PRACTICA N°2MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULA

I. OBJETIVOS Que el alumno conózcalas técnicas de estudio celular Practicar y dominar las técnicas de estudio celular

II. FUNDAMENTOClasificaremos los métodos que se utilizan para el estudio de la célula en dos grandes grupos:1) Técnicas para el estudio fisicoquímico: sirven para conocer la composición y relacionar esta composición con las estructuras celulares. Estos métodos son:

a) Centrifugaciónb) Cromatografíac) Electroforesisd) Cultivos "in vitro"

2) Técnicas para el estudio morfológico de la célula. Nos permiten conocer como es su forma, su tamaño y su estructura. Son, fundamentalmente:

a) Microscopia ópticab) Microscopia electrónica

Microscopio electrónico de Trasmisión (MET) Microscopio electrónico de barrido (MEB)

1) TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO FISICOQUÍMICO DE LA CÉLULASe utilizan para el aislamiento, localización e identificación de las sustancias que constituyen la materia viva.Presentan dos problemas principalmente:a) Los componentes de un ser vivo se encuentran formando mezclas muy complejas.b) La mayoría de las sustancias que encontramos en los seres vivos son, a su vez, de una gran complejidad.A) CENTRIFUGACIÓNConsiste en la separación de los componentes de una mezcla en función de las diferencias entre las velocidades que presentan al someterlos a elevadas aceleraciones (g). Esto se consigue haciendo girar la mezcla en un rotor a un gran número de vueltas por minuto. Los aparatos empleados con este fin se denominan ultracentrifugas.Esta técnica requiere los siguientes pasos:1) FRACCIONAMIENTO U HOMOGENEIZACION: El material biológico, por ejemplo: un fragmento de tejido del hígado, es triturado para disgregarlo y romper las membranas celulares.La rotura de las membranas deja en libertad los orgánulos celulares y el contenido del hialoplasma. Si la homogeneización se realiza suavemente, los orgánulos permanecerán intactos. Obtendremos así una "papilla" que estará compuesta de restos de membranas, orgánulos celulares, núcleos, moléculas libres y agua.2) CENTRIFUGACION: Las ultracentrífugas son maquinas que consiguen velocidades de rotación muy elevadas, hasta 500.000 v/mn. Los materiales biológicos sometidos a estas aceleraciones se desplazan hacia el fondo de los recipientes que los contienen con velocidades que dependen de su masa, de su forma y volumen, y de la naturaleza del medio en el que se realice la centrifugación.B) CROMATOGRAFÍASe fundamenta en la separación de los componentes de una mezcla por sus diferencias de absorción. Estas diferencias van a ser debidas a las fuerzas de Van der Wals que se establecen entre los componentes de la

mezcla y una sustancia que actúa de fase estacionaria. Según la naturaleza de la fase estacionaria, tendremoslos siguientes tipos de cromatografía:

1) CROMATOGRAFIA SOBRE PAPEL: Se emplea para la separación de sustancias químicas que presenten propiedades muy parecidas. Se opera de la siguiente manera. Una pequeña cantidad de la mezcla a separar se deposita sobre un fragmento de papel poroso en el que quedara embebida. A continuación se introduce el borde del papel en una sustancia en la que sean solubles los componentes de la mezcla que queremos separar. El disolvente se desplazara por capilaridad y los ira arrastrando. Los componentes de la mezcla viajaran más o menos rápido según establezcan fuerzas más o menos grandes con las moléculas del papel. Para observar los componentes ya separados se emplean reacciones coloreadas específicas.2) CROMATOGRAFIA DE GASES: Consiste en un serpentín largo y delgado cuyas paredes están impregnadas de un liquido (fase estacionaria). La mezcla a separar se vaporiza y atraviesa el serpentín transportada por un gas. La fase estacionaria retiene más o menos los diferentes componentes de la mezcla. Estos se detectan cuando al atravesar una llama entran en combustión, lo que aumenta la conductividad eléctrica del detector. Este método tiene la ventaja de necesitar pequeñísimas cantidades (0,05 mg) y es capaz de separar sustancias muy parecidas químicamente; por ejemplo: ácidos grasos, azucares u hormonas.C) ELECTROFORESISEn este método, la mezcla a separar se deposita en

una cubeta sobre un soporte de tipo poroso (acetato de celulosa o también gel de almidón). A continuación se establece una diferencia de potencial entre los extremos del soporte. Las sustancias que componen la mezcla se desplazaran en función de su carga eléctrica.Naturalmente este método se empleara con sustancias que presenten cargas eléctricas (proteínas y ácidos nucleicos)D) CULTIVOS IN VITROEstos métodos nos van a permitir mantener líneas celulares en el exterior de un organismo en condiciones favorables a su multiplicación.La gran ventaja va a ser la facilidad para el tratamiento del material biológico y su estandarización.Las células extraídas deben mantenerse para su cultivo en un medio con las condiciones físicas y químicas adecuadas y suministrarles aquellas sustancias que ellas no son capaces de sintetizar. En la actualidad se venden medios de cultivo concretos para cada tipo celular y que permiten mantener los cultivos durante largos periodos de tiempo.2) MÉTODOS MORFOLÓGICOSEl ojo humano puede distinguir a 25 cm dos objetos separados entre si 0,2 mm. Este es el poder separador o poder de resolución del ojo. Las células de mamífero suelen tener unos 0,01 mm, por lo que no es posible verlas a simple vista y mucho menos observar en ellas detalles estructurales. El microscopio va a permitir su observación al aumentar el poder de resolución del ojo.CLASES DE MICROSCOPIOSA) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICOA1) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)El microscopio electrónico fue puesto a punto en 1931 a partir de los trabajos teóricos de De Broglie. Los electrones pueden comportarse como ondas o como partículas. Como ondas pueden llegar a tener una longitud 100.000 veces menor que la luz visible. Al ser

partículas negativas pueden ser desviadas por campos eléctricos que actúan como lentes. En esencia su funcionamiento es similar al del microscopio óptico. Un cátodo emite un haz de electrones que son acelerados por la aplicación de una diferencia de potencial entre el cátodo y el ánodo. El flujo de electrones es concentrado sobre el objeto por una primera lente magnética que hace las veces de condensador. Los electrones atraviesan la muestra. Una segunda lente magnética, el objetivo, da una imagen aumentada del objeto. Una tercera lente, el ocular, aumenta de nuevo la imagen dada por la anterior. La imagen final es proyectada sobre una pantalla o fotografiada.Los microscopios electrónicos permiten aumentos útiles que van de 2000 a 100.000 pudiendo llegar hasta 600.000. Los microscopios electrónicos son aparatos de hasta 2 m de alto y llegan a pesar 500 kg. FIJACION. Las células son fijadas mediante fijadores no coagulantes. Los mas corrientes

son el tetroxido de osmio (OsO4), el formaldehido (HCHO) y el permanganato potásico (MnO4K). Los metales pesados que algunos contienen se fijan selectivamente a las diferentes estructuras celulares. Aquellas que retengan mas los metales aparecerán mas oscuras. Es por esto que la imagen depende mucho del tipo de fijador utilizado.

DESHIDRATACION e INCLUSION. La pieza es deshidratada e infiltrada mediante una resina o plástico para darle una mayor consistencia y facilitar su corte.

CORTE. Los cortes se realizan mediante ultra micrótomos de cuchilla de vidrio o de diamante. Los cortes más finos (0,03μ) son depositados sobre un tamiz y dispuestos para su observación al microscopio.

A2) MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB)Este tipo de microscopio permite obtener imágenes tridimensionales del objeto a estudiar.Primero se efectúa un sombreado metálico de la superficie de la muestra, y la réplica obtenida es barrida por un haz de electrones. Los electrones secundarios que se forman son captados y convertidos en imágenes sobre una pantalla de televisión. Estos microscopio son muy útiles para revelar estructuras anatómicas submicroscopicas, sin embargo su aumento no suele pasar de 20.000.

B) MICROSCOPIO ÓPTICO O FOTÓNICOFunciona de la siguiente manera: Una fuente luminosa envía rayos de luz a una primera lente, llamada condensador, que concentra los rayos de luz sobre el objeto a observar. Estos rayos atraviesan el objeto y una lente denominada objetivo da una imagen aumentada de este. Una segunda lente, el ocular, vuelve a aumentar la imagen dada por el objetivo. Esta última imagen es la que será recibida por el observador.PREPARACION DEL MATERIAL:

CORTE. Los objetos demasiado gruesos son cortados mediante aparatos denominados microtomos. Estos permiten realizar cortes de apenas unas micras de grosor, corrientemente entre 3 μ y 20 μ. El tejido destinado al corte debe congelarse o incluirse en parafina para darle una mayor consistencia y que se pueda cortar con facilidad.

