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Tecnología del DNA recombinante,clonación y creación de genes

quiméricos

Preguntas esenciales

1. ¿Se pueden crear nuevos genes usando DNArecombinante?

2. ¿Se puede modificar la herencia de un organismousando DNA recombinante?

3. ¿Cuales son los métodos que usan los científicospara crear moléculas de DNA recombinantes?

• ¿Qué significa Clonar?• ¿Qué es una librería o genoteca de DNA?

• ¿Se puede amplificar DNA sin usar un organismovivo?

• ¿Es posible hacer cambios dirigidos en la herenciade un organismo?

Pero primero vamos a recordar un poco…

Un gen típico eucariota!

PROMOTOR

exón 1 exón 2 exón 3

intrón 1 intrón 2

GEN

5’

5’

3’

3’

+ (hebrasentido)

U (sólo RNA)

C T pirimidinas

||| ||G A purinas

PROMOTOR

intron 1 intron 2

GEN

5’3’ RNApol

DNA hace RNA hace PROTEINA

exón 1 exón 2 exón 35’ 3’

+ (hebrasentido)

PROMOTOR

exon 1 exon 2 exon 3

intron 1 intron 2

GEN

5’

5’

3’

3’

+ cadena

RNApol

5’

Pre-mRNA

3’

La complementaria de una cadena negativa se sintetiza paraproducir la copia de un gen: TRANSCRIPCIÓN

2

5’3’ RNApol

5’

Pre-mRNA

3’

5’

Splicing o ayuxtamiento

3’

mRNA

5’3’

mRNA

5’3’

mRNA

TRADUCCIÓN

MS

G

proteínaNH2

RNARibosomal

t RNA

OBJETIVOS

1. CLONAR

¿Qué significa clonar?Clon: una colección de moleculas o células, todos idénticos a una molécula o

célula original

• “Clonar un gen” es hacer copias del mismo, por ejemplo en una poblaciónbacteriana

• Gen puede ser una copia de un gen original o natural

• Gen puede ser una versión alterada del mismo

• Tecnología del DNA recombinante lo hace posible en el laboratorio

CLON = multiples copias de la misma cosa

Por tanto – si clonamos un gen, significa:

•Cortarlo (RESTRICCIÓN) del resto del genoma

•Unirlo covalentemente (LIGARLO) dentro de algo que sepropague (un VECTOR).

•Situar el vector dentro (TRANSFORMARLO) de unacélula (HUESPED) que va a propagar el vector por nosotros

exon 1 exon 2 exon 3

intron 1 intron 2

GEN

5’

3’

restricción

ligar

VECTOR

Por ejemplo plasmid

Vector recombinante

3

Vector recombinante

bacteria

Cromosoma delhuesped

TRANSFORMAR

PROPAGACIÓN DEL VECTOR

•Incremento delnúmero de copiasdel plásmido•Proliferación

celular

Recuerda – DNA procariota no tiene intrones!

Si queremos trabajar con un gen y su producto –necesitamos un versión “sin intrones” del gen:

5’3’

RNApol

5’Pre-mRNA

3’

5’

splicing

3’

mRNA

Esto es:equivalente alRNA

5’

3’

mRNA

Necesitamos hacer una versión en DNA del mRNA

Su nombre es cDNA

Cuando por ejemplo decimos que hemos clonado y expresadoel gen para (por ejemplo hormona de crecimiento humana)queremos decir que hemos clonado el cDNA de la hormona decrecimiento humana

Figure 9.1.1 Figure 9.1.2

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Objetivos

1. Clonación

2. Enzimas empleados en tecnología del DNArecombinante

1. DNA polimerasas

Reacción general:

(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi

Enzimas usadas en tecnología del DNA recombinante

P

P

N

N

N

OH

5’

N

P

P

P

P

P

P

P

N

N

N

OH

P

N5’

+

DNApol

OH

Todas las DNA polimerasas:

Necesitan un cebador con un 3’OH libre

El DNA sintetizado en la nueva hebra SIEMPREva en dirección 5’ 3’

5’ OH3’5’3’

Equivalente a nuestra hebra –para nuestro gen ejemplo

P.e. DNA polimerasa I de E. coli.

DNA polimerasa dependiente de DNA

P.e. DNA polimerasa I de E. coli.

DNA polimerasa dependiente de DNA

5

P.e. DNA polimerasa I de E. coli.

DNA polimerasa dependiente de DNA

Pero también tiene otras actividades asociadas

p.e. 5’ → 3’ exonucleasa (eliminar los cebadores RNAprimers en la replicación del DNA)

P.e. DNA polimerasa I de E. coli.

