Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297307

www.elsev ier .es /e imc

Formacin mdica continuada: Infeccin por el VIH en el adulto

Diagnstico de laboratorio de la infeccin por el Vresiste

Federico aliaa Servicio de Mb Departament

informacin del artculo

Historia del artRecibido el 12Aceptado el 14On-line el 23 d

Palabras clave:VIHDiagnstico deMonitorizaci

r e s u m e n

Keywords:HIVLaboratory diaMonitoring

Introducci

A mediadel VIH pardicho virustenido un g

Nota: secartculo en: ht

Autor paraCorreo elec

0213-005X/$ doi:10.1016/j.

Documento descargado de http://www.elsevier.es el 21/05/2015. Copia para uso personal, se prohbe la transmisin de este documento por cualquier medio o formato.culo:de diciembre de 2010de diciembre de 2010

e febrero de 2011

laboratorion

En el diagnstico de la infeccin VIH, para considerar un resultado positivo, se recomienda el uso de trestcnicas con distinto principio o base antignica, siendo obligado que para la conrmacin una de ellassea elWestern Blot. Las tcnicas serolgicas de cuarta generacin acortan el perodo ventana a 13-15 das,debido a que incluyen la deteccin de antgeno-p24. La deteccin del genoma-VIH (ADN proviral/ARN)complementa al diagnstico serolgico en situaciones complejas. La viremia plasmtica (carga viral) seutiliza para el seguimiento de los pacientes infectados por VIH, para contribuir a la decisin del inicio detratamiento y para comprobar el fallo virolgico al rgimen antirretroviral en uso. Las pruebas de resis-tencia se utilizan para guiar el cambio de tratamiento, y para detectar la transmisin de cepas resistentesen los nuevos diagnsticos. Antes de utilizar un antagonista de CCR5 hay que determinar el tropismoviral; para ello, se pueden utilizar mtodos genotpicos, accesibles a los laboratorios de diagnstico, ofenotpicos, de ms difcil acceso.

2010 Elsevier Espana, S.L. Todos los derechos reservados.

Laboratory diagnosis of HIV infection, viral tropism and resistance toantiretrovirals

gnosis

a b s t r a c t

The accurate diagnosis of HIV infection demands that to consider a positive result, at least three assayswith different antigenic base should be used, one of them, Western-Blot being mandatory for conrma-tion. Fourth generation ELISAs shorten the window phase to 13-15 days, as they now include p24 antigendetection. Proviral DNA or Viral RNA detection by molecular methods have proved useful for addressingcomplex situations in which serology was inconclusive. Viral load (HIV-RNA) is routinely used to follow-up HIV infected patients and is used for treatment initiation decisions. It is also used to monitor viralfailure. When this happens, resistance tests are needed to guide treatment changes. Resistance is alsoused to assess the transmission of drug resistance to newly diagnosed patients. Finally, before using ananti-CCR5 drug, viral tropism needs to be determined. This can be done using genotypic tests, widelyavailable in many HIV labs, or phenotypic tests, only available at certain sites.

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n

dos de la dcada de 1980 se introdujo el diagnsticoa identicar individuos con sospecha de infeccin por. Durante estos 25 anos, las pruebas diagnsticas hanran desarrollo como consecuencia del progreso en los

cin acreditada por el SEAFORMEC. Consultar preguntas de cadatp://www.eslevier.es/eimc/formacion.correspondencia.trnico: fegarcia@ugr.es (F. Garca).

conocimientos de los mecanismos inmunopatognicos, de la rela-cin hospedador-virus, de los mecanismos de replicacin vrica, yde la respuesta inmune que sucede en los individuos infectados enel curso de la infeccin. Los adelantos en la tecnologa, principal-mente los avances en tcnicas de biologa molecular a travs dela incorporacin de la PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa),sin duda han contribuido a implementar mtodos de laborato-rio de inestimable valor para el manejo del paciente VIH. En estecaptulo se revisarn los principales mtodos disponibles para eldiagnstico de laboratorio de la infeccin por el VIH, y para la deter-minacin de las resistencias a los antirretrovirales y del tropismoviral.

see front matter 2010 Elsevier Espana, S.L. Todos los derechos reservados.eimc.2010.12.006ncias a los antirretrovirales

Garcaa,, Marta lvareza, Carmen Bernala,b, Naticrobiologa, Hospital Universitario San Cecilio, Granada, Espanao de Microbiologa, Facultad de Medicina Granada EspanaIH, del tropismo viral y de las

Chuecaa y Vicente Guillota

298 F. Garca et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297307

Marcadores inmunolgicos y virolgicos durante lainfeccin

En el curso de la infeccin se pueden utilizar varios marcadoresvricos paracintica y ely la eleccidel diagnses el ARN-Vaproximadaa los 10-12se puede d(ADN provise puede demadamenteen el sueromedia de 22semanas3. Cles de viremla formaci

El intervde anticuery se caractep24 y ausen

Tcnicas de

El diagnde anticuerprcticame

Con objemente negacapaces deproducen sdad es del 9porque la sms puedendefectos inm

El incremla especiccas actualea menor predisminuyebabilidad dde infeccinser conrm

Tcnicas de

La calidadada seleccbase antigpresentes e1985, usabtaban los aintrodujerocomo antgnuevos anttodos los susigui increa los 33-35adquirierontercera genello se acormodicado

ARN-VIH/ADN proviral

Ag p24

10

ra 1.

lumientoulacis tcneaa a 1IH4 (n 99negauiereas co, quefeccde lantad, ene VIdenti% y 9a deanttar imda, laticainacmulpatitomocientnado, y personas con anticuerpos frente a diversos antgenos,6. Debido a la posibilidad de estas reactividades no espec-que recurrir a las pruebas conrmatorias para vericar los

dos positivos de las tcnicas de screening.

s rpidas

eces se pueden plantear situaciones urgentes y por ello sesarrollado tcnicas de ejecucin rpida, que no necesitanaje y se pueden interpretar a simple vista. Se basan en laacin de partculas sensibilizadas de ltex, o eritrocitos, tc-e Dot-inmunoensayo y de inmunocromatograa capilar7. Lailidad oscila entre el 85-99%8,9, y la especicidad entre el 93-suelen producir falsos negativos en muestras con bajo nivelcuerpos o estadios recientes de infeccin10, y falsos positivosiones con alta prevalencia de anticuerpos11.

Documento descargado de http://www.elsevier.es el 21/05/2015. Copia para uso personal, se prohbe la transmisin de este documento por cualquier medio o formato.identicar la infeccin ymonitorizar su tratamiento. Lamomento de aparicin de cada uno de ellos es distinto,n del marcador a detectar va a depender del objetivotico1. El primer marcador que aparece tras la infeccinIH que se puede detectar por tcnicas de amplicacinmente a las dos semanas de la infeccin, generalmentedas. Prcticamente al mismo tiempo que el ARN-VIH,etectar el ADN de VIH integrado en el genoma celularral). El antgeno p24 aparece en suero a los 11-13 das, ytectar, con las tcnicas de mxima sensibilidad, aproxi-durante 1 mes y medio2. Los anticuerpos se detectana las tres o cuatro semanas de la infeccin, con unadas, y alcanzan su concentracin mxima a las 10-12uando aparecen los anticuerpos, disminuyen los nive-ia y desaparece el antgeno p24 como consecuencia de

n de inmunocomplejos1.alo de tiempoque existe entre la infeccin y la aparicinpos o seroconversin, se conoce como perodo ventana,riza por presencia de ADN proviral, ARN-VIH, antgenocia de anticuerpos especcos.

