Universidad Nacional del Santa E.A.P Medicina Humana

DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMASI. INTRODUCCIONII. CAPACIDADComprueba la naturaleza proteica de las enzimas y su sensibilidad frente a diversos agentes fsicos y qumicos; demostrando la variacin de su comportamiento y actividad.

III. MATERIALESReactivos: Solucin de amilasa salival natural al 10 % o amilasa o tripsina en capsulas. NaOH 2.5N Acetato de plomo al 10% H2SO4 50% Etanol Reactivo de Biuret Agua destiladaMateriales: 5 pipetas de 5 ml y 2 de 10 ml 7 tubos de ensayo Vaso de 600 ml. PIREX Goteros 4 gradillasEquipos: Cocina elctrica para bao de agua a 100C

IV. PROCEDIMIENTOArme el siguiente set de tubos y rotule cada uno de ellos:COMPONENTESTUBOS (ml)

IIIIIIIVVVIVII

Sol. Amilasa al 10%2222222

Agua destilada2----------2

Sol. NaOH 2.5N--2----------

Sol. H2SO4 al 50%----

2--------

Sol. Acetato de plomo al 10%------2------

Alcohol etlico--------2----

Reactivo de Biuret----------2--

Mezclar por inversin los sistemas: I, II, IV, VI, VIIDejar caer en zona los reactivos correspondientes para los sistemas: III y V (inclinar el tubo de ensayo formando ngulo de 45 y verter el reactivo lentamente por las paredes del tubo)El sistema VII llevar a bao de agua hirviente por espacio de 5 minutos.Observar el aspecto y color producido en cada uno de los sistemas e interpretar los resultados obtenidos.V. RESULTADOS

TUBOREACTIVOREACCION QUIMICAPRODUCTOOBSERVACION

I

II

III

IV

V

VI

VII

CUESTIONARIO1. Qu enzima utilizo en el experimento? Describa sus caractersticas generalesLa enzima que se utiliz en este experimento fue -AMILASA.La -amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal.Su funcin consiste en la digestin bucal del almidn proveniente de la dieta. Cataliza la ruptura de los enlaces polimerizantes (1-4), accin determinada por la estructura de su centro activo. As, desempea un importante papel en la nutricin. Sin embargo, tambin se ha detectado que su expresin gentica se relaciona con el funcionamiento del sistema nervioso autnomo, por lo que se ha propuesto que su monitoreo pudiera ser til en la evaluacin del estrs fsico y psicolgico. Esto, a su vez, puede tener implicaciones en el estudio del dolor (principal motivo de consulta estomatolgica) o en la evaluacin del estado de salud bucal.La -amilasa son generalmente estable a pH 5.5 8.0 en presencia de un complemento de calcio, la actividad ptima de las -amilasas normalmente ocurre entre pH 4.8 a 6.5, pero hay diferencias en las formas de las curvas de actividad de pH de las diferentes enzimas de amilasas y tambin en los valores de pH ptimo. Sin embargo, las clasifica segn el pH a la que actan en amilasas alcalinas y cidas; las amilasas alcalinas tienen un pH ptimo entre 8.0 y 10.5, que se usan en la fabricacin de detergentes principalmente; las amilasas cida actan en un rango de pH de 3.5 a 5.0 cuya existencia indica una mejora potencial en los procesos de degradacin del almidn.Segn la temperatura a la que actan, las amilasas se pueden clasificar en amilasas termoestables y termolbiles; las enzimas termoestables son aquellas que actan sin pierde su actividad en un rango de 60 a 110 0C y la mayora de ellas son de origen bacteriano; mientras que las enzimas termolbiles, son aquellas que actan hasta 550C sin perder su actividad, generalmente varan entre los 20 y 550C y son de origen fngico principalmente. La mayora de las enzimas purificadas pierden actividad rpidamente encima de los 500C pero sta inactivacin puede ser retardada por la presencia de calcio, las -amilasas-amilasas no cuentan con enzimas pero ellas son calci metalo enzimas; las amilasas tienen por lo menos un tomo de in calcio por molcula de enzima. La fuerza de los enlaces de ste metal a las protenas es dependiente de la fuente de la enzima, adems las -amilasas requieren de ste metal para la actividad cataltica, con la presencia de calcio son completamente resistentes a los extremos de temperatura, pH, tratamiento con urea o exposicin a proteasas como pepsina, tripsina, subtilisina, y papana.