FIJACION. Su fin es matar a las células con la menor alteración de las estructuras posible, para evitar las modificaciones que pudiesen producirse posteriormente por el metabolismo celular o por la descomposición. Como fijadores se emplean determinadas sustancias químicas (por ejemplo: formaldehido y tetroxido de osmio).

DESHIDRATACION. La extracción del agua del interior de las células permitirá también una mejor conservación y la penetración de los colorantes. Para deshidratar el material a observar se le sumerge en alcoholes de cada vez mayor graduación que por dilución irán extrayendo el agua

TINCION. Es la coloración de las células o de partes de estas para que resalten y posibilitar así su observación. Algunos colorantes son selectivos pues tiñen partes concretas de la célula.

MONTAJE. Una vez realizadas las anteriores operaciones el material se coloca entre un porta-objetos y un cubre-objetos. Para un montaje no definitivo, se coloca entre "porta" y "cubre" una gota de glicerina. Este tipo de preparaciones tiene una duración limitada y solo sirven para la observación momentánea o a lo sumo de unos días. Si se desea una mayor duración debe realizarse el montaje en gelatina-glicerina.

III. PROCEDIMIENTO

ANEXO DE PRÁCTICA: MICROSCOPIA

I. OBJETIVOS Introducción a técnicas microscópicas de uso común en Biología Celular y a

herramientas básicas para el manejo de microscopios fotónicos.

II. FUNDAMENTO

Una célula animal típica mide entre 10 y 20 μm de diámetro, muy por debajo del tamaño más pequeño que puede apreciar el ojo humano (100 μm). Para observar estructuras tan pequeñas y para distinguir detalles dentro de éstas, es necesario el uso de lentes magnificadoras. Una lente convexa constituye un microscopio simple, pero generalmente no logra aumentos mayores a 10 veces el tamaño real del objeto. Para obtener magnificaciones mayores se desarrolló el microscopio compuesto, el cual está constituido por un sistema de lentes que logran magnificaciones de más de 1000 veces el tamaño del objeto.En el microscopio compuesto existen básicamente dos sistemas de lentes, uno ocular y otro objetivo, además de todo el sistema mecánico encargado de darle soporte. Dentro de los componentes no ópticos del microscopio se encuentran la base o pie y el brazo del microscopio, los cuales en su conjunto se denominan estativo. En la base del microscopio se localiza la fuente de luz del mismo, o el espejo responsable de dirigir la luz natural hacia la muestra. La platina constituye un soporte sobre el cual se coloca el espécimen, y posee un orificio que permite el pasaje de la luz. Asociados a esta platina existen dos tornillos que permiten el desplazamiento en el plano xy del espécimen. A ambos lados del estativo se disponen, generalmente, de forma concéntrica los tornillos de enfoque del microscopio (macrométrico y micrométrico), encargados de mover hacia arriba y abajo la platina para poner en foco el espécimen. Por encima de la platina se localiza el revólver portaobjetivo donde se encuentran las lentes objetivas de distinto aumento. La rotación del revólver coloca a cada una de las lentes en el eje óptico. Siguiendo el camino del eje óptico se encuentra el tubo donde se localizan elementos del sistema óptico.La parte óptica propiamente dicha está constituida por el condensador, la lente objetiva y la ocular. El condensador es una lente convergente que toma los rayos de luz provenientes de la fuente y forma un cono de rayos convergentes sobre la muestra. El condensador posee un tornillo de enfoque que permite su movimiento hacia arriba y abajo para lograr una óptima iluminación del espécimen. Además posee un diafragma o iris que regula la cantidad de luz que atraviesa el condensador y llega al espécimen, así como el ángulo del cono de luz. Las lentes ocular y objetiva son lentes convergentes, que describiremos en detalle más adelante.

Figura 1: Esquema del funcionamiento de un microscopio compuesto. La luz proveniente de una fuente pasa a través de una lente condensadora y luego atraviesa al espécimen localizado en el soporte o platina del microscopio. La lente objetiva forma luego una imagen real (es decir que puede ser proyectada en una pantalla) intermedia que se proyecta justamente en el diafragma fijo de la lente ocular. Esta imagen es posteriormente aumentada aún más por la lente ocular generándose una imagen virtual (no puede ser proyectada en una pantalla) invertida del objeto que es percibida por el ojo como si estuviese a 2.5 cm de distancia.

Características de las lentes objetivas:

La lente objetiva está compuesta por un conjunto de lentes, de las cuales la más frontal (primera lente que atraviesan los rayos de luz en la lente objetiva) se encarga de generar una imagen magnificada del objeto. El resto de las lentes se encargan de corregir aberraciones ópticas. La aberraciones (distorsiones) esféricas o cromáticas son inherentes al diseño de toda lente. Las aberraciones de tipo esféricas hacen que el campo se vea curvo cuando en realidad es plano. Las aberraciones cromáticas son producto de los distintos índices de refracción de las diferentes longitudes de onda que componen la luz blanca, y hacen que los objetos se vean borrosos. Las lentes objetivas que presentan correcciones para ambos tipo de aberración se denominan planapocromáticas.La lente objetiva tiene inscripciones que indican ciertas características, tales como su magnificación, apertura numérica, correcciones, etc. (figura 2). Las lentes objetivas de un microscopio, que poseen distinto poder de magnificación, suelen estar diseñadas para proyectar la imagen intermedia en el mismo punto del tubo, de manera que es necesario hacer únicamente pequeñas correcciones con los tornillos de enfoque cuando se cambia de lente durante la observación. Los microscopios que poseen este tipo de lentes se denominan parafocales. Además, el centro del campo de observación es el mismo en los distintos lentes, por lo cual se denominan paracentrales.

Iluminación:Para obtener buenas imágenes es importante el uso de una correcta iluminación, utilizando tanto fuentes naturales como artificiales de luz. La iluminación debe ser brillante y uniforme en toda la muestra, lo cual se logra en los microscopios actuales utilizando el sistema de iluminación Köhler. En este sistema, una lente colectora colocada por delante de la fuente generadora de luz proyecta una imagen aumentada de la fuente de luz, cuyo foco se localiza exactamente en el diafragma o iris del condensador. Al atravesar el condensador se genera un haz de rayos paralelos que iluminan de manera uniforme la muestra. El diafragma del condensador regula el ángulo del cono de luz que alcanza el espécimen. Modificando la posición del condensador con el tornillo de ajuste del condensador y variando también la apertura del diafragma iris del condensador se logra que el filamento de la fuente de luz se localice en el plano focal de la lente objetiva. Es así que se obtienen condiciones óptimas de iluminación de la muestra.La función de un microscopio será entonces generar una imagen magnificada del objeto, esto es una imagen de mayor tamaño que el objeto real, y que permita apreciar los detalles del mismo, es decir que debe tener resolución. Generalmente a magnificaciones mayores, mayor será la resolución de la imagen, aunque esto no siempre es cierto. Es importante comprender entonces las diferencias entre magnificación (tamaño de la imagen) y resolución (detalles en la imagen). Sin resolución, no importa cuán aumentada esté la imagen del objeto, esta no aportará información al observador, la magnificación deja de aportar información útil para transformarse en “magnificación vacía”.Límite de resolución:

El límite de resolución se define como la menor distancia que puede haber entre dos puntos para ser distinguidos como dos entidades independientes. Para el ojo humano esta distancia es de 100 μm, es decir que dos puntos que estén separados una distancia menor a 100 μm serán percibidos por el observador como un único punto.

