� Introducción: Cinética enzimática.Ecuación de Michaelis-Menten.Ecuación de Lineweaver-Burk.

� Reacciones con múltiples substratos.

� Inhibición enzimática: - Reversible

Competitiva.No competitiva.Acompetitiva.

- Irreversible. Ejemplos de inhibidores irreversibles

TEMA 11.- CINÉTICA ENZIMÁTICA

Perfil cinético de un enzima alostéricoPerfil cinético de un enzima micaeliana

Introducción. Cinética enzimática

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.

Modelo Cinético de Michaelis-Menten• Las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas:

Primera etapa, se forma el complejo enzima-sustrato.Segunda etapa, el complejo enzima-sustrato se transforma en el producto, liberando el enzima.

• V1 = k1 [E] [S] • V2 = k2 [ES] • V3 = k3 [ES]

[E] = [ET] - [ES]

• En equilibrio la V de formación de ES es igual a la velocidad de descomposición.V1 = V2 + V3

k1[S] [E] = (k2 + k3 )[ES]

donde la expresión (k2+ k3)/k1 se ha sustituído por KM, o constante de Michaelis-Menten

• La velocidad máxima (Vmax) se obtiene cuando el enzima está saturada por el S. Vmax = k3 [ET]

• La velocidad de reacción = la velocidad de formación del producto:

v = v3 = k3 [ES] =

• Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación general de la velocidad obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:

Modelo Cinético de Michaelis-Menten

KM es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima.

En efecto, si KM = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2.

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v frente a [S]) es una hipérbola

El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad.

Modelo Cinético de Michaelis-Menten

Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v frente a 1/[S]), ya que es una línea recta. Esta

representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk

1

Vmax

v =Vmax • [S]

Km + [S]

y= m. x + b

v1

[S]1

Km- 1 • pendiente es KM/Vmax

• abscisa en el origen es -1/KM• ordenada en el origen es 1/Vmax

v1

[S]1 1

Vmax

+=Km

Vmax[ ]

KM/Vmax

A partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

Representación de Lineweaver-Burk

Reacciones con múltiples substratos

a) Reacción enzimática con formación de un complejo ternario (ES1S2)

b) Reacción enzimática en la que no se forma de un complejo ternario

Mecanismo ping pong

a.1. Unión aleatoria de los S

a.2. Unión ordenada de los S

Inhibidor: Efector que se une al enzima y hace disminuir su actividad, mediante interacciones con el centro activo u otros centros específicos.

Se excluyen todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática.

Dos tipos de inhibidores:* Inhibidores reversibles: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato, o con ambos.

- COMPETITIVOS: El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del sustrato.

- NO COMPETITIVOS: El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el sustrato. No impide la fijación del sustrato a la enzima, pero sí la acción catalítica.

- ACOMPETITIVOS: El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-sustrato una vez formado, impidiendo la acción catalítica

* Inhibidores irreversibles: modifican químicamente a la enzima mediante uniones covalentes.

Inhibición Enzimática

IE ES

EI

SE + P

Características:

-Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente excluyentes.

- A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibición.

- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo estructural del sustrato.

- El inhibidor es tan específico como el sustrato.

Ki = [E] [I][EI]

Inhibición competitiva

Se define una constante de equilibrio de disociación del inhibidor

Inhibición reversibleInhibición Enzimática

´

Representación directaInhibición competitiva

s

0 20 40 60 80 100 120

v

0

20

40

60

80

100

120

Con Inhibidor

Sin Inhibidor

Inhibición competitiva

Km´= Km (1+[I]/Ki)

v =Vmax • [S]

Km 1+[I] + [S]Ki[ ]

´

Inhibición reversibleInhibición Enzimática

1/s-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

-1/Km

-1/(Km(1 + i/Ki))

1/Vmax

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble

Inhibición Enzimática

COO-

CH2

CH2

COO-

FAD FADH2COO-

CH

CH

COO-

Succinato Fumarato

SDHSuccinato deshidrogenasa

Ejemplo de inhibición competitiva

COO-

CH2

COO-

Malonato

COO-

C O

CH2

COO-

Oxalacetato

Inhibidorescompetitivos

Inhibición Enzimática

E ES

EI

I

SE + P

I

ESI

S

- El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre (E) y al complejo enzima-sustrato (ES)

- Ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos

Características:

Inhibición no competitiva

Inhibición reversibleInhibición Enzimática

Vmax’ < Vmax

Vmax’ = Vmax /(1+[I]/Ki)

Vmax . [S]V´ =

Km . (1+[I]/Ki) + [S] . (1+[I]/Ki)

Vmax´= Vmax/(1+[I]/Ki)

Inhibición no competitiva

Inhibición reversibleInhibición Enzimática

- El I sólo se une al complejo ES y en un sitio distinto al que se fija el S en el centroactivo

- Baja la Km y Vmax, pero el cocienteKm/Vmax no se altera.