2. Seale con precisin las propiedades fsico-qumicas que determinan que una enzima sea una protena.Existen numerosas razones para afirmar que las enzimas son protenas. Las ms importantes son las siguientes:

Elanlisisde las enzimas obtenidas en forma ms pura, cristalizada, demuestra que son protenas. Las enzimas son inactivadas a altas temperaturas y, en general, la cintica de la desnaturalizacin trmica de las enzimas da resultados muy parecidos a los de la desnaturalizacin trmica de las protenas; por ejemplo el Q10 de la mayora de las reacciones qumicas es de 2 a 3, y, en el caso de las enzimas, a temperaturas elevadas, alrededor de 60 a 70 C, la actividad neta aumenta varios cientos, como sucede con la velocidad de la desnaturalizacin trmica de las protenas. Las enzimas son activadas en una zona muy restringida de pH, y presenta un punto ptimo de pH donde su actividad es mayor. Las protenas en su punto isoelctrico, muestran propiedades parecidas desde el punto de vista deviscosidad, solubilidad, difusin, etc., que resulta del todo similares a las propiedades de este tipo que muestran las enzimas. Todos los agentes que desnaturalizan a las protenas tambin destruyen o inactivan a las enzimas, ya sea elcalor, los cidos fuertes, o losmetalespesados que pueden combinarse con ellas. Losproblemasde solubilidad y de precipitacin son comunes a las protenas y las enzimas; en general, son solubles en agua osolucionessalinas, insolubles en alcohol, precipitan con determinadas concentraciones de sales neutras, etc.

3. Cul es la importancia de la naturaleza proteica de las enzimas?4. Qu procedimientos y tcnicas se usan para determinar la naturaleza de las enzimas? REACCIN XANTOPROTEICA Es debida a la formacin de un compuesto aromtico nitrado de color amarillo, cuando las protenas son tratadas con cido ntrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas protenas con aminocidos portadores de grupos bencnicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un lcali vira a un color anaranjado oscuro. Procedimiento: 1. Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 cc. de solucin problema (clara de huevo ). 2. Aadir 1 cc. de HNO3 concentrado. 3. Calentar a la llama o al bao mara a 100 C 4. Enfriar en agua fra 5. Aadir gota a gota 2ml de hidrxido amnico o una disolucin de sosa al 40% REACCIN DE BIURET La producen los pptidos y las protenas, pero no los aminocidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptdico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los aminocidos. Cuando una protena se pone en contacto con un lcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret, de frmula:

que en contacto con una solucin de sulfato cprico diluida, da una coloracin violeta caracterstica. Procedimiento 1. Tomar un tubo de ensayo y poner unos 3 cc. de albmina de huevo. 2. Aadir 2cc. de solucin de hidrxido sdico al 20%. 3. A continuacin 4 5 gotas de solucin de sulfato cprico diluida al 1%. 4. Debe aparecer una coloracin violeta-roscea caracterstica. REACCIN DE LOS AMINOCIDOS AZUFRADOS Se pone de manifiesto por la formacin de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se basa esta reaccin en la separacin mediante un lcali, del azufre de los aminocidos, el cual al reaccionar con una solucin de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo. Procedimiento: 1. Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 cc. de albmina de huevo (clara de huevo). 2. Aadir 2 cc. de solucin de hidrxido sdico al 20%. 3. Aadir 10 gotas de solucin de acetato de plomo al 5%. 4. Calentar el tubo hasta ebullicin. 5. Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro de plomo, utilizndose el azufre de los aminocidos, lo que nos sirve para identificar protenas que tienen en su composicin aminocidos con azufre.5. De qu depende la actividad enzimtica?

