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Tesis de Posgrado

Preservación por métodosPreservación por métodoscombinados, actividad del agua,combinados, actividad del agua,

pH, aditivos, tratamiento térmico,pH, aditivos, tratamiento térmico,de suero de quesería concentradode suero de quesería concentrado

parcialmente hidrolizadoparcialmente hidrolizado

Leiras, María Cecilia

1992

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Leiras, María Cecilia. (1992). Preservación por métodos combinados, actividad del agua, pH,aditivos, tratamiento térmico, de suero de quesería concentrado parcialmente hidrolizado.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2544_Leiras.pdf

Cita tipo Chicago:Leiras, María Cecilia. "Preservación por métodos combinados, actividad del agua, pH, aditivos,tratamiento térmico, de suero de quesería concentrado parcialmente hidrolizado". Tesis deDoctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1992.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2544_Leiras.pdf

UNIVERSIDAD DE BUENOS AI RES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

DEPARTAMENTO DE INDUSTRIAS

PRESERVACION POR METODOS COMBINADOS C ACTIVIDAD DE AGUA. pH.

ADI TI VOS. TRATAMIENTO TERMICO_ ) DE SUERO DE QUESERIA

CONCENTRADO PARCI ALMENTE HI DROLI ZADO.

MARIA CECI LI A LEI RAS

Tesis presentada para optar a1L1tul o de Doctor en C1enci as Quim1cas.

Ori entaci ón: Tecnol ogi a de A11mentos

Directora de Tesis: Dra. Stella Maris Alzamora .254]?

-1992- 7'2'

AGRADECIMIENTOS

A la Dra- Stella Maris Alzamoraquien dirigió este trabajo, porsu dedicación y por toda la ayuda brindada.

Al Dr. Jorge Chirife por su valiosa colaboración yasesoramiento prestados en la realización de este trabajo.

A1 Departamento de Industrias de la Facultad de CienciasExactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires porfacilitar el uso de sus instalaciones.

Al Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Técnicas,el cual a través del otorgamiento de la beca hizo posible larealización de este trabajo.

A las Doctoras Pilar Buera, MiryamCassanello, Beatriz Elizaldey Marcela Tolaba y al Ing. Agr. Lucas González que, en formadesinteresada, measesoraron para el tratamiento de algunostemas de este trabajo.

A Ada Albertoni quien colaboró en las búsquedas bibliográficasrealizadas.

A todos mis compañeros de Industrias que, de una forma u otra,me ayudaron y acompañaron durante todo este tiempo.

A los Licenciados Raúl Lichtmann de la empresa Alimtec y FavioPassini de la empresa Biotec, que cedieron la enzima empleada.

A Sancor Cooperativas Unidas Ltda. que facilitó el suero de

1. gquTIVOS

El aprovechamiento del suero de queso es deseabletanto desde el punto de vista nutricional, pues poseeproteinas de alto valor biológico y las vitaminashidrosolubles de la leche, como desde el punto de vistaecológico, ya que su descarga al medio ambiente originagraves problemas de contaminación. Sin embargo, suutilización para alimentación, tanto humana como animal,presenta ciertos problemas pricipalmente debido a su altocontenido en lactosa (70 Z p/p de los sólidos totales).

En la Argentina,el suero de queso es concentradohasta un 50 X p/p de sólidos aproximadamente y luego secadoen spray. Debido al alto costo del secado en spray y a lalimitada aplicación del suero en polvo se buscaron métodosalternativos de procesamiento. Kanterewicz (1985b)desarrolló, en este laboratorio, un métodode obtención desuero de queso concentrado (50 Z p/p de sólidos) establemicrobiológicamente a temperatura ambiente. Este métodoestaba basado en la reducción de la actividad de agua poragregado de solutos, reducción del pH y uso de agentesantimicrobianos. Los inconvenientes que presenta esteproducto son: su alta concentración de lactosa (35 Z p/p),lo cual le da una textura arenosa, su sabor salado y su altaviscosidad, factores que limitan su empleo en determinadosproductos alimenticios.

Para ampliar las posibilidades de aplicación delsuero de queso concentrado se propone hidrolizarenzimáticamente parte de la lactosa presente en el mismo.De esta forma se eliminan los problemas de textura y

viscosidad en el suero de queso concentrado ya quedesaparecen los cristales de lactosa. A su vez la reducciónde la actividad de agua (aw) que conlleva la hidrólisis dela lactosa facilita la obtención de un suero establemicrobiológicamente sin el agregado de sustancias para

controlar la awque afecten negativamente la palatabilidaddel producto.

El objetivo de este trabajo es la obtención de suerode queso de alta concentración de sólidos (50 % p/p)parcialmente hidrolizado, estable microbiológicamente atemperatura ambiente durante al menos tres meses. Paralograr la reducción necesaria de la a“, a fin que la mismasea un factor esencial en la estabilidad microbiológica, sepropone realizar la hidrólisis enzimática directa, enausencia de refrigeración, de la lactosa presente en elsuero de queso concentrado (50 Z p/p de sólidos). Otrosfactores que se utilizarán para asegurar la conservación delproducto son la reducción del pH y el uso de agentesantimicrobianos.

2. H'ÜUDUCCION

2.1. Enero de queso

El suero de queso es el producto que resulta de laseparación de 1a caseina y la grasa de la leche durante laelaboración del queso. La caseina puede separarse porcoagulación ó por acidificación, obteniéndose así suerodulce ó suero ácido respectivamente. No es un producto decomposición quimica definida; ésta varia considerablementesegún el origen y proceso utilizado para su separación.Diferentes tipos de queso producen diferentes tipos desuero. Pero también un mismo tipo de queso, elaborado endiferentes queserías, da lugar a diferentes composicionesdesuero. En la Figura 2.1 se detalla la elaboración dequeso por coagulación y la obtención de suero dulce, materiaprima utilizada en este trabajo (Spreer, 1973). Elrendimiento en suero varia según el tipo de queso. En laobtención de quesos de pasta dura se obtienenaproximadamente 9 kilogramos de suero por kilogramo de quesoelaborado. Para quesos de pasta blanda el rendimiento es de5 a 7 kilogramos de suero por kilogramo de queso. En laArgentina 1a producción media anual de suero liquido es deaproximadamente 2.100.000 toneladas, de las cuales el 0,8 Zes procesada; el resto se desecha o se usa tal cual.

Tradicionalmente el suero de queso ha sidoconsiderado una materia prima de escaso valor, ya que poseeuna baja concentración de sólidos. Como se produce engrandes cantidades, si se lo quiere desechar, requiere deuna alta demandabioquímica de oxigeno para su tratamientodebido a la alta concentración de lactosa. El suero de

FIGURA 2.1

Elaboración de queso por coagulación (Spreer,

* Leche higienizadal

1973).

* Preparación de 1a leche para queseria1) Ajuste de la temperatura2) Tipíficación del contenido graso3) Agregado de cultivos y sales4) Maduración previa

l* Coagulación de la caseína

lCuajada

lCompactacíón

lMoldeo

lPrensado

lSalado

lMaduración

lEmpaquetado

u Queso comercial H

queso contiene la mitad de los sólidos totales de la leche,lo cual incluye toda la lactosa y las proteinas del suero.Debido a esto se han realizado investigaciones en todo elmundoa fin de implementar nuevos y más valiosos usos parael suero de queso (Gekas y López Leiva, 1985). Los usos máshabituales del suero de queso son: en alimentación animal(como suero liquido para cerdos o deshidratado como aditivoen alimentos para otros animales), en alimentación humana(suero deshidratado comoaditivo en chacinados, panaderia,etc. ó suero deshidratado y desmineralizado para laelaboración de leches maternizadas) y para la obtención delactosa, la cual se utiliza principalmente en las industriasfarmacéutica y alimentaria. Existen varias tecnologías quepueden aplicarse a1 suero a fin de mejorar elaprovechamiento de. sus componentes: fermentación paraproducir proteinas unicelulares, alcohol ó metano;producción de sustancias químicas comoácido cítrico, ácidoláctico, lactulosa, lactitol, detergentes, etc.;ultrafiltración para extraer las proteinas del suero yobtener diferentes tipos de concentrados de proteina desuero; hidrólisis de lactosa para aumentar la dulzura, etc..

Las proteinas del suero son de excelente calidad.Están constituidas por una mezcla de proteinas yglicoproteínas, entre las que se encuentran albúminas yglobulinas. Estas se insolubilizan por calentamiento a 90°Cy, en contraste con la caseina, son solubles a su pHisoeléctrico. Si están desnaturalizadas (por acción delcalor), su solubilidad es baja y coprecipitan con 1acaseina. Dentro de las proteinas del suero se encuentra unafracción que no coagula por calor pero precipita por accióndel ácido tricloroacético, 1a cual se designa como proteosa

peptona (su peso molecular es intermedio entre las proteinasy los péptidos). Las sustancias nitrogenadas no proteicasson compuestos dializables que permanecen en Solución en lasdistintas condiciones en que se produce la precipitación delas proteínas. Incluyen aminoácidos libres, creatinina,urea, creatina. ácido úrico, amoniaco, nucleótidos,fosfolipidos (Alais, 1971).

Los concentrados de proteína proveen una forma deaprovechar las propiedades tanto nutritivas comofuncionalesde las proteinas del suero. Las proteinas del suero son dealto valor biológico ya que poseen un alto contenido entriptofano (3,3 Z p/p), en lisina (10,9 Z p/p) y enaminoácidos azufrados por la presencia de cistina. Su valornutricional es más alto que el de la caseina, por lo que esdeseable su utilización. Los problemas que se debensolucionar en el procesamiento industrial de las proteinasdel suero son la desnaturalización durante el procesamientoy las variaciones en composición de los productos que seagrupan bajo el nombre de concentrados de proteina de suero.Estas variaciones en composición son debidas a la fuente dela materia prima, al método de fabricación del queso, altratamiento térmico previo, a las condiciones dealmacenamiento, etc. (Schmidt y 001., 1984, Delaney y 001.,1972). El proceso de obtención de los concentradosproteicos es caro; por lo tanto es conveniente tratar deutilizar el suero de queso completo, eliminando losproblemas que causa la lactosa y aumentando su poderedulcorante (Dicker, 1982).

2.2. Hidrólisis de lactosa

2.2.1. Generalidades y métodos

Las desventajas de la lactosa como azúcar son: labaja solubilidad (Shah y Nickerson, 1978), su escaso poderedulcorante (Dioker, 1982; Zadow, 1986) y la intolerancia ala mismaque presentan algunas personas (Hourigan y Mittal,1984; Torun y 001., 1979). Se han sugerido varios métodosfisicos para disminuir la concentración de lactosa en lechey suero: cristalización, diálisis, filtración por geles yultrafiltración. Otros métodos modifican químicamente a lalactosa: reducción, oxidación, fermentación e hidrólisis.Este último método implica la ruptura de la uniónglicosidíca fi+1-4.

La lactosa es un disacárido compuesto por glucosa ygalactosa y al ser hidrolizada parcialmente se obtiene unamezcla de los tres azúcares. Los efectos de la hidrólisisson varios:

I Uno de los más importante es el aumento de la solubilidadde la mezcla de lactosa, glucosa y galactosa respecto de lalactosa (Dicker, 1982; Harju y Kreula, 1978). Cuando setrabaja con sistemas de una concentración de lactosa mayorque 50 Z p/p hay un óptimo en la solubilidad de la mezcla deazúcares cuando se alcanza el 75 Z de hidrólisis. A mayor ómenorporcentaje de hidrólisis cristalizan galactosa 6lactosa respectivamente (Guy y Edmonson, 1978)

I Otra de las ventajas de hidrolizar la lactosa es el sabormás dulce del producto. Aparentemente la mezcla de azúcaresdebida a la hidrólisis de lactosa tiene un efecto sinórgicosobre la dulzura, ya que es mayor que la suma calculada a

partir de los componentes (Guy y Edmonson, 1978). Para elcaso de la leche, el aumento en el sabor dulce alhidrolizarse aproximadamenteel 70 Z de la lactosa presentees equivalente al agregado de 2 %p/p de sacarosa (Zadow,1986).