deteccin de infeccin VIH

stico de infeccin se realiza detectando la presenciapos especcos ya que estos se encuentran en el sueronte en el 100% de las personas infectadas.to deminimizar el riesgo de obtener un resultado falsa-tivo todas las tcnicas son extremadamente sensibles, ydetectar anticuerpos de baja avidez por antgeno que selo en las fases tempranas de la infeccin. La sensibili-9%, hay que senalar que es imposible conseguir un 100%eroconversin no ocurre hasta las 3-4 semanas y ade-existir infectados seronegativos como consecuencia deunitarios.ento de la sensibilidad lleva aparejado un descenso de

idad (se producen falsos positivos), aunque las tcni-s cifran la especicidad en torno al 99%. Por otro lado,valencia de la infeccin VIH en la poblacin estudiada,

el valor predictivo positivo y es por tanto mayor la pro-e que se produzcan resultados falsos positivos con tasas

por VIH bajas. Por ello, todo resultado positivo debeado mediante un test conrmatorio1.

screening: ELISA

d diagnstica del ELISA viene determinada por una cui-in del punto de corte o cut-off y sobre todo por lanica utilizada que captura los anticuerpos especcosn la muestra. Las primeras tcnicas se desarrollaron enan como base antignica un lisado vrico, y se detec-nticuerpos a los 40 das de la infeccin1. En 1987 sen las tcnicas de segunda generacin que incorporabanenos protenas recombinantes y pptidos sintticos, ygenos que permitieron detectar anticuerpos frente abtipos M, y los grupos N y O, y frente a VIH-2. Se con-mentar la sensibilidad, detectndose los anticuerposdas tras la infeccin4. En 1994 las tcnicas de ELISAel formato en sndwich, se denominaron ELISA de

eracin, detectan anticuerpos de clase IgG e IgM, y porta el perodo ventana a 22 das4. Estas tcnicas se hanutilizando sustratos uorescentes (ELFA) o formatos de

0

Figu

quimiocesammanipcido lasimultventanARN-Vhasta umenteno reqpersoncuentade la innalestrasplacitos Btipos den la iel 99,5cuencipor losden esutilizala idencontamvos encon hevirus crus, padisemiHLA1,5

cas hayresulta

Tcnica

A vhan deaparataglutinnicas dsensib99%. Sede antien regELISA de 1. generacin

ELISA de 4.a generacin: Anticuerpos + Agp24

ELISA de 2. generacin

ELISA de 3. generacin

Das despus de la exposicin706050403020

ANTICUERPOS

Tiempo de aparicin de marcadores especcos de infeccin VIH.

iniscencia, lo que permite la automatizacin, el pro-de un gran nmero de muestras, la reduccin de

n y de los costes5. Recientemente se han introdu-nicas de cuarta generacin que permiten la deteccinde anticuerpos y antgeno p24, reducindose el perodo3-15 das, es decir, se aproxima casi a la deteccin deg. 1). Con estas tcnicas la sensibilidad se incrementa,9% lo que reduce la posibilidad de un resultado falsa-tivo, esto indica que en principio un resultado negativoconrmacin ni seguimiento serolgico, excepto en

n alto riesgo de adquirir la infeccin6. Hay que tener ense pueden producir falsos negativos en fases iniciales

in hasta que se produce la seroconversin, en estadiosmisma, en pacientes con tratamiento inmunosupresor,os de mdula sea, personas con alteraciones de linfo-pacientes con hipogammaglobulinemia, infectados porH no detectados por la base antignica, o por un errorcacin de la muestra5. La especicidad se sita entre9,9% y se pueden producir falsos positivos como conse-reconocimientos no especcos de sustancias del suerogenos vricos de la base antignica. Los factores que pue-plicados en la falsa reactividad son la base antignicainactivacin de las muestras por calor, los errores encin de las mismas, y la hemlisis, aspecto lipdico yin microbiana del suero. Se han descrito falsos positi-tparas, hemodializados, multitransfundidos, pacientesis alcohlica, personas con infecciones agudas por otrosherpes y VHB, vacunados frente a VHB e Inuenzavi-es con enfermedades autoinmunes, lupus eritematoso

F. Garca et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297307 299

Ensayos conrmatorios

Las tcnicas conrmatorias que se utilizan ms frecuente-mente son el Western Blot (WB) y el inmunoblot recombinante oimunoensaysibilidad qupueden incodiagnostica

El Westetenas vricaelectroforesbrana de nipaciente, latcnica de Ese produceDetecta antgp120 y gpprotenas eque incluyepermite ide

En el mzado lo quesubjetivos,de bandasvricas5. Poplina de lec

La intepuntos conausencia tonumerososconsidera pgp41, y gp12 bandas, etres bandasdarizacinal menos ulaboratorioindicacioneterminadode positividversias yapueden corinfeccin conocomplejonacidos depor calor, cociones cruzapor subtipohiperestimupatolgicaseritematosoo incluso netcnicas deantgeno yexclusivamtado indetela historia clidad de unpatrn de retura con o sen estas siturias (LIA o Ila determinsrico paraante un Wenueva mues

En la repeticin con el nuevo suero, pueden existir varias posi-bilidades, la primera es que la tcnica de screening se mantengapositiva y no se detecten cambios en el WB respecto al primero, oincluso se produzca una disminucin en el nmero de bandas y en

dad,, y elmueesapla mloresi en ea y seism

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DNenomterm

Documento descargado de http://www.elsevier.es el 21/05/2015. Copia para uso personal, se prohbe la transmisin de este documento por cualquier medio o formato.o en lnea (LIA) que tienen comomnimo lamisma sen-e el ELISA y una especicidad superior. Ambas tcnicasrporar antgenos de envoltura de VIH-2 lo que permiter este tipo vrico.rn Blot es una metodologa en la cual las distintas pro-s se separan en funcin de su peso molecular medianteis en gel de poliacrilamida y se transeren a una mem-trocelulosa sobre la que se anade e incuba el suero delunin antgeno-anticuerpo se detecta mediante una

LISA. Si el suero posee anticuerpos frente a una protenauna banda coloreada que dene la reactividad en WB.icuerpos frente a las glicoprotenas de envoltura gp160,41, las codicadas por el gen gag p55, p24 y p17 y lasnzimticas p66, p51 y p311. Existen casas comercialesn al menos una protena del gen env de VIH-2 lo quenticar las infecciones producidas por dicho tipo vrico.omento actual esta metodologa se ha semiautomati-facilita su realizacin, pero los resultados pueden ser

ya que lectura se basa en la observacin de la presenciacoloreadas que corresponden a las distintas protenasr ello, en cada laboratorio se debe establecer una disci-tura de reactividades.rpretacin de los resultados es uno de los mayoresictivos en la serologa VIH, se considera negativo latal de reactividad; para valorar la positividad existencriterios, segn el Center for Disease Control (CDC) seositivo cuando se detectan al menos 2 bandas de p24,60/gp120, la OMS reconoce una prueba positiva conl ARC (Cruz Roja Americana) indica que deben existiruna de cada gen estructural, y el Consorcio de Estan-

de la Serologa de Retrovirus indica que debe existirna de gp120 o gp160 y una de p24 o p312,12,13. Cadadebe establecer sus propios criterios de acuerdo a lass de la tcnica que se utilice. Se interpreta como inde-cualquier reactividad que no rena el criterio mnimoad y es en esta categora donde surgen mas contro-

