19© OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

11© Número de publicación: 2 279 53951© Int. Cl.:

C12N 15/62 (2006.01) C12N 15/13 (2006.01)

C07K 16/30 (2006.01) C07K 16/46 (2006.01)

A61K 47/48 (2006.01) C07K 19/00 (2006.01)

C07K 14/705 (2006.01) C12N 9/64 (2006.01)

C12N 5/10 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01)

C12N 5/20 (2006.01) A01K 67/027 (2006.01)

A01H 1/00 (2006.01)

12© TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3

86© Número de solicitud europea: 97918258 .186© Fecha de presentación : 29.04.199787© Número de publicación de la solicitud: 089662687© Fecha de publicación de la solicitud: 17.02.1999

54© Título: Anticuerpo monoclonal anti-CEA, conjugados que comprenden dicho anticuerpo, y su uso terapéuticoen un sistema ADEPT.

30© Prioridad: 04.05.1996 GB 960940514.02.1997 GB 9703103

45© Fecha de publicación de la mención BOPI:16.08.2007

45© Fecha de la publicación del folleto de la patente:16.08.2007

73© Titular/es: AstraZeneca AB.151 85 Södertälje, SE

72© Inventor/es: Copley, Clive, Graham;Edge, Michael, Derek yEmery, Stephen, Charles

74© Agente: Lehmann Novo, María Isabel

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, dela mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europeade Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo seconsiderará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 delConvenio sobre concesión de Patentes Europeas).E

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Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

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DESCRIPCIÓN

Anticuerpo monoclonal anti-CEA, conjugados que comprenden dicho anticuerpo, y su uso terapéutico en un siste-ma ADEPT.

La presente invención se refiere a un nuevo anticuerpo monoclonal anti-CEA (denominado aquí “anticuerpo806.077” o “Ab 806.077”), útil para el diagnóstico y terapia del cáncer.

Se ha establecido que la transformación de células de tejidos normales en células tumorales está asociada con uncambio en la estructura sobre la superficie celular. Las estructuras de las superficies celulares alteradas pueden servircomo antígenos, y las estructuras modificadas por tumores representan un tipo del denominado antígeno asociadoa tumores (véase, por ejemplo, Altered Glycosylation in Tumour Cells, Eds. Reading, Hakamori y Marcus 1988,Arthur R. Liss publ.). Tales antígenos se pueden aprovechar, por ejemplo, mediante la generación de anticuerposmonoespecíficos usando tecnología de hibridomas, ya que actualmente está bien consolidada tras haber sido descritaprimeramente por Kohler y Milstein (Nature, 256, 495-497, 1975).

Un antígeno asociado a tumores es CEA (antígeno carcinoembriónico), como se describió en primer lugar porGold y Freedman, J Exp Med, 121, 439, 1965. Este antígeno está presente sobre la superficie de la célula tumoral, ytambién se puede demostrar su presencia en el suero de la sangre.

El concepto de usar anticuerpos dirigidos contra antígenos asociados a tumores, en el tratamiento del cáncer, hatenido mucho valor durante cierto tiempo (Herlyn et al. (1980) Cancer Research 40, 717). Los anticuerpos se puedenusar para seleccionar como dianas a diversos agentes químicos y biológicos contra el tumor, y tales conjugados hansido particularmente exitosos a la hora de formar la base de muchos métodos de diagnóstico tanto in vitro como invivo. También es prometedor el uso de inmunoconjugados en la terapia del cáncer (Lord et al.(1985) Trends in Biote-chnology 3, 175; Vitetta et al (1987) Science 238, 1098). Este enfoque es técnicamente mucho más exigente que lasaplicaciones de diagnóstico, y requiere que los antígenos asociados a tumores que se seleccionan como dianas en talesenfoques inmunoterapéuticos sean altamente específicos del tumor, y que no se expresen en cantidades significativasen tejidos humanos vitales. Aunque no se desea estar atados por consideraciones teóricas, así como la propiedad detener una distribución de tejido asociado a tumor específica, para algunas aplicaciones es deseable que el anticuerpopermanezca en la superficie celular después de la unión al antígeno, en lugar de internarse rápidamente. Por ejemplo,en un sistema ADEPT (terapia con profármaco y enzima dirigida por anticuerpo, véanse las patentes US 4975278 y5405990), se cree que es preferible que el anticuerpo permanezca en la superficie celular para facilitar la activacióndel profármaco mediante el conjugado de anticuerpo-enzima.

Los conjugados de anticuerpos también tienen aplicación en inmunoterapia de tumores. Los pocos párrafos si-guientes exponen los antecedentes científicos para esta aplicación. A fin de responder a un estímulo inmunitario, lascélulas T requieren dos señales. Una de tales señales se proporciona mediante el reconocimiento, por parte del re-ceptor de células T (TCR), de péptidos presentados por MHC. Sin embargo, se ha demostrado que la estimulaciónde TCR sola da como resultado una insensibilidad o anergia de las células T, y se requiere una segunda señal, oseñal coestimuladora, para estimular la activación y proliferación de células T específicas (repasado por SchwartzR.H. J. Exp. Med., 1996, 184, 1-8). Al recibir ambas señales, las células T citotóxicas resultantes median la respuestainmunitaria exterminando las células diana. Se ha identificado un número de moléculas coestimuladoras potencia-les (por ejemplo, B7, ICAM, LFA-1 y 3, CD40, CD70 y CD24, repasado por Galea-Lauri J. et al Cancer GeneTherapy, 1996, 3, 202-213). La principal función coestimuladora parece que está proporcionada por las moléculasrelacionadas B7.1 (también denominada CD80) y B7.2 (también denominada CD86), que pueden interactuar condos receptores, CD28 y CTLA-4 (Hellstrom K.E. et al Immunol. Rev., 1995, 145, 123-145 y Lenschow D.J. et alAnn. Rev. Immunol., 1996, 14, 233-258). B7.1 y B7.2 se expresan sobre células que presentan antígenos (APC),tales como las células dendríticas, mientras que CD28 y CTLA-4 están presentes en las células T. B7.2 parece quese expresa constitutivamente sobre la superficie de las APC pero, después del contacto con una célula T, la expre-sión de B7.1 aumenta. Análogamente, CD28 se expresa sobre células T, pero, tras la activación, disminuye y sesustituye por la expresión de CTLA-4. La estimulación de CD28 y CTLA-4 mediante B7.1 y B7.2 representa unpatrón complejo de señalización que controla no sólo la activación de la célula T, sino el control subsiguiente de laproliferación para modular la respuesta inmunitaria (Greene J. et al J. Biol. Chem., 1996, 271, 26762-26771). Estefenómeno puede explicar los datos a veces conflictivos dados por autores que estudian estas moléculas coestimula-doras.

En el cáncer, se han identificado linfocitos infiltrantes de tumores, pero la falta de respuesta inmunitaria al tumorpuede ser debida a la anergia de las células T. Las células tumorales pueden presentar antígenos específicos o selectivossobre su superficie, pero carecen de B7.1/B7.2, permitiéndoles escapar a la vigilancia inmunitaria. De hecho, losexperimentos in vivo han demostrado que las células tumorales transfectadas con B7.1/B7.2 son menos tumorigénicasque las células sin transfectar de la misma estirpe, y que las células transfectadas son capaces de inducir inmunidadprotectora frente a la reexposición con células progenitoras (Townsend S.E. y Allison J.P., 1993, Science, 259, 368-370). Esto demuestra que, una vez estimulada, la respuesta inmunitaria se puede hacer independiente de B7.1/B7.2.Hellstrom ha propuesto que la expresión de B7.1/B7.2 en células tumorales, mediante terapia génica, tiene el potencialde estimular una respuesta del hospedante que puede reducir o eliminar la enfermedad. Gajewski (J. Immunol., 1996,156, 465-472) y Matulonis et al. (J. Immunol., 1996, 156, 1126-1131) han dado a conocer que B7.1 es superior a B7.2en la activación de células T. Se afirma que el uso de B7.1 en disolución (como una fusión con dominios constantes

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de anticuerpos) proporciona sólo una coestimulación modesta a células T que reciben estimulación de TCR vía unafuente independiente (Linsley P.S. et al. J. Exp. Med., 1991, 173, 721-730).

Existe la necesidad de anticuerpos anti-CEA adicionales y mejorados, útiles en el diagnóstico y en la terapia delcáncer.

La presente invención se basa en el descubrimiento de un nuevo anticuerpo anti-CEA, denominado aquí anticuerpo806.077.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo anti-CEA que comprende regiones quedeterminan la complementariedad (CDR), CDR las cuales tienen las siguientes secuencias:

a) cadena pesada

CDR1 DNYMH (SEQ ID NO: 29)

CDR2 WIDPENGDTE YAPKFRG (SEQ ID NO: 31)

CDR3 LIYAGYLAMD Y (SEQ ID NO: 32);

b) cadena ligera

CDR1 SASSSVTYMH (SEQ ID NO: 26)

CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 27)

CDR3 QQRSTYPLT (SEQ ID NO: 28).

Las CDR, o regiones que determinan la complementariedad, son aquellas secuencias dentro de los bucles hiperva-riables de los dominios variables de anticuerpos que se cree que son críticas a la hora de determinar la especificidadde la interacción antígeno-anticuerpo (Kabat, E.A., Lu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. y Gottesman, K.S. (1987).Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4ª edición. Washington D.C.: United States Dept. of Health and Hu-man Services; se cita también esta referencia al lector para detalles de la numeración de los restos de los anticuerpos deKabat). Sin embargo, las CDR tales como se definen aquí incluyen restos de armazones en los que estos contribuyen ala unión. Para el anticuerpo 806.077, las CDR se determinaron mediante homología con las secuencias hipervariablesde otros anticuerpos murinos. En esta memoria descriptiva, los términos “VK” y “VH” significan regiones variablesde las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos, respectivamente. La anatomía de la molécula del anticuerpo ha sidoestudiada por Padlan (1994) en Molecular Immunology 31, 169-217.

Las CDR de la cadena ligera son:

restos 24-34 inclusive de VK CDR1 de Kabat, SASSSVTYMH (SEQ ID NO: 26);

restos 50-56 inclusive de VK CDR2 de Kabat, STSNLAS (SEQ ID NO: 27);

restos 89-97 inclusive de VK CDR3 de Kabat, QQRSTYPLT (SEQ ID NO: 28).

Las CDR de cadena pesada son:

restos 31-35B inclusive de VH CDR1 de Kabat, DNYMH (SEQ ID NO: 29); los restos de VH CDR1 deKabat preferidos son nº 27-35B inclusive, FNIKDNYMH (SEQ ID NO: 30);

los restos 50-65 inclusive de VH CDR2 de Kabat, WIDPENGDTE YAPKFRG (SEQ ID NO: 31);

los restos 95-102 inclusive de VH CDR3 de Kabat, LIYAGYLAMD Y (SEQ ID NO: 32); y los restos deVH CDR3 de Kabat preferidos son los nº 93-102 inclusive, HVLIYAGYLA MDY (SEQ ID NO: 33).

Preferiblemente, la afinidad de unión para el antígeno de CEA es al menos 10E-5M, más preferiblemente, laafinidad de unión para CEA es al menos 10E-6M, más preferiblemente, la afinidad de unión para CEA es al menos10E-7M, más preferiblemente, la afinidad de unión para CEA es al menos 10E-8M, más preferiblemente, la afinidadde unión para CEA es al menos 10E-9M, más preferiblemente, la afinidad de unión para CEA es al menos 10E-10M,y especialmente la afinidad de unión para CEA es al menos 10E-11M.

El término anticuerpo, como se usa aquí, generalmente significa una molécula inmunoglobulínica (o un fragmentode la misma, o un constructo de anticuerpo modificado, tal como scFv que retiene la unión a antígeno CEA específica).Las CDR son principalmente responsables de la unión al antígeno, la secuencia proteínica no CDR normalmente derivade una inmunoglobulina, pero puede derivar de un dominio inmunoglobulínico de un miembro de la superfamilia deinmunoglobulinas.

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Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo anti-CEA que comprende la siguienteestructura, opcionalmente humanizada:

una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 11)

y;

una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 9):

o uno cualquiera de los siguientes constructos del mismo:

F(ab’)2; F(ab’), Fab, Fv, Fv de cadena sencilla y V-min.

Se prefieren los constructos de fragmentos F(ab’)2. Se contempla cualquier fragmento adecuado de anticuerpo queretenga las características de unión del anticuerpo 806.077. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo recientementedescrito es “L-F(ab)2”, como se describe por Zapata (1995) en Protein Engineering, 8, 1057-1062. También se contem-plan Fv enlazados mediante disulfuros. Opcionalmente, el anticuerpo forma parte de un conjugado como se describemás abajo.

Un anticuerpo humanizado preferido comprende al menos una de las siguientes secuencias:

una secuencia de región variable de cadena pesada que es VH1 (SEQ ID NO: 55);

una secuencia de región variable de cadena ligera que es VK4 (SEQ ID NO: 71);

una región constante de IgG3 de cadena pesada de CH1 humana;

una región CL de cadena ligera kappa humana; y

una región de bisagra de IgG3 humana;

opcionalmente en forma de un fragmento F(ab’)2.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia polinucleotídica capaz de codificarla región variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CEA de la invención. Preferiblemente, la regiónvariable de cadena pesada o ligera está fusionada (opcionalmente vía alguna secuencia de ligación) a un gen quecodifica un resto efector proteínico (como parte de un conjugado; véase el texto más abajo); preferiblemente, la fusiónse realiza a través de la cadena pesada del anticuerpo. Generalmente, la fusión se puede realizar en el término N o Cde la cadena de anticuerpo. Para conjugados de B7, se prefiere la fusión en el término N de la cadena del anticuerpo.

La CPB tiene un prodominio N-terminal que se cree que ayuda a corregir el plegamiento de la proteína antes deque se elimine el prodominio para eliminar la enzima activa. Si proCPB se fusiona en su término C al término N de unacadena de anticuerpo, esto permite eliminar el prodominio (por ejemplo, mediante tratamiento con tripsina) del términoN del constructo de fusión. Como alternativa, si proCPB se une al término C de una cadena de anticuerpo, entoncessurge el problema de tener que eliminar el prodominio desde la “mitad” del constructo sin destruir la proteína defusión. La solución es coexpresar el prodominio separadamente (en trans). Esto tiene la ventaja de que, una vez se hanconstruido las estirpes celulares, no se requiere la activación mediante tripsina de la proteína de fusión expresada paraeliminar el prodominio de CPB. Los constructos con proCPB fusionada en su término C al término N de una cadenade anticuerpo tienen la ventaja de no requerir la construcción de líneas celulares de coexpresión, lo que requiere unagran cantidad de expresión del prodominio junto con una gran cantidad de expresión de otras proteínas.

En esta memoria descriptiva, se contemplan análogos de aminoácidos conservativos de secuencias de aminoácidosespecíficas, que retienen las propiedades de unión del anticuerpo anti-CEA de la invención, pero difieren en secuen-

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cia en una o más sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos conservativas. Sin embargo, se prefieren lassecuencias de aminoácidos específicamente enumeradas. Más abajo se tabulan las sustituciones de aminoácidos con-servativas típicas.

Sustituciones Conservativas

En esta memoria descriptiva, se contemplan variaciones de ácidos nucleicos (supresiones, sustituciones y adicio-nes) de secuencias de ácidos nucleicos específicas, que retienen la capacidad para hibridarse en condiciones restrictivasa la secuencia específica en cuestión. Más abajo, en el Ejemplo 9, se expone un ensayo de hibridación. Sin embar-go, se prefieren las secuencias de ácidos nucleicos enumeradas específicamente. Se contempla que el ácido nucleicopeptídico puede ser un equivalente aceptable de secuencias polinucleotídicas, al menos para fines que no requieran laproducción en una proteína (Wittung (1994) Nature 368, 561).

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como sedescribe aquí, caracterizado porque está humanizado.

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Un anticuerpo humanizado, fragmento relacionado o estructura de unión de anticuerpo, es un polipéptido com-puesto en su mayor parte de un armazón estructural de secuencias inmunoglobulínicas derivadas de humanos, quemantienen secuencias de aminoácidos no derivadas de seres humanos en y alrededor del sitio de unión al antígeno(regiones que determinan la complementariedad o CDR; esta técnica es conocida como injerto de CDR, que a menu-do implica también algunos cambios del armazón; véanse los Ejemplos más abajo). La metodología apropiada se hadescrito, por ejemplo, en detalle en los documentos WO 91/09967, EP 0328404 y Queen et al. Proc Natl Acad Sci86, 10029, Mountain y Adair (1989) Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 10, 1 (1992), aunque tambiénse contemplan métodos alternativos de humanización, tales como la modificación de los restos de la superficie delanticuerpo (documento EP 519596, Merck/NIH, Padlan et al). Los anticuerpos 806.077 humanizados preferidos sonuno cualquiera de los Ejemplos 11-47 ó 107-122. Una región variable de cadena pesada humanizada preferida es VH1(véanse los Ejemplos). Una región variable de cadena ligera preferida es VK4, que incorpora opcionalmente cualquie-ra de los cambios adicionales descritos en los Ejemplos 107-109. Una región constante de cadena pesada humanizadapreferida es IgG3.

Los anticuerpos humanizados quiméricos representan otro aspecto de la invención. La preparación de fragmentosde anticuerpos humanizados quiméricos de anticuerpo 806.077 de anticuerpo se describe en el Ejemplo 8 de estedocumento. Los anticuerpos quiméricos se construyen generalmente combinando la región variable de una especiecon una región constante de otro anticuerpo procedente de una especie diferente.

El término “humanizado”, en relación con los anticuerpos, como se usa aquí, incluye cualquier método de huma-nización, tal como, por ejemplo, la inserción de CDR, o la preparación de anticuerpos quiméricos o cualquiera de sushíbridos, tal como, por ejemplo, una cadena pesada, a la que se le ha injertado una CDR, en combinación con unacadena ligera quimerizada (véase el Ejemplo 110 para una realización adecuada).

En particular, un anticuerpo de roedor, con la administración repetida in vivo en el hombre, ya sea solo o como unconjugado, provocará una respuesta inmunitaria del receptor contra el anticuerpo del roedor; la denominada respuestade HAMA (anticuerpo anti-ratón humano). La respuesta de HAMA puede limitar la eficacia del fármaco si se requiereuna dosificación repetida. La inmunogenicidad del anticuerpo se puede reducir mediante modificación química delanticuerpo con un polímero hidrófilo, tal como polietilenglicol, o usando los métodos de ingeniería genética, para ha-cer que la estructura de unión del anticuerpo se parezca más a la del ser humano. Por ejemplo, las secuencias génicaspara los dominios variables del anticuerpo del roedor que se unen a CEA se pueden sustituir por dominios variablesde una proteína de mieloma humano, produciendo así un anticuerpo quimérico recombinante. Estos procedimientos sedetallan en los documentos EP 194276, EP 0120694, EP 0125023, EP 0171496, EP 0173494 y WO 86/01533. Comoalternativa, las secuencias génicas de las CDR del anticuerpo de roedor que se une a CEA se pueden aislar o sintetizary se pueden sustituir por las regiones de secuencias correspondientes de un gen de anticuerpo humano homólogo,produciendo un anticuerpo humano con la especificidad del anticuerpo de roedor original. Estos procedimientos sedescriben en los documentos EP 023940, WO 90/07861 y WO 91/09967. Como alternativa, un gran número de restosde superficie del dominio variable del anticuerpo del roedor se puede cambiar por aquellos restos normalmente encon-trados en un anticuerpo humano homólogo, produciendo un anticuerpo de roedor que tiene una “modificación” de losrestos de la superficie, y que por lo tanto será reconocido como propio por el organismo humano. Este enfoque ha sidodemostrado por Padlan et al. (1991) Mol. Immunol. 28, 489.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedante transformada con una secuenciapolinucleotídica, o un animal no humano transgénico o una planta transgénica desarrollados a partir de la célulahospedante en la que la secuencia polinucleotídica codifica al menos la región variable de la cadena pesada o cadenaligera de un anticuerpo anti-CEA de la invención, opcionalmente en forma de un conjugado como se describe en estedocumento.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo 806.077 de hibridoma depositado conel número de depósito 96022936 de ECACC, y sus estirpes celulares variantes.

El anticuerpo 806.077 de hibridoma se depositó en la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC),PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Reino Unido, el 29de febrero de 1996 con el número de acceso 96022936 según el Tratado de Budapest.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona el plásmido pNG3-Vkss-HuCk, depositado con elnúmero de depósito 40798 de NCIMB.

El plásmido pNG3-Vkss-HuCk se depositó en The National Collections of Industrial and Marine Bacteria(NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Escocia, Reino Unido, el 11 de abril de 1996, con el númerode referencia de depósito 40798 de NCIMB según el Tratado de Budapest.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona el plásmido pNG4-VHss-HuIgG2CH1’, depositadocon el número de depósito 40797 de NCIMB.

El plásmido pNG4-VHss-HuIgG2CH1’ se depositó en The National Collections of Industrial and Marine Bacteria(NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Escocia, Reino Unido, el 11 de abril de 1996, con el número dereferencia de depósito 40797 de NCIMB según el Tratado de Budapest.

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Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona el plásmido pNG3-Vkss-HuCk-NEO, depositado conel número de depósito 40799 de NCIMB.

El plásmido pNG3-Vkss-HuCk-NEO se depositó en The National Collections of Industrial and Marine Bacteria(NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Escocia, Reino Unido, el 11 de abril de 1996, con el número dereferencia de depósito 40799 de NCIMB según el Tratado de Budapest.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para obtener al menos una región variablede una cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CEA como se define aquí, que comprende:

a) transformar una célula hospedante con una secuencia polinucleotídica que codifica al menos la región varia-ble de la cadena pesada o ligera del anticuerpo anti-CEA, y opcionalmente desarrollar la célula hospedantetransformada en un mamífero no humano transgénico o en una planta transgénica;

b) someter a la célula hospedante, al mamífero no humano o a la planta transgénica a condiciones que con-duzcan a la expresión, y opcionalmente a la secreción, de al menos la región variable; y opcionalmente

c) purificar al menos parcialmente la región variable.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para obtener un anticuerpo o un conjugadocomo se define aquí, que comprende:

a) someter a la célula hospedante, a un animal no humano transgénico o a una planta transgénica como sedefine aquí, o al hibridoma de 806.077, a condiciones que conduzcan a la expresión, y opcionalmente a lasecreción, del anticuerpo o conjugado; y opcionalmente

b) purificar al menos parcialmente el anticuerpo o conjugado.

Preferiblemente, las regiones variables tanto de cadena pesada como de cadena ligera se expresan en la mismacélula y se ensamblan, para formar de ese modo un anticuerpo anti-CEA. Preferiblemente, la región variable de ca-dena pesada o ligera se fusiona (opcionalmente vía alguna secuencia de ligación) a un gen que codifica un restoefector proteínico (como parte de un conjugado; véase el texto más abajo), realizándose preferiblemente la fusióna través de la cadena pesada del anticuerpo. Generalmente, la fusión se puede realizar en el término N o C de lacadena del anticuerpo. Para conjugados de B7, se prefiere la fusión en el término N de la cadena del anticuerpo.CPB tiene un prodominio N-terminal que se cree que ayuda a corregir el plegamiento de la proteína antes de quese elimine el prodominio para liberar la enzima activa. Si proCPB se fusiona en su término C al término N de unacadena de anticuerpo, esto permite eliminar el prodominio (por ejemplo, mediante tratamiento con tripsina) del tér-mino N del constructo de fusión. Como alternativa, si proCPB se une al término C de una cadena de anticuerpo,entonces surge el problema de tener que eliminar el prodominio desde el “centro” del constructo sin destruir la pro-teína de fusión. La solución es coexpresar el prodominio separadamente (en trans). Esto tiene la ventaja de que, unavez que se han construido las estirpes celulares, no se requiere la activación con tripsina de la proteína de fusiónexpresada, para eliminar el prodominio de CPB. Los constructos con proCPB fusionada en su término C al términoN de una cadena de anticuerpo tienen la ventaja de no requerir la construcción de estirpes celulares de coexpresiónque requieren una gran cantidad de expresión del prodominio, junto con una gran cantidad de expresión de otrasproteínas.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para obtener un anticuerpo monoclonal806.077, que comprende:

a) cultivar el anticuerpo 806.077 de hibridoma, depositado como nº de depósito 96022936 de ECACC, en unmedio en condiciones que conduzcan a la expresión del anticuerpo a partir de aquel; y

b) obtener un anticuerpo 806.077 de anticuerpo a partir del medio de cultivo; y opcionalmente

c) preparar un fragmento F(ab’)2 de anticuerpo 806.077 de anticuerpo mediante digestión enzimática.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un conjugado que comprende un resto efector y unanticuerpo 806.077 anti-CEA de la invención como se describe aquí. Un resto efector es una entidad que tiene elefecto de conferir otra actividad (por ejemplo, un ligando enzimático, de toxina o radioactivo) al anticuerpo 806.077al formar el conjugado.

En una realización, preferiblemente, el resto efector es una enzima adecuada para uso en un sistema ADEPT. Enla Solicitud de Patente Internacional WO 96/20011, publicada el 4 de julio de 1996, se propuso un sistema ADEPTde “polaridad invertida”, basado en enzimas humanas mutantes que tienen la ventaja de una baja inmunogenicidaden comparación con, por ejemplo, las enzimas bacterianas. Una enzima hospedante particular fue CPB pancreáticahumana (véase, por ejemplo, el Ejemplo 15, CPB humana [D253K], y el 16, CPB humana [D253R], allí) y susprofármacos (véanse los Ejemplos 18 y 19, allí). La enzima hospedante está mutada para dar un cambio en el modo deinteracción entre la enzima y el profármaco en términos de reconocimiento del sustrato, en comparación con la enzima

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hospedante natural. En la Solicitud de Patente Internacional nº PCT/GB96/01975 (publicada el 6 de marzo de 1997como WO 97/07796) se describe un trabajo adicional sobre combinaciones de enzima de CPB mutante/profármaco,para el sistema ADEPT. Las enzimas adecuadas preferidas para ADEPT son una cualquiera de CPG2, o una enzimade CPB de polaridad invertida, por ejemplo una cualquiera de [D253K]HCPB, [G251T, D253K]HCPB o [A248S,G251T, D253K]HCPB.

Los conjugados del anticuerpo 806.077 también tienen aplicación en inmunoterapia de tumores. En consecuencia,en otra realización preferida, el resto efector conjugado es una molécula coestimuladora, preferiblemente la moléculacoestimuladora es B7, más preferiblemente B7.1 o B7.2 humana, y especialmente B7.1 humana. Preferiblemente, elconjugado está en forma de una proteína de fusión, preferiblemente en el que la proteína de fusión se forma a travésde la ligación a un término C de la molécula coestimuladora a una cadena de anticuerpo 806.077 de término N, pre-feriblemente vía la cadena pesada de la cadena del anticuerpo, preferiblemente en el que el anticuerpo 806.077 carecede una región de anticuerpo Fc, más preferiblemente un fragmento de anticuerpo F(ab’)2, más preferiblemente, el an-ticuerpo está humanizado o es de ser humano. En el Ejemplo 104, más abajo, se describe un conjugado especialmentepreferido.

Se predice que el uso de anticuerpo para seleccionar como diana una molécula coestimuladora contra células tu-morales confiere la función de presentar antígenos a las células tumorales, de forma que las células T reciben unaestimulación de TCR específica a partir de la propia célula tumoral y una señal coestimuladora a partir de la moléculaseleccionada como diana por el anticuerpo. El uso de anticuerpos humanos o humanizados se prefiere para el trata-miento de tumores humanos, debido a que los anticuerpos murinos pueden provocar una reacción inmunitaria cuandose usan en el hombre, lo que puede dar como resultado una reducción de la eficacia en la terapia repetida. El uso deuna proteína de fusión que combina una región que se une a un antígeno tumoral enlazada a la porción extracelular deuna molécula coestimuladora es nuevo. Hayden et al. (Tissue Antigens, 1996, 48, 242-254) ha dado a conocer el usode una molécula de anticuerpo biespecífica que combina un dominio de unión a antígeno antitumoral con un dominiode unión anti-CD28. Mientras que esta molécula es capaz de interactuar con CD28 en células T, la señal que puedesuministrar tiene la desventaja de ser cualitativamente diferente de la proporcionada por los ligandos CD28 naturales,por ejemplo la afinidad de unión es mayor que aquella entre B7.1 y CD28. La homología de especies cruzadas entreB7.1, B7.2 y CD28, CTLA-4 indica una conservación evolutiva de las secuencias de la región de unión. En consecuen-cia, se cree que, por ejemplo, B7.1 del hombre puede interactuar con CD28 de ratón, y puede proporcionar una señalcoestimuladora similar. Para el tratamiento de enfermedad humana, es preferible una proteína humana o humanizada.Sin embargo, el uso de una proteína humana o humanizada en modelos de animales podría producir efectos similares alo anticipado en el hombre, y tales modelos de animales podrían proporcionar datos importantes en cuanto a la eficaciade una proteína de fusión de anticuerpo humano/humanizado-B7.1/B7.2 humano en el tratamiento de la enfermedadhumana.

La conjugación del resto efector y el anticuerpo se puede realizar mediante cualquier método adecuado, tal como,por ejemplo, enlace químico vía ligadores heterobifuncionales, o mediante técnicas de fusión génica recombinante.En general, las proteínas de fusión son los conjugados preferidos, particularmente para conjugados con HCPB o B7.

Los conjugados preferidos son aquellos en los que el resto efector se selecciona de uno cualquiera de los siguientes:

a) una enzima adecuada para uso en un sistema ADEPT;

b) CPG2;

c) [G251T,D253K]HCPB;

d) [A248S,G251T,D253K]HCPB;

e) una molécula coestimuladora;

f) dominio extracelular de B7;

g) dominio extracelular de B7.1 humano; y

h) dominio extracelular de B7.2 humano;

opcionalmente en forma de una proteína de fusión.

Se apreciará que el conjugado de la presente invención no consiste necesariamente en una molécula efectora y enuna molécula de anticuerpo. Por ejemplo, el conjugado puede comprender más de una molécula efectora por moléculade anticuerpo. En general, los conjugados de anticuerpos F(ab’)2, que son fusiones entre el anticuerpo y una enzima oun dominio extracelular de B7, tendrán 2 moles de enzima o B7 por mol de anticuerpo.