I Para aquellas personas que no pueden digerir la lactosa,la hidrólisis aumentael valor nutritivo de la leche y elconsumode la misma. También para los cerdos la hidrólisistrae beneficios, ya que permite que puedan ingerir unacantidad mayor de suero de queso por dia y el aumento depeso es más rápido que en cerdos con una dieta standard(Hustranta y col. 1979; Alaviuhkola y Harju, 1985).

I E1 jarabe que se obtiene a partir de lactosa hidrolizadatiene menor viscosidad, lo cual permite un mejor manejo delmismo y además la baja viscosidad puede contribuir amodificar las propiedades fisicas de la preparación a la quese agregue (Nickerson, 1974).

I Los jarabes de lactosa hidrolizada poseen la propiedad deretener humedady asi evitar la pérdida de agua de losalimentos que los contienen ya que,al ser un sistema menoscristalino,es más higroscópico (Nickerson, 1974). Estapropiedad es importante en confitería, ya que es capaz deretener más humedadque el azúcar invertido (Harju y Kreula,1978).

I Para determinados productos, la hidrólisis de lactosaofrece ventajas desde el punto de vista del pardeamiento noenzimático, ya que a pH neutro la glucosa y galactosa son2,5 y 5,0 veces más reactivas '(en presencia de amino

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compuestos), respectivamente, que la lactosa (Pomeranz ycol, 1882).

I La mayor fermentabilidad de la glucosa respecto de lalactosa favorece el proceso de panificación, obteniéndose unmayor volumen de dióxido de carbono.

En la Tabla 2.1 se resumen todas las propiedades y ventajasde la mezcla de azúcares resultante de la hidrólisis delactosa con respecto a la lactosa sin hidrolizar.

La hidrólisis de lactosa ofrece a la industrialechera la oportunidad de desarrollar nuevos productosdestinados a mercados especificos. Esta técnica puede seraplicada a todos los efluentes que contengan lactosa: leche,suero de queso, permeatos de ultrafiltración de leche osuero y suero de caseina, aumentando el potencial de uso delos mismos.

Existen dos técnicas básicas para hidrolizar lalactosa: hidrólisis ácida e hidrólisis enzimática.

I Hidrólisis ácida: Se puede hidrolizar la lactosa conácido a alta temperatura, pero este procedimiento solamentees viable para efluentes libres de proteina, comoes el casodel permeatode ultrafiltración. Si se utilizan ácidosminerales es conveniente emplear bajas temperaturas (50-60°C) para inhibir las reacciones secundarias y se puedennecesitar hasta 48 horas para llegar a un grado dehidrólisis aceptable (Lin y Nickerson, 1977; Vujicic y 001.,1977). El proceso se puede mejorar utilizando resinas deintercambio iónico: no se agrega ácido y se pueden emplear

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TABLA 2.1

Propiedades y ventajas de la lactosa hidrolízada ( Nijpels.1978; Nickerson, 1974; Zadow, 1986; Dicker, 1981).

Solubilidad a 25°C (g/IÜÜ g solución):Lactosa: 17,0Glucosa: 50,5Galactosa: 84,0Lactosa hidrolízada al 80 X : 55,0

Dulzura (relativa a 1a sacarosa, sacarosa: 100 ):Lactosa: 20-40Glucosa: 74Galaotosa: 32Lactosa hidrolízada al 80% 55-65

Textura:Lactosa: arenosa debido a los cristales (a concentracionesmayores que la solubilidadlLactosa hidrolízada al 80 Z suave

Fermentabílidad:Lactosa: limitadaLactosa hidrolízada al 80 Z : mucho mayor

Caramelización y pardeamiento relativos (a alta temperatura)Lactosa: 1.0

Glucosa: 2,5 } para 1a mezcla 3,75Galactosa: 5,5

Nutrición:La lactosa hidrolízada no produce trastornos debido

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(continuación de la Tabla 2.1)

a intoleranciá en humanosy animales.

Propiedades fisicas:La lactosa hidrolizada posee menor punto de congelación(puede ser de utilidad en helados y otrasformulaciones congeladas).

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altas temperaturas (90-100 °C) (Demaimayy col., 1878). Lavelocidad de reacción es mayor y es aplicable a procesoscontinuos. Los tiempos de operación son de 0,5 a 2 horas(Harju y Kreula, 1978). El producto hidrolizado es marrón ypuede necesitar decoloración, desmineralización yneutralización antes de ser utilizado. Si en el sustrato ahidrolizar quedara algo de proteína es muycomplejo removerel color y sabor (Lin y Nickerson , 1977). Las desventajasde la hidrólisis ácida son: a) no se puede aplicar a leche uotros efluentes que contengan proteina, b) 1a presencia desales inactiva al ácido por lo que se necesita un alto gradode desmineralización, c) el color marrón del productoresultante obliga a la decoloración por carbón activado, d)por lo general se forman productos secundarios indeseables,y e) el alto costo de los materiales necesarios para laconstrucción de la planta, ya que éstos deben resistircondiciones muy agresivas. Dado que su aplicación eslimitada no se utiliza demasiado a nivel comercial (Vujicicy col., 1977; Demaimayy col., 1980; Demaimayy col., 1978;Coughlin y Nickerson, 1975).

I Hidrólisis enzimática: Es el método más utilizado parahidrolizar la lactosa. Las enzimas que se utilizan para lahidrólisis enzimática de la lactosa pueden provenir dediversas fuentes. siendo las más empleadas para productosalimenticios las de Kluyveromyces sp. y Aspergillus 5p..Las fi-galactosidasas catalizan la hidrólisis defi-D-galactósidos y de a-L-arabinósidos. Tambiénson capacesde catalizar la síntesis de ciertos oligosacáridos por mediode la transferencia de residuos de galactósidos. Estatransferencia ocurre preferentemente al alcohol primario dela D-glucosa (Richmondy col., 1981). Las propiedades de las

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enzimas dependen de su origen, aunque su especificidad semantiene esencialmente igual. Las lactasas producidas porlevaduras son intracelulares. pero los hongos puedenproducir enzimas extracelulares.

Enzimasprovenientes de diferentes orígenes e inclusode diferentes fabricantes tienen diferentes óptimos de pH ytemperatura. En la Tabla 2.2 se muestran las condicionesrecomendadas para el uso de diversas lactasas (Zadow, 1986;Gekas y López Leiva, 1985). Por lo general las enzimas sonactivas dentro de un rango estrecho de pH. Por ejemplo, delas enzimas descriptas en 1a Tabla 2.2, sólo la provenientede Aspergillus oryzae tiene suficiente actividad como paraser usada ventajosamente en leche y en suero dulce. ambos asu pH original. Las enzimas provenientes de levadurastienen poca estabilidad térmica en los medios de cultivohabituales, por lo que se deben utilizar por debajo de los40°C, siendo su óptimo 30-35°C. Su pH óptimo es 6-7,5, porlo que se utilizan preferentemente para leche y suero dulce.Las enzimas fúngicas son estables en un rango de temperaturamás amplio. Su óptimo es alrededor de 55°C y pueden serutilizadas hasta 69°C. Su rango de pH óptimo, más bajo queel de las lactasas de levadura, es 2,5-5,5 (Miller y Brand,1980; Mustranta y col. 1979).

Para la hidrólisis enzimática se pueden emplearbásicamente tres técnicas: enzimas solubles (se usan unasola vez), sistemas con recuperación de la enzima,generalmente por medio de membranas (se usa varias veces) yenzimas inmovilizadas.

I Enzimas solubles: Para elegir la enzima soluble a emplear

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TABLA 2.2

Propiedades de lactasas provenientes de diversas fuentes.

ORIGEN p" TEMPERATUR‘ coracronssorrruo ESTABILXDAD OPTIMA (OC)

Aspergillus niger 3,0-4,0 2,5-8,0 55-60 noAspergillus orizae 5,0 3,5-8,0 50-55 noKluyveromyces 6 Saccha­romyces fragilís 6,6 6,5-7,5 37 Mn‘z, K.Kluyveromyces ó Saccha­romyces lactis 6,9-7,3 7,0-7,5 35 Mn‘z. K+Escherichia coli 7,2 s.0-e,o 4o Na‘ , K‘Lactobacillusthermophillus 6,2-7,1 55Leuconostoccítrovorum 6,5 - 60 no

se deben tener en cuenta el sustrato, el pHde trabajo, latemperatura máximay el tiempo de contacto, la actividad yel costo de la enzima. Para reducir costos se puedennecesitar tiempos de contacto largos (varias horas) ytemperaturas de 37-45 °C. Con la leche como sustrato esteproceso da lugar a deterioro microbiano. (Zadow, 1986;Miller y Brand, 1980; Gekas y López-Leiva, 1985).

I Sistemas con recuperación de la enzima por medio demembranas: La base de este proceso es la permeabilidaddiferenciada de la enzima y la lactosa a través demembranasde ultrafiltración. La lactosa y sus productos dehidrólisis permean y la enzima queda retenida. A fin depoder recuperar selectivamente la lactasa de la mezcla dereacción se debe pasar el material a hidrolizar previo a lareacción por la misma membrana. Es decir que se debenutilizar sustratos libres de proteína (permeatos). Laenzima se recupera por ultrafiltración de la mezcla dereacción. El permeato hidrolizado puede después juntarsecon el concentrado de leche ó suero ó sino se puede procesarcada efluente por separado, obteniéndose concentrados deproteína y jarabes de lactosa hidrolizada.. A1 ser unproceso complejo no es utilizado comercialmente (Miller yBrand, 1980; Norman y col, 1978; Roger, 1978)

I Enzimas inmovilizadas: Este es el método con mayorpotencial de aplicación para operaciones en gran escala, yasea para hidrolizar leche, suero o permeatos. La lactasa hasido inmovilizada en varios soportes insolubles, encerradadentro de membranas semipermeables, colocada entre dosmembranasde diálisis y en reactores de fibra hueca. Variospaises poseen plantas que trabajan con enzimas

inmovilizadas; sin embargo muchos de los sistemas empleadosno son aptos para leche ya que, a pH mayor que 6,0, suactividad es muybaja. En Japón y Australia se desarrollóun sistema para hidrolizar leche y suero que utiliza lalactasa de Aspergillus oryzae inmovilizada sobre una resina.Pese a que su pH óptimo es 5,0, a pH 6,8 retiene un 50 Z desu actividad. Se trabaja a 35-40 °C y para minimizar elcrecimiento microbiano se utilizan tiempos de hidrólisisentre 1 y 5 minutos, dependiendo del sustrato (Zadow, 1988).Aparte de su menor costo respecto de los otros sistemas dehidrólisis de lactosa, el empleo de enzimas inmovilizadastiene la ventaja que, debido a los cortos tiempos decontacto, no hay problemas de aparición de sabores extrañosy que además no se agrega ningún aditivo a la leche. Paraevaluar el costo de este proceso se deben considerar laactividad y vida operativa útil de la preparación, elcrecimiento microbiano y el diseño del reactor. Enbibliografia se han desarrollado numerosos sistemas deenzimas inmovilizadas para la hidrólisis de leche y sueros vpermeatos diluidos (Sprossler y col, 1981; Sprossler yPlainer, 1983; Plainer y col., 1982; Pastora y col., 1974;Okos y col., 1978; Harju y col., 1978; Harju y Heikonen,1982; Hustad y col., 1973a; Hustad y col., 1973b; Hultin,1983; Giacin y col., 1974; Jones y White, 1985; Yang y col.,1984; Finocchiaro y col., 1980).