DNA polimerasa dependiente de DNA

Pero también tiene otras actividades asociadas

p.e. 5’ → 3’ exonucleasa (eliminar los cebadores RNAprimers en la replicación del DNA)

P.e. DNA polimerasa I de E. coli.

DNA polimerasa dependiente de DNA

Pero también tiene otras actividades asociadas

p.e. 5’ → 3’ exonucleasa (eliminar los cebadores RNAprimers en la replicación del DNA)

P.e. DNA polimerasa I de E. coli.

DNA polimerasa dependiente de DNA

Pero también tiene otras actividades asociadas

p.e. 3’ → 5’ exonucleasa (corrige errores cometidos por lapolimerasa)

2. RNA polimerasas

En el lab - del Bacteriofago - RNA polimerasa dependiente de DNA

Alta especificidad para promotores

No requiere un cebador

PROMOTOR GEN

5’

5’

3’

3’

reacción general:

(NMP)n + NTP (NMP)n+1 + PPi

5’3’ RNApol

5’

(Pre)-mRNA

3’

RNA se sintetiza en dirección 5’ 3’

promotor

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3. Transcriptasas reversas

• DNA polimerasa dependiente de RNA – se encuentran en virus(AMW – avian myeloblastosis virus / MMLV – moloney murineleukemia virus.

• Algunas transcriptasas reversas también tienen 3’ y/o 5’ actividadexoRNase (degrada RNA después de la transcripción reversa)

• Requieren un cebador

RNA5’3’

3. Transcriptasas reversas

• DNA polimerasa dependiente de RNA – se encuentran en virus(AMW – avian myeloblastosis virus / MMLV – moloney murineleukemia virus.

• Algunas transcriptasas reversas también tienen 3’ y/o 5’ actividadexoRNase (degrada RNA después de la transcripción reversa)

• Requieren un cebador

RNA5’3’

cebador5’

3. Transcriptasas reversas

• DNA polimerasa dependiente de RNA – se encuentran en virus(AMW – avian myeloblastosis virus / MMLV – moloney murineleukemia virus.

• Algunas transcriptasas reversas también tienen 3’ y/o 5’ actividadexoRNase (degrada RNA después de la transcripción reversa)

• Requieren un cebador

RNA5’3’

cebador5’

DNA (de nuevo) se sintetiza en dirección 5’ 3’

4. Endonucleasas de restricción

Sólo se usan tipo 2 en DNA recombinante

Reconoce secuencias palíndromes

Cortan dentro – endo - DNA

4. Endonucleasas de restricción

Sólo se usan tipo 2 en DNA recombinante

Reconoce secuencias palíndromes

Cortan dentro – endo - DNA

5. Ligasa

Corrige a la endonucleasa de restricción y requiere ATP

Recuerda – se requieren extremos compatibles

Funciona mejor en extremos cohesivos que en romos

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DNA Ligasa

G P-AATTC GAATTC

| + | ||||||CTTAA-P G CTTAAG

ATP /Mg2+

Ligación de extremos romosusando T4 DNA ligasa, quecataliza la unión dependientede ATP de moléculas deDNA

A

P

P

P

OH OH

_

ATP

N

HO

P

5’

DNA o RNA

N

P

5’P

•Fosfatasa (elimina grupos P) p.e. fosfatasa de tracto intestinalP

N

P

5’HO

6. Quinasas / Fosfatasas

DNA

or RNA

Como se hace un cDNA?

•Transcriptasa reversa: encontrada en virus

requiere un cebador

mRNA tiene una cola “poliA”

5’3’

mRNA

AAAAAAAAAA

5’3’

mRNA

AAAAAAAAAA

Oligo dT I.e (TTTTTTTTT)

5’3’AAAAAAAAAA

TTTTTTT 5’

5’3’AAAAAAAAAA

TTTTTTT

Transcriptasa reversa + dNTPs

5’

5’3’AAAAAAAAAA

TTTTTTT5’

3’

8

5’3’AAAAAAAAAA

TTTTTTT5’

3’

1era cadena del cDNA

5’

3’TTTTTTT 5’

3’

1ra cadena del cDNA

AAAAAA

cebador

2nda cadena de cDNA

DNA polimerasa + dNTPs

ligar

VECTOR

Por ejemplo plasmido

5’

3’TTTTTTT

3’AAAAAA

DNA de Doble Cadena,con una cadenaequivalente al mRNA

Endonucleasas de restricción (EN DETALLE)

•Se encuentran en bacterias.