Los conjugados específicamente preferidos son una proteína de fusión seleccionada de una cualquiera de los si-guientes conjugados (enumerándose las secuencias en la dirección desde el término N hasta el término C):

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a) una fusión de F(ab’)2 de 806.077 humanizado-{[A248S, G251T, D253K]HCPB}2, que comprende:

una cadena de Fd’ de anticuerpo, de estructura VH1 (SEQ ID NO: 55)/región constante de CH1 deIgG3/región de bisagra de IgG3;

fusionándose la cadena de Fd’ vía su término C al término N de [A248S, G251T, D253K]HCPB; y

una cadena ligera de anticuerpo de fórmula VK4 (SEQ ID NO: 71)/región de CL de cadena ligerakappa;

b) fusión de {[A248S, G251T, D253K]HCPB}2-F(ab’)2 de 806.077 humanizado, que comprende: [A248S,G251T, D253K]HCPB;

fusionándose la HCPB en su término C, vía un ligador (GGGS)3, al término N de una cadena de Fd’ deanticuerpo de estructura VH1 (SEQ ID NO: 55)/región constante de CH1 de IgG3/región de bisagra deIgG3; y

una cadena ligera de anticuerpo de fórmula VK4 (SEQ ID NO: 71)/región de CL de cadena ligera kappa; y

c) una fusión de (dominio extracelular de B7.1 humano)2-F(ab’)2 de 806.077 humanizado, que comprende:

dominio extracelular de B7.1 humano;

fusionándose B7.1 en su término C al término N de una cadena de Fd’ de anticuerpo de estructuraVH1 (SEQ ID NO: 55)/región constante de CH1 de IgG3/región bisagra de IgG3; y

una cadena ligera de anticuerpo de estructura VK4 (SEQ ID NO: 71)/región de CL de cadena ligerakappa.

En esta memoria descriptiva, la región de bisagra del anticuerpo, en relación con los conjugados, se define segúnlos principios expuestos por Padlan (1994) en Molecular Immunology 31, 169-217; en particular, véase la Tabla 2 allí.En estos conjugados especialmente preferidos, había 2 moles de enzima o B7.1 por mol de F(ab’)2. La barra inclinadahacia delante (“/”) es simplemente un separador para indicar elementos estructurales discretos unidos mediante enlacespeptídicos, que constituyen las partes del conjugado.

Las secuencias humanizadas de la región variable VH1 y/o VK4 tienen la ventaja de conservar buenas propiedadesde unión, requiriéndose cambios adicionales mínimos en el armazón humano. La región de bisagra de IgG3 tiene laventaja de proporcionar buenos niveles de producción de F(ab’)2, y una homogeneidad de producto.

En otra realización preferida que se refiere a los conjugados especialmente preferidos definidos anteriormente, lafusión se efectúa a través de la cadena ligera del anticuerpo. En aún otra realización preferida que se refiere a losconjugados especialmente preferidos definidos anteriormente, el elemento estructural de la región constante de CH1de IgG3/región bisagra de IgG3 se puede sustituir por el elemento de IgG2 correspondiente.

Cuando la molécula efectora es una toxina, este resto de toxina generalmente comprende un componente que poseepropiedades citotóxicas, y por tanto es capaz de exterminar células tras su internamiento.

El resto de toxina y el anticuerpo anti-CEA se pueden acoplar directamente entre sí, o se pueden acoplar indirec-tamente. El resto de toxina y el anticuerpo anti-CEA en general se acoplan de forma que la geometría del conjugadopermita que el anticuerpo anti-CEA se una a su célula diana. Ventajosamente, el resto de toxina y el anticuerpo anti-CEA se acoplan de forma que el conjugado sea extracelularmente estable, e intracelularmente estable, de forma queel resto de toxina y el anticuerpo anti-CEA permanezcan acoplados fuera de la célula diana, pero, tras la introducciónen la célula, se libere el resto de toxina. De este modo, ventajosamente, el conjugado tiene un sitio intracelularmenteescindible/extracelularmente estable.

Los ejemplos de conjugados en los que el resto de toxina se acopla directamente al resto de unión a la céluladiana incluyen aquellos en los que el resto de toxina y el anticuerpo anti-CEA están acoplados mediante un puentede disulfuro formado entre un grupo tiol en el resto de toxina y un grupo tiol en el anticuerpo anti-CEA. Los detallesde la preparación y propiedades de inmunotoxinas y otros conjugados se dan en la Solicitud de Patente Europea EP528.527 (nº de publicación), cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia polinucleotídica capaz de codificarun polipéptido de un anticuerpo o un conjugado como se define en cualquier reivindicación anterior. La expresión“capaz de codificar” pretende englobar secuencias polinucleotídicas teniendo en cuenta la degeneración, en el códigogenético, por cuanto algunos aminoácidos son codificados por más de un codón.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector que comprende un polinucleótido según sedefine anteriormente.

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Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedante transformada con una secuenciapolinucleotídica como se define anteriormente, o un animal no humano transgénico o una planta transgénica desarro-llados a partir de la célula hospedante.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende unconjugado de la invención descrito aquí, en asociación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable,opcionalmente en una forma adecuada para la administración intravenosa.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un conjugado como se describe aquí, para uso comoun medicamento.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un conjugado como se describe aquí, para lapreparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica.

Se apreciará que la dosis y el régimen de dosificación dependerán del resto efector particular empleado, de lapoblación de la célula diana, y de los antecedentes del paciente. La dosis del conjugado administrada estará típicamenteen el intervalo de 0,1 a 1 mg/kg de peso del paciente.

Los conjugados de la presente invención normalmente se administrarán en forma de una composición farmacéutica.De este modo, según la presente invención, también se proporciona una composición farmacéutica que comprendeun conjugado (como se define aquí) en asociación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En elEjemplo 10 se da aquí un ejemplo de tal formulación.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular en una variedad de formas de dosifi-cación. Generalmente, los conjugados de la presente invención se administrarán parenteralmente, de forma preferibleintravenosamente. Una composición farmacéutica parenteral particular es aquella que se formula en una forma dedosificación unitaria que es adecuada para la administración mediante inyección. De este modo, las composicionesparticularmente adecuadas comprenden una disolución, emulsión o suspensión de la inmunotoxina, en asociación conun vehículo o diluyente parenteral farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o diluyentes adecuados incluyen ve-hículos acuosos, por ejemplo agua o disolución salina, y vehículos no acuosos, por ejemplo aceites fijos o liposomas.Las composiciones pueden incluir agentes que potencien la estabilidad del conjugado en la composición. Por ejemplo,la composición puede incluir un tampón. La concentración del conjugado variará, pero, en general, el conjugado seformulará a concentraciones de alrededor de 1 hasta 10 mg/ml.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector de expresión que codifica un anticuerpo anti-CEA de la invención, como se define aquí.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector de expresión que codifica al menos la regiónvariable de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CEA, como se define aquí.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedante transformada con un vectorcomo se describe aquí, que es compatible con la expresión en aquella.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedante transformada con una secuenciapolinucleotídica como se define aquí.

Como hospedante, se han usado células de mamíferos (CHO, COS, mieloma) para la coexpresión de los ADNc decadenas H y L del anticuerpo, y sus fragmentos, para producir un anticuerpo con la actividad de unión especificada(Bebbington, C., 1991, Methods, vol. 2, p. 136-145, y Adair, J., 1992, Immunological Reviews, vol. 130). Para laexpresión de constructos que conduzcan a la expresión directa de CPB activa, se prefieren los sistemas de expresiónde células COS o CHO. Los ADNc se pueden introducir en plásmidos, y se puede dejar que se integren en el ADNcromosómico, especialmente para células CHO, o se puede dejar que se repliquen hasta un número de copias muyalto, especialmente en células COS. Los plásmidos generalmente requieren un marcador seleccionable para el mante-nimiento en hospedantes transfectados, un promotor eucariota eficaz, para permitir un nivel elevado de transcripción apartir de los ADNc, sitios de enzima de restricción convenientes para la clonación y poliadenilación, y señales de ter-minación de la transcripción, para la estabilidad del mensaje. Varios de tales vectores se han descrito en la bibliografía(Bebbington, C. et al, 1992, Bio/Technology, vol. 10, p. 169-175, y Wright, A., 1991, Methods, vol. 2, p. 125-135), yson vectores comercialmente disponibles (tales como pRc/CMV, Invitrogen Corp.), los cuales son adecuados.

La expresión de un abanico de fragmentos de anticuerpos en E. coli está bien documentada (repasado por Pluckt-hun, A., Immunological Reviews, 1992, vol. 130, p. 151-188 y Skerra, A., Current Opinion in Immunology, 1993, vol.5, p. 256-262). La expresión intracelular de las cadenas Fd y L ya se ha descrito (Cabilly, S., 1989, Gene, vol. 85, p.553-557), pero esto puede requerir el replegamiento in vitro y la reasociación de las cadenas (Buchner, J. y Rudolph,R., 1991, Bio/Technology, vol. 9, p. 157-162) para producir la actividad de unión. Una vía más eficaz para obtenerfragmentos de anticuerpos activos es a través de la secreción periplásmica (Better, M. et al, 1988, Science, vol. 240,p. 1041-1043). Los componentes de la cadena H y L del fragmento de anticuerpo se coexpresan a partir de un únicoplásmido. Cada cadena de anticuerpo se proporciona con un péptido líder bacteriano que la dirige al periplasma de E.coli, en el que el líder se separa por escisión y las cadenas libres se asocian para producir fragmentos de anticuerpos

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solubles y activos. Se cree que este proceso imita el proceso natural en células eucariotas, en las que las cadenas deanticuerpos expresadas pasan hacia la luz del retículo endoplásmico antes de la asociación en anticuerpos completos.Este proceso a menudo da como resultado la presencia de la actividad de unión en el sobrenadante del cultivo.

Algunos sistemas de expresión implican la transformación de una célula hospedante con un vector; tales sistemasson bien conocidos, tales como, por ejemplo, en hospedantes de E. coli, de levadura y de mamíferos (véase Methodsin Enzymology 185, Academic Press 1990). También se contemplan otros sistemas de expresión, tales como, porejemplo, mamíferos no humanos transgénicos, en los que el gen de interés, preferiblemente cortado de un vector ypreferiblemente en asociación con un promotor mamario para dirigir la proteína expresada en la leche del animal, seintroduce en el pronúcleo de un cigoto mamífero (habitualmente mediante microinyección en uno de los dos núcleos(habitualmente el núcleo macho) en el pronúcleo), y después se implanta en una madre adoptiva. Una producción delos animales producidos mediante la madre adoptiva portará y expresará el gen introducido que se ha integrado enun cromosoma. Habitualmente, el gen integrado se pasa a los descendientes mediante la cría convencional, permi-tiendo de este modo la fácil expansión del lote. Preferiblemente, la proteína de interés se cosecha simplemente dela leche de animales transgénicos hembra. Se aconseja al lector las siguientes publicaciones: Simons et al. (1988),Bio/Technology 6:179-183; Wright et al. (1991) Bio/Technology 9:830-834; US 4.873.191 y US 5.322.775. La mani-pulación de embriones de ratón se describe en Hogan et al, “Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory 1986.

También se contempla la tecnología de plantas transgénicas, tal como, por ejemplo, se describe, por ejemplo, enlas siguientes publicaciones: Swain W.F. (1991) TIBTECH 9:107-109; Ma J.K.C. et al (1994) Eur. J. Immunology24:131-138; Hiatt A. et al (1992) FEBS Letters 307:71-75; Hein M.B. et al (1991) Biotechnology Progress 7:455-461; Duering K. (1990) Plant Molecular Biology 15:281-294.

Si se desea, los genes hospedantes se pueden inactivar o modificar usando procedimientos estándares como seresume brevemente más abajo, y como se describe por ejemplo en “Gene Targeting; A Practical Approach”, IRL Press1993. El gen diana, o una porción del mismo, se clona preferiblemente en un vector con un marcador de selección (talcomo Neo) insertado en el gen para interrumpir su función. El vector se linealiza, después se transforma (habitualmentemediante electroporación) en células madre embriónicas (ES) (por ejemplo, derivadas de una cepa 129/Ola de ratón),y después tienen lugar sucesos de recombinación homóloga en proporción a las células madre. Las células madre quecontienen la interrupción génica se expanden y se inyectan en un blastocito (tal como, por ejemplo, de un C57BL/6Jde ratón), y se implantan en una madre adoptiva para su desarrollo. La descendencia quimérica se puede identificarmediante marcadores coloreados de revestimiento. Las quimeras se crían para averiguar la contribución de las célulasES a la estirpe germinal, apareándolas con ratones con marcadores genéticos que permiten que se realice una distinciónentre gametos derivados de ES y los derivados de blastocitos del hospedante. La mitad de los gametos derivados decélulas ES portarán la modificación génica. La descendencia se identifica sistemáticamente (por ejemplo, mediantetransferencia Southern) para identificar aquella con una interrupción génica (alrededor de 50% de la progenie). Estadescendencia seleccionada será heterocigótica y, por lo tanto, se puede crear con otra descendencia heterocigótica yhomocigótica seleccionada después (alrededor de 25% de progenie). Los animales transgénicos a los que les falta ungen se pueden cruzar con animales transgénicos producidos mediante técnicas conocidas, tales como la microinyecciónde ADN en los pronúcleos, la fusión de esferoplastos (Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258), o la transfecciónmediada por lípidos (Lamb et al. (1993) Nature Genetics 5 22-29) de células ES para producir animales transgénicoscon una falta de un gen endógena y una sustitución génica foránea.

Las células ES que contienen la intervención génica seleccionada se pueden modificar adicionalmente transfor-mándolas con la secuencia génica diana que contiene una alteración específica, que se clona preferiblemente en unvector y se linealiza antes de la transformación. Tras la recombinación homóloga, el gen alterado se introduce en elgenoma. Estas células madre embriónicas se pueden usar subsiguientemente para crear transgénicos como se describeanteriormente.

La expresión “célula hospedante” incluye cualquier célula procariota o eucariota adecuada para tecnología de ex-presión, tal como, por ejemplo, bacterias, levaduras, células vegetales y cigotos mamíferos no humanos, oocitos, blas-tocitos, células madre embriónicas y cualesquiera otras células adecuadas para tecnología transgénica. Si el contextoasí lo permite, la expresión “célula hospedante” también incluye una planta transgénica o un mamífero no humano de-sarrollado a partir de cigotos mamíferos no humanos transformados, oocitos, blastocitos, células madre embriónicas,células vegetales o cualesquiera otras células adecuadas para tecnología transgénica.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de un ser humano o animalque necesite de tal tratamiento, que comprende administrar a un ser humano o a un animal una cantidad farmacéutica-mente eficaz de un conjugado como se describe aquí.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para seleccionar como diana un restoefector contra células que presentan el antígeno CEA en un mamífero que necesite tal selección, que comprende laadministración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de la invención como se define aquí.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un anticuerpo como se describe aquí en unmétodo de diagnóstico.

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Un método de diagnóstico es inmunoensayo. Se puede diseñar un inmunoensayo para el ensayo in vitro basadoen el nuevo anticuerpo según la invención, según técnicas inmunológicas convencionales en la técnica, utilizando elanticuerpo según la invención en una forma marcada o no marcada, y determinando la formación del complejo delanticuerpo con CEA en la muestra a ensayar. En un caso, el anticuerpo se puede marcar con un marcador detectable,tal como un radiomarcador, una sustancia quimioluminiscente, una sustancia fluorescente o un marcador enzimático.Como alternativa, el anticuerpo se detecta vía un complejo formado con una sustancia marcada, o mediante técnicassin marcaje, tales como métodos con biosensores, por ejemplo basados en resonancia plasmónica de superficie. Lamuestra puede estar, por ejemplo, en forma de un fluido corporal, tal como suero, o como una preparación tisular(ensayo histoquímico).

Para fines de diagnóstico in vivo, el anticuerpo según la invención se proporciona con un marcador adecuadoexternamente detectable, tal como, por ejemplo, un radiomarcador o un átomo de metal pesado, y se administra a unsujeto, con lo que se determina la posible acumulación localizada del anticuerpo en el organismo.

Para el diagnóstico in vitro de cáncer, el anticuerpo anti-CEA se puede conjugar con enzimas tales como pero-xidasa de rábano picante y luciferasa bacteriana, que puede generar una señal que se puede medir, o se conjuga amarcadores fluorescentes o radioisótopos, que se pueden detectar y cuantificar directamente. En un sistema de inmu-noensayo estándar, tales conjugados proporcionan un medio para medir la presencia o ausencia de CEA en tejidos delcuerpo, y en consecuencia proporciona un ensayo rápido y conveniente para el diagnóstico de la enfermedad tumoral.Véanse descripciones generales de la metodología implicada en Enzyme Immunoassay, E.T. Maggio, CRC Press ylos documentos US 36908334, US 3791932, US 3817837, US 3850578, US 3853987, US 3867517, US 3901654, US3935074, US 3984533, US 3996345 y US 4098876.

Para el diagnóstico in vivo del cáncer, el anticuerpo anti-CEA se puede conjugar a isótopos de elementos talescomo itrio, tecnecio o indio, o a isótopos de metales pesados, que se pueden detectar mediante cámaras de formaciónde imágenes del cuerpo completo (véase Larson, S.M., 1987, Radiology, 165, 297-304).

Para la terapia del cáncer, las realizaciones preferidas implican un anticuerpo anti-CEA que se puede conjugara un resto efector que puede exterminar las células cancerígenas directa o especialmente vía la activación de unprofármaco adecuado en un sistema ADEPT. En un sistema ADEPT, el exterminio selectivo de las células tumoralesse logra conjugando el anticuerpo anti-CEA a una enzima que es capaz de catalizar la conversión de una dosis notóxica de un profármaco en un compuesto farmacéutico tóxico potente. La administración del conjugado conduce ala localización de la actividad enzimática en el sitio tumoral. La administración subsiguiente del profármaco conducea la producción local del fármaco tóxico y al exterminio selectivo en el sitio del tumor. Este enfoque se describeen los documentos WO 88/07378. US 4.975.278. US 5.405.990 y WO 89/10140. El anticuerpo 806.077 también sepuede usar conjugado con una molécula coestimuladora para inmunoterapia de tumor, como se describe anterior-mente.

El exterminio celular selectivo de células tumorales también se puede lograr mediante conjugación del anticuer-po anti-CEA directamente o mediante derivatización química con agentes quelantes macrocíclicos que contienenradioisótopos de energía elevada, tales como 90Y, 131I y 111In. El anticuerpo anti-CEA sirve para localizar el isóto-po para el tumor, y la radiación emitida por el isótopo destruye el ADN de las células circundantes y elimina eltumor.

El exterminio selectivo de células tumorales también se puede lograr mediante conjugación del anticuerpo an-ti-CEA a fármacos citotóxicos y citostáticos, tales como metotrexato, clorambucilo, adriamicina, daunorrubicina yvincristina. Estos fármacos se han usado en los hospitales durante muchos años, y la terapia que proporcionan estálimitada a menudo por toxicidad no específica. La conjugación de estos fármacos al anticuerpo anti-CEA permitelocalizar a estos fármacos en el sitio del tumor, aumentando así la dosis de fármaco que se puede suministrar al tumorsin incurrir en efectos secundarios inaceptables producidos por la acción de tales fármacos sobre otros tejidos, talescomo la médula ósea o el sistema nervioso.

En muchas aplicaciones, la eficacia del anticuerpo se mejora reduciendo el tamaño de la estructura de unión delanticuerpo, y mejorando de ese modo la penetración en el tejido y otras propiedades farmacodinámicas de la compo-sición farmacéutica. Esto se puede lograr eliminando la región Fc de la molécula del anticuerpo, enzimáticamente omediante métodos de ingeniería genética, para producir un fragmento Fab’ o F(ab’)2 recombinante.

También se pueden usar métodos de ingeniería genética para reducir adicionalmente el tamaño del anticuerpoanti-CEA. El Fv, que contiene las CDR, se puede manipular mediante ingeniería genética y se puede expresar enaislamiento, y se puede reticular químicamente, por ejemplo mediante el uso de enlaces de disulfuro. Como alternativa,tanto los dominios de cadena ligera como de cadena pesada, que forman la estructura de Fv, se pueden producir comouna única cadena polipeptídica (SCFv) fusionando los dominios de Fv con una secuencia peptídica ligadora procedentedel término C natural de un dominio al término N del otro dominio (véanse los documentos PCT/US/87/02208 y US4704692). Como alternativa, un único dominio de Fv se puede expresar aisladamente formando un anticuerpo dedominio sencillo o dAb, como se describe por Ward et al Nature (1989) 341, 544. Otro tipo de anticuerpo anti-CEA contemplado es un constructo V-min, como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO 94/12625(inventores: Slater y Timms). Las abreviaturas usadas aquí incluyen:

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ADEPT terapia de profármaco y enzima dirigida por anticuerpo

APC célula que presenta antígeno

CDR regiones que determinan la complementariedad

CEA antígeno carcinomaembriónico

CL dominio constante de la cadena ligera del anticuerpo

CPB carboxipeptidasa B

CPG2 carboxipeptidasa G2

DAB sustrato de tetrahidrocloruro de 3,3’-diaminobencidina

DEPC pirocarbonato de dietilo

DMEM medio Eagle modificado de Dulbecco

ECACC Colección Europea de Cultivos celulares animales

EIA inmunoensayo enzimático

ELISA ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima

FCS suero fetal de ternera

Fd cadena pesada de Fab, Fab’ o F(ab’)2 que contiene opcionalmente una bisagra

HAMA anticuerpo anti-ratón humano

HCPB carboxipeptidasa B humana, preferiblemente pancreática

bisagra (de una IgG) un péptido corto, rico en prolina, que contiene las cisteínas que unen mediante puentes las 2cadenas pesadas

HRPO peroxidasa de rábano picante

NCA antígeno de reacción cruzada sin especificidad

NCIMB Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marinas

PBS disolución salina tamponada con fosfato

PCR reacción en cadena de polimerasa

preproCPB proCPB con una secuencia líder N-terminal

proCPB CPB con su prodominio N-terminal

SDS-PAGE electroforesis en dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida

TBS disolución salina tamponada con Tris

VH región variable de la cadena pesada del anticuerpo

VK región variable de la cadena ligera del anticuerpo

La invención se ilustra mediante los siguientes Ejemplos no limitantes (apoyados por Ejemplos de Referencia quesiguen a los Ejemplos), en los que:

la Figura 1 muestra la actividad antitumoral del conjugado de anticuerpo 806.077 con CPG2 en un modelo ADEPT;

la Figura 2 muestra una cartografía plasmídica de pCF009;

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la Figura 3 muestra datos de BIAcore que muestran la proteína de fusión de anticuerpo-B7.1 que se une a CTLA4-Ig inmovilizado, en la que la línea continua representa la unión de ensayo, y la línea punteada es un control testigo; yexcepto que se establezca de otro modo:

el ADN se recuperó y purificó mediante el uso del kit GENECLEAN™ II (Stratech Scientific Ltd. o Bio 101Inc.). El kit contiene: 1) 6 M de yoduro de sodio; 2) una disolución concentrada de cloruro de sodio, Tris y ED-TA, para obtener un lavado de cloruro sódico/etanol/agua; 3) Glassmilk - un vial de 1,5 ml que contiene 1,25 mlde una suspensión de una matriz de sílice especialmente formulada, en agua. Esto es una técnica para la purifica-ción de ADN basándose en el método de Vogelstein y Gillespie, publicado en Proceedings of the National Academyof Sciences USA (1979) Vol. 76, p. 615. De forma resumida, el procedimiento del kit es el siguiente. A un volu-men de gel de sílice se le añaden 3 volúmenes de disolución de yoduro de sodio procedente del kit. La agarosase funde calentando la mezcla a 55ºC durante 10 min., después se añade Glassmilk (5-10 ml), se mezcla bien, yse deja reposar durante 10 min. a temperatura ambiente. La Glassmilk se hace girar y se lava 3 veces con NEWWASH (0,5 ml) del kit. El tampón de lavado se elimina de la Glassmilk, que se deja secar en aire. El ADN se elu-ye incubando la Glassmilk seca con agua (5-10 ml), a 55ºC durante 5-10 min. El sobrenadante acuoso que contieneel ADN eluido se recupera mediante centrifugación. La etapa de elución se puede repetir, y los sobrenadantes sereúnen;

las células DH5α de E. coli competentes se obtuvieron de Life Technologies Ltd. (células competentes DH5α deeficacia MAX);

se realizaron minipreparaciones de ADN plasmídico bicatenario usando el kit de preparación de ADN RPMTM deBio 101 Inc. (número de catálogo 2070-400), o un producto similar - el kit contiene disolución de lisis alcalina paraliberar el ADN plasmídico de las células bacterianas, y contiene Glassmilk en un filtro giratorio, para adsorber el ADNliberado que entonces se eluye con agua estéril o Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5;

el medio libre de suero es medio de suero reducido OPTIMEMTM I, número de catálogo 31985 de GibcoBRL;

el reactivo LIPOFECTINTM (número de catálogo 18292-011 de GibcoBRL) es una formulación liposómica 1:1(p/p) del lípido catiónico cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-n,n,n-trimetilamonio (DOTMA) y dioleoilfosfatidi-letanolamina (DOPE), en agua filtrada en membrana. Se une espontáneamente a ADN para formar un complejo delípido ADN - véase Felgner et al. en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84, 7431;

G418 (sulfato) es GENETICIN™, número de catálogo 11811 de GibcoBRL, un antibiótico aminoglicosídico rela-cionado con la gentamicina, usado como agente de selección en experimentos de genética molecular;

AMPLITAQTM, disponible de Perkin-Elmer Cetus, se usa como la fuente de ADN polimerasa termoestable; y

los procedimientos de biología molecular generales se pueden seguir a partir de cualquiera de los métodos descritosen “Molecular Cloning - A Laboratory Manual” Segunda Edición, Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring HarborLaboratory, 1989).

Ejemplo 1

Descubrimiento y creación de una estirpe celular de hibridoma 806.077

Se inmunizaron subcutáneamente ratones BALB/c, de 8 a 10 semanas, con una dosis primaria de CEA (10 µg) endisolución salina tamponada con fosfato (0,1 ml) y adyuvante completo de Freund (0,1 ml). Dos semanas más tarde,y nuevamente 2 semanas más tarde, los animales se revacunaron con dosis adicionales de CEA (10 µg) en disoluciónsalina tamponada con fosfato (0,1 ml) mezclada con adyuvante incompleto de Freund (0,1 ml). Treinta y dos semanasmás tarde, se administró a los animales una inmunización intravenosa final de CEA (10 µg) en disolución salinatamponada con fosfato, y se sacrificaron tres días después. Se retiraron los bazos, y se prepararon y fusionaron concélulas NS0 (disponibles de la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales, con el nº de acceso 85110503),mediante métodos estándares (Kohler y Milstein, Nature (1975) 256, 495). Las células resultantes se distribuyeron encápsulas de cultivo de 96 pocillos, y se incubaron durante 2 semanas. Los sobrenadantes de los hibridomas resultantesse identificaron sistemáticamente mediante EIA (inmunoensayo enzimático). De un total de 1.824 pocillos generadosa partir de 5 fusiones, 102 pocillos fueron positivos contra CEA natural. En la fusión 806, se encontró que diecisietepocillos eran positivos. Las células contenidas en estos pocillos se clonaron mediante dilución limitante, y los clonesresultantes se ensayaron mediante EIA. Se clonaron con éxito estirpes procedentes de 10/17 pocillos originales. Unaestirpe, denominada 806.077, se depositó en la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales con el nº de acceso96022936. La tabla a continuación proporciona un resumen del programa de generación de anticuerpos que condujoal descubrimiento del hibridoma del anticuerpo 806.077.

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Ejemplo 2

Preparación de anticuerpo 806.077 a partir de la estirpe celular de hibridoma depositada, nº 96022936 de ECACC

2.1 Preparación a partir de medio que contiene suero

Se retiró una ampolla de 1 ml, crioconservada, del almacenamiento en nitrógeno líquido, y se descongeló rápida-mente en un baño de agua a 37ºC. Los contenidos se transfirieron asépticamente a un tubo de centrífuga estéril, de 15ml. Las células se resuspendieron mediante adición gota a gota de 10 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco(DMEM) que contiene 10% (v/v) de suero fetal de ternera (FCS), junto con un mezclamiento suave. La suspensión secentrifugó a 50 x g durante 10 min., el sobrenadante se eliminó asépticamente, y el pelete se resuspendió en 5 ml deDMEM, 10% de FCS y 1% de L-glutamina en un matraz de cultivo de tejidos de 25 ml, pregasificado con 95% de airey 5% de dióxido de carbono. El matraz se incubó a 36,5ºC en la oscuridad.

Después de 3 días, el matraz se subcultivó haciendo pasar los contenidos de todo el matraz a un matraz más grande,de 75 ml, diluyendo con DMEM, 10% de FCS y 1% de L-glutamina (densidad viable final = 2-3 x 105 células/ml). Laexpansión posterior a matraces de 162 ml se realizó de manera similar.

Los sobrenadantes de cultivo para purificación se prepararon en cultivos giratorios de 500 ml, en botellas giratoriasde 850 ml. Los cultivos se sembraron a 2 x 105 células viables/ml en botellas giratorias pregasificadas, que se hicierongirar a 3 rpm y se incubaron a 36,5ºC. Los cultivos se hicieron crecer hasta madurez, y se cosecharon típicamente 500-800 horas después de la inoculación, cuando la viabilidad celular estuvo por debajo de 10% y la concentración de IgGhubo alcanzado un máximo.

2.2 Tratamiento de las cosechas de cultivo

Tras la cosecha, los sobrenadantes del cultivo de las botellas giratorias se aclararon mediante centrifugación a60 x g durante 30 minutos. Se añadió azida sódica (0,02% p/v) como conservante, al sobrenadante aclarado, que sealmacenó a 4ºC en la oscuridad hasta la purificación.