EFECTO DEL pH La mayora de los enzimas presentan un pH ptimo para el cual su actividad es mxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye bruscamente. Este efecto se debe a que, al ser los enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras protenas, se desnaturalizan y pierden su actividad si el pH vara ms all de unos lmites estrechos (Figura de arriba). De ah la conocida importancia biolgica de los sistemas tampn. En la mayor parte de los casos el pH ptimo est prximo a la neutralidad, en consonancia con el pH intracelular, pero existen enzimas con pH ptimo muy diverso segn sea el pH del medio en el que habitualmente actan (los enzimas proteolticos del jugo gstrico tienen pHs ptimos prximos a 2 ya que este es el pH de dicho jugo). Por ltimo existen algunos enzimas a los que el pH no afecta en absoluto. EFECTO DE LA TEMPERATURAAl igual que ocurre con la mayora de las reacciones qumicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la temperatura. La variacin de la actividad enzimtica con la temperatura es diferente de unos enzimas a otros en funcin de la barrera de energa de activacin de la reaccin catalizada. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en otras reacciones qumicas, en las reacciones catalizadas por enzimas se produce un brusco descenso de la actividad cuando se alcanza una temperatura crtica. Este efecto no es ms que un reflejo de la desnaturalizacin trmica del enzima cuando se alcanza dicha temperatura. Si representamos grficamente la variacin de la actividad de los enzimas en funcin de la temperatura (ver Figura de abajo) da la impresin de que existe una temperatura "ptima" anloga al pH ptimo estudiado anteriormente; hay que resaltar que esa aparente temperatura ptima no es ms que el resultado de dos procesos contrapuestos: 1) el incremento habitual de la velocidad de reaccin con la temperatura y 2) la desnaturalizacin trmica del enzima. Concentracin del sustratoPara muchos enzimas, la velocidad de catlisis vara con la concentracin del sustrato. A una concentracin de enzima constante, la velocidad de reaccin aumenta al aumentar la concentracin del sustrato hasta que se llega a una velocidad mxima. En cambio, las reacciones no catalizadas no presentan este efecto de saturacin.A una concentracin de enzima fija, la velocidad de reaccin es casi proporcionalmente lineal a la concentracin de sustrato, cuando la concentracin del sustrato es pequea. A una concentracin alta de sustrato, la velocidad es, prcticamente, independiente de la concentracin del sustrato. Michaelis-Mente, propusieron un sencillo modelo que explica estas caractersticas cinticas, se basa en la formacin del complejo especfico enzima-sustrato intermediario de la catlisis.

La velocidad mxima se obtiene cuando los centros del enzima estn saturados por el sustrato, es decir, cuando prcticamente todo el enzima se encuentra en forma de complejo enzima-sustrato.La km se define como la concentracin de sustrato al a cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima, hace referencia a la afinidad del enzima por el sustrato y, por tanto, a su eficacia cataltica, es decir, a la velocidad a la que se lleva a cabo el proceso cataltico.

6. Cul es la utilidad clnica de las enzimas?Sin enzimas, no sera posible la vida que conocemos. Igual que la biocatlisis que regula la velocidad a la cual tienen lugar los procesos fisiolgicos, las enzimas llevan a cabo funciones definitivas relacionadas consaludy la enfermedad. En tanto que, en la salud todos los procesos fisiolgicos ocurren de una manera ordenada y se conserva lahomeostasis, durante los estados patolgicos, esta ltima puede ser perturbada de manera profunda. Por ejemplo, eldaotisular grave que caracteriza a la cirrosis heptica puede deteriorar de manera notable la propiedad de las clulas para producir enzimas que catalizan procesos metablicos claves como la sntesis de urea. La incapacidad celular para convertir el amoniaco txico a urea no txica es seguida por intoxicacin con amoniaco y por ultimo coma heptico. Un conjunto deenfermedadesgenticas raras, pero con frecuencia debilitantes y a menudo mortales, proporciona otros ejemplos dramticos de las drsticas consecuencias fisiolgicas que pueden seguir al deterioro de la actividad enzimtica, inclusive de una sola enzima

