1

Cromatografía

INTRODUCCIÓN

• La cromatografía es una técnica que se emplea para separar entre si los componentes de una sustancia.

• Esta técnica fue creada por el botánico ruso Michael Tswett en 1906, el cual llamó a su método cromatografía, palabra griega que significa escritura a color, porque lo utilizo para separar compuestos coloreados.

• Tswett llevó a cabo una extracción de una mezcla de pigmentos de hojas verdes utilizando éter de petróleo, un disolvente no polar, y descubrió que era capaz de separar los pigmentos al hacer pasar el extracto a través de una columna, un tubo de vidrio rellenado con carbonato de calcio (tiza). identificando distintas materias por su color en la columna, demostrando que la clorofila es solo uno de los muchos pigmentos que se encuentran en las hojas de las plantas.

3

A principios del siglo XX, el botánico ruso este t separó pigmentos vegetales pasando soluciones de estos pigmentos por una columna de vidrio empaquetada con CaCO3. Las especies separadas aparecían como bandas de colores, lo que dio origen al nombre del método

Origen

fundamentaciones Es un conjunto de técnicas basadas

en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

La cromatografía cumple dos funciones básicas:

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente.

Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica).

5

º

º

º

Fase estacionaria

Fase móvil

1

2

Cromatografía: técnica separativa donde los componentes de una muestra se distribuyen entre dos fases (FM y FE), como consecuencia de su diferente afinidad hacia dichas fases. La separación se basa en las distintas velocidades de migración de los analitos, determinadas por el tiempo que permanecen en cada fase

Definición

Fase móvil (líquida o gaseosa): contiene los componentes a separar y fluye a través de la fase estacionaria

Fase estacionaria (líquida o sólida): a través de la cual fluye la fase móvil y donde quedan momentáneamente retenidos los componentes de la muestra

Un sistema cromatográfico consta de dos fases

Fase estacionaria: Material que permanece dentro de la columna cromatográficadurante

la cromatografía y que retiene algún componente de la muestra, posee unagran área superficial y puede ser un sólido o un líquido dispuesto sobre un sólidoque actúa como soporte.

Fase móvil: Es un fluido que puede ser líquido, gas o fluido supercrítico que seusa

como portador de la mezcla y que se hace pasar a través de la columnaRevelado:

Proceso de separar un soluto de la muestra por medio de cromatografía.

Soporte: El material sólido inerte que en la C. de reparto sirve para sostener

lafase estacionaria líquida en su sitio.

CLASIFICACIÓN

9

CLASIFICACIÓN

10

11

Otras consideraciones de clasificacón

• Según el tipo de fase móvil y de fase estacionaria

• Según el tipo de interacción entre la fase estacionaria y los solutos

• Según el tipo de flujo empleado• Según el tipo de modificaciones en la fase móvil• Según el método de detección• Según la finalidad del experimento

ClasificaciónDe acuerdo a la disposición física de la FE

Planar

papel

capa delgada

Columna

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

• En este caso se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria manteniendo un pequeño espesor constante a lo largo de la placa. El eluyente ascenderá, por capilaridad, por la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo “manchas” de los componentes.

• Se usan láminas de: vidrio como soporte del adsorbente, plástico (ej: acetato) ó metálicos (ej: aluminio). Los tamaños de la placa para CCf convencional son: 20 x 20; 10 x 20 y 5 x 2.

• Hay placas que contienen un indicador de fluorescencia, para facilitar la identificación de las muestras. Si no se usa indicador y los componentes no son coloridos se requerirán técnicas de revelado.

PRINCIPIO• La separación de mezclas de moléculas mediante la cromatografía de capa

fina se basa en el principiodel reparto entre dos fases. • En general, una cromatografía se realiza permitiendo que la mezcla de

moléculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que sedenomina fase estacionaria.

• Un segundo medio (la fase móvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para "lavar" (eluír) a las moléculas en la muestra.

• Debido a que las distintas moléculas en la muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase móvil "lavará" a los distintos componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la fase móvil serán eluídos más rápido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria.

14

PREPARACION DE LA PLACA• En la cromatografía de capa fina, la fase estacionaria es una

delgada capa de un soporte sólidogranulado, tal como gel de sílica, alumina, ácido silícico u otros, que se depositan sobre una placa devidrio, aluminio u otro soporte inerte.

• Para que adquiera firmeza y no se desmorone, la capa de faseestacionaria se aglutina con una pequeña cantidad de sulfato de calcio u otro agente cementante.

• Las muestras se aplican añadiendo pequeñas gotas de solución en un pequeño círculo cerca del extremo inferior de la placa.

• La gota se deja secar y si se desea poner más muestra se pueden aplicar más gotas, cuidando de que la mancha no se haga demasiado grande.

15

PREPARACION DE LA PLACA• La placa seca se sumerge en un pequeño volumen de fase móvil

(mezcla de solventes). La polaridad dela mezcla de solventes se elige de acuerdo a la mezcla de compuestos que se desea separar.