El uso de enzimas solubles tiene ventajas cinéticasrespecto de las otras dos técnicas, pero se tiende aprolongar el uso de las mismas mediante el empleo detécnicas de inmovilización. Los costos relativos de lostres procesos han ido cambiando en los últimos años según laevolución la tecnologia. El costo de las enzimas solubles

(sin recuperación) ha disminuido considerablemente en losúltimos años, lo mismoque el de las enzimas inmovilizadas.Se debe tener en cuenta que el costo de las enzimas solublesestá en relación directa con la pureza de las mismas, peroel uso de enzimas más baratas puede dar lugar a la formaciónde sabores extraños, probablemente debido a la actividad deproteasas.

La velocidad y el grado de hidrólisis alcanzadodependen del origen de la enzima utilizada, suconcentración, tiempo y condiciones de reacción yconcentración de sustrato. La inhibición por productosreduce la velocidad de la reacción a medida que lahidrólisis avanza y también depende de la fuente de laenzima. Por ejemplo, la enzima de Aspergillus niger es másintensamente inhibida por uno de sus productos de reacción,la galactosa, que la de Aspergillus oryzae (Sprossler y001., 1983). La lactasa de Saccharomyces ó Kluyveromyceslactis es, aparentemente, menos inhibida por sus productosque las lactasas provenientes de hongos (Aspergillus niger yoryzae). Según los datos de Miller y Brand (1980),trabajando con igual concentración de ambas enzimas, cadauna a su temperatura y pH óptimo. al cabo de 2 horas con laenzima de S. lactis se alcanza un 15 Z más de hidrólisis quecon la lactasa de A.niger. La velocidad de hidrólisis conla lactasa de S. lactis está cerca del máximo aconcentraciones de lactosa similares a las de la leche(4,5-5 Z p/p). En cambio, para la enzima de A. niger, lavelocidad de hidrólisis sigue aumentando hasta que laconcentración de lactosa llega al límite de la solubilidad(Miller y Brand, 1980). Los autores Harju y Heikonen (1982)encontraron que, para la lactasa de Aspergillus niger

adsorbida en una resina de fenol-formaldehído, el mejorsustrato desde el punto de vista cinético es el permeato.La constante de velocidad es un 20 Z mayor con permeato quecon suero desmineralizado y éste a su vez es levemente mejorsustrato que suero entero.

2.2.2. Intolerancia a la lactosa

Cuando un ser humano ingiere lactosa, ésta eshidrolizada en el intestino delgado a glucosa y galactosapor acción de una B-galactosidasa que está situada en elepitelio del intestino. En cierta porción de la poblaciónmundial, la actividad de la fi-galactosidasa está por debajode lo normal o puede ser cercana a cero. La tolerancia a lalactosa varía con la raza y población, siendo, en general,1a raza blanca muytolerante y, dentro de las razas negra yamarilla se presenta entre 7U y 100 Z de intolerancia(Mustranta y col. 1979). En estos casos al consumirseproductos que.contienen lactosa, ésta pasa sin digerirse alintestino grueso. Se produce un aumento de la osmolalidaden los fluidos intestinales y aumenta la cantidad de aguaque llega al intestino. La lactosa no digerida puede serfermentada por los microorganismos intestinales generandoácidos, hidrógeno y dióxido de carbono. Estos dos efectosson los responsables de los síntomas que presentan laspersonas intolerantes a la lactosa: dolor abdominal,flatulencia,- náuseas, diarrea y pérdida del apetito(Hourigan y Mittal, 1984; Torun y 001.,1979)

2.3. Preservación de alimentos por el método de factorescombinados

2.3.1. Factores que inhiben el crecimiento microbiano

Los procesos de preservación de los alimentos tienencomoobjetivo primario prolongar la vida útil de los mismosa fin de permitir su almacenamiento y distribución. Tambiéndeben asegurar sus características organolépticas y suvalor nutritivo, que depende, entre otros factores, de lasoperaciones a las que se someten las materias primas durantesu procesamiento y de las condiciones de almacenamiento,tanto de las materias primas comodel producto final. Paradefinir 1a calidad de un alimento se deben tener en cuentatres aspectos: el higiénico-sanitario, ya que debe serinocuo para 1a salud; el nutritivo, vinculado a 1a presenciade nutrientes y antinutrientes en el mismo, y laaceptabilidad del producto, la cual está ligada a 1apercepción psicosensorial (Tannenbaum, 1982).

E1 objetivo primario de un proceso de preservación eslograr 1a estabilidad microbiológica del alimento, ya queestá directamente relacionada 1a salud humana. Una vezlogrado el control de esta forma de deterioro se debeconsiderar el desarrollo de otras reacciones adversas quepueden ocurrir, tanto durante las operaciones depre-procesamiento como en el procesamiento y almacenamiento.Es decir, que también debe tenerse en cuenta la estabilidadenzimática y fisico-quimica del alimento durante las etapasmencionadas.

La inhibición del crecimiento de los microorganismospuede lograrse mediante el control de una serie de factoresdentro del alimento: actividad de agua (aw), temperatura dealmacenamiento, pH, potencial redox, tratamiento térmico,

uso de conservadores, etc.. A continuación se dará unabreve descripción de la influencia de algunos de losfactores enumerados en el crecimiento y supervivencia de losmicroorganismos.

Los microorganismos necesitan para su crecimiento unadeterminada cantidad de agua eu el alimento. También lamayoría de las reacciones de deterioro requiere una ciertacantidad de agua que actúa comosolvente de los reactantes ycatalizadores. El parámetro que mejor indica la"disponibilidad del agua" en el alimento es la actividad deagua. Se la puede definir como1a relación entre la presiónde vapor de agua en el alimento respecto de 1a presión devapor del agua pura, ambas a la misma temperatura. En lasección 2.3.3 se analizará más extensamente el concepto deactividad de agua y su cálculo en alimentos.

Al estudiar las relaciones entre el crecimiento de

los microorganismos y la aw se debe considerar que existeuna aw mínima debajo de la cual un dado microrganismo nocrece (Scott, 1957). En 1a tabla 2.3, recopilada porTroller (1979), se presentan los valores de aw minima decrecimiento de algunos microorganismos de interés enalimentos para el caso en que los demás factores queinfluencian su desarrollo estén en los valores óptimos paracada microorganismo en particular. Cuando estos y otrosfactores del medio se desvian respecto del punto óptimo parael crecimiento de un microorganismo determinado, disminuye

la resistencia del mismofrente a la aw reducida, aumentandola aw mínima que permite el crecimiento.

El desarrollo de microorganismos presenta algunas

Actividades demicroorganismos

22

TABLA 2.3

minimas para el crecimiento de1979).

agua(Troller,

BACTERIAS LEVADURAS HONGOS

C. botulimun tipo EPseudomonas (a)

Flavobacterium, KlebsiellaLaotobacillus (a), Proteus (a)Pseudomonas, Shigella

Alcaligenes, Bacillus, ProteusCitrobacter, Clostridium,Enterobacter, Escherichia,Pseudomonas,'Salmonella,Vibrio, Serratia,Lactobacillus (a)Clostridium botulinumTipos A, B y C

Lactobacillus, Vibrio, StachybotrisNicrobacterium, Aerobacter,Pediococcus, Steptococcus (a)

Lactobacillus (a) Rhizopus,Streptococcus Botrytis,

Hucor

23

(continuación de la Tabla 2.3)

0,92 Rhodotorula, Pichia

0,91 CorynebactriumStaphylococcus (anaerobio)Streptococcus (a)

0,90 Lactobacillus (a), Víbrio, Hansenula,Nicrococcus, Bacillus (a), SaccharomycesPediococcus

0,88 Candida, Debaryomyces,Torulopsis, Hansenias­para

0,87 Debaryomyces

0,88 Staphylococcus (aerobio),Vibrio (a)

0,80 Saccharomycesbailii

0,75 Halobacteríum,Halococcus

0,70

0,62 Saccharomyces rouxii

0,61

C1ados­porium

Paecilomyces

Aspergillus,Penicillum,

Aspergillus,Wallemia

Crysosporium

Honascus

Xeromyces

diferencias según se trate de bacterias, hongos o levaduras.pero en forma general se puede decir que las fases decrecimiento que se observan en cada caso son similares(Troller y Christian, 1978). Existe un primer periodo deadaptación, conocido comofase "lag", seguido por una fasede crecimiento acelerado (fase exponencial) y finalmente lavelocidad de crecimiento disminuye, alcanzándose unequilibrio entre la velocidad de crecimiento y la de muerte(fase estacionaria). Eventualmente la velocidad de muertepuede ser mayor a la velocidad de crecimiento con lo cual seentra en una fase declinante, disminuyendo la poblaciónmicrobiana. A valores de aw menores a 1a mínima para sucrecimiento las células pueden permanecer latentes (fase"lag" infinita) ó morir (Sperber, 1983).

No se conoce el mecanismo exacto responsable de lainhibición del crecimiento microbiano a bajas actividades deagua, pero hay dos factores involucrados:

I Las células normalmente sufren plasmólisis cuando setransfieren de un medio de alta aw a un medio de baja aw ,ya que la célula pierde agua. Por ejemplo S. aureus pierdealrededor del 50%de su agua intracelular si se lo cambia de

un medio de aw 0,995 a otro de aw-QQSO (Koujima y col)1978).

I Cuando la célula se coloca en un medio de aw reducida, sepone en marcha un mecanismo celular que produce laregulación del contenido interno de solutos (por síntesis otoma de solutos del medio), de forma tal de justo excederla osmolalidad externa y mantener constante su contenido deagua. Estos solutos sintetizados- no interfieren con el

26

desempeñonormal de las funciones metabólicas de la célula:son solutos "compatibles" (Brown, 1974).

Si la presión osmótica del medio es tan elevada queexcede la capacidad osmorreguladora de la célula , se pierdeagua irreversiblemente, cesa el crecimiento y se produce lamuerte a una velocidad que depende tanto de la aw como deotros factores ambientales. Los solutos compatibles máscomunesson el ión potasio para bacterias halofílicas,prolina en bacterias osmotolerantes, ácido r-amíno butíriooen bacterias moderadamenteosmotolerantes y ácido glutámicoen bacterias poco osmotolerantes (Troller, 1980). Para laslevaduras los solutos compatibles son principalmentepolioles, incluyendo glicerol y etanol (Brown, 1974). Lascepas más osmotolerantes, como Saccharomyces rouxii,retienen el glicerol con mayor eficacia que otras menosresistentes a la baja a", como Saccharomyces cerevisiae.Debaryomyces hansenii acumula glicerol en su faselogaritmica y arabitol en la fase estacionaria cuando creceen un medio de alta concentración de cloruro de sodio. Laacumulación de arabitol, encontrada en varias levaduras,probablemente actúe comofuente de energia (Corry, 1987).Los hongos, por lo general, también acumulan polioles.Geotrichum candidum acumula manitol y arabitol y Aspergillusniger glicerol, eritritol y manitol. La lista de solutoscompatibles se agranda continuamente a medida que avanza lainvestigación y es tan diversa que se torna difícilencontrar una relación estructural entre todos ellos. Todoesto indica que los mecanismosde resistencia a la baja awy de osmorregulación son complejos y dependen delmicroorganismo considerado.