La capacidad de distinguir (separar) detalles pequeños será entonces el poder de resolución del microscopio. Teniendo en cuenta esta definición, el poder de resolución de un microscopio aumenta cuando la

mínima distancia entre dos puntos que pueden distinguirse como dos objetos disminuye. El límite de resolución de una lente puede calcularse utilizando la ecuación de Abbe:Donde λ es la longitud de onda de trabajo, y AN es la apertura numérica, la que se calcula como:AN = Ƞ. sen θ.La apertura numérica depende de dos parámetros: el ángulo de incidencia de la luz en el lente (2θ), y el índice de refracción del medio que separa el objeto de la lente objetiva (Ƞ) (figura 3). Nótese que al aumentar el ángulo de incidencia de la luz, es decir en aquellos lentes de gran apertura numérica, disminuye la distancia de trabajo, esto significa que la distancia entre el espécimen y el extremo inferior de la lente objetiva es muy pequeña (figura 3).Figura 3: Apertura angular de una lente objetiva.Considerando las ecuaciones anteriores es evidente que existen tres maneras de modificar el límite de resolución de una lente: variando la longitud de onda de trabajo, variando el índice de refracción, y el ángulo del cono de luz que incide sobre la muestra. Trabajando con longitudes de onda cercanas al violeta (ver apéndice), se logra el mejor poder de resolución, es decir valores de límite de resolución pequeños. Por otro lado, para modificar el ángulo del cono de luz que incide sobre la muestra puede variarse la distancia del condensador al objeto o el diseño del condensador. Para variar el índice de refracción, lo que se hace es modificar el elemento que está en contacto con el objeto y con la lente objetiva. El índice de refracción (n) del aire es 1, el del agua es 1.33 y el del aceite y vidrio es aproximadamente 1.51 (figura 4). Por tal motivo utilizando aceite entre el preparado y la lente objetiva, se logra que los rayos de luz que atraviesan la muestra se desvíen poco y sean captados por la

lente.Figura 4: Principio de trabajo de lentes de objetivas de inmersión en aceite. La presencia de aceite en el espacio comprendido entre el cubreobjetos y la lente objetiva, incrementa el número de rayos provenientes del espécimen que son captados por la lente objetiva.

En algunas aplicaciones del microscopio no es necesario utilizar lentes objetivas de gran apertura numérica ya que los detalles de la muestra pueden ser apreciados utilizando lentes con aperturas numéricas más pequeñas. Esto además es importante ya que el trabajo con lentes objetivas de gran apertura numérica trae aparejado el inconveniente de la disminución de la profundidad de campo, la cual puede ser entendida como la distancia hacia arriba y abajo del plano focal real del espécimen que se encuentra en foco. Otra desventaja es que la distancia de trabajo (ver figura 3) es forzosamente menor en lentes de mayor apertura numérica (pues θ es mayor).

2) Microscopía de contraste de fase:Los especímenes biológicos son generalmente transparentes, es decir que el contraste de la muestra es tan bajo que, independientemente del aumento o del poder de resolución del microscopio, el objeto es prácticamente invisible. Entonces, cuando es necesario mantener inalterada la muestra, sin teñirla, se recurre a técnicas que permiten incrementar el contraste natural. Este contraste se genera al transformar diferencias en el retardo del pasaje de la luz a través de la muestra, en diferencias en intensidad de luz que puedan ser captadas por el ojo humano o la cámara fotográfica. Los especímenes biológicos interaccionan con la luz de una forma que no es uniforme, ya que retardan el pasaje de la misma de manera variable dependiendo de la estructura celular que se interponga en su camino. Este retardo dependerá del índice de refracción o grosor de la estructura celular generándose un retardo que generalmente es de 1/4 λ.El microscopio de contraste de fases está diseñado entonces, para generar contraste en los especímenes biológicos transformando las diferencias de desfasaje de las ondas en diferencias de amplitud (intensidad) que sean apreciables. El sistema posee un mecanismo constituido por un disco opaco con un anillo transparente que se inserta en el condensador del microscopio. Existe un anillo complementario en la lente objetiva, que tiene como función separar los rayos que atravesaron la muestra, de los que no lo hicieron. Casi toda la luz que atraviesa el anillo transparente en el condensador, pero no atraviesa la muestra, pasa luego por el anillo del objetivo. La luz que atraviesa la muestra será retrasada y no atravesará el anillo de la lente objetiva en ese plano.El microscopio transforma el desfasaje de 1/4λ en uno de 1/2λ. Al existir dicho desfasaje entre las ondas que atraviesan la muestra y las que no, éstas pueden interferir con las ondas que no son retrasadas por la muestra, de manera destructiva (desfasaje de 1/2λ) generando oscuridad, o constructiva (desfasaje de λ) generando zonas brillantes (Figura 6).Este tipo de microscopía es la elegida para seguir el transcurso de ciertos procesos biológicos ya que permite la observación de células vivas y no es necesario fijar y teñir la muestra para generar contraste.3) Microscopía de contraste interferencial de Nomarski (DIC):

El fundamento es similar al de contraste de fase, pero reduce al mínimo los artefactos ópticos que ésta posee y aumenta la resolución. Separa por completo la luz directa de la difractada utilizando prismas y transmisión de luz a través de vías complicadas. No se observan halos brillantes donde hay cambios bruscos del índice de difracción de la luz, pero sí se genera un falso volumen de la muestras (Figura 5).

III. PROCEDIMIENTO1. Observación de célula vegetales:

Realizar cortes Colocar una gota de agua en el portaobjetos y observar

2. Observación de células animales Colocar una gota de sangre en el portaobjetos realizar un barrido con el cubreobjetos y

observar3. Observación de hongos

Colocar una gota de agua en el portaobjetos, con el asa de siembra esparcir la muestra, colocar el cubreobjetos y observar

IV. CUESTIONARIO

1. Registre los aumentos (X) y las aperturas numéricas (AN) de las lentes objetivas instaladas en su microscopio.

Aumento (×) Apertura numérica (AN)

2. En condiciones de observación con luz verde (λ = 550 nm) y usando la ecuación de Abbe, indique el mejor límite de resolución (LR) obtenible con su microscopio. Explicite los cálculos realizados.

3. Escriba los fundamentos de Microscopía de epifluorescencia.4. Escriba los fundamentos de Microscopía láser confocal 5. Dibuje lo observado indicando el aumento correspondiente:6. Escriba la ecuación de Abbe y explique brevemente su significado. 7. Explique brevemente el concepto de apertura numérica.8. Explique la diferencia entre resolución y magnificación. 9. Identifique en el diagrama adjunto:

PRACTICA N°3PERMEABILIDAD CELULAR.

I. OBJETIVOS

Analizar los fenómenos de ósmosis a través de la membrana plasmática de células animales y vegetales.

Comprender los conceptos de permeabilidad de membrana, osmolaridad e isotonicidad y su importancia.

II. FUNDAMENTOLas membranas biológicas comparten una estructura general común. Están constituidas por una bicapa muy delgada de moléculas lipídicas (fosfolípidos) y proteicas (aproximadamente 5 nm de espesor) que forman estructuras dinámicas y fluidas. En microscopía electrónica de transmisión las membranas se observan como una estructura trilaminar debido a que la región ocupada por las cabezas de los fosfolípidos se tiñe con el tetróxido de osmio quedando electrón densa y la región hidrofóbica electrón lúcida. Una de las principales funciones que desempeñan las membranas es mantener las diferencias esenciales entre el medio intracelular y extracelular actuando como barreras selectivamente permeables.Conceptos básicos:1) Permeabilidad de membrana:- membranas permeables: permiten el pasaje de todo tipo de moléculas.- membranas semipermeables: permiten el pasaje de un sólo tipo de molécula.- membranas selectivamente permeables: poseen diferentes grados de permeabilidad a distintas moléculas.2) Tonicidad de una solución:- solución hipotónica: menor concentración de solutos con respecto al interior celular u otra solución.- solución isotónica: igual concentración de solutos con respecto al interior celular u otra solución.- solución hipertónica: mayor concentración de solutos con respecto al interior celular u otra solución.3) Ósmosis:Movimiento de agua en respuesta al gradiente de concentración de solutos. La fuerza que dirige este movimiento se conoce como presión osmótica. No todos los solutos ejercen el mismo efecto osmótico (concentraciones iguales de sales y moléculas no ionizables no ejercen la misma presión osmótica).4) Osmolaridad:Es una medida de concentración que indica la presión osmótica ejercida por una solución. Depende del número de partículas disueltas en la solución independientemente de su naturaleza. La concentración fisiológica del interior celular es 0,3 osmolar. Es de suma importancia considerar esta condición para la preparación de toda solución que interactúe con células vivas. 242) PRUEBA DE VIBLIDAD CELULAREs el conteo de las células vivas (sanas) o muertas en una muestra. Generalmente los métodos de determinación de la viabilidad se basan en el análisis de dos parámetros: actividad metabólica de la célula o integridad de membrana plasmática. Los métodos más comunes para evaluar la integridad de membrana y así determinar el índice de células viables en una suspensión celular son los test de exclusión de colorantes vitales (ej.: Azul Tripán). Las células vivas, cuyas membranas celulares estén integras, excluyen a estos

Protocolo de obtención de células para iniciar un cultivo primario (no será utilizado en clase)- Cortar los órganos en trozos de menos de 2mm con 2 escalpelos en una gota de tampón salino (PBS, pH 7.2-7.4).- Agregar 1-1.5ml de solución de tripsina (en tampón salino pH 7.2-7.4, con EDTA).- Incubar 15min a 37ºC y agregue aproximadamente 4 ml de medio de cultivo suplementado con suero.- Pipetear repetidamente (sin hacer espuma) a fin de obtener una suspensión celular homogénea.- Tomar una muestra de 500μl y agregar 500μl de solución de Azul Tripán diluida.- Observar rápidamente al microscopio montando una gota entre porta y cubreobjeto.

colorantes en forma activa. El método del Azul Tripán pone en evidencia el funcionamiento de un mecanismo de transporte activo a través de la membrana plasmática. Por este procedimiento se visualizan las células mediante un microscopio y se cuentan las células muertas (azules) en el total de la muestra. Este método es utilizado por ejemplo previo a iniciar un cultivo, para determinar cuantas células vivas existen, permitiendo optimizar las condiciones de cultivo. Además puede emplearse para determinar la eficacia de agentes terapéuticos en la búsqueda de drogas, o en tests toxicológicos.