que las causas del WB indeterminado son diversas yresponder a fases tempranas o estadios avanzados de lan deterioro inmunolgico grave, y presencia de inmu-squepueden reducir los anticuerpos circulantes, recinmadre VIH positiva, a sueros hemolizados, inactivadosn factor reumatoide, o con bilirrubina elevada, a reac-das conotros retrovirus, sueros depacientes infectadosno B o con hipergammaglobulinemia secundaria a lalacin antignica, multitrasfundidos, o a situacionescomo conectivopata, gammapata policlonal y lupusdiseminado5. La posibilidad de un WB indeterminadogativo se incrementa cuando se realiza el screening concuarta generacin, debido a que las mismas detectanla positividad de de dicha tcnica puede deberse casiente a antgeno p24 libre srico. Por todo ello, un resul-rminado debe ser evaluado minuciosamente valorandolnica del paciente, las prcticas de riesgo y la posibi-a infeccin reciente por VIH. Es importante observar elactividades ya que si se detecta alguna banda de envol-in bandas del gen gag, puede deberse a infeccin VIH,aciones se debe de recurrir a otras pruebas conrmato-FI)14 y en ocasiones es necesario complementarlas conacin de ADN proviral o carga viral o antgeno p24 librevalorar una posible primoinfeccin12. En cualquier casostern Blot indeterminado se debe solicitar siempre unatra5.

intensies altanuevanen o dque encon vaning. Spositivde las mcuyo ctividadcomo ide 6 mtieneesin sin

Detecc

La dvirus educe ude repla infeevolucaquellaconclu

El anicas dmomeestudio

Ensayo

Laconocecin. Eanticugresa lincremrecientse agrudetecccacinde ellainfecciy negapuedenPara eltado code bajael ndicon PBprobabanteriones eVIH y p

Determ

El Aen el gesta deen este caso la posibilidad de una reaccin inespeccapaciente debe ser tranquilizado. Se debe solicitar una

stra en un mes y comprobar que las bandas se mantie-arecen para dar una respuesta nal. Hay que destacar,ayora de casos estas situaciones se producen en suerosmuy cercanos al punto de corte en las tcnicas de scree-l suero de repeticin la tcnica de screening semantieneobservanms bandas y un incremento en la intensidadas, probablemente sea debido a una seroconversin, ene informar como positivo si rene los criterios de posi-solicitar una nueva muestra si sigue interpretndose

erminado6. El CDC recomienda realizar un seguimientoen los WB indeterminados, y si el patrn de WB se man-e, el resultado sedebeconsiderarnegativoen individuostologa y riesgo bajo de infeccin.

e antigenemia

cin de anticuerpos especcos, indican exposicin alcin, y la deteccin directa del antgeno viral p24 intro-cepto dinmico en la serologa ya que al ser un ndice

in viral, aporta informacin sobre el estado actual de. Se detecta en estadios iniciales de infeccin, o enSIDA, y sirve de apoyo al diagnstico serolgico en

uaciones en las que la deteccin de anticuerpos no ese8.no p24 se puede determinar en suero y plasma con tc-ISA de captura que aumentan la sensibilidad que en elctual puede llegar a ser de 8 pg/ml, lo que segn algunosede equivaler a 5.000-10.000 copias de ARN de VIH.

a la deteccin de infecciones recientes por VIH

icacin de infecciones recientes es importante paraatrnde transmisindeVIHenuna comunidadopobla-primera fase de la infeccin existen ttulos bajos dey anticuerpos de baja avidez; cuando la infeccin pro-centracin de anticuerpos y la avidez de los mismos se. Los mtodos que permiten diferenciar una infeccinuna crnica basados en la deteccin de anticuerposbajo el trmino STARHS (algoritmo serolgico para lae infeccin reciente por el VIH) que se basa en la apli-os tcnicas de ELISA para detectar anticuerpos VIH, unadicada para que sea menos sensible. Se considera unaciente si lamuestra es positiva para ELISA convencionaln el ELISAmodicado de baja sensibilidad9. Tambin senticar infecciones recientes usando el ndice de avidez.procesa el suero por duplicado (diluido con PBS y tra-anidina que interere en la unin antgeno-anticuerpoez). Tras el procesamiento de ambos sueros se calculaavidez dividiendo la senal obtenida del suero tratado

anidina. Si el ndice es < 0,6 se puede considerar con unad elevada que la infeccin ha ocurrido en los 6 meses5. Hay que destacar, que estas tcnicas se utilizan conmiolgicos, para conocer el patrn de transmisin der disenar medidas preventivas adecuadas.

in de ADN proviral

proviral se corresponde con el genoma viral integradoa de la clula a la que el virus infecta. En la actualidad,inacin est siendo reemplazada por la determinacin

300 F. Garca et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297307

de carga viral (ARN-VIH), en gran parte debido a las dicultadesde disponer de ensayos comerciales para determinar ADN provi-ral, con sucientes controles de calidad y certicacin por agenciasreguladoras, adems de quepara su realizacin se debe utilizar san-gre total. Side utilizar lVIH. En esteaquellas sitcluyente. Seen el diagnmiento de lcontinuacide VIH en e

Determinac

La viremnmero deen plasma.y la situacidecisionesantirretrovidebe iniciarcasos es el r

El objetirpido pormantenerlanivel de carciones de rviral disminy algo msel rgimenun nivel estcionaconunse recomiey despus ala supresin4 meses dutolerabilidatos, ademsrevisin dela replicacipueden extnecen virolde CD4 portorizacin mcambiar su

En los pocasionalmque vuelveen el tratamdiversos estpueden desde resistenc

Se consiviral es detantirretroviser detectabmenos un men cuenta lfrmacos, y

En la actde la cargacapacidad dun nivel deembargo, to

viremia entre 20 y 50 copias/ml. En el mercado existen sistemasbasados en la amplicacin de la senal (branched-DNA) o en laamplicacin de la secuencia (RT-PCR en tiempo real, NASBA yLCx). Las tcnicas de transcripcin reversa-reaccin en cadena de la

rasa, ens (20el suo lo

a dedo enen decescuanpropnsto hann caur otracicibargde

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Documento descargado de http://www.elsevier.es el 21/05/2015. Copia para uso personal, se prohbe la transmisin de este documento por cualquier medio o formato.n embargo, es la determinacin de referencia a la horaos mtodos moleculares para diagnosticar la infeccinsentido juega un papel importante para complementar

uaciones diagnsticas en las que la serologa no es con-puede utilizar para valorar la transmisin madre-hijostico de la transmisin vertical de VIH y para el segui-a prolaxis post-exposicin, aunque, como veremos an, la mayora de los laboratorios utilizan la carga viralstos escenarios.