La aw minima de crecimiento de un microorganismos de_pende del soluto utilizado para disminuir 1a actividad deagua del medio. Por ejemplo, Scott (1959) encontró que lavelocidad de crecimiento de Paecylomyces amstelodamí esmayor en un medio con glucosa ó sacarosa que en otro concloruro de magnesio, cloruro de sodio ó glicerol a 1a mismaaw. Sperber (1983) realizó una recopilación de datos sobrela influencia de varios solutos sobre 1a aw minima para elcrecimiento de bacterias, la cual se encuentra en 1a tabla2.4. Se observa que la aw minima para el crecimiento enpresencia de glucosa o cloruro de sodio es más alta que enpresencia de glicerol.

El mecanismode osmorregulación celular funciona paramantener la homeostasis con respecto al contenido de agua.En las células vegetativas el proceso homeostático esactivo, por lo tanto requiere energia adicional a lanecesaria para el crecimiento celular (Gould, 1985). Si enel medio se limita el aporte de energía, por ejemploreduciendo la concentración de oxigeno y/o nutrientes,controlando la temperatura tal que no sea la óptima para el

microorganismo, reduciendo la aw y el pH, el microorganismono podrá afrontar el requerimiento adicional de energia ypor lo tanto su velocidad de crecimiento disminuirá (Gould,1985).

La temperatura es otro factor de gran importanciapara el desarrollo de los microorganismos. Por lo generaléstos presentan una mayor tolerancia a 1a aw reducida cuandose encuentran a temperaturas cercanas a las óptimas para sucrecimiento. Por ejemplo, Clostridium botulimun tipo B

incubado a pH = 7,0 y a aw 0,96 no crece a 20°C; a 30°C se

28

TABLA 2.4

Influencia del soluto sobre la aw mínima de crecimiento debacterias (Sperber, 1963).

MICROORGANISMO MINIMA av PARA EL CRECIMIENTO EN

NOCL OLUCOSA GLXCEROL

Clostridium perfringens 0,970 0,960 0,950Clostridium botulinum tipo E 0,970 — 0,940Clostridium sporogenes 0,945 0,965 0,935Lactobacillus holveticus 0,963 0,966 0,928Streptococcus thermophillus 0,985 0,986 0,947Streptococcus lactis 0,965 0,949 0,924Pseudomonasfluorescens 0,957 - 0,940

observa crecimiento luego de 9 dias y a 40°C'crece luego detres dias de incubación (Ohye y Christian, 1966). Para

levaduras osmofílicas 1a aw mínima para fermentar glucosa es0,66 a 30 °c; 0,70 a 20 °C y 0,78 a 1o °C (von Schelhorn,1950). Los estudios realizados por Ayerst (1966, 1969)

confirman que los hongos son más tolerantes a 1a baja awcuando la temperatura es cercana a la óptima de crecimiento:Aspergillus ruber a 5°C crece a a 0,85 mientras que a 37°C

wlo hace a 0,80.

E1 pH es un factor selectivo importante para eldesarrollo de los microorganismos en los alimentos. Engeneral se puede decir que el tipo de microorganismo quecrece en un alimento está determinado (a una dadatemperatura) principalmente por el pH y la actividad deagua, y ésta influirá sobre el pH mínimo de crecimiento.

Por ejemplo en un alimento de pH 4,5 y aw reducida sólocrecerán hongos y/o levaduras. A este mismo pH pero a awalta, los microorganismos involucrados en el deterioro sonlas bacterias ácido-lácticas. Para Staphylococcus aureus,los pH mínimo y máximo para su desarrollo en medios delaboratorio son 4,0 y 9,8 respectivamente (Corlett y Brown,1980; Troller y Christian, 1978) y para los lactobacilos,los valores son 3,8 y 7,2 (Corlett y Brown, 1980). Laslevaduras Saccharomyoes cerevisiae, Saccharomyoes rouxii ySaocharomyces bailii crecen dentro del rango de pHcomprendido entre 2,0-2,35 y 8,6 (Corlett y Brown, 1980;Troller y Christian, 1978).Los hongos son los que poseen elmayor rango de pH que permite crecimiento, siendo el valormínimo 1,9 y el máximo 9,3 (Corlett y Brown, 1980).

Otros factores que tienen influencia sobre el pH

30

minimode crecimiento son el tipo de soluto presente y laespecie de microorganismo. Baird Parker y Freame (1967)demostraron que el cloruro de sodio es más inhibitorio queel glicerol a la misma aw. Por ejemplo para esporas deClostridium botulinum tipo B, el pH mínimo de crecimiento es5,3 en un medio con glicerol y 7,0 en un medio con clorurode sodio, mientras que para esporas de Clostridium botulinumtipo A el pH mínimo es 5,3 en glicerol y 5,5 en cloruro de

sodio (aw = 0,97).

La concentración de oxigeno también influye sobre elcrecimiento microbiano. Los microorganismos facultativostienen una aw minima de crecimiento menor en condicionesaeróbicas que en condiciones anaeróbicas. Por ejemplo, paraStaphylococcus aureus la aH mínima de crecimiento enpresencia de oxígeno es 0,86, mientras que en ausencia deoxigeno es 0.92 (Scott, 1953). Por lo general losmicroorganismos aerobios se vuelven más sensibles a 1a faltade oxigeno a menor a y temperatura (Corry, 1987).

w

Los conservadores o agentes antimicrobianos ayudan aprevenir el crecimiento de los microorganismos en losalimentos. Debenser capaces de inhibir el crecimientomicrobiano, no ser tóxicos, metabolizarse y eliminarse delorganismo sin quedar retenidos en el mismo, ser solubles enagua (ya que los microorganismos crecen en la fase acuosa delos alimentos), ser estables en el alimento , no tener oloró sabor y ser económicos. Es muy dificil encontrarcompuestos que cumplan simultáneamente con todos estosrequisitos.

Los ácidos orgánicos lipofílicos, preferentemente en

31

su estado no disociado, presentan actividad antimicrobiana.Según una hipótesis reportada en bibliografia estoscompuestos inhiben el crecimiento microbiano por interferircon la permeabilidad de la membranacelular al producir undesacoplamiento entre el transporte de sustratos y lafosforilación oxidativa del sistema transportador deelectrones (Baird-Parker, 1980). Las formas no disociadasde ácidos comoel sórbico, propiónico y benzoico podriandifundir libremente a través de la membrana celular eionizarse dentro de la célula dando lugar a protones queacidifican el medio interno del microorganismo, quenormalmente es neutro (Corlett y Brown, 1980). El efecto delos conservadores depende del pH a través de la constante dedisociación del conservador ya que la forma no disociada esla que presenta mayor actividad antimicrobiana.

Dentro de los conservadores más utilizados dentro dela industria alimentaria se pueden mencionar:

I Benzoatos: su actividad antimicrobiana es máxima en elrango de pH 2,5-4,0 (pKa = 4,2); por lo tanto se utilizanmás en alimentos ácidos y son más efectivos para hongos ylevaduras que para bacterias, ya que a pH mayor que 4,5 suactividad decrece notablemente.

l Parabenos: son ésteres alcalinos del ácido para­hidroxibenzoico. Comono son ácidos débiles y el grupocarboxilo está esterificado, la molécula activa no disociadaestá presente en un rango amplio de pH (pKa = 8,5). Laactividad antimicrobiana es directamente proporcional a lalongitud de la cadena, pero disminuye la solubilidad alaumentar ésta. Por lo general son_más activos contra hongos

32

y levaduras que contra bacterias. Son más caros que otrospreservadores y no son muy solubles en agua.

I Propionatos: son muyefectivos frente a hongos y algomenos frente a bacterias y levaduras. Actúa a pH inferior a5,5 (pKa=4,9). Se lo utiliza preferentemente en pan,tortas, quesos procesados y alimentos para animales.

I Acido sórbico y sorbatos: el sorbato de potasio es elconservador más empleado en alimentos. El ácido sórbico esun ácido graso a,fi—insaturado de cadena recta, cuya fórmula

molecular es CHs-CH=CH-CH=CH-CO0H. El grupo carboxiloreacciona fácilmente formandosales y ésteres. De las salesdel ácido sórbico, 1a más importante es la de potasio por sualta solubilidad en agua. Los sorbatos inhiben o retardanel crecimiento de hongos, levaduras y bacterias, perogeneralmente su acción es más pronunciada sobre hongos ylevaduras. .El valor de su constante de disociación, pKa,es 4,8; por lo tanto tiene mayor poder de inhibición enalimentos ácidos. El pH máximo para su actividad es6,0-6,5, mayor que para benzoatos ó propionatos. Se loutiliza para inhibir el crecimiento de microorganismos enquesos, manteca, jamones, embutidos fermentados, jugos yjarabes, alimentos de humedad intermedia, panes, pescadoahumado, vinos, jugos de fruta, aderezos, bebidascarbonatadas, productos derivados del tomate, dulces yjaleas, salchichas, carne, yogur, carne de cerdo, etc.(Sofos, 1989).

223.2. Método de los factores combinados

El primer método de preservación que utilizó el

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hombre,basado en el control de la actividad de agua, fue ladeshidratación. Sin embargo, debido a los cambios detextura (baja capacidad de rehidratación) y sabor que sufreel alimento, en las últimas décadas se buscó modificar ymejorar las tecnologías de conservación de los alimentos quese basan en 1a reducción de la actividad de agua, a fin deobtener productos de mejor calidad.

Asi, se desarrollaron entonces los "alimentos dehumedadintermedia" (A.H.I.), que basan parcialmente suestabilidad en la reducción de la aH por agregado desolutos o por agregado de solutos y deshidrataciónposterior. Son alimentos estables sin refrigeración óproceso térmico. El rango de aw de estos alimentos esaproximadamente 0,86-0,65, el cual corresponde a una humedaden base seca del 10 al 40 X p/p (Karel, 1976).

Dentro de los A.H.I se encuentran algunos que hansido producidos desde hace muchos años, como los lospreservados por adición de azúcar (frutas confitadas,compotas, jaleas, jarabes, etc.), aquellos que han sidosecados con el agregado de sal (jamón curado, pescadossalados, embutidos crudos) y productos de panaderia (tortasde fruta, pasteles rellenos de fruta, etc.). Entre losA.H.I. desarrollados. recientemente se encuentran comidaspara animales, salsas, pastas secas (ravioles,tortellettis), leche condensada, jugos concentrados, sopasconcentradas (Brimelow, 1985).

En los últimos 20 a 30 años se han realizado grancantidad de trabajos de investigación y de desarrollo en elárea de los A.H.I y en la tecnologia involucrada en su

34

formulación y fabricación. Sin embargo al examinar losavances realizados se llega a la conclusión que la mayoríade los A.H.I existentes han sido formulados para finesespecíficos (fuerzas armadas, programas espaciales, etc.) óson los alimentos tradicionales ya mencionadosanteriormente. Es decir que no hay nuevos A.H.I. que seande uso masivo. Dada la alta cantidad de humectante que sedebe de agregar a los A.H.I a fin de lograr su estabilidad(Benmergui y col., 1979; Chirife y 001., 1980; Chirife yFerro Fontán, 1980), la aceptabilidad de los mismos es bajaya que el cambioen las caracteristicas organolépticas esbastante pronunciado respecto del alimento original. Otradesventaja que poseen es que, pese a su estabilidadnicrobiológica, están expuestos a reacciones de pardeamientono enzimático, reacciones catalizadas por enzimas, pérdidade nutrientes, oxidación de lípidos y otras reaccionesproducidas por radicales libres, etc. Es bien sabido(Labuza, 1975) que las velocidades de las reacciones depardeamiento no enzimático y oxidación de lípidos están muycercanas a sus valores máximospara ciertas formulaciones delos A.H.I. Otra desventaja de este tipo de alimentos es latendencia de los consumidores hacia productos que poseancada vez menor cantidad de aditivos, lo cual implica unabaja aceptación de los A.H.I. Por lo tanto este tipo dealimentos no ha seguido -desarrollándose (Troller yChristian, 1978).

