Presentacion Listeria Monocytogenes 2013 Del 6 de Agosto
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Lic. En Biol. Gregorio Poot Mex
Replica curso de determinación Salmonella sp. y Listeria monocytogenes en
alimentos.
Actualizaciones en determinación de Salmonella sp. y Listeria monocytogenes en alimentos
• En las siguientes diapositivas se expondrá las actualizaciones en la determinación de Salmonella sp y Listeria monocytogenes para su aislamiento en muestras de alimentos.
• Se trata de las actualizaciones que propone el PROY-NOM-210-SSA1-2013 y sobre las cuales fue efectuado el curso taller L. monocytogenes y Salmonella sp.
Características del género Salmonella
• Bacilo Gram negativo• Familia Enterobacteriaceae• Generalmente móviles• Aerobios o anaerobios facultativos• Antígenos somáticos “O” (lipopolisacárido)• Antígenos flagelares “H” (proteínas)
Determinación de Salmonella sp.
Pre- enriquecimiento Se utiliza de manera general el Caldo Lactosado. Incubar por 24 +/- 2 h a 35°C
Enriquecimiento selectivoSe utilizan Caldo Selenito Cistina y Caldo Tetrationato. Incubar por 24 +/- 2 h a 35° C. Adicionar 0.2 ml de Yodo Yoduro y 0.1ml de Verde Brillante. Se menciona el uso del Caldo Rappaport Vassiliadis
Selección en medios sólidosSe menciona que se pueden utilizar tres agares de los siguientes: Agar Verde Brillante, Agar Sulfito de Bismuto y Agar XLD, Agar Hektoen, Agar SS. Incubar por 24 +/- 2h a 35 +/- 1°CSe menciona que se prueben dos o más colonias típicas de cada placa
Identificación bioquímicaMenciona pruebas bioquímicas adicionales para la identificación cuando no se identifica directamente con la serología.
Confirmación serológica
NO
M -114 S
SA
1-1994
Prueba de ureasa se puede incluir en las pruebas presuntivas
Pre- enriquecimientoSe utiliza de manera general el Agua Peptonada Amortiguada. Incubar por 18 +/- 2 h a 37°C
Enriquecimiento selectivoSe descarta el uso del Caldo Selenito Cistina.Se utiliza el Calo Müller- Kauffmann Tetrationato novobiocina. 0.2 ml de solución Yodo Yoduro Incubar por 24 +/- 3 h a 37 +/- 1°C +/- y se utiliza el Caldo Rappaport Vassiliadis. Incubar por 24 +/- 3 h a 41.5 +/- 1°C.
Selección en medios sólidosSe indica el uso de Agar XLD y se menciona que se utilicen dos agares más, Agar Sulfito de Bismuto y Agar Hektoen. Incubar por 24 +/- 3 h a 37 +/- 1°CSe menciona que se prueben dos o más colonias típicas de cada placa y si no hay, dos o más colonias atípicas. Sembrar en agar nutritivo ; incubar 24 hrs a 35 °c
Identificación bioquímica y serología.Prueba de UreasaPrueba de Lisina descarboxilasaDetección de Beta-GalactosidasaPrueba de IndolPrueba de Voges ProskaweImplica un día más de análisis
PR
OY
-NO
M -210 S
SA
1-2013
COMPARACIÓN DE LA NOM-114-SSA1-1994 y El Proyecto de la NOM-210-SSA1-2013
CONCLUSIÓN
• NOM-114• Se utiliza de manera general el Caldo
Lactosado. Incubar por 24 +/- 2 h a 35°C
• Tiempo total: 4 días• Permite el uso de otros medios solidos
para aislamiento.• Tsi y Lia
• Proy. NOM-210• Tiempo total: 6 días• Se utiliza de manera general el Agua
Peptonada Amortiguada. Incubar por 18 +/- 2 h a 37°C
• Incluye el uso de novobiocina permite mejor selectividad en el enriquecimiento. MKTTn
• Pruebas bioquimicas adicionales• Se mantienen XLD, SB y Hecktoen.
Listeria monocytogenes
Generalidades
Gram (+)
Bacilo 1-2 x 0.5-0.8 µm
No esporulado
0 – 45 °C [37 °C]
pH 5.0 – 9.6 [pH 7.0]
Tolera 10 % NaCl
C a
r a c
t e
r í s
t i c
a s
Patógeno intracelular facultativoβ-hemólisis discreta | CAMP (+)
hidroliza la esculina
oxidasa(-) catalasa (+)
Voges-Proskauer y Rojo de Metilo (+)
Flagelos perítricos / 25 °C
(Mandell et al., 2002).
Ciclo infectivo L. monocytogenes
La bacteria es inocua en el medio ambiente y es la modificación del ambiente al ser sometida a presión selectiva la que permitirá la expresión de los factores de virulencia.
1.- Entrada a las células del huésped.
2.- Escape del fagosoma y desarrollo
intracelular.
3.-Desplazamiento intracitoplásmico.
4.- Diseminación célula a célula.