2.3 Purificación de anticuerpo 806.077

El sobrenadante (31) de hibridoma de anticuerpo 806.077 se ajustó hasta pH 7,5 con hidróxido sódico acuosodiluido, y se filtró a través de un filtro de 0,45 µm (Millipore MILLIDISKTM). El anticuerpo del sobrenadante filtradose cargó en una columna de afinidad de Proteína G (por ejemplo, Proteína G de flujo rápido SEPHAROSETM, código

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de producto 17.0618.03 de Pharmacia; 5 cm i.d x 6,5 cm = 130 ml), equilibrada en disolución salina tamponadacon fosfato (“PBS”; 8 mM de Na2HPO4, 1,5 mM de KH2PO4, 150 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, pH 7,3, porejemplo según está disponible en forma de comprimidos para la reconstitución, de Oxoid) a 4ºC y a un caudal de4 ml/min. La columna se lavó con PBS (260 ml) al mismo caudal, y el anticuerpo se eluyó con citrato sódico 100mM, pH 2,6, recogiendo las fracciones y monitorizando el eluato mediante absorción con luz UV (280 nm). Lasfracciones que absorben la luz UV que contienen el anticuerpo se reunieron, se ajustaron inmediatamente hasta pH7, y se concentraron hasta alrededor de 2 mg/ml mediante ultrafiltración usando una membrana de corte de 30 kDa(por ejemplo, Amicon YM30). La diálisis, usando una membrana de corte de porosidad de 6-8 kDa (por ejemplo,SPECTRAPOR™ 1), en 50 mM de tampón Tris-HCl pH 7,0, produjo 110 mg de anticuerpo 806.077, con una purezade >95% mediante SDS-PAGE.

Ejemplo 3

Selectividad de anticuerpo 806.077

Para evaluar la selectividad, se han identificado muchos tejidos normales y tumorales humanos para determinarla reactividad con el anticuerpo 806.077, usando inmunohistología indirecta de tres etapas sensible, sobre seccionescongeladas mediante criostato, fijadas en acetona.

La inmunohistología se llevó a cabo sobre secciones de tejido humano obtenidas tras cirugía de resección, opost mortem. Para conservar la morfología y antigenicidad óptimas, los tejidos se obtuvieron lo más fresco posible,se cortaron en pequeños trozos (alrededor de 0,5 cm3), y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido antes delalmacenamiento a -80ºC. Se cortaron secciones de tejido (6 µ) en un criostato, se montaron en portaobjetos revestidoscon polilisina (por ejemplo, portaobjetos TECHMATETM azules, Dako) y se fijaron en acetona enfriada en hielo,durante 2 minutos antes de envolverlos en papel de aluminio y almacenarlos a -80ºC.

Los portaobjetos se dejaron descongelar a temperatura ambiente antes de desenvolverlos del papel de aluminioinmediatamente antes del uso. Cada sección se perfiló con un marcador de diamante, y se añadió a cada sección 100µl de anticuerpo 806.077 diluido hasta 2 µg/ml en disolución salina tamponada con Tris (TBS), o 100 µl de control detipo reactivo CEA/NCA (anticuerpo A5B7) a 2 µg/ml en TBS, o 100 µl de un control que consiste en el isotipo MOPC(Sigma Chemical Company, St. Louis, U.S.A., número de catálogo M 9269) a 2 µg/ml en TBS, o un control positivopertinente, tal como LP34 (Dako). Todas las incubaciones subsiguientes se llevaron a cabo a temperatura ambientedurante 30 minutos en una cámara humidificada: todas las etapas de lavado se realizaron en TBS, con 2 cambios. Trasla incubación, los portaobjetos se lavaron y se añadió a cada sección 100 µl de un segundo reactivo de anticuerpo, quecomprende 1/50 de inmunoglobulinas anti-ratón de conejo conjugadas con peroxidasa de rábano picante (Dako Patts)y 1/5 de suero humano normal (Sigma), en TBS.

Los portaobjetos se incubaron nuevamente y se lavaron en TBS. Se añadió a cada sección un anticuerpo de detec-ción final, 100 µl de inmunoglobulina anti-conejo de cerdo conjugada con peroxidasa de rábano picante (dilución 1/50con 1/5 de suero humano normal, en TBS), se incubó y se lavó a conciencia. Se preparó sustrato de DAB (tetrahidro-cloruro de 3,3’-diaminobencidina) usando 1 comprimido de DAB (Sigma) con peróxido de hidrógeno (17 µl) en TBS(17 ml), y se añadió gota a gota a través de un papel de filtro rápido (por ejemplo, Whatman número 4). Después de 3minutos de incubación, el exceso de DAB se eliminó de los portaobjetos mediante golpecitos, y los portaobjetos se la-varon en TBS. Después de teñir mediante contador con hematoxilina (por ejemplo, hematoxilina de Mayer, Shandon),las secciones se deshidrataron en alcohol y xileno, y se montaron en un montante sintético no acuoso (por ejemplo, unmontante E-Z, Shandon) antes de su examen en un microscopio.

Las áreas de unión del anticuerpo se visualizaron mediante tinción de color pardo en la sección. Se usó un sistemade puntuación para evaluar el grado de unión del anticuerpo 806.077 a los tejidos:

+ + + (fuerte) = unión del anticuerpo a >75% de células tumorales

++ (moderado) = unión del anticuerpo a 50%-75% de células tumorales

+ (débil) = unión del anticuerpo a 25%-50% de células tumorales

+/- (mínimo) = unión del anticuerpo no focal a un área pequeña de células tumorales

- = sin tinción

El antígeno carcinoembriónico (CEA) es un miembro de la superfamilia génica de inmunoglobulinas con unaregión de dominio de tipo variable predicha (dominio N; 108 aminoácidos) y tres conjuntos de regiones de tipodominio constante, A1B1, A2B2 y A3B3; 92 aminoácidos para los dominios A, y 86 aminoácidos para los dominiosB (Hefta, 1992, Cancer Research 52:5647-5655). Además, el CEA posee dos péptidos señal, uno en el término aminoy uno en el término carboxilo. Ambos se eliminan durante el procesamiento post-traduccional, sustituyéndose el deltérmino carboxi por un resto de glicosilfosfatidilinositol (GPI).

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Se ha dado a conocer un gran número de proteínas relacionadas con CEA, con homología variable con respectoa CEA (Thompson, 1991, J. of Clinical Laboratory Analysis, 5:344-366). Éstas incluyen los antígenos de reaccióncruzada no específicos, NCA 1 y 2. Estas proteínas relacionadas se expresan en un abanico de tejidos normales,incluyendo granulocitos y epitelio pulmonar normal. La mayoría de los anticuerpos monoclonales anti-CEA generadoshasta ahora reaccionan de forma cruzada con una de estas proteínas relacionadas, y de este modo reaccionan con unabanico de tejidos normales, y a menudo reaccionan fuertemente con granulocitos o con el epitelio pulmonar.

El anticuerpo anti-CEA, 806.077, se identificó como selectivo de CEA, no mostrando reactividad cruzada frente agranulocitos, y sólo una mínima tinción frente a tejidos pulmonares normales 4/14 ensayados.

El anticuerpo 806.077 se identificó inicialmente en busca de la selectividad por el tumor y NCA como un sobrena-dante de 5 cultivos tisulares. Las identificaciones se llevaron a cabo usando el sobrenadante puro, y se diluyó a 1:10y demostraron una unión equivalente del anticuerpo a tumores de colon cuando se comparan con A5B7, pero demos-traron una unión mucho más reducida a tejidos pulmonares y de bazo normales cuando se comparan con el mismoanticuerpo. El anticuerpo se purificó mediante afinidad (como se describe en el Ejemplo 2), y las identificaciones serepitieron y se extendieron para incluir otros tipos de tumores y tejidos.

El anticuerpo se tituló frente a un panel de secciones de tumores colorrectales, y esta identificación demostró quela concentración de identificación sistemática óptima del anticuerpo 806.077 era 2 µg/ml. Todas las identificacionessistemáticas subsiguientes se llevaron a cabo usando el anticuerpo a esta concentración. Los resultados de estas identi-ficaciones fueron los siguientes. Se comparó la reactividad del anticuerpo 806.077 frente a A5B7 (también identificadoa 2 µg/ml) frente a los siguientes tejidos tumorales/normales:

Reactividad tumoral del anticuerpo 806.077:

Tumores de colon (n = 17)

Se observó reactividad moderada a fuerte (++/+++ equivalente a A5B7) en los 17 tumores ensayados.

Tumores de mama (n = 6)

Tinción moderada/débil (+/++), 2/6 tumores; tinción mínima (+/-), 2/6 tumores.

Tumores NSCLC (n = 6)

Tinción fuerte (+++), 2/6 tumores; tinción moderada (++), 1/6; y tinción débil (+), 2/6 tumores.

Tumores gástricos (n = 2)

Tinción fuerte (+++), 1/2 tumores; tinción débil (+), 1/2 tumores.

Tumores ováricos (n = 3) y tumores de próstata (n = 3)

No se observó tinción en ninguno de estos tumores.

En todos los casos, se observó una reactividad equivalente con A5B7.

Reactividad de tejido normal:

Pulmón (reactividad de NCA) (n = 14)

Tinción débil (+), 4/14 tejidos pulmonares; sin tinción (-), 10/14 tejidos.

A5B7 se unió moderadamente (++), 1/14 tejidos pulmonares; débilmente (+), 10/14 tejidos; y mínimamente (+/-),1/14 tejidos.

Bazo (reactividad de granulocitos/NCA) (n = 6)

No se observó ninguna tinción en ninguno de los tejidos de bazo ensayados.

A5B7 se unió moderadamente (++), 1/6 tejidos; y débilmente (+), 5/6 tejidos.

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Tejidos normales post mortem (n = 13)

Sólo se observó reactividad moderada/débil (++/+) en tejidos del esófago, piel, colon y páncreas (tejidos normalesque expresan CEA). Se observó una unión similar con A5B7. Además de los tejidos positivos, colon, piel, esófago, ypáncreas, los tejidos negativos fueron: cerebelo, mesencéfalo, cerebro, músculo liso, hígado, riñón, aorta, estómago,corazón.

Ejemplo 4

Generación de fragmento F(ab’) de anticuerpo 806.077

Se suspendió ficina (10 mg) en una disolución de 50 mM de cisteína (3 ml; BDH 37218) y 50 mM de tris-HClpH 7,0, y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. El exceso de cisteína se eliminó mediante cromatografía de exclusiónde tamaños (columna SephadexTM G-25, 1,5 cm x 25 cm; Pharmacia) en 50 mM de tampón tris-HCl pH 7,0. Laconcentración de ficina reducida se determinó monitorizando la absorbancia de UV a A280 nm (suponiendo que unadisolución de 1 mg/ml tenga una lectura de absorbancia de 2 en una cubeta de 1 cm), y se encontró que era 1,65 mg/ml.

Una disolución de anticuerpo 806.077 (100 mg) en 50 mM de tampón de tris-HCl pH 7,0 (50 ml) y ficina recien-temente reducida (5 mg; 3 ml de la disolución anterior) se digirió a 37ºC durante 20 horas. El producto digerido sediluyó entonces con un volumen igual de PBS, y se cargó en una columna de afinidad de Proteína G (SEPHAROSETM

Fast Flow de Pharmacia, 5,0 cm i.d x 6,5 cm = 125 ml; equilibrada previamente con 50 mM de tampón tris-HCl pH7,0, a 4ºC), a un caudal constante de 3 ml/min. La columna se lavó con 50 mM de acetato de sodio pH 4,0 (250ml), para eliminar fragmentos de bajo peso molecular, seguido de 50 mM de citrato de sodio pH 2,8, para eluir elF(ab’)2, monitorizando la absorbancia de UV del eluato a A280 nm. El eluato que contiene F(ab’)2 se ajustó has-ta pH 7, y el tampón se intercambió a 100 mM de fosfato de sodio/100 mM de cloruro de sodio/1 mM de EDTA,pH 7,2, mediante diálisis, y se concentró hasta 8 mg/ml mediante filtración por membrana usando un corte de 10kDa (por ejemplo, AmiconTM YM10), suponiendo que una disolución de 1 mg/ml tiene una lectura de absorbanciaa 280 nm de 1,4 en una cubeta de 1 cm. Se obtuvo un rendimiento de 65% de 42 mg de F(ab’)2 con una purezade 95%.

Ejemplo 5

Preparación del conjugado de F(ab’)2 del anticuerpo 806.077 con carboxipeptidasa G2

El ligador para la derivatización de F(ab’)2 del anticuerpo 806.077 fue SATA (éster N-hidroxisuccinimídico delácido S-acetiltioglicólico, Sigma, código de producto A 9043). El ligador para la derivatización de la carboxipepti-dasa G2 (CPG2) fue SMPB [éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 4-(p-maleimidofenil)butírico, Sigma, código deproducto M6139].

5.1 Derivatización de F(ab’)2

A una disolución del fragmento F(ab’)2 (40 mg, preparado como se describe en el Ejemplo 4) en 100 mM defosfato/100 mM de NaCl/1 mM de EDTA, pH 7,2 (tampón A; 5 ml), se le añadió SATA (0,28 mg) en DMSO (28µl). Después de 40 minutos a temperatura ambiente, la disolución resultante se aplicó a una columna de desalación(SEPHADEXTM G-25, 1,5 cm i.d x 50 cm = 100 ml; equilibrada en tampón A a 4ºC), a un caudal de 1,2 ml/min.,para eliminar los reactivos en exceso. El eluato se monitorizó mediante absorción de UV a A280 nm. El fragmentoF(ab’)2 derivatizado con SATA se reunió y se mezcló con 10% v/v de 500 mM de hidroxilamina HCl/500 mM defosfato de sodio/30 mM de EDTA pH 8,0 durante 60 minutos a temperatura ambiente, para desacilar el fragmento F(ab’)2 derivatizado. La concentración de proteína se determinó mediante absorción de UV a 280 nm, suponiendo queuna disolución de 1 mg/ml tiene una lectura de absorbancia de 1,4 en una cubeta de 1 cm. La disolución se diluyóhasta alrededor de 1 mg/ml con tampón A. La carga del ligador se determinó mediante el ensayo de -SH de Ellman, yse encontró que era 1,8-2,0 ligadores/mol de F(ab’)2.

5.2 Derivatización de CPG2

La purificación a gran escala de CPG2 a partir de Pseudomonas RS-16 se describió en Sherwood et al. (1985),Eur. J. Biochem., 148, 447-453. La preparación de los anticuerpos F(ab’)2 e IgG acoplados a la enzima de CPGse puede efectuar por medios conocidos, y se ha descrito, por ejemplo, en el documento PCT WO 89/10140. LaCPG se puede obtener de Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP40JG, Reino Unido. La CPG2 también se puede obtener mediante técnicas recombinantes. La secuencia codificantenucleotídica para CPG2 se ha publicado por Minton, N.P. et al., Gene, (1984) 31, 31-38. La expresión de la secuenciacodificante se ha dado a conocer en E. coli (Chambers, S.P. et al., Appl. Microbiol, Biotechnol. (1988), 29, 572-578) yen Saccharomyces cerevisiae (Clarke, L. E. et al., J. Gen Microbiol, (1985) 131, 897-904). La síntesis génica total seha descrito por M. Edwards en Am. Biotech. Lab (1987), 5, 38-44. La expresión de proteínas heterólogas en E. coli seha repasado por F.A.O. Marston en DNA Cloning Vol. III, Practical Approach Series, IRL Press (Editor D M Glover),1987, 59-88. En Methods in Enzymology Volumen 194, Academic Press 1991, editado por C. Guthrie y G R Fink, seha repasado la expresión de proteínas en levadura.

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La enzima de CPG está disponible de la compañía Sigma Chemical Company, Fancy Road, Poole, Dorset, U.K.La enzima de CPG se describió en: Goldman, P. y Levy, C.C., PNAS USA, 58:1299-1306 (1967), y en: Levy, C.C. yGoldman P., J. Biol. Chem., 242:2933-2938 (1967). La enzima de carboxipeptidasa G3 se ha descrito en Yasuda, N. etal., Biosci. Biotech. Biochem., 56:1536-1540 (1992). La enzima de carboxipeptidasa G2 se ha descrito en la patenteeuropea 121352.

Se dializó CPG2 (50 mg; enzima recombinante a partir de E. coli) en 100 mM de fosfato de sodio/100 mM decloruro de sodio pH 7,2 (= tampón B), y se diluyó hasta 8 mg/ml, suponiendo que una disolución de 1 mg/ml tieneuna lectura de absorbancia a 280 nm de 0,6 en una cubeta de 1 cm.

Se disolvió SMPB (Sigma) en DMSO a 10 mg/ml. Se mezcló CPG2 (50 mg en tampón B, a 8 mg/ml) con ladisolución de SMPB (0,108 ml; 1,08 mg), y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 120 minutos.Los reactivos en exceso se eliminaron en una columna de desalación (Sephadex G-25, 1,5 cm i.d x 50 cm = 100ml; equilibrada en tampón B a 4ºC), a 1,2 ml/min. La CPG2 derivatizada se reunió, y se determinó la concentraciónmediante UV A280 nm, suponiendo que una disolución de 1 mg/ml tiene una lectura de absorbancia a 280 nm de 0,6en una cubeta de 1 cm. La disolución se diluyó hasta una concentración de CPG2 de alrededor de 1 mg/ml. La carga deligador se determinó mediante un ensayo de Ellman “inverso”, añadiendo una cantidad conocida de 2-mercaptoetanola la CPG2 derivatizada con maleimido, y ensayando el grupo -SH sin reaccionar. Se encontró una carga de ligador de2,0-2,4 ligadores/mol de CPG2.

5.3 Conjugación

Se mezclaron en nitrógeno pesos iguales del F(ab’)2 derivatizado desacetilado y de la CPG2 derivatizada, y lamezcla (alrededor de 80 ml, a una concentración de proteína total de alrededor de 1 mg/ml) se dejó a temperaturaambiente durante 20 h. La reacción se terminó mediante adición de 10% v/v de 100 mM de glicina acuosa. La mezclade conjugación bruta se intercambió de tampón mediante diálisis en un tampón con bajo contenido de sal (50 mM deacetato de sodio, pH 6,0), y se aplicó a una columna de afinidad de ligando colorante (en la que el colorante se une aCPG2, por ejemplo ACL Mimetic Green 1, 2,5 cm i.d x 10 cm = 50 ml) a 4ºC, equilibrada en el mismo tampón, paraeliminar el fragmento F(ab’)2 derivatizado sin reaccionar. El conjugado y la CPG2 derivatizada se eluyeron con 50mM de acetato/500 mM de NaCl pH 6,0, a un caudal de 2,0 ml/min., monitorizando la elución mediante UV (A280nm).

El conjugado bruto, que aún contiene CPG2 derivatizada, se concentró usando un dispositivo de ultrafiltración de10 kDa de corte (por ejemplo, Amicon YM10TM), hasta alrededor de 12 ml, a una concentración de proteína total de 5mg/ml, y se añadió 10% v/v de 10 mM de sulfato de cinc (Sigma Z 0251) en agua, para reponer el cinc perdido frentea la CPG2 en el proceso. Una cromatografía adicional mediante exclusión de tamaños (por ejemplo, SEPHACRYL S-300HR™ Pharmacia, 2,5 cm i.d x 25 cm = 500 ml) a 4ºC en 50 mM de acetato de sodio/150 mM de cloruro de sodiopH 6,0, a un caudal de 1 ml/min., recogiendo fracciones y monitorizando mediante UV A280 nm, dio como resultadoel fraccionamiento del conjugado y su separación de la CPG2 derivatizada sin reaccionar, según se determina medianteSDS-PAGE de las fracciones de la columna.

El pico que contiene el conjugado (con relación de F(ab’)2 CPG2 de 1:2, 1:1 y 2:1) se reunió y se concentrómediante ultrafiltración hasta 1,3 mg/ml, determinándose la concentración de proteína mediante la monitorización dela absorbancia de UV a A280 nm (suponiendo que 1 mg/ml tiene una absorbancia de 1,0). La pureza del conjugadose determinó mediante SDS-PAGE, y se encontró que contiene un total de 12 mg de conjugado, con la siguientecomposición: 65% de conjugado en una relación 1:1, 20% de conjugado en una relación 1:2 ó 2:1 con < 5% de F(ab’)2derivatizado libre y < 5% de CPG2 derivatizada libre.

Ejemplo 6

Actividad antitumoral del conjugado de F(ab)’2 del anticuerpo 806.077 con CPG2, en combinación con un profárma-co

La actividad antitumoral del conjugado de F(ab’)2 del anticuerpo 806.077 con CPG2, preparado como se describeen el Ejemplo 5, se evaluó en combinación con el profármaco ácido N(4-[N,N-bis(2-cloroetil)amino]-fenoxicarbonil)-L-glutámico (denominado “PGP” en este ejemplo, como se describe en el Ejemplo 1 en el documento US 5.405.990y en Blakey et al., Br. J. Cancer 72, 1083-88, 1995), en un modelo de xenoinjerto de tumor colorrectal humano.

Se inyectaron s.c. con 1 x 107 células de tumor colorrectal LoVo (nº 87060101 de ECACC) a grupos de 8-10ratones atímicos hembra. Cuando los tumores tuvieron 4-5 mm de diámetro, se inyectaron intravenosamente (i.v.)conjugado de F(ab’)2 de anticuerpo 806.077 con CPG2 (250 U de actividad enzimática de CPG2 kg−1) o disoluciónsalina tamponada con fosfato (170 mM de NaCl, 3,4 mM de KCl, 12 mM de Na2HPO4, 1,8 mM de KH2PO4, pH 7,2).Setenta y dos horas después, se inyectó i.p. el profármaco de PGP (3 dosis de 40 mg/kg, a intervalos de 1 h). Despuésse midió la longitud de los tumores en las dos direcciones, tres veces por semana, y se calculó el volumen del tumorusando la fórmula:

volumen = π/6 x D2 x d

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en la que D es el diámetro más grande, y d es el diámetro más pequeño del tumor. El volumen del tumor se expresócon relación al volumen del tumor en el momento del inicio del grupo de la terapia que corresponde al profármaco.La actividad antitumoral se comparó con grupos testigo a los que se les administró PBS en lugar de conjugado ode profármaco. La actividad antitumoral se expresó tanto como un retraso del crecimiento, definido como el tiempoque transcurre hasta que los tumores tratados aumentan su volumen en 4 veces menos el tiempo que transcurre paraque los tumores de control aumenten su volumen 4 veces, y como un valor de T/C, definido como el volumen deltumor tratado dividido entre el volumen del tumor del control, 14 días después de la administración del profármaco.La significación estadística de los efectos antitumorales se evaluó usando el análisis del ensayo de varianza (de unavía).

En la Fig. 1 se muestra la actividad antitumoral del conjugado de F(ab’)2 del anticuerpo 806.077 con CPG2 encombinación con el profármaco de PGP, y los datos antitumorales se resumen a continuación.

Actividad antitumoral del conjugado de F(ab’)2 del anticuerpo 806.077 con CPG2, en combinación con un profárma-co de PGP en xenoinjertos de tumores LoVo

Los resultados demuestran que el conjugado de F(ab’)2 de anticuerpo 806.077 con CPG2, en combinación con elprofármaco de PGP, produce regresiones del tumor y retrasos prolongados del crecimiento que fueron estadísticamentesignificativos en comparación con los grupos del control.

Ejemplo 7

Clonación y secuenciación de las regiones variables de los genes de la cadena pesada y de la cadena ligera delanticuerpo 806.077

7.1 Preparación de ARN citoplásmico

Hay varios procedimientos para el aislamiento de ARNm poliA+ a partir de células eucariotas (Sambrook J.,Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, SegundaEdición, 1989, Capítulo 8, p. 3, denominado aquí como “Maniatis”). En este caso particular, el ARN citoplásmico sepreparó como se describe mediante Favoloro et al., Methods in Enzymology 65, 718-749, a partir de un pelete celularde hibridoma congelado, que contiene 1 x 109 células, que se ha almacenado a -80ºC.

Las células se resuspendieron en 5 ml de tampón de lisis enfriado con hielo (140 mM de NaCl, 1,5 mM de MgCl2,10 mM de Tris-HCl pH 8,6, y 0,5% de NP40 (un detergente no iónico de poliglicoléter; nonilfenoxipolietoxietanol,número de catálogo de Sigma 127087-87-0)), que contiene 400 u de un inhibidor de ribonucleasa (RNAguard; nº deCat. 27-0815-01 de Pharmacia), y se sometieron a remolino durante 10 s. Esta disolución se colocó encima de unvolumen igual de tampón de lisis enfriado en hielo que contiene 24% (p/v) de sacarosa y 1% de NP-40, y se almacenóen hielo durante 5 min. La preparación se centrifugó entonces a 4000 rpm durante 30 min. a 4ºC en una centrífugade acceso superior de laboratorio (Sorval RT6000B), después de lo cual se eliminó la fase citoplásmica superior hastaun volumen igual de 2 x tampón de PK (200 mM de Tris (pH 7,5), 25 mM de EDTA, 300 mM de NaCl y 2% (p/v)de SDS). Se añadió proteinasa K (Sigma, nº Cat. P2308) hasta una concentración final de 200 µg/ml, y la mezcla seincubó a 37ºC durante 30 min.

La preparación se extrajo con un volumen igual de fenol/cloroformo, se eliminó la fase acuosa, y se añadió 2,5volúmenes de etanol y se mezcló. Esta disolución se almacenó entonces a -20ºC toda la noche. El ARN se recogió me-diante centrifugación (4000 rpm, 30 min. a 4ºC en una centrífuga de acceso superior de laboratorio, Sorval RT6000B),el sobrenadante se decantó y el pelete se secó en un secador de vacío, después de lo cual se disolvió en 250 µl deagua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC) (preparada como se describe en Maniatis, citado anteriormente). Elcontenido de ARN se midió mediante espectrofotometría, y se calculó la concentración suponiendo una absorbancia a260 nm de 1 = 40 µg/ml.

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7.2 Preparación de ADNc de la región variable de la primera hebra

En Maniatis (Capítulo 8) se repasa un número de métodos para la síntesis de ADNc. Los cebadores oligonucleo-tídicos usados se basaron principalmente en aquellos propuestos por Marks et al. J. Mol. Biol (1991) 222, 581-597.En este caso, el ADNc se preparó como se describe más abajo. Se mezcló ARN (5 mg) en un tubo de microcentrífugacon 10 µl de 5 x tampón de transcriptasa inversa [250 mM de Tris (pH 8,3), 40 mM de MgCl2 y 50 mM de DTT], 1µl de cebador directo (25 pM), 10 µl de 1,25 mM de dNTP, 5 µl de 10 mM de DTT, 0,5 µl de RNAguard (Pharmacia)al que se añadió H2O tratada con DEPC para obtener un volumen de 50 µl. La mezcla de reacción se calentó hasta70ºC durante 10 min., y después se enfrió lentamente hasta 37ºC, después de lo cual se añadieron 100 u (0,5 µl) detranscriptasa inversa M-MLV (nº de Cat. 27-0925-01 de Pharmacia), y la reacción se incubó a 37ºC durante 1 h. Elcebador directo usado para la generación del ADNc de cadena ligera fue el oligonucleótido CK2FOR (SEQ ID NO:1), que se diseñó para que se hibridase a la región constante CK de los genes de cadena ligera kappa murinos. Para elADNc de cadena pesada, se usó el cebador directo CGIFOR (SEQ ID NO: 2), que se hibrida al dominio constante deCH1 de IgGI murino.

7.3 Secuenciación de aminoácidos

Las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos 806.077 se aislaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western, yse sometieron a secuenciación de aminoácidos N-terminales. Los resultados mostraron que el término N de la cadenaligera estaba químicamente bloqueado; sin embargo, se obtuvieron datos de secuencia para los primeros 34 restosN-terminales de la cadena pesada (SEQ ID NO: 3). En base a esta secuencia de aminoácidos, se diseñó un cebadorinverso de ADN específico para la PCR de la región variable de cadena pesada de 806.077. Este cebador se denominóSP1back (SEQ ID NO: 7).

7.4 Aislamiento de fragmentos génicos de anticuerpo mediante PCR

El aislamiento de los genes de la región variable de cadena ligera y pesada de 806.077 se realizó usando el ADNcpreparado como se describe anteriormente, como molde. Las condiciones generales de reacción fueron las siguientes.

A 5 µl de la reacción de ADNc se añadieron 5 µl de dNTP (2,5 mM), 5 µl de 10 x de tampón de enzima (500 mMde KCl, 100 mM de Tris (pH 8,3), 15 mM de MgCl2 y 0,1% de gelatina), 1 µl de 25 pM/µl de cebador inverso, 1 µlde 25 pM/µl de cebador directo, 0,5 µl de ADN polimerasa termoestable, y agua tratada con DEPC, para obtener unvolumen de 50 µl. Las condiciones de la PCR se ajustaron para 25 ciclos a 94ºC durante 90 s; 55ºC durante 60 s; 72ºCdurante 120 s, terminando el último ciclo con otros 72ºC durante 10 min. de incubación.

Usando las condiciones generales de reacción, el cebador directo usado para la preparación del ADNc de cadenaligera fue el oligonucleótido CK2FOR (SEQ ID NO: 1), y para el ADNc de cadena pesada fue el oligonucleótidoCG1FOR (SEQ ID NO: 2). Se realizó un número de reacciones que usan una variedad de diferentes cebadores inversos,tanto para las cadenas pesada como ligera, para obtener los productos de PCR específicos deseados.

En el caso de la cadena ligera de 806.077, en el análisis se obtuvo un producto de PCR específico usando loscebadores inversos VK1back (SEQ ID NO: 4) y VK4back (SEQ ID NO: 5). De forma similar, se obtuvieron productosde PCR específicos para la cadena pesada usando los cebadores VH1back (SEQ ID NO: 6) y SP1back (SEQ ID NO:7). Los productos de la reacción se analizaron en un gel de agarosa al 2%. Los productos del tamaño esperado secortaron, y se purificó el ADN.

7.5 Clonación de los productos de PCR en el vector Bluescript KS+

Para cada fragmento de anticuerpo, tanto el oligonucleótido de la región 5’ (cebador inverso) como la región 3’(cebadores directos) introdujeron un sitio de restricción. Los productos de PCR discretos fueron tanto para VH co-mo VK. Las reacciones de PCR fueron capaces por lo tanto de ser clonadas en el vector Bluescript KS+ (StratageneCloning Systems) vía los sitios de restricción enzimática apropiados, usando métodos de manipulación de ADN es-tándares (por ejemplo, los productos de PCR VH1back/CG1For se clonaron vía PstI/HindIII, y VK4back/CK2For víaSacI/HindIII). El ADN se preparó a partir de los clones obtenidos, y se realizó una secuenciación rigurosa de al menos12 clones de tal constructo, usando un equipo de secuenciación fluorescente automatizado (Applied Biosystems). Lassecuencias se repasaron, se compararon y se alinearon usando un programa de ordenador adecuado. Se obtuvieronsecuencias de consenso tanto para los genes de VH como VK, y se tradujeron subsiguientemente a su secuencia deaminoácidos correspondiente.