•P.e. BamHI Bacillus amyloliquefaciens cepa H

•En naturaleza – funciona para digerir DNA extraño en la bacteria

•Reconoce (secuencias palíndromes) secuencias inversas repetidas(tiene la misma secuencia 5’-3’ en cada cadena)

•“restringe” la existencia en la bacteria

•Para evitar daño del DNA endógeno, los sitios de restricción estánmetilados

Cromosola propio

Me

Me

Me

= secuencia de reconocimiento de laendonucleasa de restricción

Me

Me

Me

Por ejemplo:bacteriófago_

Tipos de endonucleasas

Tipo I: Dependiente de ATP

Endonucleasa y metilasa

Digiere DNA en sitios al azar

Hasta 1 kb del sitio de reconocimiento

Tipo II: Independiente de ATP

Endonucleasa

Digiere DNA en el sitio de reconocimiento

Type III: dependiente de ATP

Endonucleasa y metilasa

Digiere DNA ~ 25nts de secuencia de reconocimiento

Endonucleasas de restricción hidroliza entre el 3’OH y 5’Ppara dejar un grupo P en el final 5’:

P

P

P

P

P

P

P

P

N

A

G

A

T

T

C

N

G

A

A

T

T

C

Cadena +

Cadena -

EcoR1+H2O

NNNGAATTCNNN

NNNCTTAAGNNN

5’NNNG-OH P-AATTCNNN

NNNCTTAA-P OH-GNNN 5’

EcoRI + H2O

5’

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Hay varios cientos de endonucleasas de restriccióndisponibles que producen varios “finales”:

5’ protuberantes

P.e. EcoRI

3’ protuberantes

P.e. HhaI

Romos

P.e. SmaI

GAATTC G P-AATTC|||||| | |CTTAAG CTTAA-P G

GCGC GCG P-C|||| | |CGCG C-P GCG

CCCGGG CCC P-GGG|||||| ||| |||GGGCCC GGG-P CCC

romoromo

reconoce una secuencia de DNAde doble cadena específica y cortadentrodentro de esa secuencia

Se llama el sitio sitio de de reconocimientoreconocimientonormalmentenormalmente 4-8 4-8 nucle nucleóótidostidos

Corta fragmentos largos de DNA enpiezas

Llamada digestidigestióón den de restricci restriccióónn

Corta de manera reproduciblereproducible Se encuentran en bacteriabacteria

Producen dos tipos de finales cohesivoscohesivos o o romos romos

Enzimas de restricción

Los cortesLos cortes producidos por producidos por las las enzimas enzimas dederestriccirestriccióón tienen simetrn tienen simetrííaa

• hace cortes que se superponenporque reconocen normalmentesecuencias simétricas

• Llamadas PalPalííndromesndromes

Palíndrome: la lectura de basesen una cadena en 5’ → 3’ is lamisma que la secuencia 5’ → 3’de la secuencia complementaria

Inverted Palindrome:

EnzimasEnzimas de de restricci restriccióónn

Extremos cohesivosExtremos cohesivos::• cada fragmento de DNA (independientemente de la fuente del DNA) generado alcortar un DNA con el mismo E.R. tiene la misma secuencia de bases en los dos finalesdigeridos (leídos en dirección 5’ a 3’).

Los dos fragmentos de DNA distintos se pueden unir por complementareidadde bases para formar una molécula de DNA recombinanteMolMolééculacula de DNA de DNA recombinante recombinante: creación de una nueva combinación deDNA no encontrada en la naturaleza

ElEl n núúmeromero de pares de bases de pares de basesen elen el sitio sitio del del enzima enzima de derestriccirestriccióón determinan determina la ladistanciadistancia media media entre sitios entre sitiosdede restricci restriccióónn

Es decir la distancia mediaentre sitios producidos porE.R. = 4n donde n =número de bases en elsitio

GTACGTAC

kb or kilobase = 1000 pares de bases

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Se pueden usar algunos “trucos” para crear sitios de restricciónDe manera práctica – digestión con endonucleasas derestricción del DNA del fago lambda

Lambda – un virus que infecta bacteria

Genoma linear de DNA de doble cadena de ~ 49Kb

Sitio RE

lamda genome

plasmid

RE

lamda genome

plasmid

RE

lambda lambda plasmid plasmid

+RE +RE

Electroforesis en gel de agarosa

Tamaño

del DNA

Con el fin de introducir DNA en un vector necesitamosextremos compatibles

VECTOR

P.e. plasmido

EcoRI

EcoRI EcoRI

EcoRI EcoRI

EcoRI

EcoRI

EcoRI EcoRI ligar

Problema: Autoligación del vector >> recombinantes

Usar 2 (no-compatibles) enzimas de restricción:

VECTOR

P.e. plasmido

EcoRI

EcoRI BamHI

EcoRI BamHI

EcoRI + BamHI

EcoRI + BamHI

EcoRI BamHI ligar

BamHI

BamHI

EcoRI