Por las razones y limitaciones expuestas esconveniente trabajar a valores de actividad de agua ycontenido de humedad mayores que los usuales para losA.H.I., con lo cual se hace necesario agregar factoresadicionales a fin de potenciar los efectos de la aw para

35

lograr la estabilidad microbiológica. Es asi comosurgieronlos alimentos de alta humedad(A.A.H.) (Sperber, 1983). Laestabilidad microbiológica de dichos alimentos se logra pormedio de una combinación de factores que obstaculizan elcrecimiento microbiano ("hurdles") (Leistner y Ródel, 1975)que incluyen, entre otros factores, una reducción moderadade la aw (en el rango 0,90-0,97), reducción ligera del pH,tratamiento térmico suave, agregados de conservantes, uso deatmósfera controlada en el envase, incorporación de floracompetitiva inocua, control del potencial redox, aplicaciónde técnicas de irradiación, reducción de 1a temperatura dealmcenamiento, escaldado a fin de inactivar enzimas ydisminuir 1a población microbiana inicial, etc.. Entoncesun A.A.H. puede definirse como aquel cuya estabilidadmicrobiológica es lograda por el uso de varios factores,ninguno de los cuales seria letal para los microorganismossi fuera usado individualmente. Estos nuevos alimentos,aparte de ser estables microbiológicamente, tienen buenapalatabilidad_(Leistner y 001., 1981). El efecto de 1acombinación de los factores de estrés es de fundamentalimportancia en la preservación de los alimentos, ya queéstos controlan el deterioro no sólo microbiano sino tambiénquimico y organoléptico. El concepto de obstáculo, que essolamente una ilustración del hecho ya conocido que laestabilidad microbiológica de' los alimentos se logra porcomplejas interacciones de numerosos factores, se puedeutilizar para el diseño y control de.alimentos.

Por ejemplo, para la conservación de la carne, senecesitan bajas temperaturas de almacenamiento, lo queimplica un consumode energía importante. Este factor deinhibición del crecimiento microbiana puede reemplazarse por

otro de menor costo, a saber descenso de aw o leve descensodel pH, ya que los factores de inhibición de crecimientomicrobiano que estabilizan microbiológicamente a un alimentoson, hasta cierto punto, intercambiables (Leistner, 1985).Otro de los factores en los que se basa la obtención denuevos alimentos preservados por métodos combinados es laaplicación de calentamiento suave (70-110°C), de forma talque los microorganismos y esporas sufran daño subletal. Asi,no pueden sobreponerse a la presencia de los demás factoresde estrés presentes en el alimento, los que, si la célulaestuviera intacta, no serían suficientes para frenar elcrecimiento.

Otro factor importante a tener en cuenta es que losfactores de estrés pueden no sólo disminuir en el alimentodurante el almacenamiento, sinó que también pueden aumentary cambiar durante el proceso y almacenamiento de unproducto, comoocurre, por ejemplo, en los embutidos curadosy ahumados. En este caso los "hurdles" ocurren en secuenciay son significativos durante cierto periodo de la maduracióndel embutido para inhibir el crecimiento de bacteriasindeseables (Salmonella sp., Clostridium botulinum,Staphylococcus aureus, bacilos gram negativos que producendeterioro y hongos) y para permitir la selección de la floraadecuada (bacterias ácido-lácticas). Así los "hurdles"bajan su concentración durante el almacenamiento(nitritos),son importantes sólo durante un cierto periodo del proceso(pH), aumentan a lo largo del tiempo (au) o se aplicanpreferentemente sobre el producto terminado (ahumado). Lasecuencia de factores de inhibición del crecimientomicrobiano se puede esquematizar de la siguiente manera(Leistner, 1985) '

37

nitrito ——+potencial redox -—+ flora competitiva -—+ pH ——+a --+ humo

w

El nitrito inhibe a Salmonella sp; pH v aw a C. botulinum;pH, refrigeración y potencial redox a S. aureus y el humo ahongossuperficiales (Leistner, 1985).

Recientemente se ha informado en literatura (Sajur,1985, Kanterewicz y col., 1985b; Alzamora y col., 1990) eldesarrollo de nuevos procesos de conservación de alimentos apartir de los siguientes factores: 1) reducción de la aw poragregado de alcoholes polihídricos, azúcares y/o sal; 2)retardo del crecimiento microbiano por adición de agentesantimicrobianos y fundamentalmente antimicóticos, comoácidosórbico, ácido propiónico, ácido benzoico, etc. y 3)reducción del pH del alimento de forma tal que seacompatible con sus caracteristicas organolépticas. Todosestos factores_ combinados , con inclusión o no de untratamiento térmico suave, permiten la estabilidadmicrobiológica en el rango de aw 0,90-0,97.

La calidad de un alimento en dicho rango de aw sepuede modificar también por reacciones químicas dedeterioro. Las que revisten mayor importancia son elpardeamiento no enzimático (reacción de Haillard) y ladegradación de nutrientes. Hasta el momentola mayoria delas investigaciones sobre estas reacciones se realizaronsobre los A.H.I. Recientemente se han empezado a realizarestudios sobre la evaluación de la calidad nutritiva yorganoléptica de alimentos a valores de aw mayores de 0,90(Fox y 001., 1982; Fox y Loncin, 1982; Petriella y 001.,

38

1985; Cerrutti y 001., 1985; Buera, 1988; Mauri. 1988), Noobstante las investigaciones sobre este tema son aúnescasas.

Es importante hacer notar que pese a que existen enbibliografía numerosostrabajos sobre hidrólisis enzimáticade lactosa, todos fueron realizados sobre sistemas modelo(lactosa, agua ó buffer y/o sales), en leche ó en lecheconcentrada hasta 20-25 %p/p de sólidos y en suero de quesode variadas concentraciones dentro del rango 5-25 % (Mahoneyy col., 1991). Por lo tanto es importante realizar unestudio profundo sobre los factores que afectan lahidrólisis enzimática de lactosa en medios altamenteconcentrados.

2.3.3. Actividad de agua en alimentos

Dadoque el método de conservación propuesto utilizacomouna de los factores de estrés microbiano el control dela actividad de agua, se analizará brevemente el concepto deaw y la predicción de la misma en sistemas binarios deelectrolitos y de no electrolitos y en sistemas demulticomponentes.

En un sistema liquido-vapor, compuesto por unasustancia pura, la tendencia de escape de las moléculas semide en términos de la energía libre de Gibbs (G). En unsistema de multicomponentes la tendencia de escape delsolvente (componente 1) está dada por su potencial quimico,ul.

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a

ul = ——G—-] (2.1)¿"1 T, P, n2,.....,n. 1

donde ni es el número de moles de la especie i. Elpotencial quimico del solvente. agua en este caso, está dadopor

pl = R T ln fl + A1 (2.2)

siendo f1 la fugacidad y A1 una constante que depende de latemperatura.

Para un cambio en la concentración del agua a unadada temperatura

donde yl' y'fl' son el potencial químico y la fugacidadrespectivamente del nuevo estado.

El concepto de actividad de agua (au) se define como1a relación, a una dada temperatura, de la fugacidad de unasustancia en un dado estado (f) y su fugacidad en algún

estado standard (fo). Para el estado standard a: = 1 (Lewisy Randall, 1981).

Refiriendo la ecuación anterior (2.3) al estadostandard

O

pl - pl - R T ln a1 (2.4)

4()

Si se elige comoestado standard el agua pura a presiónatmosférica, la actividad del agua en cualquier solución es

agua puroaw = f1 / f1 (2.5)

En soluciones acuosas y en particular en alimentos, atemperatura y presión normales, la diferencia entre lafugacidad y la presión de vapor es despreciable, con lo cualse puede aproximar

a ua pura _ o ua purof g _p g1 (2.6)

pues la presión de vapor del agua, pl, se aproxima a la deun gas ideal. Por lo tanto se puede emplear la siguientedefinición operativa de la actividad de agua

agua puroaw = 91 / p1 (2.7)

donde p1 es la presión de vapor del agua en la solución ó'agua puroalimento y p1 es la presión de vapor del agua puraa la mismatemperatura y presión. Esta expresión tambiénpuede relacionarse con la humedadrelativa en equilibrio conel alimento (HREZ) por la ecuación

a“=M100

Es importante poder predecir la aw de un sistema.Para esto se debe conocer la composición del mismo. Para elcaso de alimentos procesados se deben considerar dos tipos:a) alimentos de aw menor que 0,75, donde debido a la bajaproporción de agua los fenómenos de soroión son los

principales responsables del descenso de la aH y b) los

alimentos de aw mayor a 0,75, en los que e] “nun constituyeuna proporción considernhle del mismo y por In Lnnto ln

depresión de la aw se debe principalmente a Fenómenos dedisolución de soluLos. El suero de Quenn concentradopertenece a la segunda categoria; por lo tanto se tratará e]tema de la predicción de aw en estos alimentan.

De acuerdo a la ley de Raoult, para solucionesideales,

: o ') .pí xípi (¿.9)

Es decir que 1a presión parcial de cualquier componente de

una solución (pi) es igual a la presión parcial delO . . a

componente puro (pi) por su fracción molar en 1a solu01on(x1). Por lo tanto

a = x = —”————— (2.10)Ïl + n q

donde nw es el número de moles de agua y nq e] número demoles de soluto. La ley de Raoult sólo es válida parasoluciones ideales, y algunos solutos se desvían delcomporLamiento ideal, siendo este efecto más marcado a altasconcentraciones. Sin embargopara soluciones diluídas esteexpresión da valores precisos de la aw (desviaciones levesde 1a idealidad) (Ross, 1975).

Generalmente los compuestos iónicos muestran mayoresdesviaciones que los no iónicos debido a lns fuerzas deatracción entre iones y moléculas polares. Las desviacionesde los compuestos iónicos aumentan con el número de ionesgenerado por molécula. Por 10 tanto, para calcular lor

valores de aw para soluciones no ideales se usa uncoeficiente osmótico molal w:

ln aw = _;_2_EJÉ__ (2.11)55,51

donde v es el número de iones generados por molécula, m laconcentración molal del soluto y 55,51 el número de moles deagua en un kilogramo de agua. Los valores de ó para varioselectrolitos han sido reportados por Robinson y Stokes(1965) y para no-electrolitos por Scatchard y col. (1938).