El ADN y las secuencias de aminoácidos obtenidos para la región variable de cadena ligera (VK) de 806.077 sedescriben en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, respectivamente. El ADN y las secuencias de aminoácidos obtenidospara la región variable de cadena pesada (VH) de 806.077 se describen en SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11,respectivamente. Un clon que contiene la cadena ligera se denominó VK4, y un clon que contiene la secuencia decadena pesada se denominó VH14A.

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Ejemplo 8

Construcción de genes de Fd quiméricos de cadena ligera y cadena pesada

Los genes de cadena pesada y ligera que se han clonado en Bluescript (VK4 y VH14A en el Ejemplo 7) se aislaronmediante PCR usando cebadores que permitieron la amplificación específica de sólo la región variable de los genesapropiados, pero también que introdujeron nuevos sitios de restricción enzimática únicos. Estos sitios de restricciónpermitieron clonar los fragmentos génicos de la región variable en el marco con fragmentos de ADN que codificantanto las secuencias señal de anticuerpo apropiadas como las regiones constantes humanas. Las secuencias señal y dela región constante para Fd de cadena ligera y de cadena pesada se clonaron cada una previamente en pNG3 y 0 pNG4,derivados del vector de expresión plasmídico eucariota pSG5.

El vector pNG3 se preparó según lo siguiente: Se digirió el plásmido pSG5 (Stratagene, nº de Cat. 216201) con SalIy XbaI, para eliminar el promotor de SV40 existente y la secuencia poliligadora. Se introdujo un nuevo poliligadormediante el uso de los oligonucleótidos SEQ NOS: 34 y 35 que se hibridaron y se clonaron en el plásmido pSG5cortado con SalI y XbaI, para dar el plásmido pNG1. El plásmido pNG1 se cortó con BglII y con HindIII, y elfragmento del promotor de CMV de BglII-HindIII, procedente de pcDNA3 (Invitrogen, nº de Cat. V790-20), se clonóen este sitio para dar el plásmido pNG2. Finalmente, la región poliA de pSG5 se aisló mediante PCR como se describeen el Ejemplo 7, sección 7.4, pero usando las secuencias oligonucleotídicas SEQ ID NOS: 36 y 37 con el plásmidopSG5. El producto de PCR se cortó con XmaI y BamHI, se purificó mediante electroforesis en un gel de agarosa al2%, se aisló (por ejemplo, con GENECLEAN, véase el ejemplo 7), y luego se ligó en el plásmido pNG2 cortado conXmaI-BamHI, para dar pNG3.

El vector pNG4 se preparó según lo siguiente. El vector pNG3 se modificó adicionalmente de forma que el sitiode reconocimiento de la enzima de restricción SacI, en el fragmento del promotor de CMV clonado, se corrompiócambiando la secuencia de ADN. Esto se logró mediante el uso de una reacción de mutagénesis mediante PCR de dosetapas, usando como molde el vector pNG3. La PCR usó dos cebadores oligonucleotídicos complementarios (SEQ IDNOS: 38 y 39), para mutar la secuencia de reconocimiento de SacI, y 2 cebadores de flanqueo (SEQ ID NOS: 40 y 41),para la amplificación del producto. Se usaron dos pares de cebadores (SEQ ID NOS: 38 y 41) y (SEQ ID NOS: 39 y40) en una reacción de PCR estándar (como se describe en el Ejemplo 7, sección 7.4), para obtener los 2 productos dePCR iniciales, que se aislaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%. Se mezclaron cantidades equimolaresde cada producto, y se reamplificaron usando los cebadores de flanqueo (SEQ ID NOS: 40 y 41) en las condicionesde reacción de PCR estándar, para cortar y empalmar juntos y amplificar el producto de PCR final. Este producto sedigirió subsiguientemente con las enzimas de restricción NcoI e HindIII, y se clonó en el vector pNG3 apropiadamenterestringido y preparado, de forma que el fragmento mutado (menos el sitio SacI) sustituyó el fragmento NcoI-HindIII(más el sitio SacI) de pNG3. Este nuevo vector se denominó pNG4.

Se tomó un clon de la cadena murina de 806.077 en el vector Bluescript KS+ (VK4), y se amplificó usando loscebadores oligonucleotídicos 077VK-UP (SEQ ID NO: 12) y 077VK-DOWN (SEQ ID NO: 13). De forma similar,se amplificó un clon de cadena pesada de 806.077 (VH14A), usando 077VH-UP (SEQ ID NO: 14) y 077VH-DOWN(SEQ ID NO: 15). La PCR se realizó según lo siguiente: a 100 ng de ADN plasmídico se añadieron 5 µl de dNTP (2,5mM), 5 µl de 10 x de tampón de enzima (véase anteriormente), 1 µl de 25 pM/µl de cebador inverso, 1 µl de 25 pM/µlde cebador directo, 0,5 µl de ADN polimerasa termoestable, y agua tratada con DEPC, para obtener un volumen de50 µl. Las condiciones de PCR se ajustaron para 15 ciclos a 94ºC durante 90 s; 55ºC durante 60 s; 72ºC durante 120s, terminando el último ciclo con otros 72ºC durante 10 min. de incubación. Los productos se analizaron en un gel deagarosa al 2%. El ADN se purificó, y el fragmento de ADN se digirió con las enzimas de restricción pertinentes en lapreparación, para la clonación subsiguiente del vector.

Para la secreción de la cadena ligera del anticuerpo, se diseñó un casete de ADN bicatenario que contenía tantola información para una secuencia de reconocimiento de Kozak como una secuencia señal de cadena ligera. El caseteconsistió en dos oligonucleótidos individuales (SEQ ID NOS: 42 y 43) que se hibridaron y se clonaron subsiguien-temente entre el sitio de restricción de HindIII y SacII del plásmido pNG3 (que se ha restringido apropiadamente yse ha aislado usando metodología estándar), para crear el vector pNG3-Vkss. La secuencia de ADN de SEQ ID NO:46, que contiene la secuencia para la región constante kappa de cadena ligera humana, se digirió con XmaI y XhoI,y se insertó entre el plásmido pNG-Vkss cortado con XhoI y XmaI, para dar el vector pNG3-Vkss-HuCk (nº 40798de NCIMB). Además, se clonó un casete de expresión del gen de resistencia a neomicina en pNG3-Vkss-HuCk (pro-cedente del vector pSG5-Neo de la variante del plásmido pSG5, suministrado por Green, Zeneca Pharmaceuticals;fuentes alternativas incluyen vectores tales como pMC1neo, número de catálogo 213201 de Stratagene). El casete deexpresión del gen de resistencia a neomicina se clonó como un fragmento XbaI, y se clonó en el sitio de XbaI delpNG3-Vkss-HuCk, y se comprobó la orientación usando digestión mediante enzimas de restricción. Esto da lugar alplásmido pNG3-Vkss-HuCk-Neo (NCIMB 40799). La secuencia génica de cadena ligera descrita anteriormente seinsertó, en el marco, clonando directamente entre los sitios de SacII y XhoI del vector pNG3-Vkss-HuCk-Neo. Elfragmento de PCR obtenido para el gen de cadena ligera se digirió con enzimas de restricción SacII y XhoI, y se clonóen el vector de expresión restringido de forma similar, que contiene las secuencias codificantes de la señal de VK y dela región constante de HuCK. La secuencia de cadena ligera de 806.077 quimérica creada se mostró en SEQ ID NOS:16 y 17.

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De forma similar, para la secreción de la cadena pesada del anticuerpo, se diseñó un casete de ADN bicatenarioque contenía tanto la información para una secuencia de reconocimiento de Kozak como una secuencia señal decadena pesada. El casete consistió en dos oligonucleótidos individuales (SEQ ID NOS: 44 y 45) que se hibridarony se clonaron subsiguientemente entre el sitio de restricción de HindIII y EcoRI del plásmido pNG4 (que se habíarestringido apropiadamente y se había aislado usando metodología estándar), para crear el vector pNG4-VHss. Deeste modo, se pudieron insertar, en el marco, las secuencias génicas de la cadena pesada, clonando directamente entrelos sitios EcoRI y SacI del vector pNG4-VHss. La secuencia de ADN de SEQ ID NO: 47, que contiene la secuenciacodificante de la región constante de IgG2CH1’ de cadena pesada humana (SEQ ID NOS: 22 y 23) se digirió conSacI y XmaI, y se clonó en pNG4-VHss cortado con SacI y XmaI, para dar el vector pNG4-VHss-HuIgG2CH1’ (nº40797 de NCIMB). El fragmento de PCR obtenido para el gen de cadena pesada se digirió con enzimas de restricciónEcoRI y SacI, y se clonó en el vector de expresión similarmente restringido pNG4-VHssHuIgG2CH1’, que contienelas secuencias codificantes de la señal VH y de la región constante de HuIgG2 CH1’. La secuencia de cadena de Fdde HuIgG2 de 806.077 quimérica creada se muestra en SEQ ID NOS: 18 y 19.

En algunos casos, puede ser preferible usar otras clases de constructos de Fd de cadena pesada quiméricos. Paraeste fin, se obtienen variantes del vector de cadena pesada que contienen HuIgG1CH1’ (SEQ ID NOS: 20 y 21) oHuIgG3CH1’ (SEQ ID NOS: 24 y 25), que sustituyen al gen de HuIgG2CH1’ (SEQ ID NOS: 22 y 23).

Las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 46 y 47 se preparan mediante una variedad de métodos, incluyendolos descritos por Edwards (1987) Am. Biotech. Lab. 5, 38-44, Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,4084-4088, Foguet y Lubbert (1992) Biotechniques 13, 674-675 y Pierce (1994) Biotechniques 16, 708. Preferible-mente, las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 46 y 47 se preparan mediante un método de PCR similar al descritopor Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4084-4088.

Una vez se construyeron las secuencias de cadena pesada y ligera individuales, se cortó un casete de expresión delgen de Fd de cadena pesada (que incluye tanto el promotor como el gen) como un fragmento de BglII/SalI, y se clonóen los sitios de BamHI/SalI del vector de cadena ligera, para producir un constructo de vector de coexpresión. Esteconstructo se transfectó en células de mieloma NS0 (nº 85110503 de ECACC), vía técnicas estándares de electropo-ración, y los transfectantes se seleccionaron en busca de la propiedad de resistencia a G418, un rasgo que es portadocomo un marcador seleccionable en el constructo plasmídico de expresión.

Como alternativa, los genes completos de Fd de cadena pesada y de la cadena ligera se pueden cortar simplementea partir de sus vectores respectivos como fragmentos HindIII/XmaI, y se pueden clonar subsiguientemente en otrossistemas de vectores de expresión de elección.

Ejemplo 9

Ensayo de hibridación de variaciones de ácidos nucleicos de secuencias de ácidos nucleicos específicas

9.1 Ensayo de hibridación

Se describe un método para detectar secuencias que contienen ácidos nucleicos variantes relacionadas con secuen-cias del anticuerpo 806.077 específicas. Estos ácidos nucleicos variantes pueden estar presentes en una variedad deformas, tales como el ADN de colonias bacterianas, o el ADN/ARN de células eucariotas fijadas sobre una membrana,como se describe anteriormente en la identificación sistemática de una librería de ADNc, o como fragmentos de ácidonucleico purificado separado mediante electroforesis en gel, y después transferidos a una membrana adecuada para lastécnicas de hibridación Northern (Maniatis et al., Capítulo 7, p. 39) o Southern (Maniatis, Capítulo 9, p. 31).

9.2 Sonda de hibridación

Las sondas de hibridación se pueden generar a partir de cualquier fragmento de ADN o ARN que codifique lasecuencia nucleica del anticuerpo 806.077 específica de interés, más específicamente procedente de la región variable,particularmente la región que codifica CDR3 de esta región. Se puede usar, como sonda específica para la regióncodificante de CDR3, un oligonucleótido sintético o su secuencia complementaria.

Una sonda de hibridación se puede generar a partir de un oligonucleótido sintético mediante adición de un gru-po 5’-fosfato radioactivo procedente de [γ-32P]ATP mediante la acción de T4 polinucleótido quinasa. Se añaden 20pmoles del oligonucleótido a 20 µl de reacción que contiene 100 mM de Tris, pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 0,1 mM deespermidina, 20 mM de ditiotreitol (DTT), 7,55 µM de ATP, 55 µCi de [γ-32P]ATP y 2,5 u de T4 polinucleótido qui-nasa (Pharmacia Biotechnology Ltd., Uppsala, Suecia). La reacción se incubó durante 30 minutos a 37ºC, y despuésdurante 10 minutos a 70ºC antes del uso en la hibridación. Los métodos para la generación de sondas de hibridacióna partir de oligonucleótidos (capítulo 11) o a partir de fragmentos de ADN y ARN (capítulo 10) se dan en Maniatis.Para estos procedimientos, también están disponibles un número de kits patentados.

9.3 Condiciones de hibridación

Los filtros que contienen el ácido nucleico se prehibridan en 100 ml de una disolución que contiene 6 x SSC, 0,1%de SDS y 0,25% de leche desnatada seca (MarvelTM), a 65ºC, durante un mínimo de 1 hora, en una vasija cerrada

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adecuada. Un aparato de hibridación patentado, tal como el modelo HB-1 (Techne Ltd.), proporciona condicionesreproducibles para el experimento.

La disolución de prehibridación se sustituye entonces por 10 ml de una disolución de sonda que contiene 6 xSSC, 0,1% de SDS, 0,25% de leche desnatada seca (por ejemplo, MarvelTM), y la sonda oligonucleotídica generadaanteriormente. Los filtros se incuban en esta disolución durante 5 minutos a 65ºC antes de permitir que la temperaturacaiga gradualmente hasta una temperatura por debajo de 30ºC. La disolución de sonda se desecha entonces, y losfiltros se lavan en 100 ml de 6 x SSC, 0,1% de SDS a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después se realizanlavados adicionales en lotes recientes de la misma disolución, a 30ºC, y después en incrementos de 10ºC hasta 60ºC,durante 5 minutos por lavado.

Después de lavar, los filtros se secan y se usan para exponer una película de rayos X, tal como Hyperfilm™ MP(Amersham International) a -70ºC en un casete de película protegida de la luz, usando una pantalla intensificado-ra de wolframato rápida, para potenciar la imagen fotográfica. La película se expone durante un período adecuado(normalmente toda la noche) antes de desarrollar para revelar la imagen fotográfica de la áreas radioactivas sobrelos filtros. Las secuencias de ácidos nucleicos relacionadas se identifican mediante la presencia de una imagen fo-tográfica en comparación con las secuencias totalmente no relacionadas que no deben de producir ninguna imagen.Generalmente, las secuencias relacionadas aparecerán positivas a la temperatura más alta de lavado (60ºC). Sin em-bargo, las secuencias relacionadas pueden presentarse sólo positivas a las temperaturas más bajas de lavado (50, 40ó 30ºC).

Estos resultados también dependerán de la naturaleza de la sonda usada. Las sondas de fragmentos de ácidosnucleicos más grandes necesitarán ser hibridadas durante períodos más prolongados a una temperatura elevada, peropermanecerán unidas a las secuencias relacionadas a temperaturas más elevadas de lavado y/o a concentraciones másbajas de sal. Las sondas oligonucleotídicas mixtas o degeneradas, más cortas, pueden requerir condiciones de lavadomenos restrictivas, tales como menores temperaturas y/o mayores concentraciones de Na+. En Maniatis (capítulo 11)se proporciona una exposición de las consideraciones para los protocolos de hibridación.

Ejemplo 10

Composiciones farmacéuticas

Lo siguiente ilustra formas de dosificación farmacéuticas representativas que contienen el anticuerpo 806.077, quese pueden usar para terapia, en combinación con un profármaco adecuado.

Disolución inyectable para sistema ADEPT

Una disolución acuosa estéril, para inyección, contiene, por ml de disolución:

Conjugado de anticuerpo 806.077 con CPG2 1,0 mgAcetato sódico trihidratado 6,8 mgCloruro sódico 7,2 mgTween 20 0,05 mg

Una dosis típica de conjugado para seres humanos adultos es 30 mg, seguida, 3 días más tarde, de tres dosis de1 g de profármaco, administrado a intervalos horarios. Los conjugados de CPG2 adecuados son uno cualquiera deaquellos conjugados descritos en los Ejemplos 105 y 106. Los conjugados con HCPB pueden sustituir al conjugadode CPG2 en la tabla. Los conjugados de HCPB adecuados son uno cualquiera de aquellos conjugados descritos en losEjemplos 48-101.

Disolución inyectable para inmunoterapia tumoral

Una disolución acuosa estéril, para inyección, contiene, por ml de disolución:

Conjugado de anticuerpo 806.077 con B7 1,0 mgAcetato sódico trihidratado 6,8 mgCloruro sódico 7,2 mgTween 20 0,05 mg

Una dosis típica de conjugado para seres humanos adultos es 30 mg. En el Ejemplo 104 se describe un conjugadoadecuado.

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Ejemplo 11

Construcción de genes de región variable de cadena ligera y pesada del anticuerpo humanizado 806.077 inicial

En primer lugar, en el siguiente texto se expone un repaso de la estrategia de humanización. El fin de la huma-nización del anticuerpo es combinar el sitio de unión de un anticuerpo no humano en el armazón de apoyo de unanticuerpo humano, a la vez que se mantienen las propiedades de especificidad y actividad de unión a antígeno ca-racterísticas del anticuerpo progenitor. La viabilidad de tal manipulación mediante ingeniería genética del anticuerpoes una consecuencia de la estrecha homología de secuencia y estructural de las inmunoglobulinas procedentes dediferentes especies de mamíferos.

En su forma más básica, el enfoque implica la transferencia de las seis regiones hipervariables o regiones quedeterminan la complementariedad (CDR) de una región de Fv de un anticuerpo a otra, como se describió en primerlugar en Jones et al Nature (1986) 321 522-525. Sin embargo, la experiencia ha mostrado que, además de las CDR,a menudo es necesario que también se transfieran los aminoácidos en el armazón del anticuerpo, para que el procesotenga éxito, puesto que parece que algunas veces tales restos entran en contacto e influyen la conformación de losbucles de CDR.

En el caso del anticuerpo 806.077, se obtuvo una versión humanizada “inicial” del anticuerpo, que comprende lasseis CDR murinas y un número de 5 sustituciones de restos del armazón. Este constructo se usó como un molde, a partirdel cual se obtuvieron otras variantes (Ejemplos 12-47) introduciendo sustituciones de restos “murinos” adicionales.El resto de este Ejemplo describe con detalle el constructo humanizado inicial.

La región variable de cadena pesada del anticuerpo humano región NEWM (Poljak, R.J et al (1974) PNAS 713440-3444) y la región variable kappa de cadena ligera REI (Palm, W y Hilschmann, N. Z. (1975) Physiol. Chem.356 167-191) se escogieron para formar el armazón del anticuerpo humano aceptor. Se han descrito en la biblio-grafía numerosos ejemplos de humanizaciones exitosas usando este armazón de Fv, y se ha resuelto la estructuratridimensional de estos dos dominios proteínicos. Basándose en la comparación de las secuencias proteínicas delas regiones variables de cadena pesada y ligera de 806.077 murinas con sus secuencias de consenso del subgru-po murino de Kabat muy relacionadas (y los miembros de secuencias individuales) y las secuencias proteínicas deNEWM y REI humanas, se diseñaron secuencias de ADN individuales para codificar el anticuerpo humanizado ini-cial que incorporó las CDR murinas y cualesquiera sustituciones de armazón adicionales consideradas importan-tes.

Las secuencias de CDR de 806.077 murinas incorporadas se describen en SEQ ID NOS: 26; 27 y 28 para laregión variable de cadena ligera, y se encuentran en las posiciones 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) y 89-97 (CDR3)respectivamente. Las CDR incorporadas en la región variable de cadena pesada se describen en SEQ ID NOS: 29, 31 y32, estando en las posiciones 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2), 95-102 (CDR3) respectivamente (usando la nomenclaturade Kabat). En la región variable de cadena pesada, se realizaron cambios adicionales V24A; S27F; T28N; F29I; S30K;V71A; A92H; R93V (nomenclatura de Kabat) en el armazón de NEWM, y en la región variable de cadena ligera nose realizaron cambios de armazón adicionales.

Se diseñaron secuencias de ADN sintéticas individuales para codificar la versión inicial de las regiones varia-bles de cadena pesada (806.077HuVH1) y ligera (806.077HuVK1) del anticuerpo humanizado 806.077, en las quese incorporaron las CDR y cualesquiera cambios adicionales de los restos del armazón. Las secuencias génicasvariables del anticuerpo, mostradas en SEQ ID NOS: 48 y 53, se pueden preparar mediante una variedad de mé-todos, incluyendo los descritos por Edwards (1987) Am. Biotech. Lab. 5, 38-44, Jayaraman et al. (1991) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 4084-4088, Foguet y Lubbert (1992) Biotechniques 13, 674-675 y Pierce (1994) Biote-chniques 16, 708. Preferiblemente, las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID NOS: 48 y 53 se preparan me-diante un método de PCR similar al descrito por Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4084-4088.

La secuencia génica de cadena ligera variable del anticuerpo 806.077 humanizado (SEQ ID NO: 49 y 50) se insertó,en el marco, clonando en el vector de expresión pNG3-Vkss-HuCK-Neo (nº 40799 de NCIMB). Para lograr esto, sedigirió el fragmento de ADN de la PCR sintético que codifica el gen de cadena ligera variable humanizado (SEQID NO: 48) con enzimas de restricción SacII y XhoI, y se clonó en el vector pNG3-Vkss-HuCK-Neo restringido deforma similar, que contenía la secuencia señal de VK y las secuencias codificantes de la región constante de HuCK. ElADN y la secuencia proteínica de la secuencia de cadena ligera de 806.077 humanizado completa (806.077HuVK1-HuCK) producida, junto con su secuencia señal, se muestran en SEQ ID NOS: 51 y 52, respectivamente, y el vectorse denominó pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo.

De forma similar, para la cadena pesada del anticuerpo humanizado, se insertó en el marco la secuencia génicaSEQ ID NO: 54 y 55 de cadena pesada variable humanizada, clonando directamente en el vector de expresión pNG4-VHss-HuIgG2CH1’ (nº 40797 de NCIMB). Para lograr esto, se digirió el fragmento de PCR sintético, obtenido para elgen de cadena pesada humanizado (SEQ ID NO: 53), con enzimas de restricción EcoRI y SacI, y se clonó en el vectorpNG4-VHss-HuIgG2CH1’ restringido de forma similar, que contenía la secuencia señal de VH y las secuencias quecodifican la región constante de CH1’ de HuIgG2. El ADN y la secuencia proteínica de la secuencia de cadena pesadade Fd de 806.077 humanizado completa (806.077HuVH1-HuIgG2 Fd) producida, junto con su secuencia señal, se

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muestran en SEQ ID NOS: 56 y 57, respectivamente, y el vector se denominó pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1’.

El constructo de anticuerpo humanizado inicial se produjo construyendo un plásmido de coexpresión que contienetanto los genes del anticuerpo de región variable de cadena ligera 806.077 HuVK1 como de cadena pesada 806.077HuVH1. El vector pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo plasmídico, que contiene la región variable de cadenaligera humanizada HuVK1 (SEQ ID NOS: 49 y 50) se digirió usando las enzimas de restricción BamHI y SalI, y elvector se hizo pasar sobre un gel de agarosa al 1%, la banda del vector se cortó y se purificó. El plásmido pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2 CH1’ (que contiene la región variable de cadena pesada 806.077HuVH1 humanizada (SEQID NOS: 56 y 57)) se digirió usando las enzimas de restricción BglII y SalI, la reacción se realizó en gel de agarosaal 2%, y la banda del fragmento se cortó y se purificó. El fragmento de ADN recuperado se ligó subsiguientemen-te en el vector pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo preparado, para producir clones del vector de coexpresiónHuVH1/HuVK1 deseado.

Estos constructos se transfectaron en células de mieloma NS0 (nº 85110503 de ECACC), vía técnicas estándaresde electroporación, y los transfectantes se seleccionaron en busca de la propiedad de resistencia al antibiótico G418.Los clones obtenidos se ensayaron tanto en busca de la expresión del anticuerpo en los ensayos de ELISA de Fd deanticuerpo antihumano y de ELISA de unión a CEA, descritos más abajo.

Para el ELISA de CEA, se revistió cada pocillo de una inmunoplaca de 96 pocillos (NUNC MAXISORB™) con50 ng de CEA en 50 mM de tampón de revestimiento de carbonato/bicarbonato, pH 9,0 (cápsulas de tampón - SigmaC3041), y se incubaron a 4ºC toda la noche. La placa se lavó tres veces con PBS + 0,05% de Tween 20, y después sebloqueó con 150 µl por pocillo de 1% de BSA en PBS + 0,05% de Tween 20 durante 1 hora a temperatura ambiente.La placa se lavó como se describió previamente, se añadieron 100 µl de muestra de ensayo por pocillo, y se incubóa temperatura ambiente durante 2 horas. Nuevamente, la placa se lavó tres veces con PBS + 0,05% de Tween 20, seañadieron 100 µl por pocillo de una dilución 1/500 de anticuerpo kappa antihumano de cabra marcado con peroxidasade rábano picante (HRPO) (Sigma A 7164), en 1% de BSA en PBS-Tween 20, y se incubó a temperatura ambienteen una plataforma de balanceo durante al menos 1 hora. La placa se lavó como antes, y después una vez más conPBS. Para detectar la unión, se añaden 100 µl por pocillo de disolución reveladora (una cápsula de tampón de fosfato-citrato - Sigma P4922 - disuelta en 100 ml de H2O, a lo que se añade un comprimido de 30 mg de dihidrocloruro de o-fenilendiamina - Sigma P8412), y se incubó durante un tiempo de hasta 15 minutos. La reacción se detuvo añadiendo75 µl de 2 M de H2SO4, y la absorbancia se leyó a 490 nm.

En el ELISA de Fd del anticuerpo antihumano, se revistió cada pocillo de una inmunoplaca de 96 pocillos con1,2 µg de anticuerpo de Fd antihumano de oveja (Binding Site PC075) en 50 mM de tampón de revestimiento decarbonato/bicarbonato pH 9,6 (cápsulas de tampón - Sigma C3041), y se incubó a 4ºC toda la noche. La placa se lavótres veces con PBS + 0,05% de Tween 20, y después se bloqueó con 150 µl por pocillo de 1% de BSA en PBS + 0,05%de Tween 20 durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó como se describió previamente, se añadieron100 µl de muestra de ensayo por pocillo, y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Nuevamente, la placa selavó tres veces con PBS + 0,05% de Tween 20, se añadió 100 µl por pocillo de anticuerpo kappa antihumano de cabramarcado con HRPO (Sigma A 7164) en 1% de BSA en PBS-Tween 20, y se incubó a temperatura ambiente en unaplataforma de movimiento de balanceo, durante al menos 1 hora. La placa se lavó como antes, y después una vez máscon PBS. Para detectar la unión, se añadió disolución reveladora, etc., como se describe anteriormente, para el ensayode unión a CEA.

Los clones que se encuentra que muestran la mejor expresión y los mejores niveles de unión a CEA se seleccionaronpara la expansión adicional en placas de 24 pocillos, y se volvieron a ensayar. El mejor clon según estos criterios deensayo se seleccionó y se expandió de forma que se llevó a cabo una producción de un litro, que se sembró usandouna dilución 1:10 de un cultivo que se hizo crecer confluentemente (es decir, 100 ml en 900 ml de medio de cultivoreciente), y se hizo crecer durante otros 14 días. El fragmento de anticuerpo F(ab’)2 humano se purificó entonces apartir del sobrenadante de cultivo, como se describe en el Ejemplo 102.

Ejemplos 12-38

Otras combinaciones de variantes de gen de región variable de cadena pesada y ligera humanizado: construcción devariantes de región variable de cadena pesada y ligera humanizadas de 806.077

Los genes de región variable de 806.077 humanizados iniciales también se usaron para la construcción subsi-guiente de otros constructos génicos que contenían restos de armazón murino adicionales. Las modificaciones de lassecuencias génicas se lograron (en la mayoría de los casos) mediante mutagénesis de casete. En esta técnica, parte delgen original se eliminó vía una restricción con dos enzimas únicas apropiadas a partir del vector plasmídico completo,y después se sustituyeron con un casete de ADN bicatenario (que consiste en dos oligonucleótidos complementarioshibridados juntos para formar un fragmento de ADN con los extremos cohesivos apropiados) mediante ligación di-recta en el plásmido preparado, reconstituyendo así el gen, pero que ahora contiene los cambios de ADN deseados.También se pueden producir otras combinaciones de mutaciones con la cadena pesada o ligera mediante intercambiosde fragmentos de ADN simples entre las variantes apropiadas, utilizando los sitios de enzimas de restricción únicosdisponibles.

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Se produjeron tres variantes adicionales de la región variable de cadena ligera humanizada, además de la secuenciaoriginal HuVK1 (SEQ ID NO: 49 y 50), y éstas se denominaron HuVK2, HuVK3 y HuVK4, respectivamente. Lavariante HuVK2 de la región variable de cadena ligera fue una modificación de la secuencia codificante de HuVK1original, a fin de producir el cambio de aminoácidos M4L (nomenclatura de Kabat), mutándose el gen (SEQ ID NO:49) mediante mutagénesis de casete. El plásmido pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo (que contiene la cadenaligera humanizada completa (SEQ ID NO: 49 y 50)) se digirió usando las enzimas de restricción SacII y NheI. Elproducto digerido se cargó entonces en un gel de agarosa al 2%, y el fragmento cortado se separó del vector que queda.El ADN vectorial se cortó entonces del gel, se recuperó y se almacenó a -20ºC hasta que se requiriese. Se diseñaron ysintetizaron (SEQ ID NOS: 58 y 59) dos oligonucleótidos (que contienen los cambios de bases deseados). Estos dosoligonucleótidos se hibridaron añadiendo 200 pmoles de cada oligonucleótido a un total de 30 µl de H2O, calentandohasta 95ºC y permitiendo que la disolución se enfríe lentamente hasta 30ºC. Después, se ligaron directamente en elvector previamente preparado 100 pmoles del producto de ADN hibridado. Este cambio de “casete” de ADN produjoel ADN de HuVK2 deseado y la secuencia proteínica (SEQ ID NO: 60 y 61) ya en el lugar en el vector de expresiónpNG3-Vkss-806.077HuVK2-HuCK-Neo.