III. PROCEDIMIENTO1. Morfología normal de eritrocitos y hoja de Elodea sp.

Corte una hoja de Elodea sp. y monte entre porta y cubreobjetos Tome una gota de sangre y monte entre porta y cubreobjetos Observe al microscopio

2. Comportamiento de las células vegetales frente a soluciones con diferente concentración de solutos

Realice montajes de hojas de Elodea en soluciones de cloruro de sodio en diferentes concentraciones

Observe al microscopio Luego de algunos minutos, vuelva a montar y observe al microscopio el Comportamiento

de células animales (eritrocitos) frente a soluciones de diferente concentración.

IV. CUESTIONARIO1.- Exprese la presión osmótica en términos de la ley de van't Hoff. Justifique brevemente.2.- ¿Qué es la osmolaridad? ¿Cómo puede determinarse experimentalmente?3.- Describa de forma breve en qué consiste la regla de Overton4.- Indique con una flecha hacia dónde se producirá el flujo de agua en los siguientes ejemplos. Justifique brevemente.

5.- ¿En qué se basa el método de determinación de la viabilidad celular con el colorante azul Tripán?

PRACTICA N°4PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS

I. OBJETIVOS Obtención de una fracción subcelular enriquecida en cloroplastos. Identificación de cloroplastos en dicha fracción. Estudio de la ultraestructura del cloroplasto.

II. FUNDAMENTO

En algas y plantas superiores, la fotosíntesis ocurre en el cloroplasto. Este organelo posee, al igual que la mitocondria, una envoltura compuesta de dos membranas, una externa y una interna, pero además posee un tercer sistema de membrana, la membrana tilacoidal. Esta membrana forma pequeños sacos aplanados, denominados tilacoides, cuyo lumen es el espacio tilacoidal. Los tilacoides se apilan, formando bloques denominados grana (cada bloque en singular es un granum). Los grana están interconectados por regiones de la membrana tilacoidal alargadas, denominadas laminillas del estroma, cuyo lumen es continuo con el espacio tilacoidal. El estroma es el espacio interno del cloroplasto que queda por fuera de la membrana tilacoidal (Figura 1).

La fotosíntesis es un complejo proceso en el cual la energía de la luz se usa para generar energía química en forma de ATP y poder reductor en forma de NADPH, que se usan a su vez para convertir el CO2 del aire en carbohidratos, liberándose paralelamente O2 a partir de agua (en plantas, algas y algunas bacterias). La reacción global de la fotosíntesis es:

6 CO2 + 6 H2O → 6 O2 + C6H12O6Las reacciones de la fotosíntesis pueden agruparse en dos clases, las reacciones fotoquímicas, que ocurren en la membrana tilacoidal y en las que se generan ATP y NADPH, y las reacciones bioquímicas, que comienzan en el estroma del cloroplasto y continúan en el citosol, en las que el CO2 es convertido en carbohidratos.

Las reacciones fotoquímicas, mediante las que se obtiene ATP y NADPH, constituyen un proceso de dos fases, denominado fotofosforilación no cíclica, para distinguirlo de otro proceso, la fotofosforilación cíclica, en el que solo se genera ATP. En la primera fase de la fotofosforilación no cíclica, la absorción de luz por el fotosistema II le permite remover electrones provenientes del agua y transferirlos a una cadena de transporte, hasta llegar al fotosistema I. Allí, una nueva absorción de luz confiere suficiente energía a los electrones para poder reducir a su aceptor final, el NADP+, formando NADPH (Figura 2).

Los fotosistemas son complejos formados por varios polipéptidos y distintos tipos de pigmentos, y en ellos la luz absorbida se utiliza para excitar a un electrón en una molécula de clorofila particular. En el fotosistema II, este electrón es transferido a la plastoquinona, una pequeña molécula análoga a la coenzima Q de la fosforilación oxidativa. Cada electrón transferido por el fotosistema II se repone con uno proveniente del agua, en una compleja reacción cuyo resultado final es la liberación de O2 a partir de agua. La plastoquinona transfiere electrones al complejo b6-f, análogo al complejo b-c1 de la mitocondria, el cual bombea protones dentro del espacio tilacoidal. La plastocianina, una proteína pequeña que contiene un átomo de cobre que varía de estado de oxidación, transporta electrones desde el complejo b6-f hasta el fotosistema I. Allí, la absorción de un fotón aumenta la energía de estos electrones, que pueden reducir a la ferredoxina, una proteína con un grupo prostético que contiene hierro y azufre. Esta a su vez transfiere los electrones al NADP+, en una reacción catalizada por la enzima NADP reductasa. Además de generar NADPH, este proceso de transporte de electrones provoca la acumulación de protones en el espacio tilacoidal, con la consecuente generación de un gradiente electroquímico a través de la membrana tilacoidal, el cual es usado para sintetizar ATP. En 1937, Robert Hill descubrió que cuando cloroplastos aislados son iluminados en ausencia de CO2, son capaces de reducir un aceptor artificial, liberando O2 paralelamente. Este resultado fue una de las primeras demostraciones de que el CO2 no participa directamente en el proceso que produce O2, y puede resumirse en la siguiente reacción química, denominada reacción de Hill:

luz, cloroplastos H2O + A AH2 + ½ O2

En el práctico realizaremos un protocolo de separación de pigmentos fotosintéticos mediante cromatografía. Los pigmentos fotosintéticos son responsables de absorber y atrapar la energía lumínica en los primeros pasos de la fotosíntesis. Los principales pigmentos son las clorofilas. En plantas verdes existen las clorofilas a y b. También existen pigmentos accesorios llamados carotenoides. Dada su estructura molecular, las clorofilas son capaces de absorber luz en el rojo y el azul del espectro visible y transmiten en el verde. Los carotenoides, por su parte, absorben en el azul y transmiten en el amarillo-anaranjado. Ya que el espectro de absorción de los pigmentos accesorios difiere del de las clorofilas, tienen el efecto de ampliar el rango de longitudes de onda que puedan ser utilizados en la fotosíntesis. La cromatografía es un procedimiento para separar los componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Existen varios tipos de cromatografía pero en todos los casos la separación se logra por la distribución de los componentes en una fase estacionaria (fija) y una fase móvil. En la cromatografía en papel, los componentes de la mezcla se separan en zonas discretas en una tira de papel de filtro,

utilizando en la fase móvil una mezcla de solventes en la cual cada componente de la muestra a separar se disuelve de manera diferencial. La fase estacionaria está constituida por el papel. Durante la cromatografía existen dos fuerzas opuestas. La fuerza del solvente en movimiento que se extiende por capilaridad hacia el otro extremo del papel, que tiende a llevarse cada componente consigo. También existe una fuerza de resistencia debida a la disolución de cada componente en la fase estacionaria. De la interacción de estas dos fuerzas en cada componente de la muestra, es que resulta la separación de cada uno de ellos. El grado de separación obtenido es una función de la solubilidad relativa de cada componente en la fase estacionaria y la fase móvil (Figura 3).

III. PROCEDIMIENTO1. Extracción de clorofila por cromatografía.

a) Método I: Cortar en trozos una hoja y macerarla en un mortero con 5 mL de acetona. Tomar la tira de papel de filtro por el borde y marcar una línea con lápiz a

aproximadamente dos cm de uno de los extremos. A lo largo de la línea marcada, sembrar con un capilar una muestra de la extracción

orgánica y dejar secar. Repetir el procedimiento unas 10 veces para concentrar la muestra.