Pitzer (1973) desarrolló un sistema de ecuacionespara las propiedades termodinámicas de los electrolitossobre un análisis del modelo de Debye-Hückel. Dichas

ecuaciones sirven para calcular la aw de soluciones hastauna concentración de 6 molal. El coeficiente osmótico estádado por la siguiente expresión (Pitzer,1973):

2 v vMx<r>-1=|zM Zx|f+m[————v ]BMx+

2 vu vx+|n z 4——L c“x (2.12)v

Donde v“ y vxson el número de iones M y X de la fórmula y ZMy Zx son sus respectivas cargas en unidades electrónicas; v= vu+ vx. Las otras cantidades se definen como:

I1/2f = - A —————————1+b11/2

B = fi (0) + fi (n exp ( _ a I1/2 )ux MX MX

43

(O ) . . . .finx ) y fiu;1 definen el primero y segundo coef1c1entevirial y Cuxdefine .eltercer coeficiente. I es la fuerzaiónica, definida como:

A es el coeficiente de Debye-Hückel para 1a función Ó ytiene un valor de 0,392 a 25 °C. La constante b se tomaigual a 1,2 para todos los solutos (Pitzer, 1973) y a = 2(Pitzer y Mayorga, 1973).

Bromley (1973) desarrolló un sistema derepresentación y estimación de las propiedadestermodinámicasde electrolitos fuertes que fue descripto porPitzer y Mayorga (1973) comouna simplificación del modelode Pitzer. E1 tercer coeficiente del virial es omitido y elsegundo coeficiente es modificado a una expresión quedepende de la fuerza iónica pero solo con un parámetro (B).La ecuación. de Bromley, pese a ser menos exacta, essatisfactoria para altas concentraciones de soluto y estádada por la siguiente expresión:

4-1-2303 A|Z z|11/2a(11/2)-(006+068)" r v + __ 3 p! .I I ­

|ZZ|I—w(aI)—B—I— (21a)- + _ 2 3 2 .

donde:

Av = 0,511 ¡{gl/2 moll/z a 25°C.

44

|Z+ Z_| es el producto de la carga de los iones.

000,11/2) = —31_/2—3'[1 + P Il/2 - —1-W— ­(p I ) 1 + p I

- 2 ln (1 + le/zn

p = 1 para todos los solutosB es un parámetro para cada soluto.

w(a,I) = 2 [ 1 + 2 a I2 _ ln (1 + a I) ]a I (1 + a I) a I

a = 125

IZ+ Z_|

Los valores obtenidos del coeficiente osmótico aplicandocualquiera de las dos ecuaciones (Pitzer ó Bromley) sepueden utilizar para calcular 1a aw por medio de la ecuación(2.11).

Para predecir la a de soluciones acuosas deno-electrolitos se ha utilizado con muchoéxito el modelodeNorrish (1966). El mismo se basa en un análisistermodinámica de las soluciones y propone la siguientecorrelación para sistemas binarios de no-electrolitos;

a = x exp ( - K x 2 ) (2 14)w 1 2 '

donde x1 y x2 son las fracciones molares de agua y solutorepectivamente y K es la constante que las correlaciona.

45

Norrish (1988) reportó los valores de K para sacarosa,azúcar invertido, jarabes de glucosa, glicerol y sorbitol.En los últimos años se han reportado valores de K paradiversos solutos de interés en alimentos (Miracco y 001.,1981; Chirife y Ferro Fontán, 1980)

Para los sistemas multicomponentes, Ross (1975)desarrolló una ecuación muysimple para estimar la actividadde agua, a través de varias simplificaciones de la ecuaciónde Gibbs-Duhem:

2 ni d ln ( ai) = Ü (2.15)

1actividad. Suponiendo que no hay interacción entre losdonde ni es el número de moles del componente i y a. su

distintos solutos,Ross. (1975) llega a la expresión

). . . . .....(a°) (2.18)W Wl H2 Wa wn

es decir que la aw de la mezcla es el producto de la aw decada componente(awï) a la molalidad total del sistema,independientemente de los otros solutos presentes. Estaecuación se cumple muy bien para no-electrolitos yno-electrolitos y un electrolito fuerte. Para dos ó máselectrolitos fuertes comienzaa ser menosexacta a valoresde aw inferiores a 0,95 (Ferro Fontán y 001.. 1980).

Se han sugerido en bibliografía varias ecuacionescomo las de Benmergui y col. (1979), Ferro Fontán y col.(1979), Chirife y col. (1980) para electrolitos, noelectrolitos y mezclas de ambos. .Estas ecuaciones dan una

46

muy buena aproximación a la aH real y tienen en cuenta queen los alimentos, si bien los componentes de bajo pesomolecular comoazúcares, salesy‘polioles son los' que másafectan al descenso de la aw, el efecto de los componentesde alto peso molecular, como proteínas y otrasmacromoléculas. no puede ser despreciado. En loscomponentes insolubles aparentemente hay un efecto capilar ytambién existen combinaciones particulares de solutos quepueden interactuar entre si dando actividades de aguamayores o menores que las esperadas. Por lo tanto, cuandose trabaja con sistemas complejos es conveniente controlarcon una medida experimental la aw predicha a partir de unmodelo (Corry, 1987).

47

3. RESUMEN DE LAS EXPERIENCIAS REALIZADAS

A los efectos de lograr los objetivos propuestos elestudio realizado comprendió principalmente tres areasfundamentales de trabajo, a saber:

I Hidrólisis de lactosa en suero de queso y en sistemasmodelo. (punto 4).

1) Suero de quesoSe estudió la influencia de:

la velocidad de agitaciónconcentración de enzimatemperatura y contenido de sólidospH

variabilidad de la materia primapresencia de conservadoresglucosa y galactosaconcentración de cristales de lactosa

sobre la velocidad de hidrólisis enzimática de la lactosa.

2) Sistemas modeloSe estudió la influencia de la temperatura sobre lavelocidad de hidrólisis enzimática de la lactosa en sistemasmodelo con sacarosa ó glicerol.

I Estabilidad microbiológica del suero de queso concentradoy parcialmente hidrolizado durante su procesamiento yalmacenamiento (punto 5).

sé determinaron las condiciones de pH y concentración y tipo

48

de conservador a fin de retardar ó inhibir el crecimiento debacterias, hongos y levaduras durante tres meses dealmacenamiento a 1a temperatura óptima de crecimiento decada microorganismo.

I Estudio de la reología del suero de queso concentrado ydel suero de queso concentrado y parcialmente hidrolizado(punto 6)

Se determinaron las curvas de flujo y de esfuerzo de corteen función del tiempo para suero de queso concentrado ysuero de queso concentrado y parcialmente hidrolizado a 25°Cy 5°c y a pH 6,0 y 5,0.

Dadoque los temas tratados pertenecen a áreas biendiferenciadas, a fin de facilitar la lectura de este trabajode tesis y lograr mayor claridad en la exposición de lostemas tratados, se encara cada uno de ellos comouna unidadindependiente.

49

4. HIDROLISIS DE LACTOSA EN SUERO DE QUESO Y EN SISTEMAS

flgDELO

4.1. Objetivos

Unode los factores de estrés que se utilizarán parapreservar el suero de queso concentrado es la reducción dela actividad de agua. En el método de conservacióndesarrollado por Kanterewicz y col. (1985b), el descenso dela aw se logra por medio del agregado de humectantes(cloruro de sodio). Los humectantes tienen la desventaja,para el caso del suero de queso, de acentuar el saborsalado del mismo, limitándose asi el empleo del mismo enalimentos dulces. Como tratamiento alternativo paradisminuir la aw se propone la hidrólisis de la lactosapresente en el suero de queso concentrado, a fin de aumentar

la molalidad y el poder de reducción de aw de los azúcarespresentes en el medio.

En este capitulo se analizará la influencia de variosparámetros en la cinética de hidrólisis enzimática delactosa en suero de queso concentrado, a fin de determinarcuáles son las condiciones óptimas de trabajo. También serealizará el modeladomatemático para predecir la velocidadde hidrólisis de lactosa en el suero de queso a fin de poderaplicar estos resultados al diseño de un reactor. Tambiénse analizará la variación de 1a actividad de agua del sueroal proceder la hidrólisis de lactosa. Finalmente seestudiará la hidrólisis de lactosa en dos sistemas modelo,uno con sacarosa y otro con glicerol.

50

4.2. Introducción

4.2.1. Reacciones catalizadas enzimáticamente

Las enzimas son catalizadores biológicos que aumentanla velocidad de reacción disminuyendo la energía deactivación necesaria para formar el complejo activado. Estose logra introduciendo dentro del camino de la reacciónnuevos intermediarios, de forma tal que el complejo activadode la reacción catalizada por la enzima posea una energia deactivación menor dentro del camino de la reacción.

El objetivo de las enzimas es proporcionar gruposdentro de su sitio activo que fuerzan al sustrato a unestado de transición de menor energia.

En las reacciones catalizadas varían los pasosintermedios y las energías de activación entre los mismos,pero el cambio total de energia libre (AG) es el mismo quepara la reacción no catalizada, por lo tanto la constante deequilibrio de la reacción (K) no varia (AG=-RTln K; donde Res la constante general de los gases y T la temperaturaabsoluta). La enzima no cambia químicamente luego de lareacción pero si puede sufrir cambios fisicos de forma talque no pueda seguir comportándose comoun catalizador.

Las caracteristicas principales de las enzimas son:1) alta velocidad de reacción, 2) especificidad, 3)formación de cadenas de reacción en caminos metabólicos.Las enzimas son proteinas con una secuencia lineal deaminoácidos (estructura primaria), que se pliega en unaestructura secundaria estabilizada por medio de uniones

51

puente hidrógeno entre el hidrógeno del grupo amida y eloxigeno del carbonilo de la cadena polipeptidica. Porinfluencia de interacciones iónicas e hidrofóbicas entre lascadenas laterales de los residuos de aminoácidos, laestructura polípeptidica presenta másplegamientos, lo queda lugar a la estructura terciaria. Esta última estructuraes la que posibilita la existencia del sitio activo de laenzima. Este se genera por 1a interacción de los gruposfuncionales comocarboxilo, amino, sulfhidrilo, hidroxilo eimidazol. El sitio activo es una estructura altamenteorganizada, estereoespecifica y tridimensional donde se fijael sustrato para que ocurra la reacción (Roberts, 1977).

4.2.2. Mecanismode la reacción enzimática con un únicosustrato

Los primeros estudios de catálisis enzimática datande 1902, cuando Brownpublicó un trabajo sobre hidrólisis desacarosa por acción de la invertasa. Demostró que 1acinética de 1a hidrólisis enzimática era marcadamentediferente a la hidrólisis ácida. Sugirió que un pasoimportante en la reacción catalizada por las enzimas era laformación de un complejo entre la enzima y el sustrato y quecon la ruptura de este complejo se obtenía el producto.Encontró que 1a velocidad aumentaba con concentracionesbajas y medias de sustrato pero que con altasconcentraciones la velocidad permanecía constante. Propusoel siguiente mecanismo:

52

k

enzima (E) + sustrato (S) 4 complejo enzima-sustrato(ES)—1

k2-——-—»enzima (E) + producto (P) (4.1)

Este mecanismoconsiste en tres reacciones elementales. Laenzima (E) y el sustrato (S) se combinan para dar elcomplejo enzima-sustrato (ES), que a su vez se descomponepara dar enzima + sustrato (E + S) (reacción inversa) óenzima + producto (E + P). Hichaelis yHenten en 1903 desarrollaron las ecuaciones que representanel mecanismo4.1, para lo cual consideraron la situación en

que k2 es mucho menor que k_1 Esto implica que 1aformación del complejo ES se acerca al equilibriotermodinámico. La ecuación propuesta por Michaelis y MentenBS

V =_V_-L5_J_ (4.2)Ks + [S]

donde v : velocidad inicial de la reacción (mmoles/ l.s).[S]: concentración de sustrato (mmoles/l).Ks: constante de disociación del complejo ES,

Ks = kl/ k_1 (mmoles/l).V : velocidad máxima o de saturación, V = k2.Eo (mmoles/

l.s), donde k2 es la constante de reacción parala descomposición del complejo ES en (enzima +producto) y Eo la concentración inicial de enzima.

