPasas, Rac1, HaCaT, C33-A, Estrógenos, ERK.



Introducción

La superfamilia Ras es un grupo de proteínas G pequeñas conocidas como GTPasas

pequeñas. Actualmente se han descrito más de 100 miembros de esta familia, en humanos las

familias Ras, Rab y Rho son las más estudiadas (Rojas et al. 2012).

Las GTPasas pequeñas son proteínas monómericas con un tamaño de 20 a 25 kDa, entre

ellas se ubica la familia de GTPasas Rho, esta se encuentra formada de 22 proteínas distintas

clasificadas en cinco subfamilias de acuerdo a su homología en la secuencia de aminoácidos: Rho

(RhoA, RhoB y RhoC); Rac (Rac1, Rac2, Rac3 y RhoG); Cdc42 (Cdc42, TC10, TCL y RhoJ);

RhoF y RhoD (Hall, 2012). Estas proteínas se localizan en el citoplasma y ancladas a la

membrana plasmática de las células, lo cual es posible gracias a modificaciones post-

traduccionales en su extremo carboxilo terminal, lo que le confiere hidrofobicidad facilitando la

asociación a la membrana celular donde podrán ser activadas por proteínas reguladoras (Roberts

et al. 2008).

Las GTPasas pueden pasar de un estado inactivo a un estado activo cuando están unidas a

nucleótidos GDP y GTP, respectivamente. La activación es mediada por factores

intercambiadores de nucleótidos de guanina (GEFs) y la inactivación es mediada por las

Proteínas Activadoras de la GTPasa (GAPs). Además, existen proteínas que interacciona con las

formas inactivas de las GTPasas, llamadas inhibidores de disociación de nucleótidos de guanina

(GDIs), las cuales actúan secuestrándolas en el citoplasma e inhibiendo su activación debido a

que enmascaran los grupos farnesil o geranil en la región C-terminal de las GTPasas Rho,

impidiendo su anclaje a la membrana celular (Cherfils & Zeghouf 2013).

En su estado activo, las GTPasas interactúan con proteínas efectoras, desencadenando

procesos celulares como motilidad, reordenamiento del citoesqueleto, quimiotaxis (Sadok &

Marshall 2014), polaridad celular (Mack & Georgiou 2014), trafico vesicular (Chi et al. 2013),

transcripción (Rajakylä & Vartiainen 2014), proliferación y división celular (Militello &

Colombo 2013), control redox (Hobbs et al. 2014), función plaquetaria (Aslan & McCarty 2013),

regulación de la inflamación (Tong & Tergaonkar 2014) y diferenciación celular (Kalfa & Zheng

2014).

Una de las GTPasas Rho que juega un papel clave en la progresión del cáncer es Rac1.

Fue descrita por primera vez en 1989 en fibroblastos. Estructuralmente Rac1 presenta 3 regiones:

un dominio G, dominio Rho y una región C-terminal. En el domino G se encuentran dos regiones

altamente conservadas en todas las Rho GTPasas, conocidas como Switch I y II, estas regiones

censan si una molécula de GDP o GTP está unida, permitiendo un cambio conformacional en la

proteína y esto es detectado por proteínas reguladoras y efectoras permitiendo su interacción con

Rac1 (Schaefer et al. 2014). Por otra parte el dominio Rho está involucrado en la unión de los

GEFs pero también actúa en la unión y activación de proteínas efectoras (Schaefer et al. 2014).

Finalmente la región C-terminal, comprende una región hipervariable y un dominio CAAX, el

Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

cual es palmitoilado permitiendo así la unión de Rac1 a la membrana plasmática. La región

hipervariable funciona como un sitio de unión de proteínas y determina la unión específica a

proteínas reguladoras o efectoras (Schaefer et al. 2014).