• En cromatografía de capa fina la fase estacionaria está hidratada, por lo que se le considera como la fase polar. Como sólo la base de la placa queda sumergida, el solvente comienza a mojar la fase estacionaria y asciende por capilaridad.

• Al recorrer la placa la fase móvil va arrastrando a las substancias apolares y aquellas más polares son retenidas por la fase estacionario dando lugar a la separación. La placa desarrollada se deja secar y se revela con un reactivo que tiña a las substancias de interés.

• La movilidad relativa o Rf es la relación entre la distancia recorrida por la mancha de un compuesto, dividida por la distancia recorrida por el frente de solvente al momento de sacar la placa del solvente.

16

• “CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA”• OBJETIVOS:• •• Conocer la cromatografía en columna como técnica de

separación de mezclas de sustancias,sus características y los factores que en ella intervienen.

• •• Utilizar la cromatografía en columna para la purificación de una

sustancia contaminada con uncolorante.• •• Controlar con cromatografía en capa fina el proceso de

separación de mezclas por cromatografíaen columna.

17

CONCEPTO DE R.F.

• Rf es el registro y se define como:• Rf = distancia que recorre la muestra desde el

punto de aplicación / distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente

• El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra (tipo de adsorbente, eluyente, así como las condiciones de la placa, temperatura, vapor de saturación, etc.). Tiene una reproducibilidad de ± 20%, por lo que es mejor correr duplicados de la misma placa.

Eluyentes más comunes para cromatografía en capa fina.

• éter de petróleo• -tolueno• -dietil-éter, t-butil-éter• -diclorometano• -acetato de etilo• -n-pentano, n-hexano• -ciclohexano• -tetracloruro de carbono• -éter dietílico• -cloroformo• -acetona• -iso-propanol• -etanol• -metanol• -ácido acético

ADSORBENTES MÁS COMUNES PARA CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

a) Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)b) Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)d) PoliamidasPara la selección del adsorbentes deber tomar las

siguientes consideraciones:a) Polaridadb) Tamaño de partículaa. Diámetrob. Área Superficialc) Homogeneidad

FACTORES QUE INFLUYEN EN UNA SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE

CAPA FINA.

a) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben más en la fase estacionaria.

b) La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de aire.

c) Limpieza de las placas. Muchas placas están contaminadas con grasa o agentes plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequeña escala, éstas deben limpiarse corriendo primero una mezcla de cloroformo y metanol y después dejar secar completamente antes de aplicar la muestra.

d) Pureza de los disolventes.

•

CRTOMATOGARTFIA EN CAPA FINA

.

25

26

RECORRIDO DEL ANALITO

27

SEPARACION DE LOS COMPUESTOS

28

COMPUESTOS SEPARADOS

29

30

31

Cálculo del factor de retención Rf

• Cuando son visibles, se puede determinar para cada una de las manchas el valor de Rf (factor de retención), o la distancia que cada compuesto se desplaza en la placa.

• Cada compuesto tiene un Rf característico que depende del disolvente empleado y del tipo de placa de CCF utilizada, pero es independiente del recorrido del disolvente.

• De esta manera se puede ayudar a identificar un compuesto en una mezcla al comparar su Rf con el de un compuesto conocido (preferiblemente cuando se hacen eluir en la misma placa de CCF).

32

CALCULO DEL RFf

• Rf = distancia recorrida por el compuesto (X) / distancia recorrida por el eluyente (Y)

33

INFORMACION

a) La cromatografía en capa fina es una técnica para determinar el número de componentes de una mezcla y como una prueba preliminar para realizar una cromatografía en columna, entre otros.

b) El proceso de cromatografía en columna se controla por cromatografía en capa fina, de tal manera que se puede separar cada componente de la mezcla.

c) La cromatografía en columna se usa para separar grandes cantidades de material: >100 mg. El proceso de cromatografía consta de una fase móvil (eluyente) y una fase estacionaria (adsorbente), los cuales dependen de las sustancias.

Cromatografía en Columna.

• Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido de Magnesio.

• La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrio.

• La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria.

• La solución que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna.

35

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

• La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria.

• Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la separación, y por tanto la resolución, aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusiónales, disminuyendo por tanto la resolución.

36

• Una columna de cromatografía es un tubo de vidrio relleno con una sustancia sólida de propiedades

• adsorbentes• constituida por pequeñas partículas: gel de sílice y alúmina son las

más usadas. Este rellenoes lo que se conoce en cromatografía como la

• fase estacionaria• . A través de la columna se hará pasar una corriente de un

disolvente o mezcla de disolventes denominada • eluyente • y/o• fase móvil 

37

• La mezcla de compuestos a separar se disuelve en una pequeña cantidad de disolvente y se coloca sobreel adsorbente, en la parte superior de la columna, quedando adsorbida por el mismo. A continuación sepasa un flujo de eluyente a través de la columna

38

• Los compuestos constituyentes de la mezcla sonarrastrados por el eluyente a su paso, haciéndoles avanzar a lo largo de la columna. Sin embargo,

• notodos los compuestos avanzan a la misma velocidad • , y esta es precisamente la clave de la

cromatografía.Algunos compuestos se ven más fuertemente retenidos por el adsorbente (

• fase estacionaria• ) y por lotanto avanzarán más despacio. Por el contrario,

otros apenas son retenidos y avanzarán a mayor velocidad.