Especies de Listeria
L. monocytogenes
L. ivanovii
L. seeligeri
L. innocua, L. welshimeri, L. grayi, L.
murrayi, L.rocourtiae. L. marthii
La identificación de
Listeria monocytogenes se
apoya en las
características fisiológicas,
bioquímicas y antigénicas:
L.monocytogenes se
divide en 14 serotipos,
identificados por la fórmula
somática (O) y flagelar (H).
Determinación Listeria monocytogenes NOM-143-SSA1-1995
Tomar 25 gr o ml en 225 caldo EB homogeneizar, incubar por 48 hrs a
30°c
Resembrar en OXA a 35°c por 24 a 48 hrs .
Colonias negras con halo negro
Resembrar en LMP a 30 °c de 24 a 48 hrs.
Con iluminación de Henry colonias de color blanco o
azul iridiscentes.
Seleccionar 5 o mas colonias típicas y pasar a placas de ASTEL
35°c por 24 hrs
a 24 y 48 ha 24 y 48 h
Prueba de movilidad en
fresco.
Solucion salina 0.85%
Tincion gram. Gram +
Prueba de catalasa.Solución de peróxido al 3%
Prueba de hemolisis.Agar sangre de cordero al 5%.
48 hrs a 35°c
Prueba de reducción de nitrato.Caldo nitratos incubar a 35°c x 5 días.
Leer 0.2ml de reactivo A y 0.2ml reactivo B rojo indica nitritos
Agregar zinc en polvo rojo después de 1h indica nitratos.
Prueba de movilidad en agar.
Usando SIM o MTM forma de paraguas.
7 dias de 20 a 25°c
Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson.SINERGIA DE HEMOLISINASEn agar sangre de carnero
Rhodoccocyus equi ATCC 6339Staphylococcus aureus ATCC 25923
Incubar a 35°c por 24 a 48 hrs
Serologia.
Informe. Reportar presencia/ausencia en 25 gr
o ml.
Prueba de utilización de carbohidratos.En caldo purpura de bromocresol al 5% con:
Dextrosa, Esculina, Maltosa, Ramnosa, Manitol y Xilosa.
A 35°c por 7 dias
Polivalente listeria monocytogenes
Determinación Listeria monocytogenes PROY- NOM-210-SSA1-2013
25 g r o ml de la muestra en 225 caldo Fraser medio a 30°c±1°c por
24±2 hNota: una coloración oscura puede
aparecer.
Inocular por estría cruzada 2 placas Oxford a 30°c±1°c a de 24 a 48 hrColonias a 24 h pequeñas
de 1mm grisáceas rodeadas de un halo
oscuro a las 48 horas de 2 mm oscuras con posible
brillo verdoso halos negros y centros hundidos
Inocular PALCAM 2 placas por estría cruzada incubar a 37°c±1°c por 24 a 48 hrs
Colonias a 24 hrs muy pequeñas grisáceas o
verde olivo de 1.5 a 2mm a veces con centros negro
pero siempre con halos oscuros a las 48 horas de color verde con el centro hundido y halos negrosTransferir 0.1ml del enriquecimiento
primario a caldo Fraser incubar a48h±2 h a 37°c±1°c
Presuntivo: Observación de la hidrólisis de la esculina.
Seleccionar 5 o mas colonias sospechosas y pasar a placas de TSYEA por estría cruzada incubar a 37°c±2°C
por 18 a 24 hrs no mas de 72 hrsSe puede usar óptica de Henry como parte informativa colonias azul-gris o
azul.Se recomienda TSYEA delgado 15ml por
placa
Prueba de movilidad en fresco.
Tomar una colonia aislada de TSYEA e inocular CSTYE
incubar a 25°c±1°c por 8 a 24 hrs o hasta turbiedad examinar
en microscopio.
Tincion gram. Gram +
Prueba de catalasa.Solución de peróxido al 3%
Prueba de movilidad en agar.
forma de paraguas.Incubar 25°c±1°c por 48
h
Pruebas complementarias.
Tinción gram a 100 x
Prueba catalasa
Forma típica de paraguas en Agar Movilidad
Prueba de hemolisis.Agar sangre de cordero al 5%
Dibujar una cuadricula de 20 a 25 cuadros inocular por picadura; utilizar cepas de referencia
L.monocytogenes y L.innocua.L. monocytogenes produce una zona discreta de3 hemolisis alrededor de la picadura; L. innocua no
muestra una zona de hemolisis y L.ivanovii muestra una zona ancha, clara y delimitada por β-
hemolisis.
Prueba de utilización de carbohidratos.Ramnosa y xilosa
En caldo carbohidratos inocular usando colonias de TSYEA. Incubar a 35°c±2°c por 5 días.Pueden usarse sistemas de bioquímicas
miniaturizadas o técnicas de biología molecular.
Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson.SINERGIA DE HEMOLISINASEn agar sangre de carnero
Rhodoccocyus equi ATCC 6339Staphylococcus aureus ATCC 25923Incubar a 35°c±2°c por 12 a 18 hrs
Para fines de vigilancia sanitaria , los aislamientos que seran considerados como L. monocytogenes
deben ser enviados al laboratorio de referencia de la COFEPRIS para realizar tipificacion.
Polivalente listeria monocytogenes
Sistema API ®LISTERIA
PRUEBA CAMP
PRUEBAS PARA CONFIRMACION DE LISTERIA MONOCYTOGENES