Agregar con pipeta el solvente cromatográfico (eter/acetona, 3:1) hasta un nivel intermedio entre el extremo del papel y la línea de siembra, y colocar la tira de papel de filtro en la probeta de vidrio. Tapar la probeta para reducir la evaporación de solventes.

Cuando el frente de solvente está a unos 0,5 cm del borde del papel, retirar de la probeta con pinza, y antes que el solvente se evapore, marcar con lápiz una línea en el cromatograma que represente el frente de migración.

Mientras el solvente se evapora (2-3 min) debe marcarse el punto de mayor migración de cada uno de los pigmentos.

Calcular el Rf (Ratio factor) para cada uno de los pigmentos según:

Rf = . distancia migrada por el soluto (pigmento) . distancia migrada por el solvente

b) Método II: Cortar en trozos una hoja y macerarla en con 20 mL de alcohol. Tomar una gasa y filtrar Tomar la tira de papel de filtro por el borde y colocarla sobre el extracto

aproximadamente dos cm de uno de los extremos. Cuando el frente de solvente está a unos 0,5 cm del borde del papel, retirar y marcar

con lápiz una línea en el cromatograma que represente el frente de amigración. Mientras el solvente se evapora (2-3 min) debe marcarse el punto de mayor migración

de cada uno de los pigmentos.

Calcular el Rf (Ratio factor) para cada uno de los pigmentos según:

Rf = . distancia migrada por el soluto (pigmento) . distancia migrada por el solvente

2. Extracción de pigmentos. Cortar en un mortero trozos de las muestras a evaluar y macerarla en con 20 mL de

alcohol. Adicionar una cucharadita de carbonato de calcio Filtrar con ayuda de una gasa Adicionar 20 ml de gasolina y 10 ml de agua Llevara a la pera de decantación y obtener las dos fases por separado

IV. CUESTIONARIO1. ¿En qué compartimientos ocurre la fase fotoquímica (luminosa) y la fase bioquímica

(oscura) de la fotosíntesis? Justifique brevemente su respuesta. 2. Señale cuál(es) de las siguientes afirmaciones acerca del fotosistema II NO es correcta.

Justifique su respuesta. a) Está ubicado en las membranas tilacoidales. b) Está involucrado en la oxidación de H2O. c) Posee una clorofila oxidable: P680. d) Tiene asociado un complejo de antena para su función de capturar luz. e) Es necesario para la fotofosforilación cíclica.

3. ¿Cómo se explica el comportamiento de los pigmentos en el cromatograma? Justifique. 4. Además del Rf, ¿qué otra característica podría utilizarse para identificar un pigmento

desconocido? 5. ¿Por qué se utilizan solventes orgánicos en la cromatografía de pigmentos fotosintéticos y

no por ejemplo, agua?

PRACTICA N°5NÚCLEO

I. OBJETIVOS Identificación de una fracción subcelular enriquecida en núcleos

mediante la reacción de Feulgen y comparación con núcleos en cortes histológicos.

Estudio de la ultraestructura del núcleo.

II. FUNDAMENTO

El núcleo es el organelo celular donde se localiza el ADN. Su forma varía dependiendo del tipo celular, puede ser esférico, ovoide o multilobulado. Su tamaño oscila entre 3 a 15 μm y su posición depende del tipo celular. Está delimitado por una envoltura nuclear constituida por dos membranas celulares (dos bicapas lipídicas) separadas por una cisterna perinuclear. Esta envoltura se continúa en el citoplasma con el retículo endoplásmico rugoso, y por lo tanto su cara externa presenta ribosomas asociados.

En la cara interna de la envoltura se localiza una red de filamentos intermedios denominada lámina nuclear, constituida por las proteínas denominadas laminas. Tanto la lámina nuclear como la envoltura se ven interrumpidas en regiones denominadas poros nucleares, destinados al transporte de moléculas desde y hacia el citosol. En el interior del núcleo el ADN que constituye los cromosomas se empaqueta con proteínas denominadas histonas. El conjunto del ADN, las histonas, y proteínas cromosómicas no histonas, se denomina cromatina. La unidad fundamental de empaquetado recibe el nombre de nucleosoma y está constituido por un octámero de histonas rodeado por dos vueltas de ADN. La cromatina posee diversos grados de compactación dentro del núcleo, y pueden existir variaciones durante el ciclo celular. En su estado más laxo o descondensado la cromatina se denomina eucromatina y se aprecia en microscopía electrónica de transmisión como regiones electrón-lúcidas (ver figura). Esta cromatina es transcripcionalmente activa ya que permite el acceso de factores de transcripción y toda la maquinaria enzimática necesaria para la transcripción. La cromatina condensada se denomina heterocromatina y se observa en microscopía electrónica de transmisión como regiones electrón-densas, generalmente asociadas a la envoltura nuclear. Esta cromatina se asocia con estados transcripcionalmente inactivos ya que dificulta el acceso de factores de transcripción al ADN. Es importante recordar que la compactación y descompactación de la cromatina son fenómenos reversibles. Podemos encontrar diferentes niveles

de compactación del ADN que van desde la fibra de 2 nanómetros (doble hélice de ADN), pasando por la fibra de 11nm que corresponde al “collar de cuentas” que incluye los nucleosomas (complejo de histonas rodeadas de dos vueltas del ADN), la fibra de 30nm, la de 300nm, la de 700nm hasta el cromosoma mitótico. El nucléolo es una región dentro del núcleo, no delimitada por membrana, donde ocurre la transcripción del ARNr y ensamblado de las subunidades ribosomales por separado. Allí se localizan loops de ADN de distintos cromosomas, que contienen clusters de genes de ARNr. Cada uno de estos clusters se denomina Región Organizadora Nucleolar (NOR). En una micrografía electrónica de transmisión pueden distinguirse tres regiones en el nulceolo: (1) una región pálida denominada componente fibrilar o centro fibrilar que contiene ADN que no está siendo transcrito, (2) un componente fibrilar denso que contiene moléculas de ARNr que están siendo sintetizadas, y (3) componente granular que contiene partículas precursoras ribosomales en maduración. El tamaño del nucleolo refleja su actividad por lo que varía en distintos tipos celulares y puede variar también dentro de una misma célula. III. PROCEDIMIENTO1. Extracción de ADN.

a) Método I: Lavar las hojas de espinaca y llenar hasta aproximadamente completar una Beaker

de 100mL. ( mg) En una licuadora se coloca la espinaca más 200 ml de agua y 20mg de cloruro de

sodio (licuar por 15 segundos) Filtrar la espinaca, adicionar 1/6 parte de un detergente no antibacteriano (según la

cantidad adquirida). Dejar reposar por 10min Dividir la muestra en 4 tubos con 40 ml cada tubo,

Tubos 1 y 3 → Enzima Tubos 2 y 4 → Extracto de piña o papaya (filtrar)

Se agita suavemente para no romper el ADN, luego adicionar: (por la paredes lentamente.Tubos 1 y 2→ 40 ml de alcohol isopropilicoTubos 3 y 4→ 40 ml de alcohol etílico

Extraer con ayuda de la varilla en ADNb) Método II:

En 100ml de agua adicionar 10g de cloruro de sodio, realizar un enjuague bucal con la solución anteriormente preparada

Tomar 50 ml de detergente y adicionar 50ml de agua. Mezcal el enjuague bucal y el detergente. Dejar reposar por 10min

Dividir la muestra en 2 tubos con 40 ml cada tubo, Tubos 1 y 2 → Enzima

Se agita suavemente para no romper el ADN, luego adicionar: (por la paredes lentamente).Tubos 1 → 40 ml de alcohol isopropilicoTubos 2 → 40 ml de alcohol etílico

Extraer con ayuda de la varilla en ADN

2. Mitosis en cebolla

Llenar un recipiente con agua y colocar un bulbo de cebolla sujeto con dos o tres palillos de manera que la parte inferior quede inmersa en el agua. Al cabo de 3-4 días aparecerán numerosas raicillas en crecimiento de unos 3 ó 4 cm. de longitud.

Cortar con una tijeras unos 2-3mm del extremo de las raicillas y depositarlo en un vidrio de reloj en el que se han vertido 2-3ml de Orceína A.