De forma similar, se construyó HuVK3 con los cambios de aminoácidos D1Q; Q3V; M4L (nomenclatura de Kabat)usando oligonucleótidos sintéticos (SEQ ID NO: 62 y 63) para producir el ADN de HuVK3 deseado y la secuenciaproteínica (SEQ ID NO: 64 y 65), nuevamente ya en el sitio en el vector de expresión pNG3-Vkss-806.077HuVK3-HuCK-Neo.

La variante HuVK4 de la región variable de cadena ligera se produjo mediante una técnica diferente, puesto queno hubo sitios de enzimas de restricción únicos disponibles próximos al sitio de mutación. HuVK4, con el cambiode aminoácidos L47W, se produjo mediante una técnica de mutagénesis por PCR. El vector pNG3-806.077HuVK1-HuVK-Neo se usó como molde para dos reacciones de PCR (94ºC, 90 segundos; 55ºC, 60 segundos; 72ºC, 120segundos durante 15 ciclos, y todos los tampones, etc., fueron como se describe previamente). La reacción A usólos cebadores SEQ ID NOS: 66 y 67 de la secuencia oligonucleotídica sintética, y la reacción B los cebadores SEQID NOS: 68 y 69 de la secuencia oligonucleotídica sintética. Los productos de estas reacciones de PCR (A y B)fueron fragmentos de una longitud de 535 pares de bases y 205 pares de bases, respectivamente. Estos productos dereacción se hicieron pasar sobre un gel de agarosa al 2%, y se separaron de cualesquiera productos de fondo. Lasbandas del tamaño esperado se cortaron del gel, y se recuperaron. Se obtuvieron mezclas de cantidades variablesde los productos A y B, y se realizaron reacciones de PCR usando las SEQ ID NOS: 66 y 68 de oligonucleótidossintéticos. El producto resultante (aprox. 700 pares de bases) se digirió con las enzimas de restricción SacII y XhoI, ylos productos escindidos se separaron en un gel de agarosa al 2%. La banda del tamaño de 310 pares de bases esperadose cortó del gel, y se recuperó. Este fragmento se ligó entonces en el vector pNG3-806.077HuVK1-HuVK-Neo (quese había cortado previamente con las enzimas de restricción SacII/XhoI y se había aislado subsiguientemente), y deeste modo se creó el ADN de HuVK4 deseado y la secuencia proteínica (SEQ ID NO: 70 y 71) dentro del vector deexpresión pNG3Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo.

Se produjeron seis variantes adicionales de la región variable de cadena pesada humanizada, además de la secuenciade HuVH1 original (SEQ ID NO: 54 y 55), y éstas se denominaron HuVH2 hasta HuVK7, respectivamente. Lavariante HuVH2 de la región variable de cadena pesada fue una modificación de la secuencia codificante de HuVH1original, a fin de producir el cambio de aminoácidos G49A (nomenclatura de Kabat), mutándose el gen (SEQ ID NO:54) mediante mutagénesis de casete. El plásmido pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2 CH1’ (que contiene Fd decadena pesada de IgG2, humanizado completo (SEQ ID NOS: 56 y 57)) se digirió usando las enzimas de restricciónStuI y NotI. El producto digerido se cargó entonces en gel de agarosa al 2%, y el fragmento escindido se separó delvector que queda. El ADN vectorial se escindió entonces del gel, se recuperó y se almacenó a -20ºC hasta que serequiriese. Se diseñaron dos oligonucleótidos, se sintetizaron (SEQ ID NO: 72 y 73), se hibridaron, y el productose ligó directamente en el vector preparado previamente. Este intercambio de “casete” de ADN produjo el ADN deHuVH2 deseado y la secuencia proteínica (SEQ ID NO: 74 y 75) ya en el lugar en el vector de expresión pNG4-VHss-806.077HuVH2-HuIgG2 CH1’.

De forma similar, se construyó HuVH3 con los cambios de aminoácidos T73S; F78A (nomenclatura de Kabat)usando oligonucleótidos sintéticos (SEQ ID NO: 76 y 77), pero, en este caso, el vector pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2 CH1’ se digirió usando las enzimas de restricción NotI y SacII. El casete de ADN sintético se ligó directa-mente al vector previamente preparado, para producir el ADN de HuVH3 deseado y la secuencia proteínica (SEQ IDNO: 78 y 79) en el vector de expresión pNG4-VHss-806.077HuVH3-HuIgG2 CH1’.

HuVH4 con los cambios de aminoácidos G49A; T73S; y F78A (nomenclatura de Kabat) combina las variantesHuVH2 (SEQ ID NO: 74 y 75) y HuVH3 (SEQ ID NO: 78 y 79). Esto se logró digiriendo el vector pNG4-VHss-806.077HuVH3-HuIgG2 CH1’ con las enzimas NotI y NheI, y aislando el fragmento de restricción de NotI/NheI, deaprox. 200 pares de bases, tras la separación en un gel de agarosa al 2%. El fragmento se recuperó y se ligó subsi-guientemente al vector pNG4-VHss-806.077HuVH2-HuIgG2 CH1’ (que se había digerido con las mismas enzimasde restricción NotI y NheI), y el fragmento vectorial se purificó. Los clones resultantes contenían el ADN de HuVH4deseado y la secuencia proteínica (SEQ ID NO: 80 y 81) en el vector de expresión pNG4-VHss-806.077HuVH4-HuIgG2 CH1’.

Se construyó HuVH5 con los cambios de aminoácidos V67A (nomenclatura de Kabat) usando oligonucleótidossintéticos (SEQ ID NO: 82 y 83). Nuevamente, el vector pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2 CH1’ se digirió usando

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las enzimas de restricción NotI y SacII. El casete de ADN sintético se ligó directamente en el vector previamentepreparado, para producir el ADN de HuVH5 deseado y la secuencia proteínica (SEQ ID NO: 84 y 85) en el vector deexpresión pNG4-VHss-806.077HuVH5-HuIgG2 CH1’.

Se construyó HuVH6 con los cambios de aminoácidos V67A; T73S y F78A (nomenclatura de Kabat) usando oli-gonucleótidos sintéticos (SEQ ID NO: 86 y 87), y, para este mutante, el vector pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2CH1’ se digirió usando las enzimas de restricción NotI y SacII. El casete de ADN sintético se ligó directamente en elvector previamente preparado, para producir el ADN de HuVH6 deseado y la secuencia proteínica (SEQ ID NO: 88 y89) en el vector de expresión pNG4-VHss-806.077HuVH6-HuIgG2 CH1’.

HuVH7, con los cambios de aminoácidos G49A; V69A; T73S; y F78A (nomenclatura de Kabat), combina lasvariantes de HuVH2 (SEQ ID NO: 74 y 75) y HuVH6 (SEQ ID NO: 88 y 89). Esto se logró digiriendo el vectorpNG4-VHss-806.077HuVH6-HuIgG2 CH1’ con las enzimas NotI y NheI, y aislando el fragmento de restricción deNotI/NheI, de aprox. 200 pares de bases, tras la separación en un gel de agarosa al 2%. El fragmento se recuperó yse ligó en el vector pNG4-VHss-806.077HuVH2-HuIgG2 CH1’ (que se había digerido con las mismas enzimas derestricción NotI y NheI, y el fragmento vectorial se purificó). Los clones resultantes contenían el ADN de HuVH7deseado y la secuencia proteínica (SEQ ID NO: 90 y 91) en el vector de expresión pNG4-VHss-806.077HuVI-I7-HuIgG2 CH1’.

Se realizaron combinaciones de tales variantes génicas variables de cadena pesada y ligera cortando el casete deexpresión de la variante génica de Fd de cadena pesada (que incluye tanto el promotor como el gen cortado comoun fragmento de BglII/SalI), y clonando este fragmento en los sitios de BamHI/SalI del vector de la variante decadena ligera, para producir un constructo de vector de expresión. En la tabla a continuación se muestra una listade posibles combinaciones de variantes basándose en las variantes de cadena pesada y ligera humanizadas descritaspreviamente.

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Análogamente con el Ejemplo 11, el Ejemplo 14 se produjo construyendo un plásmido de coexpresión que contienetanto los genes del anticuerpo de región variable de cadena ligera HuVK4 de 806.077 como de cadena pesada deHuVH1 de 806.077. En este caso, el vector pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo plasmídico, que contiene HuVK1de región variable de cadena ligera humanizada (SEQ ID NOS: 70 y 71) se digirió usando las enzimas de restricciónBamHI y SalI, y el vector se hizo pasar sobre un gel de agarosa al 1%, y se purificó la banda del vector. El plásmidopNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG2 CH1’ (que contiene la región variable de cadena pesada de HuVH1 de 806.077humanizado (SEQ ID NOS: 56 y 57) se digirió usando las enzimas de restricción BglII y SalII, la reacción se realizósobre agarosa al 2%, y la banda del fragmento se cortó y se purificó. El fragmento de ADN recuperado se ligóen el vector pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo preparado, para producir clones del vector de coexpresión deHuVH1/HuVK4 deseado.

Como se describe en el Ejemplo 11, estos constructos se transfectaron en células de mieloma NS0 (nº 85110503 deECACC), vía técnicas estándares de electroporación, y los transfectantes se seleccionaron en busca de la propiedad deresistencia a G418. Los clones obtenidos se ensayaron en busca de la expresión del anticuerpo en ensayos de ELISAde Fd del anticuerpo antihumano y de ELISA de unión a CEA. Los clones que muestran la mejor expresión y losmejores niveles de unión a CEA se seleccionaron, se expandieron, y el producto se expresó. Después, se purificó elfragmento de anticuerpo F(ab’)2 humano a partir del sobrenadante de cultivo, como se describió en el Ejemplo 102.

Ejemplo 39-47

Expresión de fragmentos de F(ab’)2 humanizados con diversas clases de regiones constantes de cadena pesada hu-mana

Se pueden usar otras clases de constructos de Fd de cadena pesada quiméricos. En consecuencia, se obtuvie-ron variantes adicionales de los vectores de cadena pesada, que contienen HuIgG1CH1’ (SEQ ID NOS: 20 y 21) oHuIgG3CH1’ (SEQ ID NOS: 24 y 115), cuyas regiones constantes están sustituidas por el gen HuIgG2CH1’ (SEQID NOS: 22 y 23). Los vectores creados fueron pNG4-VHss-HuIgG1 CH1’ y pNG4-VHss-HuIgG3 CH1’, respec-tivamente. La región variable del anticuerpo de cadena pesada, en cuestión, se puede cortar del plásmido apropiadopNG4-VHss-“región variable de VH”-HuIgG2 CH1’ mediante digestión con las enzimas de restricción EcoRI y SacI,y se pueden clonar en el vector pNG4-VHssHuIgG1 CH1’ o pNG4-VHss-HuIgG3 CH1’ restringido de forma similar,y de este modo producir una secuencia de Fd de cadena pesada completa. Como se describe anteriormente, una vezque se construyen las secuencias de cadena pesada y ligera individuales, se puede cortar un casete de expresión del gende Fd de cadena pesada (que incluye tanto el promotor como el gen) mediante digestión con enzimas de restricción,y el fragmento se puede clonar entre los sitios apropiados del vector de cadena ligera para producir el vector de coex-presión final. La tabla más abajo describe Ejemplos 39-47 en los que se han combinado diversas regiones variables decadena pesada y ligera con un número de diferentes clases de regiones constantes de cadena pesada humana.

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En el Ejemplo 44, el vector pNG4-VHss-HuIgG3 CH1’ se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y SacI, yel fragmento del vector se aisló como se describió previamente. La región variable del anticuerpo de cadena pesada deHuVH1 (SEQ ID NOS: 54 y 55) se cortó del plásmido pNG4-VHss-806.077HuVHI-HuIgG2 CH1’ mediante digestióncon enzimas de restricción EcoRI y SacI, y el fragmento se clonó en el vector pNG4-VHssHuIgG3 CH1’ similarmenterestringido, para producir una secuencia de Fd de cadena pesada de IgG3 humanizada completa (SEQ ID NOS: 94y 95) en el vector pNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG3 CH1’ completo. El casete de expresión del gen de Fd decadena pesada (que incluye tanto el promotor como el gen) se cortó como un fragmento de BglII/SalI, y se clonóen los sitios de BamHI/SalI del vector pNG3-Vkss-806.077HuVK1-HuCK-Neo de cadena ligera (que contiene lacadena ligera humanizada de HuVK1-HuCK, SEQ ID NOS: 51 y 52), que se había digerido usando las enzimas derestricción BamHI y SalI, se hizo pasar sobre agarosa al 1%, y la banda del vector se purificó. Esto produjo un vectorde coexpresión (pNG 806HuVH1/HuVK3/HuIgG3) a partir del cual se pudo expresar el fragmento de anticuerpohumanizado 806.077HuVH1/HuVK1-HuIgG3/Kappa.

TABLA

En el Ejemplo 47, el vector pNG4-VHss-HuIgG3 CH1’ se digirió con enzimas de restricción EcoRI y SacI, y elfragmento del vector se aisló. La región variable del anticuerpo de cadena pesada de HuVHI (SEQ ID NOS: 54 y 55)se cortó del plásmido pNG4-VHss-HuVH1-HuIgG2 CH1’ mediante digestión con enzimas de restricción with EcoRIy SacI, y el fragmento se clonó en el vector pNG4-VHss-HuIgG3 CH1’ restringido de forma similar. Esto produceuna secuencia de Fd de cadena pesada de IgG3 humanizada completa (SEQ ID NOS: 94 y 95), en el vector completopNG4-VHss-806.077HuVH1-HuIgG3 CH1’. El casete de expresión del gen de Fd de cadena pesada (que incluyetanto el promotor como el gen) se cortó como un fragmento de BglII/SalI, y se clonó en los sitios de BamHI/SalI delvector pNG3-Vkss-806.077HuVK4-HuCK-Neo de cadena ligera (que contiene las HuVK4-HuCK de cadena ligerahumanizada de SEQ ID NOS: 98 y 99), que se había digerido usando las enzimas de restricción BamHI y SalI, sehizo pasar sobre agarosa al 1% y la banda del vector se purificó. Esto produjo un constructo de vector de coexpresiónpNG 806HuVH1/HuVK4/HuIgG3, del que se pudo expresar el fragmento de anticuerpo humanizado HuVH1/HuVK1-HuIgG3/Kappa.

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Los otros Ejemplos mostrados en la tabla anterior se produjeron todos de manera similar a la descrita en losEjemplos 44 y 47. Sin embargo, en el caso de los constructos que contienen IgG1 humana, la construcción de vectorde coexpresión final se realizó clonando el casete de expresión del gen de Fd de cadena pesada (que incluye tantoel promotor como el gen), cortado como un fragmento de BglII/BamHI (debido a que hay un sitio de restricciónSalI interno en el gen de región constante de HuIgG1 CH1’) y clonado en el sitio de BamHI del vector de cadenaligera preparado apropiadamente. En este caso, se debe de comprobar la orientación del casete de cadena pesada. Estose logró mediante digestión de restricción (por ejemplo, con la enzima de restricción HindIII) y análisis medianteelectroforesis en gel de agarosa, en el que los tamaños de los fragmentos resultantes se observaron con relación afragmentos comparables procedentes de una versión de HuIgG2 similarmente digerida (Ejemplos 11-38). Cuandolos patrones de fragmentación coincidieron para ambos constructos, se pudo estar seguro de que el casete de cadenapesada estaba en la orientación correcta.

Como se ha descrito previamente en el Ejemplo 11, estos constructos se transfectaron en células de mieloma NS0(nº 85110503 de ECACC), vía técnicas estándares de electroporación, y los transfectantes se seleccionaron en buscade la propiedad de resistencia a G418. Los clones obtenidos se ensayaron para la expresión del anticuerpo tanto en losensayos de ELISA de Fd de anticuerpo antihumano como de ELISA de unión a CEA, y se seleccionaron los clonesque se encuentra que muestran los mejores niveles de expresión y de unión a CEA, se expandieron, y se hicieroncrecer para la expresión génica. Como antes, el fragmento de anticuerpo F(ab’)2 humano se purificó después a partirdel sobrenadante de cultivo, como se describe en el Ejemplo 102.

Ejemplo 48

Preparación de proteína de fusión de F(ab’)2 de 806.077 humanizado-[A248S, G251T, D253K]HCPB

Este Ejemplo describe la preparación de un gen que codifica un fragmento de cadena pesada de Fd humanizadade 806.077 ligado a [A248S, G251T, D253K]HCPB, y su coexpresión con un gen que codifica una cadena ligerahumanizada de 806.077 y un gen que codifica el prodominio de carboxipeptidasa B humana, para dar la proteínade F(ab’)2 con una molécula de [A248S, G251T, D253K]HCPB en el término C de cada uno de los fragmentos decadena pesada. Las regiones constante y de bisagra del fragmento de cadena pesada de Fd humanizada se obtienen apartir del isotipo de anticuerpo IgG3 humano. La proteína expresada también se denomina como proteína de fusión deanticuerpo-enzima.

(a) Preparación de un gen que codifica el fragmento de cadena pesada de Fd humanizada de 806.077 ligado a[A248S, G251T, D253K]HCPB, y su clonación en pEE6

Se generó mediante PCR, a partir de pZEN 1921 (Ejemplo de Referencia 2), un gen que codifica Fd de 806.077humanizado enlazado a [A248S, G251T, D253K]HCPB. Se estableció una primera PCR con el molde pZEN1921 (2ng) y los oligonucleótidos SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 101 (100 pM de cada uno) en tampón (100 µl) que contiene10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 0,125 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP ydTTP. La reacción se incubó a 94ºC durante 5 min., después se añadió ADN polimerasa termoestable (2,5 u, 0.5 µl),y la mezcla se cubrió con aceite mineral (100 µl), y la mezcla de reacción se incubó a 94ºC durante 1 min., a 53ºCdurante 1 min., y a 72ºC durante 2,5 min. durante 25 ciclos, más 10 min. a 72ºC. El producto de PCR de 536 pares debases se aisló mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% (agarosa tipo I, Sigma A-6013), seguido del corte dela banda a partir del gen, y del aislamiento del fragmento de ADN.

Se estableció una segunda PCR con el molde IgG3-pBSIIKS+ (8,7 ng, descrito en el Ejemplo de Referencia 4)y los oligonucleótidos SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 103, y el fragmento de 954 pares de bases aislado como sedescribe anteriormente. Los productos de las 2 PCR se combinaron (a 0,2, 1,0 ó 5,0 ng/µl) en tampón de PCR, comose describe anteriormente. La mezcla se incubó a 94ºC durante 5 min., después 10 ciclos a 94ºC durante 1 min. y 63ºCdurante 4 min. Se añadieron los oligos de SEQ ID NOS: 101 y 102 (100 pM de cada uno) en tampón de PCR (50 µl).Tras la incubación a 94ºC durante 3 min., la mezcla se incubó adicionalmente a 94ºC durante 1,5 min., a 53ºC durante2 min. y a 72ºC durante 2 min., durante 25 ciclos, más 10 min. a 72ºC. En este proceso, la base G en la posición 508en SEQ ID NO: 115 se cambió a una base A.

El producto de PCR de 1434 pares de bases se aisló mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1%, se purificóy se digirió con NheI (20 u) y XbaI (80 u) (New England Biolabs Inc.), en volumen total de 100 µl que contiene 10mM de Tris HCl (pH 7,9), 50 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 1 mM de DTT y BSA (100 µg/ml) durante 4 h a 37ºC.El fragmento resultante se aisló nuevamente mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1%, y se purificó. En unadigestión similar, el vector pNG4-VHss-806.077huVH1-HuIgG2CH1’ (10 µg; Ejemplo 11) se cortó con NheI y XbaI,y después se añadió fosfatasa alcalina intestinal de ternera (1 µl; New England Biolabs, 10 u/µl) al plásmido digerido,para eliminar los grupos 5’ fosfatos, y se continuó la incubación a 37ºC durante otros 30 minutos. La actividad defosfatasa se destruyó incubando a 70ºC durante 10 minutos. El plásmido cortado con NheI-XbaI se purificó a partirde gel de agarosa. El producto de PCR digerido mediante NheI-XbaI, procedente de lo anterior (alrededor de 500 ng)se ligó con el ADN plasmídico cortado anterior (alrededor de 200 ng), en 20 µl de una disolución que contiene 50mM de Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, 1 mM de ATP, 50 µg/ml de BSA y 400 u de T4 ADNligasa (New England Biolabs, Inc.) a 25ºC durante 4 h. Se usó una alícuota de 1 µl de la reacción para transformar 20µl de células DH5α de E. coli competentes. Las células transformadas se colocaron en placas sobre L-agar más 100µg/ml de ampicilina. Los clones potenciales que contienen el gen para Fd de 806.077 humanizado-[A248S, G251T,

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D253K]HCPB se identificaron mediante PCR. Cada clon se sometió a PCR como se describe anteriormente, con losoligonucleótidos SEQ ID NOS: 104 y 105. Se analizó mediante electroforesis, en un gel de agarosa al 1%, una muestra(10 µl) de la reacción de PCR. Los clones que contienen el gen requerido se identificaron mediante la presencia deun producto de PCR de 512 pares de bases. Los clones que producen la banda de 512 pares de bases se usaron paraminipreparaciones de ADN. Las muestras de ADN se comprobaron mediante digestión con HindIII y XbaI, en buscade la presencia de los fragmentos de 3751 pares de bases y 1862 pares de bases. Los clones que contienen estosfragmentos al digerir ADN con HindIII y XbaI se usaron para la preparación de ADN plasmídico a gran escala, yla secuencia de injerto se confirmó mediante análisis de la secuencia de ADN. La secuencia del inserto esperado semuestra en SEQ ID NO: 112. De los clones examinados anteriormente, dos contenían la secuencia esperada, pero conuna única mutación de base. El clon 54 (también denominado pMF195) tuvo una base T en la posición 605 en SEQ IDNO: 112, en lugar de la base A, mientras que el clon 68 (también denominado pMF198) tuvo una base C en la posición1825, en lugar de la base T esperada. La secuencia mostrada en SEQ ID NO: 112 se preparó a partir de pMF195 ypMF198 digiriendo ambos (10 µg de cada uno) con XmaI (10 u) y XbaI (100 u) (New England Biolabs) en tampón(100 µl) que contiene 20 mM de Tris-acetato (pH 7,9), 50 mM de acetato potásico, 10 mM de acetato de magnesio, 1mM de DTT y BSA (100 µg/ml). El fragmento de 215 pares de bases procedente de pMF195 y el fragmento de vectorprocedente de pMF198 (tras el tratamiento con fosfatasa alcalina), se aislaron de un gel de agarosa al 1%, y se ligaronjuntos como se describió previamente. La mezcla de ligación se usó para transformar células DH5α competentes. Lascélulas transformadas se colocaron en placas sobre L-agar más ampicilina, y las colonias resultantes se identificaron,mediante digestión del ADN con XmaI y XbaI en busca de la presencia de los fragmentos de 5400 pares de bases y 215pares de bases. Los clones positivos se usaron para la preparación de ADN plasmídico a gran escala, y la secuenciadel inserto se confirmó mediante análisis de secuencia de ADN. El plásmido que contiene el gen de Fd de 806.077-[A248S, G251T, D253K]HCPB, procedente del clon número 102, se denominó pMF213. El fragmento de HindIII-XbaI, procedente pMF213, se clonó en pEE6 [éste es un derivado de pEE6.hCMV - Stephens y Cockett (1989) NucleicAcids Research 17, 7110 - en el que un sitio HindIII, en dirección 5’ del promotor de hCMV, se ha convertido en unsitio BglII], en DH5α (identificadas mediante PCR con los oligonucleótidos SEQ ID NOS: 106 y 107 para un insertode 2228 pares de bases), para dar pMF221.

(b) Preparación del vector de coexpresión para la expresión de la proteína de fusión de anticuerpo con enzima

Para generar vectores capaces de expresar la proteína de fusión de anticuerpo con enzima en células eucariotas, seusó GS-System™ (Celltech Biologics) (documentos WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 y WO 89/10404).El procedimiento requiere la clonación del gen de cadena ligera del anticuerpo humanizado, en la región HindIII-XmaI del vector pEE14. Este vector se describe por Bebbington en METHODS: A Companion to methods in Enzy-mology (1991) 2, 136-145. Para construir el vector de expresión, se digirieron plásmidos pEE14 y pNG3-VKss-806.077HuVK4-HuCK-Neo (Ejemplo 14) con HindIII y XmaI, como se describe anteriormente. El vector apropiado(procedente de pEE14) y el inserto (732 pares de bases procedentes de pNG3-VKss-806.077HuVK4-HuCK-Neo), apartir de cada producto de la digestión, se aislaron en un gel de agarosa al 1%, y se ligaron juntos y se usaron paratransformar cels DH5α competentes. Las células transformadas se colocaron en placas sobre L-agar más ampicilina(100 µg/ml). Se identificaron colonias mediante análisis de restricción del ADN aislado, en busca de la presencia de unfragmento de 732 pares de bases en la digestión del ADN con HindIII y XmaI. Los clones que producen un fragmentode restricción de 732 pares de bases se usaron para la preparación de ADN plasmídico a gran escala, y la secuencia delinserto se confirmó mediante análisis de secuencia de ADN. El plásmido que contiene la secuencia de cadena ligerahumanizada de SEQ ID NO: 70, en pEE14, se denominó pEE14-806.077HuVK4-HuCK.

Para obtener el vector de coexpresión, se cortó pMF221 (10 µg) con BglII (20 u) y SalI (40 U) en tampón (100 µl)que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 7,9), 150 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 1 mM de DTT y BSA (100 µg/ml),y el fragmento de 4560 pares de bases se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa, y se purificó. De formasimilar, se cortó pEE14-806.077HuVK4-HuCK con BamHI (40 u) y SalI (40 u), y el fragmento del vector de 9,95 kbse aisló y se ligó al fragmento de BglII-SalI procedente de pMF221, y se clonó en DH5α. Las colonias se identificaronmediante PCR con 2 conjuntos de oligonucleótidos (SEQ ID NOS: 104 y 105, y SEQ ID NOS: 108 y 109). Los clonesque dan productos de PCR de 185 pares de bases y 525 pares de bases, respectivamente, se caracterizaron mediantesecuenciación de ADN. Un clon con la secuencia correcta se denominó vector de coexpresión de cadena ligera depMF228/HCPB mutante de Fd, en DH5α. La secuencia de Fd humanizada-HCPB mutante se muestra en SEQ ID NO:113. Los restos de 1 a 19 son la secuencia señal, los restos 20 a 242 son la región variable e IgG3 CH1 humanizada,los restos 243 to 306 son la región de bisagra de IgG3, y los restos 307 a 613 son la secuencia de HCPB mutante, conlos cambios en los restos 248, 251 y 253 procedentes de la secuencia de HCPB humana. Los cambios en la secuenciade HCPB se producen en SEQ ID NO: 113 en las posiciones 554 (Ser), 557 (Thr) y 559 (Lys), respectivamente.

(c) Preparación de un vector para la expresión del prodominio de proHCPB

Se preparó, como se describe en el Ejemplo de Referencia 17 de la Solicitud de Patente Internacional NúmeroWO 96/20011, un segundo plásmido de expresión eucariota, pEE12 que contiene un gen para la secuencia prepro,para la secreción del prodominio con un resto de leucina C-terminal adicional (denominado pro-L), de preproHCPB.El plásmido pMF161 se preparó mediante PCR a partir de pMF18, como se describió para la secuencia prepro sinmodificar, pero usando los oligonucleótidos SEQ ID NOS: 110 y 111. El fragmento de 359 pares de bases se clonó enpBluescript para dar pMF141, y subsiguientemente en pEE12 para dar pMF161. La secuencia proteínica de pro-L semuestra en SEQ ID NO: 114.

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(d) Expresión de la proteína de fusión de anticuerpo con enzima en células eucariotas

Para la expresión en células eucariotas, se cotransfectaron, en células COS-7, vectores que contienen genes capacesde expresar la proteína de fusión de anticuerpo con enzima (pMF228) y la secuencia de pro-L (pMF161). Las célulasCOS son una estirpe celular de riñón de mono verde africano, CV-1, transformada con un virus de SV40 de origendefectuoso, y se han usado ampliamente para la expresión transitoria a corto plazo de una variedad de proteínas,debido a su capacidad para replicar plásmidos circulares que contienen un origen de replicación SV40 con un númeromuy elevado de copias. Hay dos clones de células COS ampliamente disponibles, COS-1 y COS-7. La metodologíabásica para la transfección de células COS se describe por Bebbington en Methods: A Companion to Methods inEnzymology (1991) 2, p. 141. Para la expresión de HCPB, se usaron los vectores plasmídicos pMF48 y pMF67 (2µg de cada uno) para transfectar las células COS-7 (2 X 105) en una placa de cultivo de seis pocillos en 2 ml demedio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero fetal de ternera (FCS) inactivado porcalor, mediante un método conocido como lipofección - suministro de polinucleótidos mediado por lípidos catiónicos[Felgner et al. en Methods: A Companion to Methods in Enzymology (1993) 5, 67-75]. Las células se incubaron a37ºC en una incubadora con CO2, durante 20 h. La mezcla de ADN plasmídico en medio libre de suero (200 µl) semezcló suavemente con el reactivo LIPOFECTINTM (12 µl), y se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. Lascélulas se lavaron con medio libre de suero (2 ml). Se añadió medio libre de suero (600 µl) al ADN/LIPOFECTINTM,y la mezcla se superpuso sobre las células, que se incubaron a 37ºC durante 6 h en una incubadora con CO2. El medioque contiene ADN se sustituyó con DMEM normal, que contiene 10% de FCS, y las células se incubaron como antes,durante 72 h. Los sobrenadantes celulares (diluidos 1:10 con 0,025 M de Tris-HCl pH 7,5; 125 µl) se analizaron enbusca de la actividad contra Hipp-Glu (ensayo de 5 h, en un volumen total de 250 µl), esencialmente como se describeen el Ejemplo 103. El sobrenadante diluido dio como resultado un 18,4% de hidrólisis del sustrato Hipp-Glu.