in de la viremia plasmtica (carga viral)

ia plasmtica o carga viral del VIH se dene como elcopias de ARN del virus que se encuentra presentesSu determinacin, junto con la cifra de linfocitos CD4n clnica del paciente, se emplea para establecer lasteraputicas y para la monitorizacin del tratamientoral16. Es uno de los factores a valorar para decidir si seel tratamiento, si bien el principal indicador en estosecuento de linfocitos CD417.vo del tratamiento es reducir la carga viral de mododebajo de los lmites de deteccin (< 50 copias/mL) ysuprimida el mayor tiempo posible, ya que con estega viral se ha demostrado que no se seleccionan muta-esistencia. Una vez instaurado el tratamiento, la cargauye rpidamente (1-2 log10) en las primeras semanaslentamente a partir del primer mes de tratamiento, sino incluye un inhibidor de la integrasa, hasta conseguirable por debajo del lmite de deteccin que se correla-amayorduracinde la respuestavirolgica. Engeneral,

nda una determinacin al comienzo del tratamiento,las 4 semanas, y cada 4-8 semanas hasta conseguir. El seguimiento posterior se debera realizar cada 3-rante al menos el primer ano18. La potencia, ecacia,d y facilidad de dosicacin de los nuevos tratamien-de la situacin econmica actual estn planteando la

estas pautas de monitorizacin. De hecho, una vez quenviral es suprimida, los intervalos demonitorizacin seender hasta los 6 meses entre los pacientes que perma-gicamente suprimidos y tienen un nivel de recuentoencima de los 350 clulas/l. Se requiere una moni-s estrecha en aquellos pacientes que han necesitado

tratamiento debido al fracaso virolgico19.acientes con carga viral controlada se ha observadoente brotes transitorios de viremia de bajo nivel (blips)espontneamente a ser indetectable sin ningn cambioiento. Se desconoce la patogenia de los blips; aunqueudios sugieren queunpequeno porcentaje de pacientesarrollar fracaso virolgico con aparicin de mutacionesia, en general, no los relacionan con fracaso virolgico.dera que hay un fracaso virolgico cuando la cargaectable a las 24 semanas de comenzado el tratamientoral, o si tras alcanzar la indetectabilidad sta vuelve ale en dos determinacin consecutivas separados en ales. En esta segunda situacin, primero hemos de tener

a tolerabilidad del tratamiento, las interacciones entrela adherencia del paciente.ualidad existen diversas tcnicas para la cuanticacinviral que tan solo dieren en sus formatos, tiempos ye procesamiento. Algunas permiten la deteccin hasta20 copias de ARN de VIH por mililitro de plasma, sindava se desconocen las implicaciones clnicas de una

polimetes sonamplioticanas comningunarrollapermit

Es nyos deuso inael diagviral npuedeutilizay espeSin emnacininfeccimadretico seaquellono esprueba

Algorit

Cuafrentemismadistintellas spositivel algo

Prueb

El cresistedel perdetecten laboutiliza

Entse encual viruestablelos mde cidnes demayorlos eninvestiestudioen la pmendaantirremuestmolecude tal ffalta d(RT-PCR) en tiempo real basadas en sondas uorescen-general, ms rpidas y permiten rangos dinmicos ms-107 copias/ml). Todas las tcnicas detectan y cuan-btipo B, que es el ms prevalente en nuestro medio,s subtipos circulantes ms frecuentes. Sin embargo,las tcnicas detecta el VIH-2. Por ltimo, se han des-sayos, no comerciales y utilizados en investigacin, queetectar una sola copia de ARN-VIH-120

ario destacar, que la elevada sensibilidad de los ensa-ticacin de la carga viral del VIH puede originar uniado del mismo, como ocurre cuando se utilizan para

ico precoz de la infeccin por VIH. Las pruebas de cargasido desarrolladas con una especicidad suciente y

sar falsos positivos21, en estas situaciones es preferibles pruebas genticas de tipo cualitativo con sensibilidaddad ampliamente demostrada, como el ADN proviral.o, existen situaciones especiales en que la determi-la carga viral se pueda usar como diagnstico de laor VIH, como es el caso de ninos recin nacidos deopositivas o en la primoinfeccin, cuando el diagns-ico est comprometido. Se considerarn vlidos slosultados en los que el nivel de viremia sea elevado, sirible descartar la infeccin mediante el uso de otras

iagnstico

el objetivo de las pruebas de deteccin de anticuerposH es el diagnstico de infeccin y la prevalencia de laferior al 10%, se recomienda el uso de tres tcnicas conncipio o base antignica, siendo obligado que una deWestern Blot. Para diagnosticar a una persona comotres pruebas deben ser positivas. En la gura 2 se reejadiagnstico de la infeccin VIH.

ra la deteccin de resistencias a antirretrovirales

imiento de los mecanismos que llevan a la seleccin dey de sus consecuencias (fracaso teraputico), as comoresistencia de cada frmaco, junto con la posibilidad depresenciamediante ensayos que se pueden llevar a caborios de diagnstico clnico, han modicado la forma dede la terapia antirretroviral.s tcnicas disponibles para la deteccin de resistenciasan los mtodos fenotpicos, consistentes en enfrentarferentes concentraciones de un determinado frmaco yl grado de inhibicin comparando con cepas control, ys genotpicos, que emplean el anlisis de la secuenciaucleicos del virus para detectar la presencia demutacio-tencia22,23. Las pruebas genotpicas son las que tienensin entre los laboratorios de diagnstico, mientras que

fenotpicos quedan reservados para laboratorios den. A principios de esta dcada, se realizaron numerosose avalaron la utilizacin de las pruebas de resistenciasca clnica, y que propiciaron que estos ensayos se reco-n todas las guas de prctica clnica sobre tratamiento

iral. Las principales caractersticas de estos estudios sen la tabla 1. Los ensayos genotpicos exigen que la basee las resistencias est sucientemente caracterizada,

a que la deteccin de una mutacin sea predictiva de laividad de un determinado agente. Por esta razn, estas

F. Garca et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297307 301

Positivo Negativo

Informar NegativoPedir nuevo suero Segundo suero

2 Tcnicas: 4.a y 3ageneracin

+/+ +/- -/-

Confirmacin con WB

Tcnica de 4. generacin

Confirmacin con WB

Sospecha de primoinfeccin

Agp24/ADN proviral(Carga Viral) Y Seguimiento

cin

/ADNarga V

e infec

pruebasgentencia (detesensibilidadPara la elabse han utililados de peresistente, ccen en su gebasados enciones con lmodo, anteestudiar el gEn la tabla 2dos genotpa los antirre

Ensayos fen

Los mtnecesario p

dosold Cin dado.

Tabla 1Estudios que v

Estudio

VIRADAPTGARTVIRA3001KAISERNARVALARGENTACTG575HAVANA

FT: fenotipo; G

Documento descargado de http://www.elsevier.es el 21/05/2015. Copia para uso personal, se prohbe la transmisin de este documento por cualquier medio o formato.Positivo

Informar Positivo

Positivo Indeterminado(valorar patrn)

Positivo

Agp24/ADN proviral(Carga Viral)

Negativo Positivo

Nueva muestraSeguimientoPosible primoinfec

Nueva muestraSeguimiento

Informar PositivoSeguimientoPosible primoinfeccin

Agp24(C

Figura 2. Algoritmo del diagnstico d

otpicas tienenengeneralmsvalorparadetectar resis-ccin de una determinadamutacin), que para predecir(ausencia de todas las posibles causas de resistencia).oracin de los perles de resistencia de cada frmaco

resultaIC50 (Fpretacimpliczado diferentes abordajes, como analizar los virus ais-rsonas en los que el fenotipo a un frmaco concreto eraaracterizando en estas cepas lasmutaciones que apare-noma, y ms recientemente, los modelos de prediccinla respuesta virolgica, que relacionan el perl demuta-a ecacia de un frmaco en un rgimen TARGA. De esteun fracaso a una combinacin de frmacos, se puedeenotipo y deducir que frmaco es causante del fracaso.se recogen las ventajas e inconvenientes de los mto-

icos y fenotpicos para la determinacin de resistenciastrovirales.

otpicos

odos fenotpicos miden la concentracin de frmacoara inhibir la replicacin viral en cultivo celular. Los

nucleares dactualidadbinantes. Encon CMSP atibilidad reen base a lala replicacisu gran labestnal alcaeliminar algbasados enmayor rapidsin estar dten en la oplasma dedentro de u

aloraron la utilidad de los estudios de resistencia.