Entre las funciones que desempeña Rac1 se encuentran tráfico vesicular, polimerización

de los filamentos de actina, adhesión, proliferación celular, migración axonal, fagocitosis y en

procesos de hematopoyesis (Bustelo et al. 2012; Cancelas, 2012). En algunos estudios

experimentales con Rac1, se ha encontrado una hiperactivación de esta proteína en cáncer de

mama (Jiang et al. 2003, Wu et al. 2004, Zuo et al. 2006), colon, pulmón (Fritz et al. 1999) y

cáncer oral de células escamosas (Liu et al. 2004); que podría ser atribuida a la a la

sobreexpresión de reguladores río arriba de Rac1 como el GEF Tiam1, que es un activador

específico para esta proteína (Veluthakal et al. 2009). Posteriores estudios también demostraron

su sobreexpresión en líneas celulares como MDA-MB-435 aumentando su invasividad y

motilidad (Baugher et al. 2005).

Además del citosol y la membrana plasmática, se ha encontrado localización de Rac1 en

el núcleo (Kraynov et al. 2000; Michaelson et al. 2001). Esta característica está determinada por

una señal de localización nuclear (PVKKRKRK), dentro de una región hipervariable (Lanning et

al. 2004), que le permite ser reconocida por algunas moléculas importadoras para su posterior

transporte al núcleo (Kawashima et al. 2009; Sandrock et al. 2010).

Diferentes estudios experimentales han demostrado la interacción de Rac1 con otras

proteínas, favoreciendo su traslocación al núcleo así como las funciones que podría desempeñar,

tales como la interacción con smGDS y STAT3 a través de la región PBR (Lanning et al. 2003);

acumulación nuclear de Rac1 durante la fase G2 del ciclo celular en células PAE, donde con una

mutante de Rac1 se demostró que en citoplasma inhibe la división celular y su sobreexpresión en

el núcleo aumenta la proliferación celular (Michaelson et al. 2008); promoción de la segregación

cromosómica mediante la formación en complejo con Tiam1 y el huso mitótico (Woodcock et al.

2010); en células HeLa, HEK293 y HaCaT, la traslocación de Rac1 al núcleo podría ser mediada

por la importina karioferina α2 en células (Sandrock et al. 2010; De la Cruz & Hernández, datos

no publicados); también el factor básico de crecimiento en fibroblastos (bFGF) induce la

translocación de Rac1 al núcleo y su acumulación incrementa la diferenciación neuronal en

células PC12 (Kim & Shin 2013); la fosforilación por ERK en el residuo T108 en células COS-

7, favorece la traslocación nuclear de Rac1 (Tong et al. 2013); así mismo el importe y exporte

nuclear de Rac1 depende de la proteína B23 que tiene función de chaperona, a través del

reconocimiento de la señal de exportación nuclear (NES) (Navarro-Lérida et al. 2015).

Por otra parte, se ha observado que los estrógenos inducen la acumulación nuclear de

Rac1 en células HaCaT así como en epitelio cervical de ratones. Se ha sugerido que su

acumulación en el núcleo podría estar promoviendo la expresión de los genes c-Myc y c-Jun

(Dircio y Muñoz en el 2011, datos no publicados).



ERK1/2 es una proteína que participa en la cascada de transducción de señal Ras-Raf-

MEK-ERK (vía de las MAPK), regulando una amplia variedad de procesos como adhesión,

migración, sobrevivencia y progresión de ciclo celular, además, diferenciación, metabolismo,

proliferación y transcripción (Roskoski Jr 2012). ERK1/2 cataliza la fosforilación de cientos de

substratos nucleares y citoplasmáticos incluidas las moléculas reguladoras y los factores de la

transcripción. Algunos de estos substratos poseen el sitio de unión D, sitio de unión F o ambos.

La actividad o fosforilación de la vía de las MAPK incrementa en alrededor de un tercio de los

canceres humanos. La fosforilación de las cinasas ocurre en residuos los cuales se distribuyen de

forma asimétrica: 85% serina, 11,8% de treonina y 1,8% de tirosina (Schwartz & Murray 2011;

Roskoski Jr 2012).