Como alternativa, se puede usar el prodominio sin modificar (procedente del plásmido pMF67 descrito en elEjemplo de Referencia 17 de la Solicitud de Patente Internacional Número WO 96/20011) en lugar del plásmido deexpresión de pro-L, en el experimento anterior.

La expresión a gran escala de proteínas a partir de células COS se describe por Ridder et al. (1995) en GENE 166,273-276 y por Blasey et al. (1996) en CRYOTECHNOLOGY 18, 183-192.

Para la expresión estable en células CHO, se siguieron los procedimientos descritos por Bebbington en MET-HODS: A Companion to Methods in Enzymology (1991) 2, 136-145, usando selección de GS con 25 µM y 50 µM deMSX. Como alternativa, también se puede usar la lipofección, esencialmente como se describe anteriormente para latransfección de células COS, para transfectar células CHO. Las células se transfectan con una mezcla de plásmidospMF228 y pMF161, o pMF228 y pMF67. Los sobrenadantes procedentes de colonias que sobreviven se identificanmediante ELISA de CEA (descrito en el Ejemplo 11) y mediante análisis Western (descrito más abajo), en busca de lapresencia de una banda de 170 kDa que corresponde a la proteína de fusión de anticuerpo con enzima requerida. Lossobrenadantes, diluidos de forma adecuada, también se identifican en busca de la actividad enzimática, como se des-cribe en el Ejemplo 103. Las colonias que expresan la proteína de fusión de anticuerpo con enzima deseada se cultivana la escala requerida (véase, por ejemplo, la publicación de M E Reff (1993) en Current Opinion in Biotechnology 4,573-576, y las referencias citadas allí), y la proteína de fusión se purificó a partir del sobrenadante del cultivo celularmediante uno o más de los métodos descritos en el Ejemplo 102.

(e) Análisis Western

Se realizó un análisis de transferencia Western como se describe a continuación. Se mezclaron alícuotas (20 µl)de cada muestra de sobrenadante con un volumen igual de tampón de muestra (62,5 mM de Tris, pH 6,8, 1% deSDS, 10% de sacarosa y 0,05% de azul de bromofenol), con y sin agente reductor. Las muestras se incubaron a65ºC durante 10 minutos antes de la electroforesis en un gel de gradiente de acrilamida de 8-18% (sistema de gelEXCEL™ de Pharmacia Biotechnology Products), en un aparato MULTIPHOR™ II (LKB Produkter AB), según lasinstrucciones del fabricante. Después de la electroforesis, las proteínas separadas se transfirieron a una membrana(HYBOND™ C-Super, Amersham International) usando un aparato NOVABLOT™ (LKB Produkter AB) según losprotocolos proporcionados por el fabricante. Después de la transferencia, la membrana se secó al aire.

La presencia de fragmentos de anticuerpo se detectó mediante el uso de un anticuerpo kappa anti-humano (SigmaA7164, conjugado de peroxidasa con cadena ligera Kappa anti-humano de cabra), usado a una dilución de 1:2500. Lapresencia de fragmentos de anticuerpo humano se visualizó usando un sistema de quimioluminiscencia (sistema dedetección ECLTM, Amersham International).

Ejemplos 49-74

Preparación de otras proteínas de fusión de F(ab’)2 de 806.077 humanizado-HCPB mutante

Estos Ejemplos describen la preparación de genes que codifican fragmentos de cadena pesada de Fd humanizada de806.077 ligados con una HCPB mutante (D253K; G251T, D253K; A248S, G251T, D253K), y su coexpresión con ungen que codifica una cadena ligera humanizada de 806.077, y un gen que codifica el prodominio de la carboxipeptidasaB humana para dar la proteína F(ab’)2 con una molécula de HCPB mutante en el término C de cada uno de losfragmentos de cadena pesada. Las regiones constante y de bisagra del fragmento de cadena pesada de Fd humanizada

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derivan del isotipo de anticuerpos IgG1 o IgG2 o IgG3 humano. Las proteínas expresadas también se denominan comoproteínas de fusión de anticuerpo-enzima.

Se repitieron los procedimientos descritos en el Ejemplo 48, con las secuencias apropiadas derivadas de la tablamostrada a continuación. Los oligonucleótidos para las construcciones de PCR y para la identificación de clonesderivan fácilmente de las secuencias apropiadas.

Para cambiar la secuencia de HCPB mutante, se sustituye el molde de PCR, el plásmido pZEN1921, en la parte (a)del Ejemplo 48, por pZEN1860 para [G251T, D253K]HCPB (descrita en el Ejemplo de Referencia 1) o por pICI1713para [D253K]HCPB (descrita en la Solicitud de Patente Internacional Número WO 96/20011).

Para cambiar la región constante y de bisagra de la cadena pesada de anticuerpo, se sustituyó el molde de PCR, elvector IgG3-pBSIIKS+, en la parte (a) del Ejemplo 48, por pNG4-VHss-HuIgG1CH1’ (descrito en los Ejemplos 39-47), o por pNG4-VHssHuIgG2CH1’ (nº 40797 de NCIMB).

Para cambiar la secuencia de cadena ligera de anticuerpo humanizada, se sustituyó el vector pEE14-806.077HuVK4-HuCK, en la parte (b) del Ejemplo 48, por pEE14-806.077HuVK1-HuCK o pEE14-806.077HuVK3-HuCK.Los vectores pEE14-806.077HuVK1-HuCK y pEE14-806.077HuVK3-HuCK se preparan como se describe parapEE14-806.077HuVK4HuCK en la parte (b) del Ejemplo 48, pero usando el fragmento de HindIII-XmaI de 732pares de bases procedente de pNG-VHss-806.077HuVK1Neo y pNG-VHss-806.077HuVK3-Neo, respectivamente(descritos en los Ejemplos 12-38), en lugar del fragmento HindIII-XmaI procedente de pNG-VHss-806.077HuVK4-Neo.

En la tabla a continuación se muestran variantes de la proteína de fusión de anticuerpo-enzima para cada Ejemplo.

TABLA

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Ejemplo 75

Preparación de proteína de fusión de [A248S, G251T, D253K]HCPB-F(ab’)2 (806.077 humanizado)

Este Ejemplo describe la preparación de un gen que codifica pro-[A248S, G251T, D253K]HCPB ligado a unfragmento pesado de Fd humanizado (versión 1 VH con IgG3 humana) del anticuerpo 806.077, y su coexpresión conun gen que codifica una cadena ligera humanizada (versión 4 VK con CK) del anticuerpo 806.077. Esto da la proteínaF(ab’)2 con una molécula de la pro-[A248S, G251T, D253K]HCPB en el término N de cada uno de los fragmentos decadena pesada. La enzima se activa mediante la eliminación enzimática del prodominio, usando tripsina.

Se llevaron a cabo técnicas de biología molecular estándares, tales como digestión enzimática de restricción, liga-ción, reacciones de quinasas, desfosforilación, reacción en cadena de polimerasa (PCR), transformaciones bacterianas,electroforesis en gel, preparaciones de tampones y generación, purificación y aislamiento de ADN, como se describepor Maniatis et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Segunda edición: Cold Spring Harbor Labora-tory, Cold Spring Harbor, Nueva York, o siguiendo los procedimientos recomendados de los fabricantes de los produc-tos específicos. En la mayoría de los casos, las enzimas se adquirieron de New England BioLabs, pero se pueden usarotros proveedores, y procedimientos equivalentes. Las secuencias oligonucleotídicas se prepararon en un sintetizadorde ADN Applied Biosystems 380A, a partir de nucleósido protegido en las bases con 5’-dimetoxitritilo-2-cianoetil-N,N’-diisopropil-fosforamiditos, y nucleósidos protegidos enlazados a soportes de vidrio de poros controlados, en unaescala de 0,2 µmoles, según los protocolos suministrados por Applied Biosystems Inc.

Los mutantes de HCPB, de HCPB natural y de las proteínas de fusión con HCPB se evaluaron en busca de sucapacidad para convertir ácido hipuril-L-glutámico o ácido hipuril-L-arginina en ácido hipúrico usando un ensayo abase de HPLC, como se describe en el Ejemplo 103, o en el de la Solicitud de Patente Internacional Número WO96/20011 Ejemplo 20.

Se llevaron a cabo técnicas de inmunoensayo usando métodos basados en aquellos descritos por Tijssen, (1985)Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vo-lumen 15, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, o siguiendo los procedimientos recomendados por los fabricantesde los productos específicos.

Para generar plásmidos capaces de expresar la proteína de fusión de anticuerpo-enzima en células eucariotas, se usóel sistema de GS (Celltech Biologics) (los detalles se encuentran en la Solicitud de Patente Internacional Números WO87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 y WO 89/10404) con los dos plásmidos pEE6 (un derivado de pEE6.hCMVen el que el sitio de restricción de HindIII, en dirección 5’ del promotor de hCMV, se ha convertido en un sitio BglII{Stephens y Cockett, 1989, Nucleic Acids Research, 17, 7110}) y pEE12 (un derivado de pSV2.GS con un númerode sitios de restricción eliminado {Bebbington et al, 1992, Bio/Technology, 10, 169}).

(a) Clonación de pre-pro-HCPB hasta el sitio de corte de la enzima de restricción de XmaI (posición 1048 en SEQID NO: 124)

Se preparó un ADN bicatenario del plásmido pMF18 (como se describe en la Solicitud de Patente InternacionalNúmero WO 96/20011, Ejemplo de Referencia 19), un constructo que consiste en pre-pro-HCPB clonado en el vectorpBluescript II KS+ (Stratagene), usando tecnología de ADN estándar (kit de plásmido Qiagen, o similar), y se digiriómediante enzimas de restricción con las enzimas HindIII y XmaI, cuidando de que se asegure una digestión completa.La enzima de restricción HindIII corta el plásmido pMFl8 justo antes del comienzo de la presecuencia del gen de

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HCPB, y XmaI corta en el codón del aminoácido 240 (prolina) de la proteína madura; el trozo de ADN de HindIIIa XmaI se denomina como el fragmento pre-pro-HCPB. Se purificó el ADN del tamaño correcto, que contiene elfragmento de pre-pro-HCPB (alrededor de 1061 pares de bases).

Se preparó ADN bicatenario del vector plasmídico pUC19 (New England BioLabs), se digirió mediante restriccióncon HindIII y XmaI, y se purificó (alrededor de 2651 pares de bases) de manera similar al fragmento de pre-pro-HCPB.Se prepararon mezclas de ligación para clonar el fragmento génico de HCPB en el vector pUC19, usando una relaciónmolar de alrededor de 1 del vector a 2,5 del inserto, y una concentración de ADN final de alrededor de 2,5 ng/µl, enpresencia de T4 ADN ligasa, 1 mM de ATP y tampón de enzima. Tras la reacción de ligación, la mezcla de ADN seusó para transformar la cepa DH5α de E. coli. Se colocaron en placas alícuotas celulares sobre medios nutrientes deL-agar que contienen 100 µg/ml de ampicilina como selección para el vector plasmídico, y se incubaron toda la nochea 37ºC. Se recogió un número de colonias, y se usó para minipreparaciones de ADN plasmídico bicatenario. Estasmuestras de ADN se analizaron mediante digestión con enzimas de restricción, y se identificó un constructo de laconfiguración correcta. Este plásmido, que contiene el fragmento pre-pro-HCPB hasta el sitio XmaI en el gen maduro,es conocido como pCF003.

(b) Clonación de [A248S, G251T, D253K]HCPB desde la posición G241 + ligador y 5 aminoácidos de VH

Para separar la HCPB de la secuencia de Fd, se introdujo un ligador peptídico neutro que consiste en (glicina-glici-na-glicina-serina)3, en la secuencia, durante la PCR. A fin de generar el fragmento de la secuencia de [A248S, G251T,D253K]HCPB (como se documenta en el Ejemplo de Referencia 2), y añadir el ligador peptídico y los primeros 5aminoácidos de la VH de 806.077 humanizada, se estableció una PCR usando 100 pmoles de cebadores CME 00971y CME 00972 (SEQ ID NOS: 122 y 123) en presencia de aproximadamente 5 ng de ADN de pZen1921, dNTP hastauna concentración final de 200 µM, tampón de reacción de Taq polimerasa, y 2,5 U de Taq polimerasa, en un volumenfinal de 100 µl. La mezcla se calentó a 94ºC durante 10 minutos antes de la adición de la enzima Taq, y la incubaciónde la PCR se llevó a cabo usando 30 ciclos de 94ºC durante 1,5 minutos, 55ºC durante 2 minutos, y 72ºC durante 2minutos, seguido de una única incubación de 72ºC durante 10 minutos al final de la reacción. El producto de PCR quecontiene el fragmento de [A248S, G251T, D253K]HCPB (alrededor de 298 pares de bases) se analizó en busca delADN del tamaño correcto mediante electroforesis en gel de agarosa, y se encontró que contenía predominantementeuna banda del tamaño correcto. El resto del producto procedente de la mezcla de reacción se purificó y se separó delos reactivos en exceso, usando una columna microconcentradora (Centricon™ 100, Amicon), seguido del aislamientodel ADN mediante precipitación con etanol/acetato de sodio, centrifugación, secado a vacío y resuspensión en aguadestilada. El ADN aislado se digirió mediante restricción con enzimas XmaI y EcoRI, y se purificó una banda deltamaño correcto (alrededor de 271 pares de bases).

El ADN bicatenario del plásmido pCF003 (descrito anteriormente), preparado usando tecnología de ADN estándar(kits de plásmidos Qiagen, o similar), se digirió mediante restricción con las enzimas XmaI y EcoRI, y se purificó unabanda del tamaño correcto (alrededor de 2696 pares de bases).

Se prepararon mezclas de ligación para clonar el fragmento génico de HCPB mutante en el vector, usando unarelación molar de alrededor de 1 del vector a 2,5 de inserto (1 de pCF003 a 2,5 de [A248S, G251T, D253K]HCPBen el fragmento del producto de PCR), y una concentración de ADN final de alrededor de 2,5 ng/µl, en presenciade T4 ADN ligasa, 1 mM de ATP y tampón de enzima. Tras la reacción de ligación, la mezcla de ADN se usó paratransformar la cepa DH5α de E. coli. Se colocaron en placas alícuotas celulares sobre medios nutrientes de L-agar quecontienen 100 µg/ml de ampicilina como selección para el vector plasmídico, y se incubaron toda la noche a 37ºC. Serecogieron alrededor de 200 colonias, y se colocaron en placas sobre filtros de nitrocelulosa estériles por duplicado(Schleicher y Schull), se prehumedecieron sobre placas de medios nutrientes de L-agar que contienen 100 µg/ml deampicilina como selección para el vector de plásmido, y se incubaron toda la noche a 37ºC. Una placa duplicada sealmacenó a 4ºC, y actuó como una fuente de células vivas para las colonias; la otra placa se trató para desnaturalizary fijar el ADN de las colonias individuales a la nitrocelulosa. El filtro de nitrocelulosa se eliminó de la placa de agar,y se colocó en sucesión sobre papeles de filtro (Whatman) empapados en: 1. 10% de SDS durante 2 minutos; 2. 0,5M de NaOH, 1,5 M de NaCl durante 7 minutos; 3. 0,5 M de NaOH, 1,5 M de NaCl durante 4 minutos; 4. 0,5 M deNaOH, 1,5 M de NaCl durante 2 minutos; 5. 0,5 M de Tris pH 7,4, 1,5 M de NaCl durante 2 minutos; y 6. 2 x SSC(citrato salino estándar) durante 2 minutos. El filtro se colocó entonces sobre un papel de filtro (Whatman) empapadoen 10 x SSC, y el ADN desnaturalizado se reticuló a la nitrocelulosa mediante tratamiento con luz ultravioleta (agentereticulador de UV Spectrolinker XL-1500). Se dejó que los filtros se secaran al aire, a temperatura ambiente, y despuésse prehibridaron a 60ºC durante una hora en una disolución de 6 x SSC con agitación suave (por ejemplo, usando unaparato de hibridación Techne HB-1D). Obsérvese que la prehibridación bloquea los sitios de unión de ADN noespecíficos sobre los filtros.

A fin de determinar qué colonias contienen los insertos de ADN de interés, el ADN reticulado al filtro de lanitrocelulosa se hibridó con una sonda de 32P-ADN marcada radioactivamente, preparada a partir de un fragmento deADN de la PCR purificado mediante [A248S, G251T, D253K]HCPB (véase anteriormente). Se marcaron alrededorde 50 ng de ADN con 50 µCi de 32P-dCTP (>3000 Ci/mmol) usando T7 ADN polimerasa en un volumen total de50 µl (kit Pharmacia T7 Quickprime), y se dejó que la reacción transcurriese durante 15 minutos a 37ºC. La sondamarcada se calentó hasta 95ºC durante 2 minutos, para desnaturalizar el ADN bicatenario, e inmediatamente se añadióa 10 ml de 6 x SSC a 60ºC, y esta disolución se usó para sustituir la disolución de prehibridación sobre los filtros. Laincubación con agitación suave se continuó durante alrededor de 3 horas a 60ºC. Después de este tiempo, la disolución

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de hibridación se separó por drenaje, y los filtros se lavaron dos veces a 60ºC en 2 x SSC durante 15 minutos cadavez. Los filtros se secaron entonces suavemente, se cubrieron con película adherente (envoltorio SaranTM, o similar),y se expusieron contra una película de rayos X (por ejemplo, Kodak X-OMAT-ARS™), toda la noche a temperaturaambiente. Después del revelado de la película, se identificaron las colonias que contienen los insertos de interéscomo aquellas que dan la exposición más fuerte (puntos más oscuros) sobre la película de rayos X. En esta serie deexperimentos, alrededor de 15% de las colonias dieron una hibridación positiva. A partir de esto, se escogieron 12colonias para la identificación adicional. Estas colonias se recogieron del filtro duplicado, se colocaron en rayas y semantuvieron en medios nutrientes de L-agar que contiene 100 µg/ml de ampicilina, y se hicieron crecer en medionutriente de caldo L que contiene 100 µg/ml de ampicilina.

Las colonias seleccionadas se usaron para minipreparaciones de ADN plasmídico bicatenario. Estas muestras deADN se analizaron mediante digestión con enzimas de restricción, y se identificaron los constructos de la configura-ción correcta. A fin de asegurar que no se habían introducido cambios en la secuencia del ADN durante la PCR, setomó un número de clones con la cartografía de restricción correcta para la preparación de ADN usando tecnologíaestándar (kits de plásmidos Qiagen, o similar), y los insertos se secuenciaron usando varios cebadores oligonucleotídi-cos separados. Se identificó un constructo de la secuencia correcta, y este plásmido, que contiene el pre-pro-[A248S,G251T, D253K]HCPB-ligador-gen de VH de 806.077 humanizado hasta el sitio PstI (en el aminoácido 5) (posición1301 en SEQ ID NO: 124), se denominó pCF004.

(c) Clonación de Fd de 806.077 humanizado

Se preparó ADN bicatenario del plásmido pNG4-VHss-HuVH1-806.077-IgG3CH1’, un constructo que consisteen la versión 1 VH de 806.077 humanizado con IgG3 CH1 humana y la región de bisagra clonado en el vector pNG4(véase el Ejemplo 44), usando tecnología de ADN estándar (kit de plásmido Qiagen, o similar), y se digirió medianterestricción con las enzimas PstI y XmaI. Se purificó el ADN del tamaño correcto, que contiene el fragmento de Fd de806.077 humanizado (alrededor de 854 pares de bases). Se preparó ADN bicatenario del vector plasmídico pUC 19(New England BioLabs), se digirió mediante restricción con PstI y XmaI, y se purificó (alrededor de 2659 pares debases), de manera similar al fragmento de Fd de 806.077 humanizado.

Se comprobaron alícuotas de las muestras de ADN tanto restringido como purificado en busca de la pureza y paraestimar la concentración, usando electroforesis en gel de agarosa comparada con patrones conocidos. A partir de estosestimados, se prepararon mezclas de ligación para clonar el fragmento génico de Fd de 806.077 humanizado en elvector pUC 19, usando una relación molar de alrededor de 1 de vector a 2,5 de inserto, y una concentración final deADN de alrededor de 2,5 ng/µl, en presencia de T4 ADN ligasa, 1 mM de ATP y tampón de enzima.

Tras la reacción de ligación, la mezcla de ADN se usó para transformar la cepa DH5α de E. coli. Se colocaron enplacas alícuotas celulares sobre medios nutrientes de L-agar que contienen 100 µg/ml de ampicilina como selecciónpara el vector plasmídico, y se incubaron toda la noche a 37ºC. Se recogió un número de colonias, y se usó paraminipreparaciones de ADN plasmídico bicatenario. Estas muestras de ADN se analizaron mediante digestión conenzimas de restricción, y se identificó un constructo de la configuración correcta. Este plásmido, que contiene elfragmento de Fd de 806.077 humanizado, desde el sitio PstI hasta el sitio XmaI, es conocido como pCF005.

(d) Clonación del constructo de Fd de 806.077 humanizado en pre-pro-[A248S, G251T,D253K]HCPB-ligador

Se preparó ADN bicatenario del plásmido pCF005 (como se documentó anteriormente), usando tecnología deADN estándar (kit de plásmido Qiagen, o similar), y se digirió mediante restricción con las enzimas PstI y EcoRI.Se purificó el ADN del tamaño correcto, que contiene el fragmento de Fd de 806.077 humanizado (alrededor de 870pares de bases). Se preparó ADN bicatenario del vector plasmídico pCF004 (como se documentó anteriormente), sedigirió mediante restricción con PstI y EcoRI, y se purificó (alrededor de 3950 pares de bases), de manera similar alfragmento de Fd de 806.077 humanizado. Se prepararon mezclas de ligación para clonar el fragmento génico de Fdde 806.077 humanizado en el vector pCF004, usando una relación molar de alrededor de 1 de vector a 2,5 de inserto,y una concentración final de ADN de alrededor de 2,5 ng/µl, en presencia de T4 ADN ligasa, 1 mM de ATP y tampónde enzima.

Tras la reacción de ligación, la mezcla de ADN se usó para transformar la cepa DH5α de E. coli. Se colocaron enplacas alícuotas celulares sobre medios nutrientes de L-agar que contienen 100 µg/ml de ampicilina como selecciónpara el vector plasmídico, y se incubaron toda la noche a 37ºC. Se recogió un número de colonias, y se usó paraminipreparaciones de ADN plasmídico bicatenario. Estas muestras de ADN se analizaron mediante digestión conenzimas de restricción, y se identificó un constructo de la configuración correcta. Este plásmido, que contiene el pre-pro-[A248S,G251T,D253K]HCPB-Ligador-Fd (806.077 humanizado) en pUC19, es conocido como pCF006.

(e) Clonación de pre-pro-[A248S,G251T,D253K]HCPB-ligador-Fd(806.077 humanizado) en el vector pEE6hCMV

Se preparó ADN bicatenario del plásmido pCF006 (como se documentó anteriormente), usando tecnología deADN estándar (kit de plásmido Qiagen, o similar), y se digirió mediante restricción con las enzimas HindIII y EcoRI.Se purificó el ADN del tamaño correcto, que contiene la proteína de fusión (alrededor de 2185 pares de bases).

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Se preparó ADN bicatenario del vector plasmídico pEE6 (como se documentó anteriormente), se digirió medianterestricción con HindIII y EcoRI, y se purificó (alrededor de 4775 pares de bases), de manera similar a la proteína defusión. Se prepararon mezclas de ligación para clonar la proteína de fusión de Fd de 806.077 humanizado en el vectorpEE6, usando una relación molar de alrededor de 1 de vector a 2,5 de inserto, y una concentración final de ADNde alrededor de 2,5 ng/µl, en presencia de T4 ADN ligasa, 1 mM de ATP y tampón de enzima. Tras la reacción deligación, la mezcla de ADN se usó para transformar la cepa DH5α de E. coli. Se colocaron en placas alícuotas celularessobre medios nutrientes de L-agar que contienen 100 µg/ml de ampicilina como selección para el vector plasmídico,y se incubaron toda la noche a 37ºC. Se recogió un número de colonias, y se usó para minipreparaciones de ADNplasmídico bicatenario. Estas muestras de ADN se analizaron mediante digestión con enzimas de restricción, y seidentificó un constructo de la configuración correcta. Este plásmido, que contiene el pre-pro-[A248S,G251T,D253K]HCPB-Ligador-Fd (806.077 humanizado) en pEE6, es conocido como pCF007.

(f) Clonación de la versión 4 de cadena ligera de 806.077 humanizada en el vector pEE12

Se preparó ADN bicatenario del plásmido pNG3-VKss-806.077-HuVK4-HuCK-Neo, un constructo que consisteen la versión HuVK4 de 806.077 humanizada con CK humana clonada en el vector pNG3 (véanse los Ejemplos 12-38), usando tecnología de ADN estándar (kit de plásmido Qiagen, o similar), y se digirió mediante restricción con lasenzimas HindIII y EcoRI. Se purificó el ADN del tamaño correcto, que contiene la cadena ligera de 806.077 humaniza-da (alrededor de 2022 pares de bases). Se preparó ADN bicatenario del vector plasmídico pEE12, se digirió medianterestricción con HindIII y EcoRI, y se purificó (alrededor de 7085 pares de bases), de manera similar a la cadena ligerade 806.077 humanizada. Se prepararon mezclas de ligación para clonar la cadena ligera de 806.077 humanizada en elvector pEE12, usando una relación molar de alrededor de 1 de vector a 2,5 de inserto, y una concentración final deADN de alrededor de 2,5 ng/µl, en presencia de T4 ADN ligasa, 1 mM de ATP y tampón de enzima. Tras la reacciónde ligación, la mezcla de ADN se usó para transformar la cepa DH5α de E. coli. Se colocaron en placas alícuotascelulares sobre medios nutrientes de L-agar que contienen 100 µg/ml de ampicilina como selección para el vectorplasmídico, y se incubaron toda la noche a 37ºC. Se recogió un número de colonias, y se usó para minipreparacionesde ADN plasmídico bicatenario. Estas muestras de ADN se analizaron mediante digestión con enzimas de restricción,y se identificó un constructo de la configuración correcta. Este plásmido, que contiene la versión 4 de cadena ligera de806.077 humanizada, es conocido como pCF008/4.

(g) Clonación de CMVp-pre-pro-[A2485,G251T,D253K]HCPB-ligador-Fd(806.077 humanizado) en pCF008/4

Se preparó ADN bicatenario del plásmido pCF007 (como se documentó anteriormente), usando tecnología deADN estándar (kit de plásmido Qiagen, o similar), y se digirió mediante restricción con las enzimas BglII y SalI. Laenzima de restricción BglII corta el plásmido pCF007 antes del comienzo del líder, promotor y gen de CMV MIE parala proteína de fusión. La enzima de restricción SalI corta alrededor de 520 pares de bases después de los codones deparada de la proteína madura. Se purificó el ADN del tamaño correcto, que contiene la proteína de fusión (alrededorde 4844 pares de bases). Se preparó ADN bicatenario del vector plasmídico pCF008/4, se digirió mediante restriccióncon BamHI y SalI, y se purificó (alrededor de 7436 pares de bases), de manera similar a la proteína de fusión. Seprepararon mezclas de ligación para clonar el gen de fusión de [A248S,G251T,D253K]HCPB-ligador-Fd(806.077humanizado) en el vector pCF008/4, usando una relación molar de alrededor de 1 de vector a 2,5 de inserto, y unaconcentración final de ADN de alrededor de 2,5 ng/µl, en presencia de T4 ADN ligasa, 1 mM de ATP y tampónde enzima. Tras la reacción de ligación, la mezcla de ADN se usó para transformar la cepa DH5α de E. coli. Secolocaron en placas alícuotas celulares sobre medios nutrientes de L-agar que contienen 100 µg/ml de ampicilinacomo selección para el vector plasmídico, y se incubaron toda la noche a 37ºC. Se recogió un número de colonias,y se usó para minipreparaciones de ADN plasmídico bicatenario. Estas muestras de ADN se analizaron mediantedigestión con enzimas de restricción, y se identificó un constructo de la configuración correcta. Este plásmido, quecontiene genes para [A248S,G251T,D253K]HCPB-ligador-F(ab’)2 (806.077 humanizado) en el vector de expresiónde GS pEE12, es conocido como pCF009, y en la Figura 2 se muestra el mapa del plásmido. El ADN y las secuenciasde aminoácidos de la cadena ligera HuVK4 se muestran en SEQ ID NOS: 70 y 71. La secuencia de ADN del pre-pro-[A248S, G251T, D253K]HCPB-ligador-Fd(806.077 humanizado) se muestra en SEQ ID NO: 124, y la secuenciade aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 125.

(h) Expresión de pro-HCPB[mutante]-ligador-F(ab’)2(806.077 humanizado) a partir de células de mieloma deratón

Se ha usado el siguiente método para la expresión de mielomas de todas las proteínas de fusión de la enzima de pro-HCPB mutante (D253K y G251T, D253K y A248S, G251T, D253K). La estirpe celular de mieloma de ratón preferidaes NS0 (Galfre y Milstein, 1981, Methods in Enzymol., 73, 3-46), y está disponible de la Colección Europea de Cul-tivos Celulares Animales PHLS CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG (número de catálogo 85110503de ECACC). Estas células se hicieron crecer en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco/BRL), quecontiene 10% de suero fetal de ternera (FCS) inactivado por calor.