Diseno Duracin N CV VIH (log10 copias/mL)

GT/STD 6 meses 108 1,15 vs 0,67GT/STD 3 meses 153 0,94 vs 0,47FT/STD 4 meses 274 1,23 vs 0,87FT/STD 4 meses 115 0,25 vs 0,4GT/FT/STD 3 meses 541 -GT/STD 3 y 6 meses 174 -FT/STD 6 meses 238 -GT/STD 6 meses 274 1,1 vs 0,8

T: genotipo; STD: estndar de tratamiento.Repetir 1. muestraPedir nuevo suero paradescartar error de muestra Negativo

Nueva muestraSeguimiento

Negativo

proviraliral)

cin VIH.

se expresan generalmente en forma de cambios en lahange -FC-), comparando con una cepa control. La inter-el valor de FC es diferente dependiendo del frmacoLos mtodos de sensibilidad del virus en clulas mono-

e sangre perifrica (CMSP) han sido desplazados en lapor otros ensayos basados en modelos de virus recom-

los primeros se asla el virus del paciente y se cultivanadiendo diluciones seriadas del frmaco. La suscep-

lativa del virus a un frmaco determinado se establecemenor concentracin del frmaco capaz de suprimirn viral. Esta tcnica presenta serios inconvenientes por

oriosidad, y porque son mtodos caros, lentos y que noncede cualquier laboratoriodediagnstico clnico. Parauno de estos inconvenientes se disenaron los mtodosel empleo de virus recombinantes que consiguen unaez y reproducibilidad en los resultados, aunque siguen

isponibles en los laboratorios de diagnstico. Consis-btencin de la secuencia de los genes de RT y PR delun paciente por medio de RT-PCR y su introduccinn sistema ya estandarizado para la produccin de un

p %pacientes CV

302 F. Garca et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297307

Tabla 2Ventajas e inconvenientes de los ensayos genotpicos y fenotpicos para la determinacin de resistencias a los antirretrovirales.

Ventajas Inconvenientes

GenotipoRapidez Deteccin indirecta de la resistenciaDicultad tcnica media, realizable en laboratorios hospitalarios Desconocimiento del efecto de las resistencias cruzadasMenor coste econmico Puede no existir correlacin con el anlisis fenotpicoLa mutacin precede a la resistencia fenotpica Carencia de sensibilidad para las variantes menores (< 20%)

Requieren la interpretacin por un expertoNo son vlidos para nuevas drogas hasta que se disenan los algoritmos de interpretacin y sevalidan clnicamente

FenotipoMedida directa de la sensibilidad a los distintos antirretrovirales No puede realizarse con cargas virales bajasProporciona informacin acerca de las resistencias cruzadas No detecta subpoblaciones virales que constituyan menos del 10-20% de la poblacin totalReejan el efecto de todas las mutaciones presentes, incluso aquellasque an no han sido descritas

No aporta sensibilidad a combinaciones de frmacos

Los resultados son fciles de interpretar Falta de estandarizacin en los valores de IC50 de cada frmacoDisponible nicamente en laboratorios comerciales por su elevada complejidadElevado coste y tcnica complejaPosible seleccin de variantes vricas mejor adaptadas al cultivo celular

VIH recombinante capaz de infectar una lnea celular, incluyendoun procedimiento que facilita la lectura de los resultados. Actual-mente hay tres companas principales que ofrecen la realizacinde estas pruebas fenotpicas: Antivirogram (Virco), PhenoSense

(Virologic) yPhenoscript (VIRAlliance). Las caractersticasdeestosensayos se muestran en la gura 3. La interpretacin de los resul-tados de estos ensayos, aunque ms intuitiva y sencilla, no estexenta de complicaciones, ya que analizan la sensibilidad frmacoa frmaco, y en la vida real las combinaciones pueden suponer uncomportamiento diferente del meramente aditivo.

Ensayos genotpicos

En ellos se estudian los cambios en el gen de la transcriptasainversa, proteasa, o integrasa, que generan la resistencia frente a

anlogos y no anlogos de los nuclesidos/tidos, frente a los inhi-bidores de la proteasa y frente a los inhibidores de la integrasa,respectivamente, que se conocen como mutaciones de resisten-cia. Tambin se pueden determinar mutaciones en HR1 y HR2 paraestudiar la resistencia frente a los inhibidores de la fusin, aun-que estos frmacos (enfuvirtide) se utilizan ya muy poco en terapiaantirretroviral.

La tcnica ms empleada para la deteccin de mutaciones deresistencia es la secuenciacin poblacional del genoma que codicalas enzimas transcriptasa inversa, proteasa o integrasa. Antes de lasecuenciacin es necesario extraer el cido nucleico del plasma delpaciente, transcribirloenADN(retrotranscripcin)yhaceralmenosuna reaccin de amplicacin (PCR). Una vez realizada la reac-cin de secuenciacin, el procedimiento de lectura se encuentraautomatizado mediante electroforesis acoplada a la deteccin de

PlasenV

lsmidoeleciona

fato

binaciloga

gag-prot

in de vinantestipificado

(1)

Figura 3. EnsaEn el mtodo Acontiene el genel virus recomrecombinacincontrolado popuede medir mque reduce elel genoma delas protenas ddel gen de la lu

Documento descargado de http://www.elsevier.es el 21/05/2015. Copia para uso personal, se prohbe la transmisin de este documento por cualquier medio o formato.RT-PCR RT-PCR

ma PlasmaElectroporacin Plsmido

delecionado

Producto PCRProducto PCR

Pd

PlsmidolinearizadoPlsmidolinearizado

Plsmido conprotena VSV-G

Precipitacin fosclicico

Recomhom

gag-prot-RT

cel.MT-4

Nested PCR

Recombinacin homologa

Virus recombinantes

Expansin virus

Tratamiento coninhibidores de laproteasa

Produccrecombpseudo

(2)Titulacin Test susceptibilidad

Tratamiento coninhibidores dela transcriptasareversa

Infeccin

Cuantificacin produccin deb-galactosidasa

yos de virus recombinantes para la determinacin fenotpica de la resistencia a los antirntivirogram (Virco) (1) los virus recombinantes se preparan mediante transfeccin de coma completo del VIH salvo la regin gag-pro-RT. La CI50 del virus recombinante se deterbinante en presencia de diluciones de cada antirretroviral. El mtodo Phenoscript (Virallihomloga, como en el Antivirogram, con un slo ciclo de replicacin viral, como en el Phe

r LTR de HIV de modo que cuando se acumulan sucentes productos del gen TAT en la clediante colorimetra o uorimetra. El mtodo Phenosense (ViroLogic) (3), a diferencia d

tiempo para los resultados. Utiliza un proceso de ligacin, ms que de recombinacin homuna partcula de VIH en la que el gen env ha sido sustituido por un gen productor de lucife VIH a excepcin de las de envoltura y, en su lugar, se expresa el gen de la luciferasa. Laciferasa en cultivos de clula infectadas con el virus recombinante en presencia de antirRT-PCR

Plasma

Producto PCR

do

Plsmidolinearizado

n

-RT gag-prot-RT

Ligacin

Tratamiento coninhibidores de laproteasa

irus

sProduccin de virus

Plsmido con MLV

Precipitacion fosfato clcico

env-luciferasa

Plsmidodelecionado

(3)

Transfeccin cel. Productoras 293TTratamiento coninhibidores de latranscriptasareversa

recombinantespseudotipificados

Infeccin

Cuantificacin luciferasa

retrovirales.lulas MT-4 con el producto amplicado PR-RT y con un plsmido quemina en cultivos,midiendo la viabilidad de clulasMT4 infectadas conance) (2), combina aspectos de los otros dos mtodos: un proceso denosense. Las clulas diana (P4) contienen el gen de la-galactosidasaula infectada, se expresa el gen de la -galactosidasa y su producto seel Antivirogram, es un ensayo de un solo ciclo de replicacin viral, loologa, para introducir el fragmento amplicado mediante RT-PCR en

erasa. En un ciclo de replicacin este virus es capaz de producir todasCI50 del virus recombinante se determina cuanticando la expresinretrovirales.