Evidencias recientes demuestran que en células COS-7, en respuesta al tratamiento con

EGF, ERK fosforila a Rac1 en la treonina 108 promoviendo su acumulación nuclear (Tong et al.,

2013). También se ha demostrado que en líneas celulares de CaCU como C33A (Mendoza-

Catalán et al., 2012) y HeLa, la localización de Rac1 es tanto citoplasmática como nuclear a

diferencia de las células HaCaT que se encuentra solo en citoplasma. El objetivo de este trabajo

fue determinar si la acumulación de Rac1 en respuesta a estrógenos depende de la actividad de la

cinasa ERK, si Rac1 se fosforila en residuos de Treonina y si existen cambios en el citoesqueleto

en respuesta a estrógenos. Además, identificar si los estrógenos aumentan la concentración de

Rac1 en núcleo en células C33A y si la traslocación de Rac1 depende de la fosforilación de ERK

utilizando el inhibidor químico de ERK.

Materiales y Métodos

Cultivo celular y tratamientos con estrógenos. Las células C33A y HaCat fueron

cultivadas en medio DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium) suplementado con 10% de

suero fetal bovino y 1% de una mezcla de antibióticos (penicilina /estreptomicina) en una

atmosfera con 5% de CO2, a 37°C. Las células fueron sembradas en cajas de Petri de 10 cm de

diámetro, una vez que alcanzaron el 80% de confluencia se pusieron en supresión con medio

basal durante 24 horas. Así mismo estas células fueron tratadas con estrógenos y con el inhibidor

químico de ERK durante 8 horas.

Inmunocitoquímica. Para determinar la localización celular de Rac1 las células HaCaT

fueron sembradas sobre cubreobjetos redondos de 12 mm de diámetro en una caja de 24 pozos.

Las células se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% de SFB e incubadas a 37°C

en atmosfera de 5% de CO2, y fueron sometidas a tres condiciones: sin tratamiento (control);

tratamiento con estrógenos (17-βestradiol) 10μM durante ocho horas; y tratamiento con

estrógenos por 8 horas más el inhibidor químico de ERK 50 μM durante las dos últimas horas de

tratamiento con estrógenos.

Después de haber colocado cada estímulo las células fueron fijadas con metanol por 10

minutos a 4°C y lavadas con PBS frío. Enseguida, se incubó por 10 minutos con solución de

bloqueo (Bio-SB Inc. Santa Barbara, CA.) para inactivar la peroxidasa endógena, luego se


bloqueó con PBS + 1% de BSA durante 30 minutos y fueron incubadas con el anticuerpo

primario específico para Rac1 (1:50) (BD Biosciences) por 1 hora a temperatura ambiente. El

anticuerpo primario fue detectado usando el Kit Mouse/Rabbit Immunodetector HRPw/DAB

(Bio-SB Inc. Santa Barbara, CA.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células fueron

contrateñidas con Hematoxilina de Harris y montadas sobre portaobjetos de vidrio usando medio

de montaje Entellan (Merck, North América Inc). La inmunorreactividad se observó al

microscopio con un objetivo de 40X.

Fraccionamiento celular. Para determinar la localización subcelular de Rac1 se realizó un

fraccionamiento celular. Transcurrido el tiempo de tratamiento con estrógenos y/o del inhibidor

químico de ERK y con una confluencia del 80-90%, las células fueron lavadas con PBS frio y

posteriormente se les adicionó 600 μL de buffer hipotónico (20mM HEPES pH 7.9, 10mM KCl,

1mM EDTA, 10% glicerol, 0.5% Tritón X-100, 1X coctel de inhibidores de proteasas PMSF,

NaF, Na2VO3) directamente sobre las placas y se incubó por 10 minutos a 4°C. Las células

fueron removidas de la caja Petri con una espátula de plástico estéril y transferidas a un tubo

eppendorf de 1.5 mL, haciendo pasar las células varias veces a través de la punta de una pipeta

para disgregarlas. Transcurrido el tiempo de incubación se centrifugó a 2000 gravedades durante

1 minuto a 4°C. Se recuperó el sobrenadante donde se encuentran las proteínas citoplásmicas. Al

botón restante se le adicionó 100 μL de buffer alto en sales (240mM NaCl, 20mM HEPES pH

7.9, 10mM KCl, 1mM EDTA, 20% glicerol, 1% tritón, 1X coctel de inhibidores de proteasas), se

agitó vigorosamente (vortex) por 45 minutos a 4°C para disgregar el botón, y por último se

centrifugó a 1200 gravedades por 15 minutos a 4ºC. Se recuperó el sobrenadante el cual que

contenía las proteínas nucleares. La concentración de proteína se cuantificó por el método de

Bradford (Kruger, 2009).