-Ocurre en reacciones multisustratos

El lugar de unión del I se crea tras la unión del S al E

Inhibición acompetitiva o mixta

Inhibición reversibleInhibición Enzimática

Inhibición acompetitiva

Inhibición reversibleInhibición Enzimática

Inhibición acompetitiva o mixta

Inhibición Irreversible- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente

E + I E’- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

- Una clase especial de inhibidores irreversibles son los Inhibidores suicidas:Son poco reactivos hasta que se unen al centro activo del enzima, donde se

transforman en un compuesto muy reactivo, inactivando irreversiblemente al enzima.

Inhibición Enzimática

Algunos tipos de inhibidores irreversibles:

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosforados

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Compuestos organofosforados

CH CH2 OHSer

PF O

CH

CH

H3C CH3

CH3H3C

CH CH2 O P O

CH

CH

H3C CH3

CH3H3C

Ser

Diisopropilfluorofosfato

(DFP)

- Actúan sobre enzimas serínicas (serin proteasas, acetil colinesterasa...), uniéndose covalentemente a través del grupo fosfato.

Ejemplos: DFP, Insecticidas (Paration, Malation) Gases de guerra (Sarín), gas mostaza.

Malation

Ejemplos de inhibidores irreversiblesInhibición Enzimática

Penicilinas. Inhiben enzimas serínicas que participan en la formación de la pared bacteriana.

Ión cianuro, CN-: Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinación del Fe hemínico del complejo citocromo oxidasa.

Ejemplos de inhibidores irreversiblesInhibición Enzimática

Inhibidor suicida (Inhibidores activados enzimáticamente)

- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera específica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos

- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molécula en una especiequímica muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivándola

- Tienen por tanto la especificidad del inhibidor competitivo y la potencia de losinhibidores irreversibles

Inhibición Enzimática

E + I EI EI* E’ + I*1 2 3

Modo de acción de los inhibidores suicidas

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el sustrato o un inhibidor competitivo convencional.2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I*.3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un

inhibidor irreversible.

Ejemplo de inhibidores suicidas

Sistema de la ββββ-lactamasa bacterianaLa utilización masiva de antibióticos ββββ-lactámicos (penicilinas,derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido a la aparición de resistencias a los mismos.

Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por producir una enzima, la ββββ-lactamasa, que inactiva a los antibióticos β-lactámicos.

Inhibición Enzimática

R CO NHS

NO

CH3

CH3

COO-

R CO NH S

HN

CH3

CH3

COO-

CO

O-

ββββ-Lactamasa

Penicilina (activa)

Ác.peniciloico (inactivo)

Con frecuencia los preparados de penicilinas se formulan añadiendo un inhibidor suicida de la ββββ-lactamasa, el ácido clavulánico

O

NO

COO-

CCH2OH

Hββββ-Lactamasa

O

HN

COO-

CCH2OH

H

CO

O-

O

HN

COO-

CCH2OH

H

CO

OCH2CHSer

Esta molécula reacciona con laserina activa de la ββββ-lactamasa,

produciendo su inactivación

Ác.clavulánico

Resumen de los parámetros cinéticos de las reacciones enzimáticas: efecto de los distintos tipos de inhibición.

Tipo de inhibición Ecuación de velocidad Km Vmáx

Sin inhibidor

Inhibición competitiva

Inhibición no competitiva

Inhibición acompetitiva o mixta

Vmáx . [S]V = Km Vmáx

Km + [S]

Vmáx . [S]V = Km (1+[I]/Ki) Vmáx

Km . (1+[I]/Ki) + [S]

Vmáx . [S]V = Km Vmáx/(1+[I]/Ki)

Km.(1+[I]/Ki)+[S].(1+[I]/Ki)

Vmáx . [S]V = Km/(1+[I]/Ki) Vmáx/(1+[I]/Ki)

Km +[S].(1+[I]/Ki)

Inhibición Enzimática