39

40

42

43

INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA DefiniciónPrincipios básicos

Definición“Técnica que permite

separar los componentes de una muestra debido a

su diferente afinidad entre dos fases

inmiscibles entre sí, una estacionaria (liquida o

sólida) y otra móvil (gas o líquida)”

to

t1

t2

A B

A B

Flujo de fase móvil

La muestra se introduce en la fase móvil y es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos) entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido de forma adecuada, los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase móvil. Los componentes abandonan la columna en orden creciente de interacción con la fase estacionaria.La amplia gama de selección de materiales para la fase móvil y la estacionaria permite separar moléculas que difieren muy poco en sus propiedades físicas y químicas.

Comportamiento cromatográfico de los compuestos

• El comportamiento cromatográfico de un componente de una muestra puede describirse de diversas formas:– VR Volumen de retención Volúmen de fase móvil necesario para transportar la banda de

un componente desde el punto de inyección, a través de la columna, hasta el detector (en el máximo de pico del componente)

– tR tiempo de retención Tiempo necesario para que el componente, una vez inyectado

pase a través de la columna y alcance el detector (en el máximo de pico del componente)

– k´ razón de reparto Es una medida del tiempo que el componente está en la fase

estacionaria en relación con el tiempo que está en la fase móvil

Cromatografía de Gases“Es la técnica a elegir para la separación de compuestos orgánicos e inorgánicos térmicamente estables y volátiles”

• Un cromatógrafo de gases consiste en el acoplamiento de varios módulos básicos ensamblados para:– Proporcionar un flujo constante de gas portador– Permitir la introducción de vapores de la muestra en la

corriente de gas que fluye– Contener la longitud apropiada de fase estacionaria– Mantener la columna a la temperatura apropiada (o la

secuencia del programa de temperatura)– Detectar los componentes de la muestra a medida que

eluyen de la columna– Proveer una señal legible proporcional en magnitud a la

cantidad de cada coomponente

Cromatografía de Gases

49

Sistema de inyecciónEl modo estándar es la inyección directa, la muestra es inyectada con una jeringa a través de un septum de goma a un alineador de vidrio donde es vaporizada y transportada por el gas al interior de la columna.El bloque de inyección, se mantiene a una temperatura tal que permita convertir prácticamente de forma instantánea la muestra líquida en un tapón de vapor.Existen jeringas especiales para muestras gaseosas. También se puede emplear un lazo o bucle para incoporar las muestras gaseosas al flujo de gas portador

Cromatograma

52

Columnas cromatográficas

Columnas capilares Columnas Empacadas

Columnas cromatográficas empacadas

Se construyen con tubo de acero inoxidable, niquel o vidrio.

Los diámetros interiores van de 1,6 a 9 mm.La longitud suele ser inferior a los 3 m.Se rellenan de un material adsorbente adecuado a las sustancias que se quiere separar.

Columnas cromatográficas capilares

Se construyen con sílice fundida. Los diámetros interiores suelen ser de 200-250 m.La longitud suele ser superior a los 20 m.Hay dos tipos:

Empacadas con partículas sólidas ocupando el total del diámetro de la columna (micro-empacadas)Tubulares abiertas, con trayectoria para el flujo abierta y sin restricción por el centro de la columna

Horno

• Las columnas cromatográficas se enrollan, se sujetan en un soporte y se introducen en el interior de un horno

• El horno debe poderse calentar y enfriar rápidamente

• La temperatura se debe poder programar para poder trabajar en régimen de gradiente

• Muchas aplicaciones y métodos cromatográficos requieren comenzar a temperaturas por debajo de la ambiental

Características ideales de un detector para Cromatografía de Gases:   Sensibilidad alta y estable; típicamente 10-8 g soluto/s   Bajo nivel de ruido   Respuesta lineal en un amplio rango dinámico   Tiempo de respuesta corto   Buena respuesta para toda clase de compuestos orgánicos   Insensibilidad a las variaciones del flujo y la temperatura   Estabilidad y robustez   Simplicidad en su operación   Identificación de compuestos positiva   Técnica no destructiva   Pequeño volumen en prevención del mezclado de componentes

Sistemas de detección

T1

T2> T1

Horno

CROMATOGRAMA es el resultado

gráfico de la cromatografía. En el caso de separación óptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada

Cromatografía líquida de alta resolución HPLC

los componentes de una mezcla son llevados a través de una fase estacionaria fija dentro de una columna mediante el flujo de una fase móvil líquida. Las separaciones están basadas en las diferencias de la velocidad de migración entre los componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la naturaleza de los analitos y su interacción con las fases.