F. Garca et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297307 303

Tabla 3Principales guas de tratamiento antirertroviral.

Gua Acceso

IAS (International AIDS Society) www.iasusa.org/guidelines/index.htmlDHHS (U.S. D ov/guCDC (CentreEACS (Europ clinicBHIVA (Briti nicalGGESIDA-PNS

Nacional sientim

dideoxi-nucla obtencipara compacia para estresistenciadesarrolladesta aplicacViroSeq Hmero emplgel, mientrla electrofola edicin dcin.

Las tcnun 98-100%viral superidas modicmuestra cosecuencia onal es en rpresentes enes que supqu los mmaco peroencontrarsey pueden sconere resrepresentanles: clonacidilucionesson aplicabnstico clnpermiten laeste momemasiva, aunque por elciones de remetodologdiagnsticotcnicas socenar y maespeccamblarlas, anoobstante, sise presentaconvencion

Interpretaci

La interpconstituye uinformacindeterminanesmuy claro

s occil dede alta intcon

stencotiv

ue fainascilloo fasnos

istenmos/hivdSIDA

sa (westigphenl Fenresishibia losos losetacque vltimar lasuyenribetacioal, sien dir laetacmosde tel delpractaciontradouiendse b

po re

iones

Documento descargado de http://www.elsevier.es el 21/05/2015. Copia para uso personal, se prohbe la transmisin de este documento por cualquier medio o formato.epartment of Health Human Services) http://www.aidsinfo.nih.gfor Disease Control) http://www.cdc.gov/hiv/ean AIDS Society) http://www.europeanaidssh HIV Association) http://www.bhiva.org/Cli(Grupo SEIMC de Estudio de SIDA-Planobre el SIDA)

www.gesida.seimc.org/pcappag=dcconsensos txt.ht

letidos (terminadores de cadena) uorescentes. Trasn de la secuencia es necesario un anlisis informticorar las secuencias obtenidas con una cepa de referen-ablecer las mutaciones encontradas relacionadas cona antirretrovirales. Algunas de las companas que hano reactivos y equipos de secuenciacin automtica parain son TruGene HIV-1 Genotyping Test (Siemens) yIV-1 Genotyping System (Abbott Diagnostics). El pri-ea la secuenciacin bidireccional y la electroforesis enas que el segundo emplea el mtodo unidireccional yresis capilar. Ambos sistemas ofrecen un software parae las secuencias y un algoritmo propio de interpreta-

icas de secuenciacin, comerciales o caseras asegurande xito en la amplicacin en muestras con una cargaor a 500-1.000 copias/ml, sin embargo, con las adecua-aciones es posible amplicar prcticamente cualquiern carga viral detectable24. No debemos olvidar, que labtenida por estos mtodos de secuenciacin poblacio-ealidad la secuencia promedio de todas las variantesn la muestra original, siendo difcil detectar mutacio-ongan menos del 10-20% del total25. Esto explica portodos que utilizamos predicen el fracaso de un fr-no aseguran el xito, ya que las mutaciones puedenpor debajo de estos niveles (variantes minoritarias),

er seleccionadas cuando se emplea el frmaco al queistencia. Para asegurar la deteccin de las variantes quemenos del 20%, hemos de recurrir a tcnicas especia-

n de los productos de amplicacin, PCR mediantelmite o PCR-alelo especca a tiempo real, que noles hoy por hoy a la rutina del laboratorio de diag-ico. Recientemente se han introducido tcnicas quesecuenciacin masiva de genomas nicos. Existen, en

nto, cuatro plataformas comerciales de secuenciacinque la tecnologa 454-UDS (Roche Diagnostics), es la

momento ofrece resultados en el campo de las muta-sistencia a antirretrovirales. Adems de una complejaa que aun no est al alcance de los laboratorios de, una herramienta imprescindible para poder usar estasn los sistemas informticos con capacidad para alma-nejar enormes masas de datos, y programas disenadosente para leer y ltrar miles de secuencias, ensam-tarlas compararlas con bases de datos externas. Nose consiguen superar estas dicultades, estas tcnicasn como una alternativa, de gran valor, a las tcnicasales.

en otraes diftientecorrecble unade resiestos mcin qen pges senformatmticade resalgorit(http:/nal defrancede InvGeno2como ede lasRT e infrenteno todinterprtacinde la derivase inclse adscde mucia locsi existpredecinterprrealizahemostrovirahayandemutdemosconsigsi estegenoti

Indicacn de las mutaciones de resistencia

retacin de las mutaciones de resistencia es compleja yno de los pasos de mayor importancia para emitir unacorrecta. Aunque existen mutaciones concretas que

perles de resistencia muy especcos y su signicado, en especial para los frmacos de baja barrera gentica,

Actualmnales que destudio deciden en laantes de cocin recieno tras una eidelines/

alsociety.org/guidelines.aspuidelines.aspxca/dcconsensos.asp?apnv0=pcientica&apnvA=dcconsensosyrc&

asiones una determinada combinacin de mutacionesinterpretar debido al efecto aditivo o incluso rever-

gunas mutaciones sobre otras. Adems, para hacer unaerpretacindel genotipode resistencias es imprescindi-tinua actualizacin por la aparicin de nuevos patronesia y por la incorporacin de nuevos frmacos. Por todosos se han disenado distintos algoritmos de interpreta-cilitan dicha labor. Estos algoritmos estn disponiblesweb y, por lo general, son de acceso gratuito. Su manejoya que slo hay que editar la secuencia obtenida, enta o txt, en dicha pgina web, que de forma auto-devuelve un informe de interpretacin de los nivelescia a todos los antirretrovirales. Entre los principalesdestacan: la pgina web de la Universidad de Stanfordb.stanford.edu), la pgina de la Sociedad Internacio-de EE.UU. (www.iasusa.org), la pgina de la ANRS

ww.hivfrenchresistance.org), el algoritmo de la Redacin en SIDA RIS (www.retic-ris.net), el algoritmoo (www.geno2pheno.org), o sistemas de interpretacinotipo Virtual (Vircotype). Estas guas recogen, ademstencias clsicas frente a anlogos y no anlogos de ladores de la proteasa, las nuevas mutaciones descritasinhibidores de la integrasa. Es importante alertar, quesistemasde interpretacin aportan lamisma calidadde

in. En general, para la eleccin del sistema de interpre-ayamos a utilizar debemos valorar, entre otros, la fechaactualizacin, la metodologa que se ha empleado parareglas de interpretacin, el nmero de pacientes quepara la elaboracin de la/s regla/s de interpretacin, sidistinto peso a distintas mutaciones, si la prevalencianes en la poblacin analizada es similar a la prevalen-se tienen en cuenta mutaciones con efecto benecioso,atos clnicos que avalen que ese algoritmo es capaz deecacia virolgica, y si se tienen en cuenta reglas dein especca para los subtipos no-B. Adems, cuandola interpretacin de un perl de resistencias tambinner en cuenta la historia previa de tratamiento antirre-paciente y, si los hubiese, los estudios previos que se leicado, sumandopara su interpretacin todo suhistricoes/secuencias (genotipoacumulado). Estaestrategiahamejorar la interpretacin del genotipo de resistencias,o mayores niveles de ecacia en el rgimen elegidoasa en el genotipo acumulado en vez de en el ltimoalizado26.