Western blot. Las proteínas fueron separadas en geles de poliacrilamida al 10% y

transferidas a membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron bloqueadas con leche

descremada al 5% durante 1 hora, posteriormente se realizaron lavados con TBS-Tween 0.05 % y

se incubó con el anticuerpo primario Anti–Rac1 (1:5000), Anti-Tubulina (1:1000), Santa Cruz

Biotechnology, durante 2 horas a temperatura ambiente seguido de lavados con TBS-Tween 0.05

%. Posteriormente se incubarán durante 2 horas con el anticuerpo secundario (Anti-ratón

1:10000, Santa Cruz Biotechnology). Finalmente, se realizó la inmunodetección usando un

estuche de quimioluminiscencia y placas autoradiográficas. La intensidad relativa de las bandas

de Western blot se determinó por medio de análisis densitométrico de las bandas empleando el

software Image J.

Extracción de proteínas totales. A partir de las células en cultivo, se retiró el medio

DMEM y se realizaron lavados con PBS, para posteriormente agregar un volumen total 500 μL

del buffer de lisis (RIPA) más inhibidores de proteasas el cual es un coctel compuesto de 5 μL de

PMSF a una concentración de 100mM, 5 μL Na2VO3, a una concentración de 250mM y

finalmente 5 μL NaF a una concentración de 1M. Posteriormente se incubó 10 minutos en frío.

Las células fueron recolectadas con un scrapper y disgregadas con ayuda de una pipeta 15 veces



para posteriormente transferirlas a tubos Eppendorf de 1.5 mL. Se homogenizaron en vortex por

30 segundos y se centrifugaron a 11,000 rpm por 10 minutos a 4 ºC. Se recuperó el sobrenadante

haciendo 3 alícuotas para almacenarlas a -70 ºC o -20 ºC.

Inmunoprecipitación. Se prepararon alícuotas de 100 μL de proteínas totales en tubos

Eppendorf de 1.5 mL. Se agregaron 2μL de anticuerpo primario para Rac1 a cada tubo y se

colocaron horizontalmente en hielo para dejarlos en agitación 1 hora a 50 rpm. Se agregaron

20μL de perlas de agarosa a cada tubo. Se agitaron los tubos en el rotador Mini Labroller a 4 ºC

durante toda la noche. Se centrifugó a 8,000 rpm por 5 minutos a 4 ºC, se decantó para recuperar

el pellet, posteriormente se añadieron 500μL de buffer de lisis y se mezcló en vortex durante 3

segundos. Se decantó y centrifugó nuevamente a 8,000 rpm por 5 minutos a 4ºC, esta vez sin

homogenizar para desechar la mayor cantidad de sobrenadante. Se agregaron 10μL de buffer de

muestra 4X y se hirvieron 5 minutos a 100 ºC. Posteriormente se realizó un Western blot para

visualizar los resultados.

Inmunofluorescencia. Las células fueron sembradas sobre cubreobjetos redondos de 12

mm de diámetro en una caja de 24 pozos. Posteriormente se retiró el medio DMEM y se

añadieron 400μL de Paraformaldehido al 4% con Tritón-100X 0.5% a temperatura ambiente. Se

retiró la solución fijadora-permeabilizadora y se agregaron 300μL de solución fría de PBS-Tween

al 0.05% en agitación manual por 10 segundos aproximadamente. Se añadieron 250μL de una

solución al 0.1M de glicina en PBS para eliminar el exceso de paraformaldehido durante 20

minutos a temperatura ambiente. Se realizaron lavados con solución fría de PBS-Tween 0.05%.

Se empleó 1 hora de bloqueo a temperatura ambiente con 200μL de una solución de BSA 3%.

Posteriormente se retiró la solución de bloqueo para añadir el anticuerpo primario para tubulina a

una dilución de 1:100 en BSA 3%. Se colocaron boca abajo sobre un montaje de papel parafilm

con 48μL del anticuerpo. Se incubo durante 4 horas. Se realizaron lavados con una solución a -20

ºC de PBS-Tween al 0.05%. Se añadió 1μL de faloidina rodaminada a una dilución 1:400 en BSA

3% y 1 μL del anticuerpo secundario acoplado a FITC durante 2 horas a temperatura ambiente.