Adems del papel central de las enzimas, en la bioqumica, la actividad de las enzimas en suero dainformacinde gran valor en el diagnstico de varias enfermedades. La mayor parte de las enzimas encontradas en suero no realizan una funcin fisiolgica en el mismo, sino que son liberadas a la circulacin durante el intercambio normal de los tejidos bajo condiciones patolgicas, los niveles sricos pueden elevarse, por ejemplo, despus de un infarto las clulas infectadas liberan sus enzimas a la circulacin. El patrn o perfil de actividades enzimticas del suero se relaciona con elprocesode enfermedad y las clulas y rganos afectados.

Aspartato aminotransferasa (AST/GOT) Valores normales: < 40U/ml Aumento importante: Infarto de miocardio, hepatitis, traumatismos Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia, hemlisis Alanina aminotransferasa (ALT/GPT) Valores normales: < 50 U/ml Aumento importante: Shock, hepatitis Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia, -amilasa Valores normales: < 50 U/mlAumento importante: pancreatitis aguda y crnica, cncer de pncreas. Aumento moderado: parotiditis, algunos carcinomas, procesos parapancreticos (gastritis, lcera duodenal, peritonitis, obstruccin intestinal)Creatn fosfoquinasa (CPK) Valores normales: < 160U/ml en varones y < 2 U/ml Aumento importante: hipertrofia o cncer de prstata (isoenzima prosttico), hiperparatiroidismo, Hodkin, enf. Paget Aumento moderado: enf. Gaucher, insuficiencia renal aguda, hepatitis, ictericia obstructiva Fosfatasa alcalina (ALP) Valores normales: 85-190U/ml en el adulto. Hasta 500U/ml en nios en desarrollo Aumento importante: ictericia obstructiva, colelitiasis, neoplasia de vas biliares, cirrosis, hepatomas Aumento moderado: neoplasias seas osteognicas, osteomalacia, enf. Paget, hiperparatiroidismoFosfatasa cida (ACP) Valores normales: < 2 U/ml Aumento importante: hipertrofia o cncer de prstata (isoenzima prosttico), hiperparatiroidismo, Hodkin, enf. Paget Aumento moderado: enf. Gaucher, insuficiencia renal aguda, hepatitis, ictericia obstructiva Lctico deshidrogenasa (LDH) Valores normales: < 120-230 U/ml Aumento importante: infarto de miocardio (LDH1), hepatitis vricas (LDH4, LDH5) Aumento moderado: hemlisis, accidente cerebro-vascular, distrofia muscularGamaglutamil transpeptidasa (GGT) Valores normales: < 35U/ml en varones y < 25U/ml en mujeresAumento importante: Hepatitis vrica, obstruccin biliar, metstasis hepticas, enf. alcohlica Aumento moderado: infecciones que afectan al hgado (citomegalovirus, mononucleosis infecciosa)

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Campos MJ, Raposo NR, Ferreira AP, Vitral RW. Salivary alpha-amylase activity: a possible indicator of pain-induced stress in orthodontic patients. Pain Med. 2011 Snchez GA, Miozza V, Delgado A, Busch L. Determination of salivary levels of mucin and amylase in chronic periodontitis patients. J Periodontal Res. 2011 KAPLAN. Clinical Chemistry. Interpretation and Techniques. Buenos Aires. Ed. Panamericana.2001

Bioqumica Clnica: Demostracin de la Naturaleza Proteica de las Enzimas