Posteriormente, en 1925, Briggs y Haldane criticaronla hipótesis de equilibrio entre los reactivos y el complejo

53

ES e introdujeron el concepto de estado estacionario. A1mezclar la enzima con el sustrato comienza a formarsecomplejo ES y luego de una fase transiente la concentraciónde complejo ES llega a un nivel estacionario. Luego laconcentración de ES decaerá según disminuya la concentraciónde sustrato. Si la concentración de sustrato es muchomayorque la concentración inicial de enzima. 1a concentración deES disminuirá muy lentamente y se puede decir quepermanecerá constante a lo largo del tiempo (d[ES]/dt = 0)(Roberts, 1977; Dixon y Hebb, 1964). En base a estassuposiciones llegaron a la expresión

v:.—v_'_[_s]—Km + [S]

k_1 + k2donde Km= constante de Michaelis y Menten Km =(mmoles/l) k1

La expresión. de Briggs y Haldane es general .para elmecanismode reacción propuesto. mientras que la Michaelis y

Menten es un caso limite en donde k_1 >> k2. La teoría delestado estacionario ha sido ampliamente utilizada paraanalizar cinéticas de reacciones que ocurren con diferentesmecanismos. En cuanto a su validez, Hong (1975) ha señaladoque plantear d(ES)/dt = 0 no es correcto, ya que para llegara la expresión de Briggs y Haldane basta con asegurar qued[ES]/dt es pequeña, es decir que la concentración delcomplejo ES varia poco en el transcurso de la reacción.

La ecuación 4.3 describe una hipérbola rectangularcon asintotas en [S] = -Km y y = V. Para cinéticaenzimática solamente interesa la sección de la hipérbola que

54

corresponde a valores positivos de [S]. A altasconcentraciones de sustrato v = V y la velocidad esconstante e independiente de 1a [S] (cinética de ordencero). A bajas [S], ([S] << Km), la velocidad es v =V.[S]/Km (cinética de orden uno) y para concentraciones desustrato intermedias el orden de la reacción está entre unoy cero.

Kmy V definen la forma de la hipérbola y son dosparámetros importantes para describir las reaccionescatalizadas por enzimas. Kmes indicativo de la afinidaddel sitio activo por el sustrato: a menor Kmmayor afinidad.Kmdepende del pH, la temperatura, el sustrato, el bufferutilizado, la composición del medio, etc.. Con respecto ala velocidad máxima. V = k2.[Eo], k2 representa la eficaciade la enzima para dar producto, ya que es 1a constante develocidad para la descomposición del complejo ES para darenzima libre y producto. Entonces V indica la cantidad deenzima presente y cuán rápido ésta cataliza la reacción(Bergmeyer, 1983). Sin embargo se debe tener en cuenta quepara reacciones que involucran varios intermediarios 6 uno omás inhibidores (los productos de la reacción pueden actuarcomoinhibidores), no es sencillo establecer cuál es elsentido fisico de las constantes Kmy V pues involucran avarias constantes de reacción.’ Esto sólo es posible en elcaso en que algún término predomine sobre los demás, i. e.cuando una constante es mucho mayor o menor que otras. Deesta forma es posible simplificar las expresiones de Kmy Vy analizar qué pasos de la reacción influyen en ellas. Paralos casos de reacciones complejas, Kmno está directamenterelacionado con la afinidad de la enzima por el sustrato.Sin embargo operacionalmente, es decir con fines de cálculosolamente, se define Kmcomo la concentración de sustrato

55

tal que la velocidad sea V/2. Ks, la constante dedisociación del complejo ES, es la que mide la afinidad dela enzima por su sustrato (Roberts, 1977).

4.2.3. Determinación de las constantes cinéticas de lareacción

Existen, básicamente, dos métodos para el cálculo delas constantes Km y V: el método de las velocidadesiniciales y el métodointegral.

I Métodode las velocidades iniciales

El métodode las velocidades iniciales es la formatradicional de analizar los datos cinéticos de reaccionesenzimáticas. Se trabaja con diferentes concentraciones desustrato y se calcula la velocidad inicial a partir de lascurvas de formación de producto versus tiempo para cadacaso. Luegod por medio de las ecuaciones de velocidadlinealizadas ó por regresión no lineal de 1a ecuación 4.3 secalculan las constantes de velocidad de la reacción. E1análisis de las velocidades iniciales de reacción tiene laventaja que las concentraciones de sustrato y de otrosligandos están precisamente definidas y que no existeinhibición por productos, lo cual disminuye las fuentesposibles de error. Para estimar 1a velocidad inicial de lareacción se pueden utilizar métodos visuales ócomputacionales. Para curvas de progresión regulares ambosmétodos dan resultados similares. Una vez estimadas lasvelocidades iniciales para una serie de mezclas de reacciónque contengan diferentes concentraciones de sustrato, sepuede representar gráficamente esta velocidad inicial enfunción de la concentración de sustrato, obteniéndose la

56

hipérbola descripta por la ecuación 4.3. Comoa partir dela hipérbola es difícil decidir cuál es el valor exacto de1a velocidad máxima, tampoco se puede calcular Km. Es poresto que se utilizan ecuaciones linealizadas de lahipérbola, como la de Lineweaver y Burk (1934), 1a de Eadiey Hofstee (1942), la de Hanes (1932) y la de Hoolf (1932)(tabla 4.1). A partir de la pendiente y ordenada de cadaexpresión lineal es posible obtener Km y V.Estadisticamente el método más confiable es utilizar unprogramade regresión no lineal para ajustar los datosdirectamente a 1a ecuación 4.3 y calcular Km y V por unprograma iterativo

Las ventajas de esta forma de evaluar los datosexperimentales son las siguientes:

I Se evita tener que considerar que las condiciones de1a reacción cambien a lo largo de la misma y se evita elproblema de una posible inactivación de la enzima por acciónde las condiciones del medio o por la formación desustancias inhibidoras durante el transcurso de la reacción(Philo y Selwyn, 1973).

I Las ecuaciones de velocidad son sencillas y fáciles deutilizar.

A su vez, presenta las siguientes desventajas:

I No se aprovecha toda la información que ofrece la curvade avance de la reacción.

I Salvo que inicialmente haya una porción lineal de la curvaproducto versus tiempo, es difícil obtener una medición

57

TABLA 4.1

Linealizaciones de la ecuación de Híchaelis y Henten.

AUTOR ECUACION

Lineweaver y Burk, —¿—: Km .1.(1934) v V [s] v

Hanes, (1932) fiL Km + [S]V V

Eadie y Hofstee, V v _ Km(1952) [S] Km v

Woolf, (1932) v = Km

58

objetiva y exacta de la pendiente al origen de la curva(Halwachs, 1970; Hsu y Tsao, 1979).

I Cuando uno de los productos de la reacción inhibefuertemente a la enzima, la velocidad decrece rápidamente,por lo cual una estimación visual de la velocidad inicial esmuy poco aconsejable (Philo y Selwyn, 1973; Cornish-Bowden,1975).

I Debe realizarse un mayor número de experiencias quecuando se trabaja con ecuaciones integradas.

El método de las velocidades iniciales es el másampliamente utilizado a1 trabajar con enzimas en sistemasmodelo en los que se puede variar la composición de losmismos.

I ggggg_ integral

Comola velocidad de reacción y la concentración desustrato verían continuamente a lo largo de la reacción, unacurva de variación de concentración de sustrato 6 productoen función del tiempo da lugar a suficientes puntos develocidad de reacción y concentración como para que seaposible determinar Kmy V. Esto puede realizarse integrandola ecuación 4.3, resultando la siguiente expresión:

t=—1—-([So]-[S])-K—mlnLS—ol (4.4)v v s

donde [So] es la concentración inicial de sustrato y [S] laconcentración de sustrato al tiempo t. La expresión

59

linealizada de esta ecuación integrada es:

LÉ21_;_LÉ1 = V _ Km.1. ln Légl (4.5)t t [S]

Graficando ([So]-[S])/t en función de 1/t.ln([So]/[S]) puedecalcularse de la ordenada al origen y de la pendiente V y Kmrespectivamente. Este mecanismo es válido cuando lareacción es irreversible y el producto de la reacción no esinhibidor de la enzima. Para el caso en que haya inhibiciónpor productos (sección 4.2.4) o reacciones reversibles,donde la ecuación 4.3 ya no se puede utilizar tal cual, sepueden deducir las ecuaciones cinéticas que contemplen estascondiciones, integrarlas y linealizarlas, lo mismo quecuando la enzima sufre inactivación de acuerdo a unacinética de primer orden.

Las ventajas del empleo del método de las ecuacionesintegradas son:

l Se necesita menor númerode experiencias a fin de calcularlas constantes cinéticas, ya que cada curva de avance de lareacción contiene toda la información necesaria (Canela yFranco, 1986).

I Es un método adecuado para el análisis de reacciones dondela enzima es fuertemente inhibida por algún producto.

I No hay necesidad de diferenciar los datos (i. e. medirvelocidades).

I Cuando se desea estudiar 1a inhibición por productos no es

necesario agregar dicha sustancia al medio de reacción, puesse genera "in situ". Esto es muy conveniente cuando losproductos son inestables o difíciles de preparar o purificar(Duggleby y Morrison, 1977).

A su vez el empleo de ecuaciones integradas presenta algunasdesventajas:

I La mayor limitación para el uso de ecuaciones integradases cuando 1a enzima, el sustrato o los productos no sonestables en las condiciones de trabajo.

I Es un método de análisis poco empleado pese a que suteoría se encuentra bien desarrollada. Una explicación aeste hecho es que errores sistemáticos pequeños puedenllevar a grandes desviaciones de los valores de lasconstantes Kmy V (Cornish-Bowden, 1975). Además muchosinvestigadores se resisten a emplear el método integral parano apartarse de un método ya probado y conocido como el delas velocidades iniciales.

I Un error en 1a determinación de 1a concentración inicialdel sustrato afecta los valores a lo largo de toda la curva,requiriendose para evitar este problema técnicascomputacionales y matemátidas más complejas que lasempleadas por el método de las velocidades iniciales (Canelay Franco, 1986).

I No se pueden utilizar cuando hay un cambio en el mecanismode 1a reacción o cambios en las condiciones experimentales alo largo del tiempo (por ejemplo, cambios de pH).

El uso de las ecuaciones integradas no sólo se limita

al cálculo o estimación de las constantes cinéticas Kmy V,sino que puede calcularse a partir de ellas la Velocidadinicial. Efectivamente, algunos autores sostienen que lavelocidad inicial estimada a partir de las curvas de avancede la reacción tienen menor error que cuando se calcula apartir de la pendiente al origen de los datos de productoversus tiempo (método de las velocidades iniciales)(Duggleby, 1985; Boeker, 1982; Cornish-Bowden, 1975).

4.2.4. Inhibición enzimática

Las enzimas pueden ser inhibidas por productos,sustratos o alguna sustancia en particular (molécula deestructura quimica similar al sustrato, iones, etc.). Lainhibición puede ser reversible (existe un equilibrio entreenzima e inhibidor que puede desplazarse hacia 1a enzimaeliminando al inhibidor del medio) o irreversible (se pierdela actividad enzimática definitivamente, aún a bajasconcentraciones del inhibidor). La inhibición irreversiblese cuantifica en términos de velocidad de inhibiciónmientras que la inhibición reversible se expresa por mediode una constante de inhibición Ki.