para la realizacin de los estudios de resistenciaente existen numerosas guas nacionales e internacio-escriben las circunstancias en las que se aconseja unresistencia (tabla 3). En general, dichas guas coin-recomendacin de realizar el estudio de resistenciamenzar el tratamiento antirretroviral, sea una infec-te o crnica, tras el fracaso teraputico, en embarazoxposicin accidental al caso fuente si no lo posee. No

304 F. Garca et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297307

Tabla 4Ventajas e inconvenientes de los diferentes mtodos disponibles para determinacin del tropismo viral.

Metodologa Ventajas Inconvenientes

ESTA (Enhanced Sensitivity Trophile Assay) Sensibilidad para variantes DM/X4 (0,3%)clnic

Limitaciones logsticas (envo EE.UU)

Genotipo V3

Genotipo V3 iremiaacion

Genotipo V3 ntes X

Ensayo MT-2

se recomienla mayora dminoritaria

Determina

Los antafamilia de fputico parantiviral detrpicas27 yinician tratafracaso viroantes de rede CCR5, seVIH por losviral por lomediante mdescriben eprincipalestica clnica,

Mtodos fen

Los ensabasan en laensayo el gea partir delrecombinacque portaninfectar lnlos dos corrmanera, sepaciente esbinante. TroUSA) es el egrupo de mtes de cicloy aprobadopismo viralmaraviroc,pal de esteenvuelta coque aunquetropismo viensayos cln

iniccorr

tar ersinsibilno alomeren lo7% deente lostectla c

dedote undidoiroc aEspaarlos quo mdetntajca elbascon-R (IMechrancales

Documento descargado de http://www.elsevier.es el 21/05/2015. Copia para uso personal, se prohbe la transmisin de este documento por cualquier medio o formato.Dispone de validacin clnica en ensayos(MOTIVATE, MERIT)

plasma (secuenciacin poblacional) Rpido, prctico y econmicoAmpliamente disponible en laboratoriosSensibilidad Clnica

en ADN proviral (CMSP/sangre total) Posibilidad de amplicar muestras con vcop/ml (nica alternativa en muchas situclnicas)Prctico

(UltraDeepSequencing) Alta sensibilidad en la deteccin de variaPermite la cuanticacin de variantes X4Validado en estudios clnicos

Barato

da tras suspensin del tratamiento por la reversin dee las mutaciones que no se detectaran al ser variantes

s.

cin del tropismo viral

gonistasde los receptoresdequimiocinas sonunanuevarmacos que ha pasado a formar parte del arsenal tera-a el tratamiento de la infeccin por VIH. La actividadlos antagonistas de CCR5 est limitada a variantes R5-la deteccin de variantes X4-trpicas en pacientes quemiento con antagonistas de CCR5 se ha asociado con ellgico al tratamiento con estos frmacos28. Por lo tanto,comendar el inicio de un tratamiento con antagonistasrequiere la realizacin de un estudio de tropismo delreceptores de quimiocinas CCR5 y CXCR4. El tropismos receptores de quimiocinas puede ser determinadotodos fenotpicos y genotpicos29. A continuacin se

n detalle las caractersticas metodolgicas as como susventajas e inconvenientes para su utilizacin en la prc-que se muestran en la tabla 4.

otpicos

yos fenotpicos para la determinacin de tropismo segeneracin de virus recombinantes. En este tipo den de la envuelta es amplicado mediante PCR (RT-PCR)plasma del paciente y mediante tcnicas de clonaje oin gentica se generan virus quimricos o seudotiposla envuelta del paciente. Estos virus son utilizados para

versinque sesolvenuna vede senen tores la cmenteun 14,el momllado dparademejorarespondamenresponmarav

EnSalud Ctema ede ciclpara laOtra veamplicon amlacinPhenoXBVBA,Paris; Fprincipeas celulares que expresan el receptor CD4 y uno deeceptores principales del VIH, CCR5 o CXCR4. De estadene el tropismo viral conferido por la envuelta deltudiado a partir del comportamiento del virus recom-leTM (Monogram Biosciences, San Francisco, California,nsayo fenotpico de mayor difusin. Se incluye en eltodos basados en la generacin de virus recombinan-nico30. Hasta elmomento, es el nicomtodo validadoen EE.UU. por la FDA para la determinacin del tro-en muestras de pacientes candidatos a tratamiento conel nico anti-CCR5 aprobado. La caracterstica princi-y otros mtodos similares es el conseguir amplicar lampletadelVIHdel paciente. Este aspecto es relevante yala regin V3 contiene los principales determinantes delral existen otras regiones implicadas (V1, V2, C4). LosicosMERITyMOTIVATEhan revelado limitacionesde la

nacin del t

Mtodos gen

Losmtoeconmica,laboratoriorealizar la dprincipiosdiferentesbasados funde aminocse propusiede la cargaespecicidabaja sensibos Caro, Lento, Exige viremia 1000 cop/mL

Menor sensibilidad analtica para DM/X4

F. Garca et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297307 305

Tabla 5Principales mtodos fenotpicos basados en generacin de virus recombinantes para determinacin del tropismo viral.

VIRalliancePhenoscript

XtrackC/PhenX-R InPheno AG

Virco NH2-V4gp120

Monogram BiosciencesTroleES*

Univ Toulouse ToulouseTropism Test (TTT)

ISCIII-FISPETropitest

Amplicn V1-V3 gp120 (900pb)

pNL4-3 defectivoenv

pHXB2D-NH2-V4-eGFP

pCAX-PXMX(expresinenv) +RTV1.F-lucP.CNDOU3

pNL43env-Luc2 vector pNL4-3-lacZ/env-

Generacin del vector Recombinacinhomloga

Clonaje Recombinacin Clonaje Recombinacin homloga Clonaje

Clulas Diana U373-CD4-CCR5 CXCR4 U87.CD4.CCR5 U87.CD4.CCR5 U87.CD4.CCR5 U87/Ghost/PBMcCD4.CCR5U373-CD4-CXCR4 CCR5/CXCR4 U87.CD4.CXCR4 U87.CD4.CXCR4 U87.CD4.CXCR4

Gen marcador -galactosidasa -galactosidasa GFP Luciferasa Luciferasa LuciferasaReplicacin Ciclo mltiple Ciclo nico Ciclo mltiple Ciclo nico Ciclo mltiple Ciclo mltipleSensibilidad 5-10% 1% 5-10% 0,3-1% 0,5% 1%

natural en secuencias de V3 y su asociacin con los fenotipos R5-o X4-trpicos, ha permitido la identicacin de nuevos residuosy patrones de aminocidos en la regin V3 relacionados con eltropismo viral. Con los datos obtenidos y a travs de la utilizacinde diferentes mtodos estadsticos (support vector machines-SVM,position spealgoritmoscorreceptorV3 de un dedisponiblesgeno2phenotambin lala informacclnicas relaconseguidoprdida sign

El algorGeno2phenoUniversidadEl mtodoSVM (Suppodicciones to de aminobasa geno2secuenciascorrespondsecuenciasde datos deB, aunque tgenticos. Egrado de seel porcentaltima verscir datos cly la presen

para el receptor CCR5, con el n de mejorar las predicciones. Laprincipal ventaja de este mtodo es que se muestra en constanteevolucin y se realizan actualizaciones peridicas en las bases dedatos.