Calentar suavemente el vidrio de reloj a la llama del mechero durante unos 8 minutos, evitando la ebullición,hasta la emisión de vapores

Con las pinzas tomar no de los ápices o extremos de las raicillas y colocarla sobre un portaobjetos, añadir una gota de Orceína B y dejar actuar durante un minuto.5

Colocar el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raíz. Con el mango de una aguja enmangada dar unosgolpecitos cobre el cubre sin romperlo de modo que la raíz quede extendida.

Sobre la preparación colocar unas tiras de papel filtro, 5 o 6. Poner el dedo pulgar sobre el papel filtro en lazona de cubre objetos y hacer una suave presión, evitando que el cubre resbale.

Observar al microscopio

IV. CUESTIONARIO1.- ¿Qué niveles de compactación de la cromatina conoce? Mencione un caso extremo de compactación que conozca. 2.- Mencione las principales características de la envoltura nuclear y explique por qué NO es apropiado denominarla membrana nuclear. 3.- Se sospecha la presencia de una proteína particular en los complejos de poro nuclear. Describa brevemente una estrategia para verificarlo. 4.- Enumere los principales pasos del fraccionamiento subcelular, y explique brevemente en qué consisten.

PRACTICA N°6MITOCONDRIA

I. OBJETIVOS Identificación de una fracción subcelular enriquecida en mitocondrias mediante la

detección de actividad de la enzima succinato deshidrogenasa (SDH). Estudio de la ultraestructura de la mitocondria.

II. FUNDAMENTOLa mitocondria es el lugar donde ocurre la mayor parte de las reacciones del metabolismo oxidativo en las células eucariotas. Esto es, es el sitio en el cual se realiza la mayor parte de la degradación oxidativa de compuestos como carbohidratos, ácidos grasos y aminoácidos, que terminan dando lugar a la generación de energía en forma de síntesis de ATP. La mitocondria es un organelo de morfología y tamaño variables, pero que típicamente tiene una forma elipsoide, de aproximadamente 0,5 μm de diámetro y 1 μm de largo. Las mitocondrias están delimitadas por dos membranas, una membrana externa lisa y una membrana interna extensamente invaginada. El espacio entre ambas membranas se conoce como espacio intermembrana, y las invaginaciones de la membrana interna, que amplían enormemente su área, se denominan crestas (Figura 1). El compartimento interno de la mitocondria es la matriz mitocondrial. Mientras que la membrana externa permite la difusión libre de moléculas de hasta 10 kDa, la membrana interna sólo deja pasar libremente O2, CO2 y H2O, y posee varios transportadores que controlan el pasaje de diversos metabolitos.

En la figura anterior se esquematizan dos de los principales procesos metabólicos que ocurren en la mitocondria, y que nos van a permitir identificarla: el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. El resultado neto del ciclo de Krebs es la oxidación de un grupo acetilo (CH3−C=O) perteneciente a la acetil-CoA a dos moléculas de CO2, y en paralelo la reducción de tres NAD+ y un FAD para dar 3 NADH y un FADH2, respectivamente. Todas las enzimas que catalizan las reacciones del ciclo de Krebs se hallan en la matriz mitocondrial, excepto la succinato deshidrogenas, que está inserta en la membrana mitocondrial interna. En la cadena respiratoria, los electrones de alta energía del NADH y el FADH2 pasan por sucesivos complejos aceptores de potencial redox creciente, con lo que esta energía se va liberando. En cada complejo se bombean protones hacia el espacio intermembrana, con lo que se establece una diferencia de concentración de H+ (y de carga) a través de la membrana mitocondrial interna. La energía liberada por el transporte de electrones queda almacenada en forma de un gradiente electroquímico. Los tres complejos, así como los dos transportadores, que constituyen la cadena respiratoria, están insertos en la membrana mitocondrial interna. Los electrones provenientes del NADH pasan al complejo NADH deshidrogenasa, y de allí pasan a la coenzima Q, una pequeña molécula hidrofóbica, que los transporta al complejo citocromo b-c1. Los citocromos son proteínas que contienen grupos hemo, en los que un átomo de hierro alterna entre los estados de oxidación Fe (II) y Fe (III). Existen varios tipos de citocromos, que pueden hallarse formando parte de complejos, o bien aislados, como el citocromo c, que transporta electrones del complejo citocromo b-c1 al complejo citocromo oxidasa. En este complejo, los electrones llegan a su aceptor final, el O2, para formar H2O. La oxidación del FADH2 es menos favorable que la del NADH, y sus electrones entran en la cadena respiratoria más adelante, siendo cedidos a la coenzima Q. El FADH2 está unido covalentemente a la succinato deshidrogenasa, que está inserta en la membrana mitocondrial interna, como mencionamos más atrás. La succinato deshidrogenasa es una enzima que sólo se encuentra en mitocondrias, y por lo tanto la medición de su actividad puede usarse para detectar la presencia de mitocondrias en una fracción subcelular. Esto se puede realizar utilizando un aceptor artificial de electrones que tenga mayor afinidad por los electrones que el FAD, como por ejemplo: 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP). Este compuesto cambia el color según su estado de oxidación: es azul cuando se encuentra en estado oxidado e incoloro cuando está reducido.

III. PROCEDIMIENTO1. Respiración.

Pesar 20 g de levadura y llevara un matraz de 200 mL Adicionar agua ( enrazar a 200mL) Pesar 1g de azúcar y llevar a matraz ( mas una pisca de sal), tapar con el corcho y el

tubo acodado o en forma de U Paralelamente llenar otro matraz con agua de cal ( 15g de oxido de calcio en 1000ml

de agua destilada hervida) Unir los dos matraces mediante el tubo acodado o en forma de U.

2. Fermentación Con la probeta medir 200 ml de leche y llevar a un frasco de vidrio Medir 100 ml de yogurt prebiótico y adicionar a los 200mL leche, tapar y llevar a

incubar por 24 h Sacar de la incubadora y medir el pH. Tomar una gota de muestra en el portaobjetos, expandir y realizar tinción de gram.

IV. CUESTIONARIO

1. Compare de forma breve las características de las membranas mitocondriales interna y externa.

2. De las siguientes afirmaciones, señale la(s) falsa(s), y justifique brevemente su respuesta. a) Las mitocondrias se encuentran en todas las células eucariotas.

b) A nivel mitocondrial se produce la oxidación de carbohidratos, aminoácidos y ácidos grasos.

c) En todas las células eucariotas, la mayor parte del ATP celular es de origen mitocondrial.

d) Las mitocondrias presentan intenso dinamismo y plasticidad.

e) La localización de las mitocondrias en la célula es independiente de la función propia de cada célula.

3. Explique brevemente qué procesos ocurren en la matriz mitocondrial y qué procesos ocurren en las membranas.

PRACTICA N°7ANÁLISIS DE PARÁMETROS DEL CICLO CELULAR

I. OBJETIVOS Reconocimiento al microscopio de luz de células en interfase y en las distintas etapas de la

mitosis. Estimación del índice mitótico de una población celular. Estimación de la duración de las fases del ciclo celular en base a datos tomados de la

literatura, obtenidos mediante la técnica de autorradiografía.

II. FUNDAMENTOParte 1 El ciclo de vida de la célula, visto al microscopio, se divide en dos grandes fases, la interfase y la fase M, etapa de división compuesta por la mitosis (división nuclear) y la citocinesis (división del citoplasma). A su vez, la interfase se subdivide típicamente en las fases G1, S y G2. La fase S corresponde a la etapa de duplicación del ADN; la fase G1 es el intervalo entre la salida de la fase M y la entrada en fase S; y la fase G2 es el intervalo entre la fase S y una nueva fase M:La duración de estas fases es variable y depende de distintos factores, en particular de la duración de G1. Al microscopio, las células en interfase se reconocen por la presencia de un núcleo que se tiñe difusamente, sin que sea posible individualizar cromosomas, aunque sí puede observarse dentro del núcleo un punto oscuro, el nucléolo. Por otra parte, la mitosis también se subdivide en etapas, claramente distinguibles al microscopio:

Profase. La cromatina en el núcleo comienza a condensarse en cromosomas bien definidos, visibles al microscopio. Cada cromosoma se ha duplicado y consiste en dos cromátidas hermanas. Cada una de ellas posee una región especializada, el centrómero, y ambos centrómeros las mantienen apareadas. Hacia el fin de la profase los microtúbulos citoplasmáticos se desensamblan y reensamblan para formar el huso mitótico. Prometafase. La prometafase comienza con el desensamblaje de la envoltura nuclear. Los microtúbulos del huso mitótico pueden entrar ahora a la región nuclear. En los centrómeros, comienzan a formarse complejos proteicos denominados cinetocoros. A ellos se adhieren parte de los microtúbulos del huso, y permiten que los cromosomas empiecen a moverse. Estos microtúbulos reciben el nombre de microtúbulos cinetocóricos, mientras que los restantes microtúbulos del huso mitótico se denominan microtúbulos polares (los que crecen alejando los centros polares) y astrales (que interactúan mediante proteínas con la envoltura tirando de los centros polares). Metafase. Los microtúbulos cinetocóricos desplazan a los cromosomas a lo largo del huso y terminan por alinearlos en la línea media del huso mitótico, la placa metafásica. Esta organización ayuda a asegurar que en la próxima fase, cuando los cromosomas se separan, cada nuevo núcleo recibirá una copia de cada cromosoma. Anafase. La anafase comienza cuando los cinetocoros en cada cromosoma se separan, permitiendo que las dos cromátidas hermanas se desapareen y se desplacen hacia polos opuestos. A partir de este momento cada cromátida pasa a ser considerada un cromosoma. El movimiento de los cromosomas se divide en dos etapas. Durante la anafase A, los microtúbulos cinetocóricos se acortan, acercando los cromosomas a los polos del huso mitótico. Durante la anafase B, los microtúbulos polares se alargan, aumentando la separación entre los polos. La citocinesis usualmente comienza en esta fase y luego continúa durante la telofase. Telofase. Una nueva envoltura nuclear se forma alrededor de cada grupo de cromosomas hijos, que vuelven a descondensarse y dejan de ser visibles al microscopio óptico. En células vegetales, se puede observar en esta fase una estructura denominada fragmoplasto en el espacio entre ambos núcleos, y es el precursor de la nueva pared celular que va a separar a las células hijas. Una población de células que se dividen activamente puede clasificarse en: Población sincrónica, en que las células van atravesando las distintas etapas del ciclo a la vez, y en particular se dividen al mismo tiempo. Las células de los embriones tempranos de la mayoría de los animales son un ejemplo de población sincrónica.

Población asincrónica, las células atraviesan el ciclo desfasadamente, y a cada momento pueden encontrarse células en todas las etapas del ciclo celular.

Estrategia experimental El análisis de los parámetros de la cinética celular ha sido objeto de intenso estudio, principalmente debido a sus implicaciones en el desarrollo de terapias para el cáncer. En esta actividad práctica introduciremos algunos conceptos clave para el análisis de estos parámetros.El índice mitótico de una población celular es la proporción de células en mitosis que hay en esta población: IM = nº de células en mitosis / nº de células totales.

En una población asincrónica, el número de células en mitosis va a depender de la proporción que ocupe la mitosis dentro de la duración del ciclo celular. Por ejemplo, si para cierta población celular la mitosis ocupa un 5 % del total del ciclo celular, cabría esperar, por probabilidad, que aproximadamente un 5 % de las células estuviera en mitosis en un momento dado. A la inversa, al obtener el índice mitótico de una población celular asincrónica, se obtiene la proporción que ocupa la mitosis dentro del ciclo celular para esa población. Además, puesto que en la mayoría de las células la mitosis dura aproximadamente una hora, conocer el índice mitótico permite calcular la duración total aproximada del ciclo celular. En el ejemplo anterior, el ciclo celular duraría 20 horas (1 hora * 100/5). La población celular que utilizaremos en la parte 1 es un meristemo de raíz de cebolla. Un meristemo es un tejido vegetal no diferenciado, en el cual las células se dividen activamente para luego diferenciarse, y por lo tanto es ideal para reconocer células en interfase y en distintas etapas de la mitosis, así como para calcular el índice mitótico. Parte 2

La autorradiografía es una técnica que permite localizar en tejidos y células un isótopo radiactivo, que puede haberse incorporado de diversas maneras. Consiste en cubrir al tejido o células que contienen al isótopo radiactivo con una delgada capa de emulsión fotográfica, dejándolo en oscuridad por un cierto tiempo, para que la emulsión quede expuesta a la radiación emitida por el espécimen. La emulsión que se encuentra exactamente arriba de las zonas que poseen radiactividad va a velarse, y luego del revelado se van a ver al microscopio como granos oscuros. En la tabla I del protocolo de actividades prácticas, se muestran datos obtenidos mediante autorradiografía. Un cultivo de células de mamífero en crecimiento rápido fue incubado por 30 minutos con 3H-timidina. La timidina es la base timina unida a desoxirribosa, y es un precursor del ADN. La 3H-timidina contiene tritio, el isótopo radiactivo del hidrógeno. La 3H-timidina va a incorporarse al ADN de las células, pero sólo al de las células que estén en la fase de síntesis de ADN, es decir en la fase S del ciclo celular. Luego de la incubación, la 3H-timidina fue removida del medio de cultivo y se extrajeron muestras a intervalos regulares de 3 horas, que fueron procesadas para autorradiografía. Posteriormente, las muestras fueron teñidas con hematoxilina, para visualizar los núcleos de las células que no incorporaron timidina marcada. En cada muestra, se contó el número de células mitóticas, y se las clasificó en marcadas y no marcadas, calculándose el porcentaje de mitosis marcadas sobre mitosis totales, tal como aparece en la tabla. Por último, se graficó este porcentaje en función del tiempo. Para entender cómo puede obtenerse la duración de las fases del ciclo celular a partir de este tipo de gráfico, consideraremos una situación simplificada. Un cultivo celular típico es una población asincrónica, en la que las células entran y salen de la fase M a distintos tiempos. Más aún, la duración de cada fase, en particular G1, va a ser distinta para cada célula. Para hacer más sencillo el análisis, consideraremos una población asincrónica, pero en la cual las fases del ciclo celular duran lo mismo para todas las células. También asumiremos que la fase M es tan corta comparada con las demás fases que puede tomarse como instantánea. La pregunta a resolver es: ¿qué forma tendría una gráfica de mitosis marcadas sobre mitosis totales en función del tiempo, en esta situación?

Veamos en primer lugar como se distribuyen las células a T0, o sea al final del pulso de 3H-timidina:

A este tiempo, las células marcadas están todas en fase S, porque sólo las células que sintetizan ADN pueden incorporar 3H-timidina y marcarse. Por lo tanto, a T0 el porcentaje de mitosis marcadas será igual a 0. Cuando las primeras células marcadas lleguen a la fase M, a T = T1, la distribución será la siguiente:

Como las células atraviesan el ciclo a la misma velocidad (porque la duración de cada fase es igual para todas), cuando las células marcadas llegan a fase M, las células que a T0 estaban en G2 ya pasaron la fase M y ahora están en G1. Por lo tanto, a T1, en fase M solo hay células marcadas, y el porcentaje de mitosis marcadas es 100%. A medida que vayan llegando células marcadas a fase M, el porcentaje de mitosis marcadas se mantendrá en 100%. Cuando la última célula marcada salga de fase M, a T = T2, el porcentaje de mitosis marcadas volverá a caer a 0. Eventualmente, a T = T3, las células marcadas volverán a llegar a fase M, repitiéndose el esquema correspondiente a T1.

Por lo tanto, la gráfica de mitosis marcadas sobre mitosis totales en función del tiempo, para esta situación, tendrá la siguiente forma:

Una serie de picos regulares…

El 100% de mitosis marcadas se alcanza a T1, cuando las primeras células marcadas llegan a fase M. A su vez, las primeras células marcadas en llegar a fase M son células que a T0 estaban al final de la fase S, y por ende sólo les queda recorrer G2 para llegar a fase M (ver esquema a T = T0). Por lo tanto, en este gráfico, T1 -- T0 es igual a G2. El 100% de mitosis marcadas se mantiene hasta que llegan a fase M las últimas células marcadas. Estas son células que a T0 estaban al comienzo de S. Por lo tanto, el tiempo que transcurre entre que llegan a fase M las primeras y las últimas células marcadas es igual a la duración de la fase S. Este tiempo es igual a T2 – T1. Por último, el tiempo entre T1 y T3 es igual a la duración total del ciclo celular, ya que es el tiempo entre dos fases M para las mismas células. En suma, de esta gráfica se obtienen la duración de G2, de S y del total del ciclo celular. Si conocemos la duración de la fase M (en general igual a 1 hora), podemos además obtener la duración de G1.En resumen, la idea básica es usar la mitosis como una ventana y observar a la cohorte de células marcadas con timidina tritiada pasar por ella. El análisis de la gráfica obtenida con los datos de la tabla I es muy similar, pero debe considerarse el efecto de la variación del ciclo celular y sus fases dentro de la población celular. El efecto gráfico que produce esta consideración es una curva suavizada de una oscilación amortiguada. El problema biomatemático que se suscita es cómo obtener información de los parámetros celulares a partir de éste gráfico. El propio Henry Quastler, pionero en el análisis autorradiográfico del ciclo celular también fue el padre del concepto de utilizar las intersecciones de la curva con el 50% de las mitosis marcadas/mitosis totales como un estimador de las duraciones medias de las fases del ciclo. Este es el método que se utilizará en clase. Sin perjuicio de ello, debe saberse que en los casos en que el segundo pico no alcanza al 50% se debe recurrir a modelos matemáticos complejos que están fuera de la órbita de este curso.