Se realizaron lavados adicionales con agua bidestilada para evitar la fluorescencia de fondo.

Posteriormente se les añadieron 50 μL de DAPI a cada portaobjetos y se dejó reposar 2 horas a

temperatura ambiente.

Transfección celular GFP-Rac1. Se sembraron alrededor de 2x105 células HaCaT en

placas de 6 pozos con 3 mL de medio, una vez llegada una confluencia del 80% se transfectaron

con 0.4 ng/µL del plásmido (GFP-Rac1) (Michaelson et al. 2008) y 10 µL de lipofectamina 2000

(Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones de manufacturación. Una vez hecha la transfección se

dejaron incubar las células durante 24 horas para posteriormente fijarlas con formaldehído al

3.7% y visualizarlas con ayuda de un microscopio de fluorescencia.

Resultados

Para determinar el efecto de los estrógenos sobre la localización subcelular de Rac1 en

células HaCaT se realizó un fraccionamiento celular y posteriormente un ensayo de Western blot


donde se demostró que en las células HaCaT Rac1 se encuentra en la fracción citoplásmica, pero

al ser tratadas con estrógenos se observa la presencia de Rac1 tanto en el citoplasma como en el

núcleo, así mismo al tratarlas con el inhibidor químico de ERK, se observa mayor concentración

de Rac1 citoplasmática y muy poca concentración de Rac1 nuclear (Figura 1-A). Posteriormente

se empleó una inmunocitoquímica donde se comprueba la localización citoplasmática y nuclear

de Rac1 en células HaCaT tratadas con estrógenos y una menor concentración de Rac1 nuclear al

añadir el inhibidor químico de ERK (Figura 1-B).

Figura 1. Efecto de los estrógenos sobre la localización de la GTPasa Rac1 en células HaCaT. A)

Fraccionamiento de células HaCaT, bajo el tratamiento con estrógenos y el inhibidor químico de ERK PD098059 B)

Células HaCaT sin y con tratamiento (10 µM de 17β-estradiol), validación por técnica de inmunocitoquímica.

Para determinar si Rac1 es fosforilada en residuos de treonina tras el tratamiento con

estrógenos, realizamos ensayos de inmunoprecipitación con un anticuerpo contra Rac1 y WB con

un anticuerpo contra treonina fosforilada. Encontramos que la fosforilación de Rac1 en residuos

de treonina incrementa tras el tratamiento con estrógenos (Figura2-A) y mediante análisis

densitométrico se determinó que el pico máximo de fosforilación en treonina es a los 5 minutos

(Figura 2-B).



Figura 2. Efecto de la fosforilación de Rac1 en residuos de treonina. A) Western blot de la Inmunoprecipitación

de Rac1 en células HaCaT tratadas con estrógenos a tiempos cortos (0, 5, 10, 15 y 30 minutos), detectando la

fosforilación en residuos de treonina. B) Análisis densitométrico, datos normalizados con Rac1 total.

Por otra parte se realizó una inmunofluorescencia de las células HaCaT tratadas con

estrógenos, con la finalidad de observar los cambios que podría causar el tratamiento con

estrógenos, y se encontraron cambios en la morfología nuclear, mayor concentración de células

en mitosis y un aumento en la formación de fibras de estrés, perdidas de las uniones celulares y

reorganización en los filamentos de tubulina (Figura 3).

Figura 3. Efecto de los estrógenos en la morfología de células HaCaT. Microscopia de fluorescencia donde se

analizó el efecto del tratamiento con estrógenos en la distribución de microfilamentos (tubulina y actina) y

morfología celular. Las flechas azules representan células en mitosis, las flechas blancas la formación de fibras de

estrés y prolongaciones finas y la flecha verde indica reorganización en los filamentos de tubulina.


Con la finalidad de establecer un modelo más fino para estudiar el efecto de la

localización nuclear de Rac1 en células HaCat, se realizaron ensayos preliminares de transfección

en células HaCaT utilizando plásmidos para expresar proteínas de fusión Rac1-GFP la cual nos

permitía localizarla en distintos compartimientos celulares. Entre las construcciones utilizadas se

encuentran Rac1-WT (localizada en citoplasma) y Rac1- ∆AAX (localización nuclear) (Figura

4).