Para la expresión de pro-[A248S, G251T, D253K]HCPB-ligador-F(ab’)2(806.077 humanizado), se usaron dosplásmidos, pCF009 (descrito anteriormente) y pRc/RSV (de Invitrogen, nº de Cat. V780-20) que contiene el gen deresistencia a neomicina para la selección de estirpes celulares estables resistentes a G418. Se usaron alrededor de 5µg de cada plásmido (de 0,5 a 10 µg) para transfectar aproximadamente 8 x 106 células NS0 mediante el métodode lipofección (Felgner et al., en Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 1993, 5, 67-75), que implica

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el suministro de polinucleótidos, mediado por lípidos catiónicos, a las células eucariotas. Las células se cosecharonmediante centrifugación, se lavaron con medio libre de suero (30 ml), se resuspendieron en 800 µl de medio, y semantuvieron a 37ºC en un matraz de cultivo de tejidos, hasta que se añadió el ADN. El medio libre de suero (450 µl)se mezcló suavemente con el reactivo LIPOFECTINTM (50 µl), y se incubó a temperatura ambiente durante 30 a 45minutos. Esta mezcla se añadió a 500 µl de medio que contiene la mezcla de ADN plasmídico (en menos de 100 µl),y se dejó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió medio libre de suero (600 µl) a la mezcla de ADNplasmídico- LIPOFECTINTM, y el complejo se añadió a las células, las cuales se incubaron durante alrededor de 5horas a 37ºC en una incubadora de CO2. El medio que contiene ADN se sustituyó entonces por medio DMEM normal(8 ml) que contiene 10% de FCS, y las células se incubaron toda la noche. El medio se sustituyó entonces nuevamentecon medio DMEM normal (8 ml) que contiene 10% de FCS, y las células se incubaron como antes, sin selección,durante 24 horas. Al final de este período, el medio se cambió a DMEM que contiene 10% de FCS y selección deG418 (1,5 mg/ml), y las células se diluyeron (entre 1 en 4 y 1 en 20) (aproximadamente 0,5 a 1,5 x 106 células porplaca) en el mismo medio, en pocillos de microtitulación (150 µl por pocillo; 2 o más placas por dilución). Las placasde microtitulación se incubaron durante al menos dos semanas a 37ºC en una incubadora con CO2, y después secomprobaron regularmente para determinar la formación de clones viables.

Los medios procedentes de pocillos que contienen clones viables individuales se tomaron para el ensayo y sesustituyeron con medios recientes (que contienen G418). Los medios retirados se ensayaron en busca de la unióndel anticuerpo a CEA, en un ELISA (de la misma manera como se describe en la Solicitud de Patente InternacionalNúmero WO 96/20011, Ejemplo de Referencia 5, parte 1, excepto que la disolución de anticuerpo secundario secambió de anti-ratón a antihumano (conjugado de peroxidasa con cadena ligera kappa anti-humana de cabra, SigmaA7164). También se ensayaron muestras positivas para el ELISA de CEA, en busca de la actividad de la enzima[A248S, G251T, D253K]HCPB (como se describe anteriormente), tras la activación (eliminación del prodominio apartir de la proteína de fusión) mediante tripsina (700 µg/ml en 50 mM de Tris-HCl y 150 mM de NaCl pH 7,6 a4ºC durante 1 hora, deteniéndose la reacción por adición de un exceso de cinco veces de inhibidor de tripsina dehaba de soja). Se identificó un número de clones que produjeron medios que fueron positivos tanto para la unión delanticuerpo 806.077 a CEA como para la actividad de la enzima [A248S, G251T, D253K]HCPB. Estos se ensayaronadicionalmente mediante análisis de transferencia Western no reductora (de la misma manera como se describe en laSolicitud de Patente Internacional Número WO 96/20011, Ejemplo de Referencia 5, parte j, excepto que la disolucióndel anticuerpo se cambió de anti-ratón a anti-humana (conjugado de peroxidasa con cadena ligera kappa anti-humanade cabra, Sigma A7164), para identificar clones que producen predominantemente una proteína de fusión de F(ab’)2(806.077). Estos clones se expandieron entonces, se ensayaron en busca de la generación estable de la proteína defusión a lo largo de un número de generaciones, y los mayores productores se reunieron y se almacenaron congeladosen nitrógeno líquido, usando tecnología estándar.

La amplificación, la expresión en gran cantidad y la fermentación de las proteínas de fusión a partir de células demieloma NS0 se realizó de manera similar a lo descrito por Bebbington et al. (1992) en Bio/Technology 10, 169-175.La proteína de fusión se purificó, y la pro-secuencia se retiró como se describe en el Ejemplo 102.

Ejemplos 76 a 101

Clonación y expresión de otras variantes de pro-HCPB-ligador-Fd(806.077 humanizado) + cadena ligera de (806.077humanizado)

El método para la generación de proteínas de fusión con otros mutantes de HPCB fue similar al detallado en elEjemplo 75 (anteriormente), con la excepción de que, en la parte b del Ejemplo 75, hubo una sustitución de [A248S,G251T, D253K]HCPB por [D253K]HCPB o [G251T, D253K]HCPB, y el ADN plasmídico usado en la reacción dePCR fue pICI1713 (Como se describe en la Solicitud de Patente Internacional Número WO 96/20011, Ejemplo 15) opZEN1860 (Ejemplo de Referencia 1), respectivamente. Tras la clonación, la identificación y la confirmación de lassecuencias, en las reacciones de clonación subsiguientes se usó el plásmido resultante que contiene pre-pro-[D253K]-HCPB-ligador o pre-pro-[G251T, D253K]HCPB-ligador y el gen de VH de 806.077 humanizado, hasta el sitio de PstI(en el aminoácido 5), en el vector inicial de pUC19, en lugar de pCF004.

El método para la generación de proteínas de fusión con otros dominios de CH1 fue similar al detallado en elEjemplo 75 (anteriormente), con la excepción de que, en la parte c del Ejemplo 75, hubo una sustitución de plásmidosque contienen la versión 1 de VH de 806.077 humanizado con las regiones bisagra y CH1 de IgG1 o IgG2 humanaen lugar de 806.077-HuVH1-IgG3CH1’ (SEQ ID NOS: 92 y 56, respectivamente). Después de la clonación, la iden-tificación y la confirmación de secuencias, en las reacciones de clonación subsiguientes se usó el plásmido resultante,que contiene la secuencia de IgG1 o IgG2, en lugar de pCF005.

El método para la generación de proteínas de fusión con otras variantes de la cadena ligera de 806.077 humani-zada fue similar al detallado en el Ejemplo 75 (anteriormente), con la excepción de que, en la parte f del Ejemplo75, hubo una sustitución de plásmidos que contienen la versión 1 o la versión 3 de Lc de 806.077 humanizado enlugar de 806.077-HuVK4-HuCK (SEQ ID NOS: 51 y 96, respectivamente). Tras la clonación, la identificación y laconfirmación de secuencias, en las reacciones de clonación subsiguientes se usó el plásmido resultante que contienela secuencia de cadena ligera alternativa, en lugar del pCF008/4. En la siguiente tabla se muestran las variantes deproteínas de fusión para cada Ejemplo (76 a 101).

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Ejemplo 102

Purificación de proteínas que contienen secuencias de anticuerpos de 806.077

La purificación o enriquecimiento de las proteínas de fusión de F(ab’)2 o del anticuerpo recombinante con laenzima se puede lograr a partir de sobrenadantes de células de mieloma, de células CHO o de células COS a travésde varios métodos, usados individualmente o en conjunto. La purificación de los constructos de F(ab’)2 de 806.077murino, de F(ab’)2 de 806.077 quimérico y de constructos de F(ab’)2 de 806.077 totalmente humanizados, y de losconstructos de la proteína de fusión de anticuerpo con enzima, que incorporan estos constructos de F(ab’)2, se logrómediante uno o más de los diferentes métodos, cromatografía de afinidad o cromatografía de intercambio aniónico, ocromatografía de proteína A/proteína G. Estas técnicas también se pueden aplicar a la purificación de las fusiones delanticuerpo 806.077 con B7 (véase el Ejemplo 104).

(a) Cromatografía de afinidad por antígeno

Se inmovilizó antígeno carcinoembriónico (CEA), frente al que se produjo el anticuerpo 806.077 murino pro-genitor, en una columna (usando productos de Pharmacia). De forma resumida, la inmovilización se realizó vía unenlace de éster estable a un medio de altas prestaciones SepharoseTM, activado mediante NHS y preempaquetado encolumnas (HiTrapTM); el acoplamiento del CEA a la matriz activada se realizó siguiendo las instrucciones estándaresproporcionadas con el producto.

Preparación de una columna de afinidad de 1 ml

En primer lugar, se diluyó una disolución madre de CEA (8 mg/ml) con agente de acoplamiento (hidrogenocar-bonato de sodio 0,2 M, cloruro de sodio 0,5 M; pH 8,3), hasta una concentración final de 0,5 mg/ml. Se lavó unanueva columna con 6 ml de HCl 1 mM enfriado con hielo, a una velocidad que no exceda 1 ml/min. Inmediatamentedespués, se inyectó el ligando de CEA (1 ml a 0,5 mg/ml) en la columna. La columna se cerró herméticamente enambos extremos y se dejó reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los grupos activos en exceso, que nose habían acoplado a ligando, se desactivaron, y cualquier ligando unido no específicamente se eliminó de la columnamediante lavado a través de tres rondas de lavados alternos de pH alto y bajo. Los tampones usados fueron 0,5 M deetanolamina, 0,5 M de cloruro de sodio (pH 8,3) y 0,1 M de acetato de sodio, 0,5 M de cloruro de sodio (pH 4,0). Encada ronda de lavados, se lavaron 6 ml de cada tampón sobre la matriz de la columna. Finalmente, la columna se lavóen tampón de almacenamiento (0,05 M de Na2HPO4, 0,1% de NaN3, pH 7,0).

Procedimiento de purificación

El sobrenadante del cultivo celular que contiene el constructo de fusión o F(ab’)2 deseado, por ejemplo, F(ab’)2 de806.077 quimérico, F(ab’)2 de 806.077 humanizado, o la proteína de fusión de anticuerpo con enzima, se diluyó 1:1con disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,2), y se hizo pasar sobre la columna de afinidad de 1 ml, a un caudalde 1 ml/min. La columna se había equilibrado previamente con disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,2; 50mM de fosfato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio). La columna se lavó con 10 volúmenes de columna de disoluciónsalina tamponada con fosfato, después de que el sobrenadante celular se había hecho pasar sobre la misma. El F(ab’)2unido se eluyó con 5 volúmenes de columna de 100 mM de citrato de sodio (pH 3,0), recogiéndose fracciones de 1 mldel eluyente. La detección del F(ab’)2 eluido se logró mediante análisis de transferencia Western, usando un conjugadode peroxidasa con anticuerpo adecuado (un conjugado de peroxidasa con cadena ligera kappa anti-humana, en el casodel F(ab’)2 totalmente humanizado, Sigma A-7164), y revelando con peróxido de hidrógeno y 4-cloro-1-naftol. Lasfracciones apropiadas se reunieron y se concentraron, usando un concentrador centrífugo (CentriconTM 30), cuandofue necesario.

(b) Cromatografía de intercambio aniónico

El sobrenadante del cultivo celular que contiene el constructo de fusión o F(ab’)2 requerido, por ejemplo, F(ab’)2 de806.077 quimérico, F(ab’)2 de 806.077 humanizado, o la proteína de fusión de anticuerpo con enzima, se diafiltró en50 mM de Tris (usando una cuba agitada con una membrana de corte de peso molecular de 10.000), hasta que la fuerzaiónica de la disolución fue equivalente al tampón de equilibración de la columna. La alícuota de 40 ml del sobrenadantediafiltrado se cargó sobre una columna adecuada (Pharmacia Mono Q™ 10/10 HR), a 2 ml/min. La columna seequilibró previamente con 50 mM de Tris (pH 8,0). Una vez que se hizo pasar el sobrenadante a través de la columna,ésta se lavó nuevamente hasta la línea base con el tampón de equilibración. El material unido sobre la columna seeluyó entonces con 0-50% de tampón B (50 mM de Tris, 1 M de cloruro de sodio pH 8,0), sobre 15 volúmenesde columna. Las fracciones de la elución se recogieron (4 ml por fracción), y aquellas que contienen el F(ab’)2 seidentificaron mediante análisis de transferencia Western usando un conjugado de peroxidasa con anticuerpo adecuado(un conjugado de peroxidasa con cadena ligera kappa anti-humana, en el caso del F(ab’)2 totalmente humanizadoSigma A-7164), y revelando con peróxido de hidrógeno y 4-cloro-1-naftol. Las fracciones apropiadas se recogieron yse concentraron usando un concentrador centrífugo (Centricon™ 30), cuando fue necesario.

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(c) Purificación mediante Proteína A y Proteína G

El sobrenadante de cultivo celular que contiene el constructo de fusión o F(ab’)2 deseado (por ejemplo, F(ab’)2 de806.077, IgG1 o IgG2 o IgG3 de 806.077 quimérico; pro-HCPB-ligador-F(ab’)2 de 806.077, F(ab’)2 de 806.077-HCPB)se diluyó 1:1 con disolución salina tamponada con fosfato antes de cargarlo en una columna previamente equilibradacon disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,2). La columna se lavó con disolución salina tamponada confosfato, nuevamente se volvió a la línea base, antes de que F(ab’)2 o la proteína de fusión unida se eluyese con 100mM de citrato de sodio (pH 3,0) en el caso del F(ab’)2, y 50 mM de glicina, 100 mM de cloruro de sodio (pH 10,8) enel caso de las proteínas de fusión. Las fracciones de la elución se recogieron y se neutralizaron mediante adición de125 µl de 2 M de Tris por 1 ml de volumen de elución. Aquellas fracciones que contienen el F(ab’)2 se reunieron y seconcentraron, cuando fue necesario, usando un concentrador centrífugo.

(d) Escisión de la prosecuencia

Para las proteínas de fusión que contienen la prosecuencia enlazada covalentemente, por ejemplo (pro-HCPB-liga-dor-F(ab’)2 de 806.077), la secuencia se escindió mediante incubación de la fusión con tripsina. Este procedimiento, aescala de miligramos (de fusión), implicó lo siguiente. Se mezcló tripsina con la proteína de fusión, en una relación de1:1000 (tripsina:fusión). La mezcla se incubó durante 24 horas a temperatura ambiente (alrededor de 22ºC), despuésde lo cual se terminó la escisión de la prosecuencia. La proteína de fusión se separó de la prosecuencia recirculando lamezcla en uno de los protocolos de purificación o enriquecimiento cromatográfico genéricos.

Ejemplo 103

Ensayo de la actividad de las proteínas de fusión de anticuerpo-enzima que contienen CPB mutante humana frente aanálogos de profármacos de Hipp-Glu

Los sobrenadantes de cultivos celulares o proteínas de fusión de anticuerpo-enzima purificadas que contienenmutantes de CPB humana (D253K; G252T, D253K; A248S, G251T, D253K: Ejemplos 48-101) se ensayaron paradeterminar su capacidad para convertir ácido hipuril-L-glutámico (Hipp-Glu; Ejemplo de Referencia 9 en la Solicitudde Patente Internacional Número WO 96/20011)) en ácido hipúrico, usando un ensayo a base de HPLC.

La mezcla de reacción (250 µl) contiene 4 µg de proteína de fusión purificada o sobrenadante de cultivo celular(usado puro o diluido con 0,025 M de Tris-HCl pH 7,5; 125 µl) y 0,5 mM de Hipp-Glu en 0,025 M de Tris-HCl,pH 7,5. Las muestras se incubaron durante 5 h a 37ºC. Las reacciones se terminaron mediante adición de 250 µl de30% de metanol, 70% de tampón de fosfato (50 mM; pH 6,5), 0,2% de ácido trifluoroacético, y la cantidad de ácidohipúrico generado se cuantificó mediante HPLC (usando un aparato Hewlett Packard 1090 Serie 11, con un sistemade conjunto de diodos).

Las muestras (50 µl) se inyectaron en una columna (25 cm; HICHROM™ Hi-RPB), y se separaron usando unafase móvil de 15% de metanol, 85% de tampón de fosfato (50 mM; pH 6,5), a un caudal de 1 ml/min. La cantidad deproducto (ácido hipúrico) producido se determinó a partir de curvas de calibración generadas con cantidades conoci-das de ácido hipúrico (Sigma-H6375). Los resultados se expresan como el porcentaje de conversión del sustrato enproducto, a 37ºC, en intervalos de tiempo desde 30 minutos hasta 24 h, dependiendo de la velocidad de conversión.

Para las proteínas de fusión de anticuerpo-enzima con una pro-CPB N-terminal, primero se elimina el prodominiomediante tratamiento con tripsina (700 µg/ml) en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM de NaCl a 4ºC durante 1 h.

Ejemplo 104

Preparación de una proteína de fusión de B7.1 humana con F(ab’)2 de 806.077 humanizado (hB7-806)

Como en el Ejemplo de Referencia 3, se construyó una proteína de fusión, que consiste en la secuencia señal yen el dominio extracelular de B7.1 humana fusionado a la región codificante 5’ de la cadena de Fd del anticuerpo806.077 humanizado, usando técnicas de PCR. Se creó un fragmento de HindIII-NheI que contiene la secuencia señalneutra y el dominio extracelular de B7.1 humana fusionada a la región VH de una cadena pesada de anticuerpo 806.077humanizada. Esto se clonó en un vector adecuado, por ejemplo pNG4-VHss-HuIgG2CH1’ o pNG4-VHss-HuIgG3CH1’(véanse los Ejemplos 39-47) (sustituyendo las bases 1-423 en SEQ ID NO: 18), para crear un gen de fusión de B7.1humana-Fd de 806.077 humanizado. La coexpresión de esta fusión con una cadena L de 806.077 humanizado (unvector adecuado que contiene la versión VK4 de la cadena ligera de 806.077 humanizada es pCF008/4; véase elEjemplo 75) se logró entonces tras la destrucción de un vector de expresión usando sistemas de expresión tales comolos descritos aquí. Tal vector se usó para transfectar células de mieloma NSO, y las colonias se seleccionaron enpresencia de la actividad de unión a CEA en el sobrenadante del cultivo. En los Ejemplos 39-47 se describen otrassecuencias humanizadas.

La proteína de fusión de hB7-806 se expresó a partir de una estirpe celular adecuada, y se purificó usando lacolumna de proteína A como se describió en el Ejemplo de Referencia 3, o uno de los métodos descritos en el Ejemplo102. Se debería observar que se prefieren métodos de purificación distintos de las columnas de proteína A para losfragmentos de anticuerpo 806.077 humanizados, y sus proteínas de fusión. La proteína de fusión se puede ensayar en

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busca de las propiedades tanto de unión al antígeno como al receptor y en busca de la actividad coestimuladora decélulas T cuando se une a células LS174T usando ensayos expuestos en el Ejemplo de Referencia 3.

Ejemplo 105

Preparación de conjugados de F(ab’)2 de 806.077 quimérico y humanizado-CPG2

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 5, con la proteína de F(ab’)2 murina sustituida por una de lasversiones quiméricas descritas en el Ejemplo 8, o una de las versiones humanizadas descritas en los Ejemplos 39-47.

Ejemplo 106

Preparación de proteína de fusión de Fab de 806.077 humanizado-enzima CPG2

Se construyeron constructos de proteínas de fusión de anticuerpo 806.077 humanizado y enzima CPG2 bacteriana,usando metodología de PCR similar a la descrita para la construcción de HvVK4 en los Ejemplos 12-38, en los quese usan cebadores diseñados específicamente, en una reacción de PCR, para amplificar los componentes génicos delanticuerpo y de la enzima (de forma que los productos de ADN resultantes contengan secuencia complementariaque solapa), los cuales se unen entonces vía una reacción de PCR de “corte y empalme/unión”, para obtener el gende fusión de anticuerpo-enzima completo. La proteína de fusión se creó uniendo el extremo 3’ del gen de cadenapesada del anticuerpo 806.077 humanizado de Fd al extremo 5’ del gen codificante estructural de CPG2, para crearun gen codificante de proteína de fusión de Fab-CPG2. En tal constructo, el componente génico de cadena pesada deanticuerpo 806.077 humanizado se puede terminar después del resto K236 para la cadena pesada de Fd de HuVH1-HuIgG1 (SEQ ID NO: 93), después del resto Val 237 para la cadena pesada de Fd de HuVH1-HuIgG2 (SEQ ID NO:57), o después del resto Val 237 de la cadena pesada en la cadena pesada de Fd de HuVH1-HuIgG3 (SEQ ID NO: 95)(de este modo, en cada caso, excluyendo cualquier secuencia que pertenezca a la región de bisagra), y se pueden uniral primer resto de CPG2 situado C-terminal en el sitio de escisión de la secuencia señal (Minton et al (1984) Gene 31,31-38). Sin embargo, a fin de obtener la unión óptima del anticuerpo y las propiedades enzimáticas, también se prevéque pueda ser deseable incorporar restos adicionales en la unión entre los dos componentes constituyentes.

El gen de fusión se clona entonces en un vector adecuado, por ejemplo pNG4-VHss-HuIgG2CH1’ (nº 40797 deNCIMB), después de la digestión mediante enzimas de restricción apropiadas, se realizó el aislamiento del vector ydel fragmento de ADN del gen de fusión, sustituyendo así el gen del anticuerpo original por el de la proteína de fusión.La coextrusión de la fusión con una cadena ligera de 806.077 humanizada se logró entonces tras la construcción de unvector de coexpresión de manera análoga a la descrita en el Ejemplo 11. El vector de coexpresión se usó para transfectarcélulas de mieloma NSO, y las colonias se seleccionaron en presencia de CEA y de la actividad de unión de Fd en unsobrenadante de cultivo como se describió previamente. La proteína de fusión se puede purificar usando una columnade Proteína A, y se muestra que tiene tanto propiedades antigénicas como enzimáticas usando una metodología deensayo estándar.

Ejemplo 107

Combinación adicional de regiones variables de cadena pesada y ligera humanizada basándose en la secuencia VK4de la cadena ligera

Se repitieron los procedimientos descritos en los Ejemplos 12-38 con la secuencia variable de la cadena ligerahumanizada de VK4 (SEQ ID NO: 71) sustituida por la secuencia modificada en la que el resto de tirosina (Tyr) en laposición 35 de SEQ ID NO: 71 se sustituye por un resto de fenilalanina (Phe).

Ejemplo 108

Combinación adicional de regiones variables de cadena pesada y ligera humanizada basándose en la secuencia VK4de la cadena ligera

Se repitieron los procedimientos descritos en los Ejemplos 12-38 con la secuencia variable de la cadena ligerahumanizada de VK4 (SEQ ID NO: 71) sustituida por la secuencia modificada en la que el resto de fenilalanina (Phe)en la posición 72 de SEQ ID NO: 71 se sustituye por un resto de leucina (Leu).

Ejemplo 109

Combinación adicional de regiones variables de cadena pesada y ligera humanizada basándose en la secuencia VK4de la cadena ligera

Se repitieron los procedimientos descritos en los Ejemplos 12-38 con la secuencia variable de la cadena ligerahumanizada de VK4 (SEQ ID NO: 71) sustituida por la secuencia modificada en la que el resto de tirosina (Tyr) enla posición 35 y el resto de fenilalanina (Phe) en la posición 72 de SEQ ID NO: 71 se sustituyen por un resto defenilalanina (Phe) y un resto de leucina (Leu), respectivamente.

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Ejemplo 110

Combinación de regiones variables de cadena pesada humanizada y una secuencia de cadena ligera quimérica

Se repitieron los procedimientos descritos en los Ejemplos 12-38 con la secuencia variable de la cadena ligerahumanizada de sustituida por la secuencia quimérica de SEQ ID NO: 17 descrita en el Ejemplo 8.

Ejemplo 111-113

Expresión de fragmentos F(ab’)2 humanizados con una secuencia variable VK4 de cadena ligera modificada

Se repitieron los procedimientos descritos en los Ejemplos 39-47 con la secuencia de cadena ligera variable descritaen el Ejemplo 107 usada para obtener una sustitución de la secuencia de cadena ligera humanizada de SEQ ID NO: 99en la que el resto de tirosina (Tyr) en la posición 57 de SEQ ID NO: 99 se sustituye por un resto de fenilalanina (Phe).

El Ejemplo 111 es la combinación de HuVH1-HuIgG1 y la SEQ ID NO: 99 modificada, descrita anteriormente.

El Ejemplo 112 es la combinación de HuVH1-HuIgG2 y la SEQ ID NO: 99 modificada, descrita anteriormente.

El Ejemplo 113 es la combinación de HuVH1-HuIgG3 y la SEQ ID NO: 99 modificada, descrita anteriormente.

Ejemplo 114-116

Expresión de fragmentos F(ab’)2 humanizados con una secuencia variable VK4 de cadena ligera modificada

Se repitieron los procedimientos descritos en los Ejemplos 39-47 con la secuencia de cadena ligera variable descritaen el Ejemplo 108 usada para obtener una sustitución de la secuencia de cadena ligera humanizada de SEQ ID NO:99 en la que el resto de fenilalanina (Phe) en la posición 94 de SEQ ID NO: 99 se sustituye por un resto de leucina(Leu).

El Ejemplo 114 es la combinación de HuVH1-HuIgG1 y la SEQ ID NO: 99 modificada, descrita anteriormente.

El Ejemplo 115 es la combinación de HuVH1-HuIgG2 y la SEQ ID NO: 99 modificada, descrita anteriormente.

El Ejemplo 116 es la combinación de HuVH1-HuIgG3 y la SEQ ID NO: 99 modificada, descrita anteriormente.

Ejemplo 117-119

Expresión de fragmentos F(ab’)2 humanizados con una secuencia variable VK4 de cadena ligera modificada

Se repitieron los procedimientos descritos en los Ejemplos 39-47 con la secuencia de cadena ligera variable descritaen el Ejemplo 109 usada para obtener una sustitución de la secuencia de cadena ligera humanizada de SEQ ID NO: 99en la que el resto de tirosina (Tyr) en la posición 57 y el resto de fenilalanina (Phe) en la posición 94 de SEQ ID NO:99 se sustituye por un resto de fenilalanina (Phe) y un resto de leucina residue (Leu), respectivamente.

El Ejemplo 117 es la combinación de HuVH1-HuIgG1 y la SEQ ID NO: 99 modificada, descrita anteriormente.

El Ejemplo 118 es la combinación de HuVH1-HuIgG2 y la SEQ ID NO: 99 modificada, descrita anteriormente.

El Ejemplo 119 es la combinación de HuVH1-HuIgG3 y la SEQ ID NO: 99 modificada, descrita anteriormente.

Ejemplo 120-122

Expresión de fragmentos F(ab’)2 humanizados con una secuencia de cadena ligera quimérica

Se repitieron los procedimientos descritos en los Ejemplos 39-47 con la secuencia de cadena ligera quiméricadescrita en el Ejemplo 110, sustituyendo las secuencias de cadena ligera humanizada usadas en los Ejemplos 39-47.

El Ejemplo 120 es la combinación de HuVH1-HulgG1 y la secuencia de cadena ligera quimérica descrita anterior-mente.

El Ejemplo 121 es la combinación de HuVH1-HuIgG2 y la secuencia de cadena ligera quimérica descrita anterior-mente.

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El Ejemplo 122 es la combinación de HuVH1-HuIgG3 y la secuencia de cadena ligera quimérica descrita anterior-mente.

Ejemplo 123

Preparación de proteína de fusión humanizada basándose en la secuencia VK4 de cadena ligera modificada

Se repitieron los procedimientos descritos en el Ejemplo 48 pero sustituyendo el plásmido pEE14-806.077HuVK4-HuCK por un plásmido que contiene la secuencia VK4 modificada de los Ejemplos 107 y 111 a 113.

Ejemplo 124

Preparación de proteína de fusión humanizada basándose en la secuencia VK4 de cadena ligera modificada

Se repitieron los procedimientos descritos en el Ejemplo 48 pero sustituyendo el plásmido pEE14-806.077HuVK4-HuCK por un plásmido que contiene la secuencia VK4 modificada de los Ejemplos 108 y 114 a 116.

Ejemplo 125

Preparación de proteína de fusión humanizada basándose en la secuencia VK4 de cadena ligera modificada

Se repitieron los procedimientos descritos en el Ejemplo 48 pero sustituyendo el plásmido pEE14-806.077HuVK4-HuCK por un plásmido que contiene la secuencia VK4 modificada de los Ejemplos 109 y 117 a 119.

Ejemplo 126

Preparación de proteína de fusión humanizada basándose en la secuencia VK4 de cadena ligera quimérica

Se repitieron los procedimientos descritos en el Ejemplo 48 pero sustituyendo el plásmido pEE14-806.077HuVK4-HuCK por un plásmido que contiene la secuencia de cadena ligera quimérica de los Ejemplos 110 y 120 a 122.

Ejemplo 127

Preparación de proteína de fusión humanizada basándose en la secuencia VK4 de cadena ligera modificada

Se repitieron los procedimientos descritos en el Ejemplo 75 pero sustituyendo el plásmido pCF008/4 por un plás-mido que contiene la secuencia VK4 modificada de los Ejemplos 107 y 111 a 113.

Ejemplo 128

Preparación de proteína de fusión humanizada basándose en la secuencia VK4 de cadena ligera modificada

Se repitieron los procedimientos descritos en el Ejemplo 75 pero sustituyendo el plásmido pCF008/4 por un plás-mido que contiene la secuencia VK4 modificada de los Ejemplos 108 y 114 a 116.

Ejemplo 129

Preparación de proteína de fusión humanizada basándose en la secuencia VK4 de cadena ligera modificada

Se repitieron los procedimientos descritos en el Ejemplo 75 pero sustituyendo el plásmido pCF008/4 por un plás-mido que contiene la secuencia VK4 modificada de los Ejemplos 109 y 117 a 119.

Ejemplo 130

Preparación de proteína de fusión humanizada basándose en la secuencia VK4 de cadena ligera quimérica

Se repitieron los procedimientos descritos en el Ejemplo 75 pero sustituyendo el plásmido pCF008/4 por un plás-mido que contiene la secuencia de cadena ligera quimérica de los Ejemplos 110 y 120 a 122.

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Ejemplo de Referencia 1

Preparación de la secuencia génica para [G251T,D253K]HCPB

El método de clonación de [G251T,D253K]HCPB en E. coli fue muy similar al método descrito en la Solicitud dePatente Internacional Número WO 96/20011, Ejemplo 15. Nuevamente, se usó pICI266 como el vector de clonación,pero el material de partida para la mutagénesis dirigida al sitio de PCR fue el gen [D253K]HCPB en el plásmido pI-CI1713 (como se describe en la Solicitud de Patente Internacional Número WO 96/20011, Ejemplo 15). Sin embargo,en este caso, se usó mutagénesis dirigida al sitio durante la amplificación de PCR del gen, para cambiar el codón en laposición 251 del aminoácido, en el gen maduro, de Glicina a Treonina (GGC a ACT), el cambio G251T. También, du-rante la generación de esta mutación, se generó un número de otras mutaciones en el mismo sitio (G251), usando unamezcla de oligonucleótidos con cambios de codón en G251. Se identificaron genes mutantes individuales tras la trans-formación e hibridación mediante secuenciación a través del sitio de mutación, antes de completar la secuenciacióngénica. En este ejemplo, sólo se considerará el oligonucleótido para introducir la mutación de G251T. Se prepararondos mezclas de PCR, de manera similar a la descrita en la Solicitud de Patente Internacional Número WO 96/20011,Ejemplo 15. En la primera reacción, los cebadores fueron CAN 00402 (SEQ ID NO: 116) y CAN 00734 (SEQ IDNO: 117). En la segunda reacción, los cebadores fueron CAN 00284 (SEQ ID NO: 118) y CAN 01076 (SEQ ID NO:119). En ambas reacciones, el ADN de partida fue pICI1713.