Como verán en la parte práctica, para poder obtener una curva de la que se puedan estimar los tiempos de las etapas del ciclo celular se deberá, previamente, sincronizar la población celular. Hablamos de sincronizar una población asincrónica cuando logramos que todas las células se encuentren en la fase M en un determinado momento. Parte 3 Análisis de parámetros del ciclo celular mediante citometría de flujo Cuantificación de ADN

Para determinar rápidamente parámetros del ciclo de una población celular puede utilizarse citometría de flujo. Un método clásico consiste en incubar a las células (vivas o fijadas y previamente permeabilizadas) con ioduro de propidio (PI), un agente que se intercala en el ADN de forma estequiométrica y emite fluorescencia cuando es excitado con una determinada longitud de onda. El material teñido es entonces medido en el citómetro de flujo, y la señal fluorescente genera un pulso electrónico en los detectores con una altura (amplitud) que es proporcional a la emisión de fluorescencia total de la célula. La clave para esta interpretación es que la célula incorpora una cantidad de colorante proporcional a su contenido de ADN. Utilizando estándares adecuados, con contenidos diploides conocidos como eritrocitos de pollo, se puede determinar la ploidía de las células de interés

Determinación de parámetros cinéticos del ciclo celular (análisis multivariado) El análisis cuantitativo de ADN es ampliamente utilizado para estimar la distribución de las fases del ciclo celular. Sin embrago, este tipo de análisis no aporta información citodinámica como la duración del ciclo o el tiempo de tránsito entre las fases. Estos parámetros pueden determinarse utilizando autorradiografía y determinando la cantidad de mitosis marcadas, o mediante técnicas más modernas de marcaje de células que están sintetizando ADN. Fase S Uno de los abordajes más utilizados es la incorporación en el medio de cultivo de un nucleótido no radiactivo, la bromodesoxiuridina (BrdU), un análogo de timidina que puede ser identificado mediante el uso de anticuerpos anti-BrdU conjugados a una molécula fluorescente. La citometría de flujo permite la medición simultánea de la cantidad de BrdU incorporado y del contenido de ADN en cada célula, permitiendo realizar el seguimiento de un grupo de células a través del ciclo. Fase M La histona H3 es fosforilada durante la mitosis entre la profase y la anafase tanto mitótica como meiótica, y por tanto su fosforilación puede ser utilizada para determinar la cantidad de células que se encuentran en fase M. Para ello se utiliza un anticuerpo conjugado a un fluorocromo (en el ejemplo, Alexa-647) capaz de unirse sólo a la forma fosforilada de la histona H3. Combinando esta técnica con la tinción de ADN, es posible discriminar las células que se encuentran en fase M de la región G2M, y por consecuencia también aquellas que se encuentran en G2, como se muestra en las siguientes gráficas.

III. PROCEDIMIENTOS1. Mitosis en cebolla

Preparación de la cebolla Llenar un recipiente con agua y colocar un bulbo de cebolla sujeto con dos o tres

palillos de manera que la parte inferior quede inmersa en el agua. Al cabo de 3-4 días aparecerán numerosas raicillas en crecimiento de unos 3 ó 4 cm. de longitud.

Cortar con una tijeras unos 2-3mm del extremo de las raicillas y depositarlo en un vidrio de reloj en el que se han vertido 2-3ml de Orceína A.

Calentar suavemente el vidrio de reloj a la llama del mechero durante unos 8 minutos, evitando la ebullición,hasta la emisión de vapores

Con las pinzas tomar no de los ápices o extremos de las raicillas y colocarla sobre un portaobjetos, añadir una gota de Orceína B y dejar actuar durante un minuto.5

Colocar el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raíz. Con el mango de una aguja enmangada dar unosgolpecitos cobre el cubre sin romperlo de modo que la raíz quede extendida.

Sobre la preparación colocar unas tiras de papel filtro, 5 o 6. Poner el dedo pulgar sobre el papel filtro en lazona de cubre objetos y hacer una suave presión, evitando que el cubre resbale

Observar al microscopio

IV. CUESTIONARIO.1. Describa los observado en práctica

PRACTICA N°8DESARROLLO EMBRIONARIO

I. OBJETIVOS Introducción al estudio de algunas etapas del desarrollo embrionario temprano y análisis

comparado de tipos de ovocitos, patrones de segmentación y gastrulación en los distintos modelos.

Integración de conceptos de estructura y dinámica celular utilizando como modelo el desarrollo.

Introducción al análisis de problemas fundamentales de la biología del desarrollo.

II. FUNDAMENTO

1. SEGMENTACIÓN:

El desarrollo de un organismo multicelular, luego de la fecundación, ocurre mediante un proceso denominado clivaje o segmentación (serie de divisiones mitóticas que dividen al citoplasma del cigoto en numerosas células más pequeñas, las blastómeras). El patrón de segmentación embrionaria está determinado principalmente por 2 parámetros: 1) factores genéticos que establecen el ángulo y momento de formación del huso mitótico y 2) la cantidad y distribución del vitelo. En general, el vitelo inhibe la segmentación; el polo animal del embrión se encuentra relativamente libre de vitelo y su opuesto, el polo vegetal, es rico en éste. De acuerdo a la cantidad de vitelo que presentan, los ovocitos se clasifican en: oligolecitos (poca cantidad de vitelo, generalmente con distribución homogénea (isolecito)), mesolecitos (cantidad moderada de vitelo distribuido hacia el polo vegetal) y telolecitos (abundante cantidad de vitelo que ocupa prácticamente todo el volumen ovocitario). El patrón de segmentación en embriones provenientes de ovocitos isolecitos y mesolecitos es holoblástico o total y en embriones provenientes de ovocitos telolecitos es meroblástico o parcial. Hacia el final de esta primera etapa del desarrollo embrionario ocurre la formación de una cavidad dentro de la masa de blastómeras en división denominada blastocele. El embrión resultante se conoce como blástula. 2. Gastrulación Es un proceso de movimiento celular que involucra a todo el embrión y resulta en la organización de las 3 hojas embrionarias: ectodermo (capa celular externa), mesodermo (capa celular intermedia) y endodermo (capa celular interna). Aunque el patrón de gastrulación es variable dependiendo de la especie, usualmente involucra una combinación de los siguientes tipos de movimientos básicos: - invaginación: plegamiento de una capa de células hacia el interior del embrión. - involución: movimiento de una capa de células utilizando otra como sustrato hacia el interior del embrión. - ingresión: migración de células individuales hacia el interior del embrión. - delaminación: generación de una capa de células que se desprende a partir de otra capa celular. - epibolia: expansión de una capa celular sobre otras células o capas.

III. PROCEDIMIENTO.1. OBSERVACIÓN DEL DESARROLLO EMBRIONARIO DE ANFIBIOS

Preparar la muestra eliminando todo tipo de impurezas. Llevar a un portaobjetos y observar en el microscopio o con ayuda de la lupa

IV. CUESTIONARIO1.- ¿Cuáles son las 4 grandes etapas del desarrollo embrionario? 2.- ¿Cómo afecta el vitelo la segmentación del cigoto? 3.- ¿Qué es la medialuna gris y qué vinculación tiene con las etapas posteriores en el desarrollo de los batracios? 4.- Construya una oración que vincule los siguientes términos: gastrulación, blastoporo, células en botella, invaginación. 5.- ¿Cuál es el nombre de las células que ingresan al inicio de la gastrulación en erizo de mar? Estas células formarán un anillo que marca el sitio donde se inicia la formación del_________________________ por invaginación de la _______________ __________________. 6.- ¿Cómo se denomina la región del cigoto de batracios que se forma al ingresar el espermatozoide, opuesta a su entrada, que se produce debido a una rotación de aproximadamente 30º en el citoplasma cortical? Ésta región determina el sitio donde se formará el _________________ ___________________ del blastoporo.