Figura 4. Ensayos de transfección con mutantes de Rac1- GFP. Análisis de fluorescencia de la distribución

subcelular de cada construcción de Rac1-GFP. Barras de escala representan 100 µm.

Estudios previos del laboratorio muestran que, a diferencia de las células HaCat en las que

Rac1 se localiza en citoplasma y en respuesta a estrógenos Rac1 se acumula en el núcleo, en

células C33A (derivadas de cáncer cervical) Rac1 se localiza tanto en núcleo como en citoplasma

aun en ausencia de estrógenos. Para determinar si la acumulación nuclear de Rac1 en células

C33A es dependiente de la activación de ERK, realizamos un tratamiento con estrógenos y

estrógenos más el inhibidor químico de ERK en células C33A, y posteriormente un ensayo de

fraccionamiento celular y Western blot, donde no se encontró ningún cambio en la cantidad de

Rac1 nuclear en presencia del inhibidor de ERK (Figura 5).



Figura 5. Efecto de los estrógenos sobre la localización de la GTPasa Rac1 en células C33A. Fraccionamiento

de células C33A, bajo el tratamiento con estrógenos y el inhibidor químico de ERK PD098059.

De acuerdo a los resultados generados se realizó un diagrama de células HaCaT, donde se

ilustra el efecto de los estrógenos en la activación de la vía de las MAPK/ERK, promoviendo un

aumento en la concentración de Rac1 nuclear, división celular y reorganización del citoesqueleto

generando polímeros de actina y fibras de estrés (Figura 6).


Figura 6. Diagrama propuesto sobre la participación de Rac1 en células HaCaT estimuladas con estrógeno. La

estimulación con estrógenos en células HaCaT activa la vía no genómica la cual está acoplada a proteínas G

(GPR30), los cuales se encuentran anclados a la membrana celular a través de sus siete dominios transmembranales,

una vez activos estos receptores pueden desencadenar diversos efectos a través de la activación de proteínas cinasas,

como MAPK/ERK (Prossnitz & Barton 2013), favoreciendo la traslocación de Rac1 al núcleo, donde promueve la

migración, división celular y reorganización del citoesqueleto generando un incremento de polímeros de actina y

fibras de estrés.

Discusión y conclusiones

Estudios experimentales han demostrado hiperactivación de Rac1 en diferentes tipos de

cáncer de mama (Jiang et al. 2003, Wu et al. 2004, Zuo et al. 2006), colon, pulmón (Fritz et al.

1999) y cáncer oral de células escamosas (Liu et al. 2004), ayudando a la traslocación de Rac1

en el núcleo, incrementando procesos relacionados con la invasividad y motilidad (Baugher et al.

2005).

Estudios anteriores identificaron en biopsias de lesiones pre malignas de cáncer

cervicouterino la presencia de Rac1 en el núcleo, mientras que en células epiteliales de cérvix

normal Rac1 se encontraba en citoplasma. (Mendoza-Catalán y colaboradores). Experimentos

preliminares de inmunocitoquímica realizados por el grupo de trabajo del LBCC, mostraron que

en células HaCaT, Rac1 se acumula en el núcleo tras el tratamiento con 10 μΜ de 17β-estradiol

durante 8 horas. Una de las limitaciones de la técnica de inmunocitoquímica, es que al ser una



técnica basada en una reacción enzimática colorimétrica, puede arrojar resultados falsos

positivos, debido a la reacción inespecífica de los anticuerpos utilizados, por lo tanto en este

trabajo utilizamos ensayos de fraccionamiento celular y Western blot para validar los resultados

obtenidos mediante inmunocitoquímica (Figura 1).