Al igual que para la determinacin de resistencias, las nue-atafoioneionaluences/Rome

neraciaretecte losoridas qusticoda, risa ucnicate ny mmeninf.mvalidre ladedos deensaensaotp

cinlas

para

Tabla 6Ventajas e inco ismo

Limitaciones Gen

Tcnicas

De interpret

Documento descargado de http://www.elsevier.es el 21/05/2015. Copia para uso personal, se prohbe la transmisin de este documento por cualquier medio o formato.cic scoring matrices-PSSM) se han disenado sosticadosde interpretacin que permiten predecir el uso deldel VIH basndose en la secuencia gentica de la reginterminado aislado viral. Algunos de ellos se encuentranen pginas web de libre acceso como son WetCat,

coreceptor, y WebPSSM. Diversos estudios han evaluadocapacidad de predecir el tropismo viral combinandoin aportada por varios algoritmos, e incluso variablescionadas con la infeccin por VIH. Estos mtodos hanmejorar la sensibilidad para detectar cepas X4, sin unaicativa de especicidad37,38.

itmo de interpretacin de ms amplia difusin escoreceptor. Se ha desarrollado conjuntamente entre lade Colonia y el Instituto Max-Planck de Alemania39.

estadstico que utiliza para hacer sus predicciones esrt Vector Machine). Geno2pheno puede realizar las pre-anto a partir de la secuencia FASTA de nucletidoscidos de la regin V3. La base de datos en la quepheno sus predicciones consiste en un total de 1100de V3 de 332 pacientes: 769 secuencias de V3 que seen con un fenotipo R5, 210 con un fenotipo X4 y 131con fenotipo R5X4, principalmente obtenidas de la baseLos lamos. La mayora de estas secuencias son subtipoambin incluye algunas secuencias de otros subtiposl servidor permite seleccionar en cada prediccin elnsibilidad para detectar variantes X4, seleccionandoje de FPR (False Positive Rate) en cada prediccin. Lain de geno2pheno oferta la posibilidad de introdu-nicos adicionales como la carga viral, nmero de CD4cia o ausencia de la delecin de 32 pares de bases

vas pllimitacpoblacde secSciencmasivaque gesecuenmite dAunqusuperilidad ediagnmatizay precnes tmedianJunior)parcial454.bio

Larequierespongonistacon elde lostas genpredicdad dePSSM

nvenientes de los ensayos genotpicos y fenotpicos para la determinacin del trop

Fenotipo La transcripcin inversa in vitro (sntesis de una doble hebra de ADNa partir de ARN) tiene una eciencia no superior al 10%

Laa pa

La eciencia del proceso de generacin del plsmido en el que seinserta la envuelta del paciente es variable. Las tcnicas de clonaje sonms ecaces que las de recombinacin homloga, y por tanto mssensible

Livari

La generacin de virus de ciclo mltiple aumenta la sensibilidadfrente a los sistemas de ciclo nico, ya que las secuencias minoritariasse amplican biolgicamente en los ciclos de infeccin-reinfeccin ypueden ser detectadas con mayor ecacia

Amdete

acin Determinacin del umbral clnico que predice el xito o el fracasoal tratamiento con antagonistas de CCR5

Lodatode srmas de secuenciacin masiva permiten superar lass de las tcnicas convencionales de secuenciacin, mediante la generacin simultnea de centenaresias clonales de virus40,41. Actualmente, 454 (454 Lifeche Diagnostics) es la plataforma de secuenciacinjor situada para el estudio del tropismo del VIH por-secuencias de 300-500 pares de bases y ello permitela regin V3 entera en un solo amplicon. As, 454 per-ar virus X4 presentes en < 1% de la poblacin viral42.estudios realizados con 454 han demostrado una

d tcnica frente a los mtodos convencionales, la rea-e esta tecnologa todava no est disponible para elclnico rutinario. Es una tecnologa cara, poco auto-equiere un conocimiento tcnico muy especializado,n anlisis bioinformtico intensivo. Estas limitacio-s e industriales se estn resolviendo rpidamenteuevas versiones de la tecnologa (secuenciador 454ediante el desarrollo de herramientas de interpretacinte automatizadas como Geno2Pheno-454 (http://g2p-pi-inf.mpg.de/index.php).

acin de los ensayos genotpicos para uso clnicodemostracin de su capacidad para identicar pacientesres y no respondedores a un tratamiento con anta-CCR5 ms que demostrar una perfecta correlacin

yo fenotpico de TroleTM. El re-anlisis retrospectivoyos MOTIVATE43 ha demostrado que las herramien-icas y el ensayo de TroleTM son comparables en lade respuesta a maraviroc a pesar de que la sensibili-herramientas genotpicas utilizadas geno2pheno-5% ydetectar variantes X4-trpicas fue del 63 y 59%, res-

viral.

otipotranscripcin inversa in vitro (sntesis de una doble hebra de ADNrtir de ARN) tiene una eciencia no superior al 10%mitada sensibilidad de la secuenciacin poblacional para detectarantes por debajo del 10-20%

plicacin limitada a la regin V3, sin tener en cuenta losrminantes contenidos en V1, V2 y C4

s sistemas de interpretacin del tropismo viral estn basados ens pareados genotipo/fenotipo con un nmero relativamente bajoecuencias y con escaso nmero de secuencias de subtipos no-B

306 F. Garca et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(4):297307

pectivamente, comparado con TroleTM. De la misma manera elre-anlisis retrospectivo del ensayo MERIT44 logr demostrar lacapacidad de la herramienta geno2pheno-5,75% para identicarpacientes respondedoresyno-respondedores amaravicocde formasimilar a ESde geno2phcomparadoestudios prse ha valorauso terapupismo viralsenalan tasaaislados deR5-trpicos

Las limitla determin6. Los datoutilizacindeterminactodo lo expor VIH, ceuropeas (www.bhivaciones la pomtodos genistas de CC

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Documento descargado de http://www.elsevier.es el 21/05/2015. Copia para uso personal, se prohbe la transmisin de este documento por cualquier medio o formato.TA-TroleTM a pesar de que de nuevo la sensibilidadeno para detectar variantes X4-trpicas fue del 55%con ESTA-TroleTM. Recientemente, se han presentadoospectivos en diferentes cohortes europeas en los quedo la respuesta a maraviroc en pacientes en los que sutico fue basado en la determinacin genotpica del tro-. En general, los resultados derivados de estos estudioss de respuesta amaraviroc superiores al 85% cuando loslos pacientes eran clasicados genotpicamente como45,46.aciones de los ensayos fenotpicos y genotpicos paraacin del tropismo viral se presentan en la tablas actuales ponen de maniesto la viabilidad de lade determinadas herramientas genotpicas para lain del tropismo viral en la prctica clnica47. Porpuesto, diversas guas de manejo de la infeccinomo las espanolas (http://www.gesida.seimc.org)16,www.europehivresistance.org) y britnica (http://.org/Tropism.aspx)48, incluyen entre sus recomenda-sibilidad de determinar el tropismo del VIH mediantenotpicos para guiar el uso teraputico de los antago-R5.

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Resten

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