Se analizaron alícuotas de las dos reacciones de PCR para buscar el ADN del tamaño correcto (alrededor de 750 y250 pares de bases) y para la estimación de la concentración mediante electroforesis en gel de agarosa, y se encontróque contenían bandas predominantemente del tamaño correcto. Después se estableció otra PCR usando cada uno delos dos primeros productos de PCR, con los dos cebadores terminales {CAN 00402 (SEQ ID NO: 116) y CAN 00284(SEQ ID NO: 118)}. Se analizó una alícuota del producto de PCR en busca del ADN del tamaño correcto (alrededorde 1000 pares de bases) mediante electroforesis en gel de agarosa, y se encontró que contenía predominantementeuna banda del tamaño correcto. El resto del producto de la mezcla de reacción se purificó, el ADN aislado se digiriómediante restricción con las enzimas NcoI y EcoRI, y se purificó una banda del tamaño correcto (alrededor de 1000pares de bases) de manera similar a la descrita en la Solicitud de Patente Internacional Número WO 96/20011, Ejemplo16.

El ADN bicatenario de pICI266 se digirió mediante restricción con las enzimas NcoI y EcoRI, y se purificó el ADNdel tamaño correcto (alrededor de 5600 pares de bases). Las alícuotas de las muestras de ADN tanto de vector como deinserto restringidas y purificadas se comprobaron para determinar la pureza y la estimación de la concentración usandoelectroforesis en gel de agarosa, comparando con patrones conocidos. A partir de estos estimados, se prepararonmezclas de ligación para clonar el gen de HCPB en el vector pICI266 de manera similar a como se describe en laSolicitud de Patente Internacional Número WO 96/20011, Ejemplo 16.

Tras la reacción de ligación, la mezcla de ADN se usó para transformar la cepa DH5α de E. coli. Las coloniasse recogieron y se ensayaron mediante hibridación. Después se tomó un número de clones para la preparación deADN plasmídico, y se secuenció a lo largo de la región de la mutación mediante PCR, a fin de identificar clonescon el cambio de G251T de manera similar a como se describe en la Solicitud de Patente Internacional Número WO96/20011, Ejemplo 16. A partir de los resultados de secuenciación, se seleccionó un clon que contiene un plásmidocon la secuencia génica de [G251T:D253K]HCPB requerida, y el plásmido se denominó pZEN1860.

Ejemplo de Referencia 2

Preparación de la secuencia génica para [A248S,G251T,D253K]HCPB

El método de clonación de [A248S,G251T,D253K]HCPB en E. coli fue muy similar al método descrito en elEjemplo de Referencia 1. El material de partida para la mutagénesis dirigida al sitio de PCR fue el gen [G251T,D253K]HCPB en el plásmido pZEN1860 (descrito en el Ejemplo de Referencia 1), en lugar de pICI1713. Sin embargo, en estecaso, se usó mutagénesis dirigida al sitio durante la amplificación mediante PCR del gen, para cambiar el codón en laposición 248 de aminoácidos, en el gen maduro, de alanina a serina (GCT a TTC), el cambio A248S. Se prepararondos mezclas de PCR, de manera similar a como se describe en el Ejemplo de Referencia 1. En la primera reacción,los cebadores fueron CAN 00402 (SEQ ID NO: 116) y CAN 00720 (SEQ ID NO: 120). En la segunda reacción, loscebadores fueron CAN 00284 (SEQ ID NO: 118) y CAN 00726 (SEQ ID NO: 121). En ambas reacciones, el ADN departida fue pZEN1860.

Los métodos de PCR, clonación, expresión e identificación fueron los mismos que para el Ejemplo de Referencia1. A partir de los resultados de la secuenciación, se seleccionó un clon que contiene un plásmido con la secuenciagénica de [A248S, G251T, D253K]HCPB requerida, y el plásmido se denominó pZEN1921.

Ejemplo de Referencia 3

Preparación y caracterización de una proteína de fusión de B7.1 humano y F(ab)2 de A5B7 murino (AB7)

Se han publicado (documento WO 96/20011, Ejemplo de Referencia 5), métodos para la preparación, purificacióny caracterización de anticuerpo F(ab’)2 de A5B7 murino recombinante. La secuencia de ADNc para el antígeno B7.1

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humano (también denominado CD80) se ha aislado y se ha descrito (Freeman G.J et al, Journal of Immunology,1989, 143, 2714-2722). En este Ejemplo, “AB7” se refiere a una proteína de fusión de B7.1 humano-F(ab’)2 de A5B7murino, y “A5B7” se refiere al anticuerpo anti-CEA denominado A5B7.

Usando una estrategia a base de PCR, se aisló la secuencia señal natural y el dominio extracelular de B7.1 humano(que codifica los aminoácidos 1-242) a partir de ADNc preparado a partir de células Raji 5 cultivadas (ATCC No. CCL86), y se fusionó directamente en dirección 5’ de la secuencia codificante en 5’ madura del fragmento Fd de A5B7murino. Esto implicó el aislamiento de la secuencia de B7.1 con los cebadores de PCR 187/96 y 204/96 (SEQ ID NOS:126 y 127) y una secuencia de Fd de A5B7 parcial con los cebadores de PCR 203/96 y 205/96 (SEQ ID NOS: 128 y129). Después de la purificación de los productos de PCR, se mezclaron en cantidades aproximadamente equimolares,y se fusionaron mediante PCR con los cebadores 187/96 y 205/96. El producto de PCR resultante se purificó, sedigirió con HindIII y BstEII (New England Biolabs (UK) Ltd., Wilbury Way, Hitchin, SG4 OTY), y se clonó enla región de HindIII-BstEII de pAF1, usando procedimientos estándares, para crear la fusión de longitud completade B7.1 humano-Fd de A5B7 murino. Este gen de fusión (SEQ ID NO: 130-131) se clonó como un fragmento deEcoRI-HindIII en el sistema de expresión de GSTM del vector pEE6 (Celltech Biologics, Bath Road, Slough, SL14EN) según los protocolos descritos en el documento WO 96/20011, Ejemplo de Referencia 5, para generar el vectorpAB7.1.

Después se clonó un fragmento de BglII-SalI, que contiene el casete de expresión de B7.1-A5B7 Fd, entre lossitios de BglII y SalI del vector pAF6 descrito previamente, para generar un vector (pAB7.2) capaz de coexpresarla proteína de fusión y la cadena L de A5B7. El vector pAB7.2 se usó después para transformar células de mielomaNS0, y las colonias se seleccionaron en base a su capacidad para crecer en ausencia de glutamina. Se identifica-ron estirpes celulares que expresan la proteína de fusión, mediante determinación de la actividad de unión a CEAen el sobrenadante del cultivo, usando el ELISA como se describió. Se seleccionó una estirpe celular, que expresaniveles adecuados de la proteína de fusión (1D4), para la purificación y caracterización de la proteína de fusión deAB7.

Purificación y caracterización de la proteína de fusión de AB7

El material de B7.1(35-242)-ASB7 F(ab)2, AB7 recombinante segregado se purificó a partir del sobrenadante decultivo usando una matriz de agarosa con Proteína A, tal como, por ejemplo, Protein-A Sepharose 4 fast flow, según sefabrica por Pharmacia (Pharmacia Biotech, 23 Grosvenor Rd, St Albans, Herts, AL1 3AW). La matriz se lavó con 2 x8 volúmenes de matriz de tampón de unión (3 M de NaCl, 1,5 M de glicina, pH 8,9). El sobrenadante de cultivo, quecontiene AB7, se diluyó 1:1 con el tampón de unión. La matriz lavada se añadió al sobrenadante de cultivo diluido (1ml de volumen sedimentado de matriz por 40 ml de sobrenadante diluido), y se incubó a 4ºC durante 2 h con agitaciónmoderada. La matriz se hizo girar mediante centrifugación, y se separó mediante vertido cuidadoso aproximadamenteel 75% del sobrenadante. La matriz se resuspendió entonces en el sobrenadante residual, y la suspensión resultantese empaquetó en una columna. La columna se lavó con 5-6 volúmenes de columna de 150 mM de NaCl, 10 mM deNaH2PO4, pH 7,4. El tampón se cambió entonces a 100 mM de citrato de sodio pH 2,8, y se recogieron las fraccionesde la elución. Estas fracciones se titularon a aproximadamente pH 7,0 mediante adición de 2 M de tampón Tris pH8,5. Las fracciones de la elución se analizaron mediante SDS-PAGE no reductor, y se retuvieron las fracciones de picode AB7 como el producto.

Secuenciación N-terminal

Se hizo pasar una muestra de AB7 sobre SDS-PAGE reductor, y se transfirió sobre una membrana de PVDF(poli(difluoruro de vinilideno)) (equipo, geles, membrana de transferencia y métodos de NOVEX, 4202 SorrentoValley Blvd, San Diego, CA 92121, USA.). Las bandas proteínicas se tiñeron con azul de Coomasie, y la banda aaproximadamente 70 kDa (es decir, la fusión de B7.1-Fd) se secuenció N-terminalmente (Applied Biosystems, 494Protein Sequencer (Perkin Elmer, ABI division, Kelvin close, Birchwood Science Park North, Warrington, WA3 7PB).La secuencia obtenida correspondió con la secuencia esperada para B7 maduro (es decir, después de la escisión de lasecuencia líder del aminoácido 35 en SEQ ID NO: 131, Val Ile His Val etc.).

Análisis BIAcore

AB7 se analizó usando un equipo de resonancia plasmónica de superficie BIAcore, obtenido de Biacore (23 Gros-venor Rd, St. Albans, Herts., AL1 3AW, UK.), según los métodos para el análisis de BIAcore de la interacciónCD80/CTLA-4 tomada de Greene JL, Leytze GM, Emswiler J, Peach R, Bajorath J, Cosand W, y Linsley PS. (1996) J.Biol. Chem. 271, 6762-26771. Se inyectaron muestras del producto de AB7 purificado sobre una superficie acopladacon amina de CTLA4-Ig y una superficie acoplada con amina de testigo (control). La unión se pudo ver claramenteen la superficie de CTLA4-Ig, en comparación con la superficie del control (véase la Figura 3). La unión tambiénse puedo demostrar entre CTLA4-Ig y AB7 cuando se inyectó CTLA4-Ig sobre una superficie de AB7 acoplada aamina.

Combinados con los datos procedentes del ELISA anti-CEA, estos datos confirman que la proteína de fusiónde AB7 purificada tiene las propiedades biológicas de ambas partes componentes, a saber, actividades de unión alantígeno y al receptor.

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Actividad coestimuladora de la proteína de fusión de AB7

Se ensayó la capacidad de la proteína de fusión AB7 para proporcionar una señal coestimuladora a las célulasT cuando se unen a células tumorales que expresan CEA, usando una adaptación de un ensayo de coestimulaciónen un formato previamente descrito (Jenkins et al. (1991) J. Immunol. 147:2461). Se incubaron células de tumorcolorrectal LS174T que expresan CEA (fijadas usando 0,5% de paraformaldehído durante 5 minutos a temperaturaambiente), con 10 µg/ml de la proteína de fusión de AB7 (2 horas girando a 4ºC en medio RPMI 1640 (Gibco. LifeTechnologies, Paisley, Scotland), que contiene 0,5% de suero humano (Sigma AB, Sigma Chemical Co, Dorset, UK.).Las células se lavaron dos veces antes del uso, y la unión de la proteína de fusión se confirmó usando una Ig anti-ratón de cabra conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Becton-Dickinson UK Ltd, Oxford) y citometría deflujo (Facscan, Becton Dickinson). Para permitir el uso de células T humanas sin cebar, en el ensayo, se proporcionó elestímulo al receptor de células T (TCR) mediante un anticuerpo anti-receptor de células T (anticuerpo anti-CD3, OKT-3 Orthoclinical Diagnostics, Amersham, UK), revestido previamente sobre los pocillos de una placa de 96 pocillos.Se inmovilizó OKT-3 incubando anticuerpo purificado (2 µg/ml en tampón de revestimiento de bicarbonato, pH 9,6(cápsula preformada, Sigma)) toda la noche a 4ºC en placas de microtitulación de fondo plano, de 96 pocillos (CostarCorporation, Cambridge, MA, USA), que entonces se lavaron tres a cuatro veces con PBS. Las células T periféricaspurificadas (procedentes de sangre humana de donante agotadas negativamente (es decir, extrayendo los componentesdistintos de las células T) usando perlas magnéticas (Dynabeads, Dynal A.S, Oslo, Noruega) se añadieron a los pocillosa 2 x 105/pocillo en 50 µl de medio RPMI 1640 que contiene 5% de suero humano. Las células LS174T unidas a laproteína de fusión se añadieron a los pocillos a 5 x 104/pocillo en 50 µl de medio RPMI 1640 más 5% de suerohumano. Finalmente, el volumen en todos los pocillos se completó hasta 200 µl usando medio RPMI 1640 más 5% desuero humano. Los cultivos se pulsaron con 1,25 µCi de [3H]timidina (Amersham International) después de 48 horas,y se cosecharon 16 horas más tarde con una cosechadora celular semiautomatizada (TomTec harvester, Wallac UK.).La incorporación de [3H]timidina en ADN se cuantificó usando un recuento de centelleo de líquidos (Betaplate Scinty contador Betaplate, Wallac UK.). En la Tabla a continuación se presentan los datos de un ensayo de coestimulacióntípico.

TABLA

Datos de coestimulación

αCD3 = anticuerpo anti-CD3; αCD28 = anticuerpo anti-CD28

Las células T sin cebar requieren tanto señales coestimuladoras como del receptor de células T. En el ensayo, laseñal del receptor de células T se proporciona mediante el anticuerpo αCD3. Al proporcionar una coestimulación víaαCD28 (Becton-Dickinson usado a 0,6 µg/ml) se estimula la captación de [3H]timidina unas 8 veces en comparacióncon αCD3 solo. La presencia de células tumorales no tiene ningún efecto significativo sobre esta estimulación. Alproporcionar la señal coestimuladora mediante la proteína de fusión de AB7 unida a las células tumorales, se estimulala captación de [3H]timidina en más de 3 veces con respecto a aquella dada por las células tumorales solas, y unas11 veces más elevada que la observada en ausencia de coestimulación. La estimulación aparente proporcionada porcélulas tumorales solas puede surgir de células accesorias residuales en la población de células T purificadas. Seobservaron consistentemente incrementos similares en la proliferación de células T en pocillos que contienen proteínade fusión unida a células tumorales, en cada uno de los 5 ensayos llevados a cabo, en comparación con los pocillosque contienen células T y células tumorales no unidas.

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Ejemplo de Referencia 4

Preparación de IgG3-pBSIIKS+

Este ejemplo describe la preparación de un vector que contiene un gen para la región constante y de bisagra decadena pesada de IgG3 humana.

Un gen que contiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 115 [ésta contiene una secuencia (restos 8 a 508) quees similar a SEQ ID NO: 25, pero con los restos 312 y 501 de SEQ 5 ID NO: 25 cambiados a C y G respectivamente],se preparó mediante PCR usando un método similar al descrito por Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA88, 4084-4088.

El gen se obtuvo en dos partes, conocidas como IgG3A e IgG3B. Éstas fueron clonadas separadamente en lossitios de SacI y XmaI de pBluescript KS+ (Stratagene Cloning Systems), para dar los vectores IgG3A-pBSIIKS+ clonA7 y IgG3B-pBSIIKS+ clon B17 respectivamente. Se obtuvo IgG3A para extender más allá del sitio de restricción dePmaCI (CACGTG en las posiciones 334-339 en SEQ ID NO: 115). De forma similar, se obtuvo IgG3B de forma queel extremo 5’ de la secuencia estaba en dirección del sitio de restricción de PmaCI. Para obtener la secuencia génicade IgG3 deseada, los vectores intermedios de IgG3A y IgG3B se cortaron con AflIII y PmaCI. El fragmento del vector(2823 pb), procedente de IgG3A-pBSIIKS+ clon A7, y el fragmento de inserto procedente de IgG3B-pBSIIKS+ clonB17 (666 pb), se aislaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1%, y se purificaron. Los fragmentos seligaron, y la mezcla de ligación se usó para transformar la cepa de DH5α de E. coli. Los clones, que contienen el genrequerido, se identificaron mediante digestión de ADN aislado con SacI y XmaI, para dar un fragmento de 520 pb. Lasecuencia del inserto se confirmó mediante análisis de secuencia de ADN, y el clon número F3 se denominó IgG3-pBSIIKS+.

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REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CEA que comprende regiones que determinan la complementariedad (CDR), en las que lasCDR comprenden las siguientes secuencias:

a) cadena pesada

CDR1 DNYMH (SEQ ID NO: 29)

CDR2 WIDPENGDTE YAPKFRG (SEQ ID NO: 31)

CDR3 LIYAGYLAMD Y (SEQ ID NO: 32); y

b) cadena ligera

CDR1 SASSSVTYMH (SEQ ID NO: 26)

CDR2 STSNLAS (SEQ ID NO: 27)

CDR3 QQRSTYPLT (SEQ ID NO: 28).

2. Un anticuerpo según la reivindicación 1, en el que las CDR 1 y 3 de la cadena pesada se definen adicionalmentecomo:

CDR1 FNIKDNYMH (SEQ ID NO: 30); y

CDR3 HVLIYAGYLA MDY (SEQ ID NO: 33).

3. Un anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende la siguiente estructura, opcionalmente humanizada:

una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 11)

y;

una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 9):

4. Un anticuerpo humanizado según la reivindicación 3, que comprende al menos una de las siguientes secuencias:

una secuencia de región variable de cadena pesada que es VH1 (SEQ ID NO: 55);

una secuencia de región variable de cadena ligera que es VK4 (SEQ ID NO: 71);

una región constante de IgG3 de cadena pesada de CH1 humana;

una región CL de cadena ligera kappa humana; y

una región de bisagra de IgG3 humana;

opcionalmente en forma de un fragmento F(ab’)2.

5. Un conjugado que comprende un anticuerpo según cualquier reivindicación precedente, y un resto efector.

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6. Un conjugado según la reivindicación 5, en el que el resto efector se selecciona de uno de cualquier de lossiguientes:

a) una enzima adecuada para uso en un sistema ADEPT;

b) CPG2;

c) [G251T,D253K]HCPB;

d) [A248S,G251T,D253K]HCPB;

e) una molécula coestimuladora;

f) dominio extracelular de B7;

g) dominio extracelular de B7.1 humano; y

h) dominio extracelular de B7.2 humano; opcionalmente en forma de una proteína de fusión.

7. Un conjugado según la reivindicación 6, que es una proteína de fusión seleccionada de una cualquiera de lossiguientes conjugados (enumerándose las secuencias en la dirección desde el término N hasta el término C):

a) una fusión de F(ab’)2 de 806.077 humanizado-{[A248S, G251T, D253K]HCPB}2, que comprende:

una cadena de Fd’ de anticuerpo, de estructura VH1 (SEQ ID NO: 55)/región constante de CH1 deIgG3/región de bisagra de IgG3;

fusionándose la cadena de Fd’ vía su término C al término N de [A248S,G251T,D253K]HCPB; y

una cadena ligera de anticuerpo de fórmula VK4 (SEQ ID NO: 71)/región de CL de cadena ligerakappa;

b) fusión de {[A248S,G251T,D253K]HCPB}2-F(ab’)2 de 806.077 humanizado, que comprende: [A248S,G251T,D253K]HCPB;

fusionándose la HCPB en su término C, vía un ligador (GGGS)3, al término N de una cadena de Fd’ deanticuerpo de estructura VH1 (SEQ ID NO: 55)/región constante de CH1 de IgG3/región de bisagra deIgG3; y

una cadena ligera de anticuerpo de fórmula VK4 (SEQ ID NO: 71)/región de CL de cadena ligera kappa; y

c) una fusión de (dominio extracelular de B7.1 humano)2-F(ab’)2 de 806.077 humanizado, que comprende:

dominio extracelular de B7.1 humano;

fusionándose B7.1 en su término C al término N de una cadena de Fd’ de anticuerpo de estructuraVH1 (SEQ ID NO: 55)/región constante de CH1 de IgG3/región bisagra de IgG3; y

una cadena ligera de anticuerpo de estructura VK4 (SEQ ID NO: 71)/región de CL de cadena ligerakappa.

8. Una secuencia polinucleotídica capaz de codificar un polipéptido de un anticuerpo o un conjugado como sedefine en cualquier reivindicación precedente.

9. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 8.

10. Una célula hospedante transformada con una secuencia polinucleotídica según la reivindicación 8, o un animalno humano transgénico o una planta transgénica desarrollados a partir de la célula hospedante.

11. Hibridoma 806.077 depositado como nº de depósito 96022936 de la ECACC.

12. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado según cualquier reivindicación precedente, enasociación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en una forma adecuada para laadministración intravenosa.

13. Un conjugado según cualquier reivindicación precedente, para uso como un medicamento.

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14. Un método para obtener un anticuerpo o un conjugado según cualquier reivindicación precedente, que com-prende:

a) someter a la célula hospedante, a un animal no humano transgénico o a una planta transgénica según lareivindicación 10, o al hibridoma de la reivindicación 11, a condiciones que conduzcan a la expresión, yopcionalmente a la secreción, del anticuerpo o conjugado; y opcionalmente

b) purificar al menos parcialmente el anticuerpo o conjugado.

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LISTA DE SECUENCIAS

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

(i) SOLICITANTE:

(A) NOMBRE: ZENECA LIMITED

(B) DIRECCIÓN: 15 STANHOPE GATE

(C) CIUDAD: LONDRES

(E) PAÍS: UNITED KINGDOM

(F) CÓDIGO POSTAL(ZIP): W1Y 6LN

(G) TELÉFONO: 0171 304 5000

(H) FAX: 0171 304 5151

(I) TELEX: 017 1 834 2042

(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 131

(iv) FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A) TIPO DE MEDIO: Disquete

(B) ORDENADOR: IBM PC compatible

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D) PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 32 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

GGAAGCTTGA AGATGGATAC AGTTGGTGCA GC 32

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 31 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

GGAAGCTTAG ACAGATGGGG GTGTCGTTTT G 31

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 34 aminoácidos

1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

1Glu Val Gln Leu

5Gln Gln Ser Gly Ala

10Glu Leu Val Arg Ser

15Gly Ala

Ser Val Lys20Leu Ser Cys Thr Ala

25Ser Gly Phe Asn Ile

30Lys Asp Asn

Tyr Met

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCA 24

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

GACATTGAGC TCACCCAGTC TCCA 24

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 22 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

AGGTSMARCT GCAGSAGTCW GG 22

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 41 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

ACTAGTGGAA TTCAGTGTGA GGTSCARCTG CAGCARTCWG G 41

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 357 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 108 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 360 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(A) LONGITUD: 120 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 39 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

AAGCTTTCCC GCGGGGACAT TGAGCTCACC CAGTCTCCA 39

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

AAGCTTCTCG AGCTTGGTCC CAGCACCGAA 30

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 36 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

AAGCTTGGAA TTCAGTGTGA GGTGCAGCTG CAGCAG 36

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 33 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

AAGCTTCGAG CTCACGGCGA CTGAGGTTCC TTG 33

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 705 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 235 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 765 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 255 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 121 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 369 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 116 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 348 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 167 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 501 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 10 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

1Ser Ala Ser Ser

5Ser Val Thr Tyr Met

10His

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 7 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

16

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

1Ser Thr Ser Asn

5Leu Ala Ser

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

1Gln Gln Arg Ser

5Thr Tyr Pro Leu Thr

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 5 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

1Asp Asn Tyr Met

5His

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

1Phe Asn Ile Lys

5Asp Asn Tyr Met His

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 17 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

17

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

1Trp Ile Asp Pro

5Glu Asn Gly Asp Thr

10Glu Tyr Ala Pro Lys

15Phe Arg

Gly

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 11 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

1Leu Ile Tyr Ala

5Gly Tyr Leu Ala Met

10Asp Tyr

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 13 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

1His Val Leu Ile

5Tyr Ala Gly Tyr Leu

10Ala Met Asp Tyr

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 60 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 60 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 29 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

AAGCTTCCCG GGTATTAAAG CAGAACTTG 29

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 29 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

ACTAGTGGAT CCCAGACATG ATAAGATAC 29

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 39 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

GGTCTATATA AGCAGAGCTG TCTGGCTAAC TAGAGAACC 39

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 39 pares de bases

19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

GGTTCTCTAG TTAGCCAGAC AGCTCTGCTT ATATAGACC 39

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 19 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

GGACTTTCCT ACTTGGCAG 19

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

GGCAACTAGA AGGCACAGTC 20

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 77 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(A) LONGITUD: 71 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 61 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 61 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 357 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

21

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 47:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 381 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 48:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

22

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(A) LONGITUD: 342 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 49:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 321 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:

23

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 50:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 107 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 51:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 705 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:

24

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 52:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 235 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:

25

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

26

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 53:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 385 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

27

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 54:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 360 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 55:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 120 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

28

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 56:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 765 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:

29

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 57:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 255 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:

30

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

31

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 58:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 40 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

32

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:

GGCGACATCC AGCTGACCCA GAGCCCAAGC AGCCTGAGCG 40

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 59:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 46 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:

CTAGCGCTCA GGCTGCTTGG GCTCTGGGTC AGCTGGATGT CGCCGC 46

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 60:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 321 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 61:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 107 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

33

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 62:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 40 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:

GGCCAGATCG TGCTGACCCA GAGCCCAAGC AGCCTGAGCG 40

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 63:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 46 pares de bases

34

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:

CTAGCGCTCA GGCTGCTTGG GCTCTGGGTC AGCACGATCT GGCCGC 46

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 64:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 321 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 65:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 107 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65:

35

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 66:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 22 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 66:

CGTATTAGTC ATCGCTATTA CC 22

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 67:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 39 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 67:

36

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

GTTGGATGTG CTGTAGATCC ACAGCTTTGG AGCCTTACC 39

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 68:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:

TCCGTTTGAT CTCGAGCTTG G 21

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 69:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 39 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 69:

GGTAAGGCTC CAAAGCTGTG GATCTACAGC ACATCCAAC 39

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 70:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 321 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 71:

37

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 107 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 71:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 72:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 64 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72:

38

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 73:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 68 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 74:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 360 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 75:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

39

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(A) LONGITUD: 120 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 75:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 76:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 80 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 76:

40

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 77:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 74 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 77:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 78:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 360 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 78:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 79:

41

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 120 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 79:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 80:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 360 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 80:

42

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 81:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 120 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 81:

43

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 82:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 80 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 82:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 83:

44

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 74 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 83:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 84:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 360 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 84:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 85:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 120 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 85:

45

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 86:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 80 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 86:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 87:

46

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 74 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 87:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 88:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 360 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 88:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 89:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 120 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

47

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 89:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 90:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 360 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 90:

48

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 91:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 120 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 91:

49

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 92:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 780 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 92:

50

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 93:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 260 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 93:

51

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

52

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 94:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 918 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

53

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 94:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 95:

54

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 306 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 95:

55

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

56

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 96:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 705 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 96:

57

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 97:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 235 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 97:

58

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 98:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 705 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 98:

59

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 99:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 235 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 99:

60

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

61

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 100:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 54 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 100:

CCCAGCACCT GAACTCCTGG GAGGAGCAAC AGGACACAGT TATGAGAAGT ACAA 54

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 101:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 50 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 101:

GGGGGTCTAG ATTATTAGTA CAGGTGTTCC AGGACGTAGC TGGCAACATA 50

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 102:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 46 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

62

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 102:

GGGGGAGCTC GGCTAGCACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGC 46

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 103:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 55 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 103:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 104:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 104:

GCCTGTGCTC AATATTGATG G 21

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 105:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 105:

GGAGAAAGCC ATATCTGCCT G 21

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 106:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

63

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 106:

TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC 30

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 107:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 23 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 107:

GGCTGGATTC TCAGTGGCGA CTT 23

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 108:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 18 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 108:

CACAACAGAG GCAGTTCC 18

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 109:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 109:

CACCTTCACC ATCAGCAGCC 20

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 110:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 19 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

64

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 110:

GGACCTGCTG CAGAGTCTG 19

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 111:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 47 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 111:

GGCTGCAGGA ATTCTTATTA TAGACGAACC CGGCTATCAA ACTGAGC 47

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 112:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1870 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 112:

65

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

66

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 113:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 613 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 113:

67

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

68

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

69

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

70

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 114:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 96 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 114:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 115:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 520 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 115:

71

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 116:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 31 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 116:

GTTATTACTC GCTGCCCAAC CAGCCATGGC G 31

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 117:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 23 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 117:

GCAGCAGGAT AGATTGTTGT AGC 23

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 118:

72

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 88 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 118:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 119:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 119:

CAATCTATCC TGCTGCTGGG ACTTCTAAAG 30

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 120:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 120:

GATTGTTGTA GTCCCGGGC 20

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 121:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 121:

GGAGCTACAA CAATCTATCC TTCTGCTGGG 30

73

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 122:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 22 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 122:

ACGGCACCAA GTACACATAT GG 22

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 123:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 90 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 123:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 124:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 2154 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 124:

74

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

75

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 125:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 716 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 125:

76

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

77

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

78

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

79

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 126:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 42 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

80

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 126:

TATATAAAGC TTGCCGCCAC CATGGGCCAC ACACGGAGGC AG 42

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 127:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 45 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 127:

ACTCCACCAG CTTCACCTCG TTATCAGGAA AATGCTCTTG CTTGG 45

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 128:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 45 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 128:

AGAGCATTTT CCTGATAACG AGGTGAAGCT GGTGGAGTCT GGAGG 45

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 129:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 40 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 129:

CCAGGCATCC CAGGGTCACC ATGGAGTTAG TTTGGGCAGC 40

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 130:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1446 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) NÚMERO DE HEBRAS: simple

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(ix) RASGO:

81

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B) LOCALIZACIÓN:16..1435

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 130:

82

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

83

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

84

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 131:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 473 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 131:

85

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

86

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 279 539 T3

87