Por otro lado, existen evidencias de que la traslocación nuclear de Rac1 en respuesta al

factor de crecimiento EGF es favorecida por la fosforilación de la treonina 108 de Rac1, por la

cinasa ERK. Los estrógenos pueden actuar a través de un receptor de tipo GPCR denominado

GPR30, el cual es un receptor transmembranal que puede activar la vía de las MAPK, llevando a

la activación de la cinasa ERK, la cual podría fosforilar a Rac1 en residuos de treonina,

favoreciendo su translocación nuclear. Nosotros demostramos mediante fraccionamiento celular

y Western blot, así como por inmunocitoquímica, que el tratamiento con el inhibidor químico de

ERK, reduce la acumulación nuclear de Rac1 en células Hacat tratadas con estrógenos (Figura

1). Estas observaciones validan los resultados preliminares obtenidos dentro del grupo de trabajo

y sugieren que los estrógenos, a través del receptor GPR30, estimulan la vía no genómica y con

ello la activación de la vía de las MAPK /ERK, llevando a la fosforilación de Rac1,

probablemente en la treonina 108, favoreciendo la traslocación al núcleo en células HaCaT.

Para determinar si el tratamiento con estrógenos favorece la fosforilación de Rac1 en

residuos de treonina, se empleó un ensayo de inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo

contra Rac1, a partir de proteínas totales obtenidas de células HaCaT, a las cuales se le realizó un

tratamiento con estrógenos en tiempos cortos (0, 5, 10, 15 y 30 minutos). Posteriormente, se

realizó un Western blot con un anticuerpo anti treonina fosforilada, y se encontró que tras el

tratamiento con estrógenos hay un incremento en la fosforilación de Rac1 en residuos de treonina

(Figura 2).

Así mismo se realizó un tratamiento con 10 μΜ de 17β-estradiol durante 8 horas en

células HaCaT, para posteriormente realizar un ensayo de inmunofluorescencia. Los resultados

mostraron cambios en la morfología nuclear, mayor concentración de células en mitosis, un

aumento en la formación de fibras de estrés, perdida de las uniones celulares y reorganización en

los filamentos de tubulina (Figura 3). Sin embargo, estos cambios no pueden ser atribuidos

totalmente a la traslocación de Rac1 en el núcleo, ya que de manera normal, los estrógenos son

responsables de muchos eventos celulares entre ellos la modulación de la expresión génica o la

activación de cascadas de señalización, etc. (Vrtačnik et al. 2014).

Se comenzaron a estandarizar ensayos de transfección en células HaCaT donde se

introdujeron plásmidos para expresar formas recombinantes de Rac1, fusionadas a la proteína

GFP la cual permitía localizarla en distintos compartimientos celulares. Entre las construcciones

utilizadas se encuentran Rac1-WT (localizada en citoplasma) y Rac1-∆AAX (localización

nuclear). Los resultados comprobaron la localización de Rac1 en la construcción de Rac1-WT, su

presencia tanto en citoplasma como en el núcleo y en la construcción de Rac1-∆AAX, la

presencia de Rac1 únicamente en el núcleo (Figura 4).

Estudios previos también demostraron la presencia de Rac1 tanto en citoplasma como en

el núcleo en líneas celulares de cáncer cervicouterino: SiHa, HeLa y C33-A (Mendoza-Catalán et

al., 2012). Por tal motivo se utilizó la línea celular C33A en un tratamiento con 10 μΜ de 17β-


estradiol durante 8 horas y el inhibidor químico de ERK mediante fraccionamiento celular y

ensayos de Western blot, para evaluar el efecto tanto de los estrógenos y su vez el

comportamiento de ERK. Los resultados no mostraron ningún cambio en la concentración de

Rac1 en el núcleo (Figura 5). Lo cual nos indica que la línea celular C33A no depende del

estímulo con estrógenos ni de la cinasa ERK para permitir la translocación de Rac1 en el núcleo.

Agradecimientos

Agradezco al programa Verano UAGro por bridarme la oportunidad de realizar una

estancia de investigación, así como al Dr. Eduardo Castañeda Saucedo, que me dio la

oportunidad de participar en la investigación de cinasas que pueden tener efectos en el desarrollo

del cáncer, y con ello el empleo de diferentes técnicas de bilogía molecular. Agradeciendo

también a la Q.B.P. Angélica Martínez López estudiante de maestría y al personal del

Laboratorio de Biología Molecular del cáncer, ya que sin su asesoría este proyecto no hubiese

sido posible.

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