La inhibición reversible puede ser competitiva, nocompetitiva y acompetitiva. Se analizan a continuación cadauno de estos casos. Se considera que el inhibidor esagregado al medio de 1a reacción (su concentración permanececonstante a lo largo de la reacción), es decir que no es unproducto.

62

I Inhibición competitiva:

En la inhibición competitiva lineal el sustrato y elinhibidor compiten por el mismositio de unión a la enzima.Generalmente la estructura quimica del inhibidor essemejante a la del sustrato y no puede unirse a moléculas deenzima cuyo sitio activo ya está ocupado por el sustrato.Las siguientes ecuaciones describen el mecanismo (Roberts,1977):

k. 1 k

‘1 (4.6)

I + E ———> EI Ki = —k:g-3

donde I es el inhibidor y Ki la constante de inhibición. Laexpresión para 1a velocidad de reacción es:

V [S]v = ' (4.7)_[I_]_

Km [ 1 + Ki ]+ [S]

donde [I] es la concentración de inhibidor presente. Elefecto del inhibidor competitivo es producir un incrementoaparente en el valor de Km en un factor (1+[I]/Ki), queaumenta a mayor concentración de inhibidor.

Por integración de esta ecuación se obtiene lasiguiente expresión:

t:_1_( [SOJ-[S])+ Km[1+E]1n@] (4.7b)-v v Ki [S]

63

I Inhibición no competitiva:

En este caso el inhibidor se une, no en el sitioactivo donde se une el sustrato, sino en otra región de laenzima. Entonces el inhibidor puede unirse a la enzimalibre o al complejo ES. El esquema que representa almecanismoes el siguiente (Roberts, 1977):

k1 k

E + s Zïíïli ES ———ÉL»E + p (4.8)-1

I k-5ïlk5k-sïlka kEI ———í—+ ESI

k-4

Para el caso en que el complejo ESI no pueda dar producto,la velocidad de la reacción se puede expresar como:

V . [S] (4.9)I

'[ 1 + LÏ% ].( Km+ [S] )

En este caso la presencia del inhibidor afecta 1a velocidadmáxima. A1 integrar esta expresión se obtiene:

ln (4.9b)t = —¿— [ 1 + Lil ] ( [So] - TSJ) +V i [S]

Km [SO]

K V

I Inhibición acompetitiva:

El inhibidor sólo es capaz de combinarse con elcomplejo ES, es decir que hasta que el sustrato no se unióal’sitio activo no hay efecto alguno del inhibidor

64

k1 k2E + s ; ES :E + P (4.10)-1

ES+ I iw551i_____k-3

La ecuación de velocidad toma la siguiente forma (Roberts,1977):

V . [S]

[ JKm+[S][l+%] (4'11)

En este caso tanto Kmcomo V disminuyen en un factor (l +[IJ/Ki). A1 integrar esta ecuación se obtiene:

t=¿[1+%]([801—[51)+ K: [1+LI_3]1nMV Ki [S]

(4.11b)

Las expresiones linealizadas de las ecuacionesintegradas correspondientes a cada tipo de inhibición(ecuaciones 4.7b, 4.9b y 4.11b) se describen a continuación:

Inhibición'competitiva

[So] - [s] z v _ Km[1 + ill ] _l_ ln [5°] (4.12)t Ki t [S]

Inhibición no competitiva

65

[so] - [S] = v _ 5L n [an1 (4.13)t Lg; t [SJ

[ 1 + Ki ]

Inhibición acompetitiva

[So] — [S] = V _ Km _l_ ln [Sol (4.14)t Lu El t [S]

[1 + Ki ] [1 + Ki ]

donde [So] es la concentración inicial de sustrato y [S] laconcentración de sustrato al tiempo t. Graficando en cadacaso ([So] - [S])/t en función de l/t ln ([So]/[S]) para unaserie de concentraciones de inhibidor se obtiene una familiade rectas de las cuales se puede obtener Km, V y Ki.

Es muy común el caso de inhibición de la enzima poruno o más productos de la reacción. Por ejemplo, lasreacciones hidroliticas son en realidad reacciones con dossustratos donde el agua es la segunda molécula quereacciona. Pero la concentración de agua , por lo general,es lo suficientemente alta como para que la reacción dehidrólisis sea considerada virtualmente irreversible. Estono impide que los productos de la reacción se unan a laenzima para dar complejos ensima-producto (EP), pero sievita que que el complejo EP reacciona en sentido inverso(hacia reactivos para dar E + S). Para este tipo de sistemasla ecuación de velocidad para el caso de inhibicióncompetitiva puede escribirse como(Roberts, 1977)

d[S] = vdt l (4.15)

Km [1 + %%l] + [S]

66

donde [P] es la concentración de producto. [P]=[So] - [S] yKi la constante de inhibición. Integrando y luegolinealizando esta ecuación se llega a:

[So] - [S] = V . Ki _ Km (Ki + |80|) _¿_ ln [So]t (Ki - Km) (Ki - Km ) t [S]

(4.16)

Esta es 1a expresión de una recta, a partir de la cual sepueden calcular V, Km y Ki. si se tienen experienciasrealizadas a diferentes concentraciones de sustrato.

Una reacción enzimática puede ser inhibida por más deun producto. Uno de los casos posibles es cuando elproducto P1 inhibe en forma competitiva y el producto P2 10hace en forma no competitiva. El esquema que representaeste tipo de reacción es el siguiente (Segel, 1975):

1291

Pl+ K k2E+S——'.">ES——>E+P1+P2+ +

P2 P2 (4.17)

H K 1|12EPZ ———» ESPZ

donde:P1: producto que inhibe en forma competitiva

67

P2: producto que inhibe en forma no competitivaKil : constante de inhibición competitivaKi2: constante de inhibición no competitiva;

La ecuación diferencial que describe esta reacción es:

(4.18)d[S] V . [S]dt P2

Km[1+ Ki2+ Ki2]+[S] [1+——Kiz]

e integrando se llega a:

t:{1+Íïl—¿9<}¿([301—[31)+{@—( 1+[So]9<)}'Ki2 Km v v

ln M- —1— ([5012- [512) (4.19)[S] 2 Ki2 V

donde K = 1 + 1Kil KiZ

En la integración de esta ecuación se supone que laconcentración de P1 es igual a la de P2 (Segel, 1975). Paradeterminar todas las constantes cinéticas utilizando estaecuación se debe emplear un método de regresión no linealpara experiencias realizadas con diferentes concentracionesde sustrato.

ms

4.2.5. Influencia del pHsobre las reacciones enzimáticas

Todas las enzimas poseen un valor óptimo de pH parasu actividad y este rango es a menudo muy estrecho. El pHóptimo no solo depende de la naturaleza y fuerza iónica delsistema buffer, sino que también varia con la temperatura yla concentración de sustrato. Describir completamente loscambios que ocurren en las enzimas debido a cambios de pH esmuy complejo. Las enzimas contienen grupos ionizables(residuos de lisina, arginina, ácido aspártico) que puedenparticipar en la fijación del sustrato durante el procesocatalitico y también tener influencia sobre el plegamiento yconfiguración de la enzima. Cambios de pH pueden afectartanto 1a estructura como la actividad del sitio activomodificando la reacción enzimática. Dadoque las reaccionesenzimáticas poseen un pH óptimo las curvas de actividad enfunción del pH son de forma acampanada.

Las enzimas presentan dos comportamientos conrespecto al pH, el reversible y el irreversible. Si el pHdel medio es extremo hay pérdida irreversible de laactividad ya que se produce desnaturalización proteica. Loscambios reversibles solamente se dan en un rango estrecho depH donde la actividad de la enzima varia al variar el pH.Laidler (1954) propone un mecanismo muy sencillo paraexplicar en forma cualitativa estos cambios de actividadreversibles. Para esto considera que la proteina tienegrupos -CO0Hy —NH2que se ionizan respectivamente a -COO_ y—NH3+.Si, por ejemplo, el sitio activo de la enzimanecesita grupos ionizados para funcionar correctamente,ambos permaneciendo juntos debido a sus cargas opuestas, sepu-ede representar como

HH

C 0 0

A1 agregar ácido o base se pasa por los siguientesequilibrios:

+NH2..COO-—»NHa+..COO_——>NH3 ..CO0Hinactivo activo inactivo

Esta es una explicación sencilla de cómoafecta el pH a lasenzimas.

Los grupos ionizables pueden estar en ambientes dediferente polaridad de la enzima, por lo cual el pKa dedeterminado grupo dependerá de la región en que seencuentre. Esto hace que el pKa de dicho grupo seadiferente del que posee en el aminoácido o en un péptido ensolución. Por lo tanto, para poder asignar valores de pKa aun grupo de una enzima, hace falta realizar previamentevarios ensayos, lo cual dificulta el estudio riguroso de lainfluencia del pH. El pH , al afectar la estructura de 1aenzima afecta los valores de Km y V, que deberándeterminarse en cada caso.

Un cambio de pH puede producir cambios en laionización de (Roberts, 1977; Dixon y Webb, 1964; Laidler yBunting, 1873):

I Grupos involucrados en la catálisis, con lo cual se puedeinhibir por completo la actividad enzimática.

I Grupos que ayudan a la unión del.sustrato, lo que puededisminuir la afinidad de la enzima por sus sustratos.

70

I Gruposdentro del sustrato, lo cual también afectará laafinidad de la enzima por el sustrato.

I Otros grupos dentro de la enzima que pueden ocasionarcambios mas o menos grandes en la estructura tridimensionalde la enzima, lo que podría alterar la estructura del sitioactivo.

4.2.6. Influencia de la temperatura en la velocidad dereacción

El efecto de la temperatura sobre la velocidad de lasreacciones enzimáticas es de sumo interés e importancia.Este efecto puede ser debido a varias causas: 1) un efectosobre 1a estabilidad de la enzima, 2) un efecto sobre la

velocidad de ruptura del complejo ES (i.e. sobre k2), 3) unefecto sobre la afinidad de 1a enzima por su sustrato (i.e.sobre k1 ó kdl), 4) a una alteración de los pKa, 5) a unefecto sobre la afinidad de la enzima por sus activadores óinhibidores, 6) también puede ser un efecto sobre lasolubilidad de soluto/s y 7) por cambios en el pH de unbuffer. Todo ello sugiere que los efectos de la temperaturapueden ser extremadamente complejos; sin embargo es posibleeliminar o cuantificar muchosde los efectos anteriormentecitados (Dixon y Webb, 1984).

Si se grafican una serie de curvas de conversión desustrato versus tiempo a diferentes temperaturas, se obtienela figura 4.1. En ella puede observarse que, pese a que amayor temperatura la velocidad inicial es mayor (porejemplo, para un dado tiempo tl)L para tiempos mayores la

71

/50c/60°C/70°C

Zo9/aoc

U3DiLL]É

o80°C

L)ER

t1TIEMPOtz

Figura4.1:

Efectode1atemperaturaen1arelaciónconversión-tiempoparauna

reacciónenzimáticadetemperaturaóptimade50°C.

conversión no es mayor a 1a temperatura más alta. Latemperatura óptima está determinada por un balance entre elefecto de la temperatura sobre 1a velocidad de reacción y suefecto sobre la inactivación térmica de la enzima (Dixon yHebb, 1964). Esta temperatura óptima dependerá, para unadada enzima, de la concentración de enzima y de sustrato yde otros factores comoel pH. fuerza iónica, etc.. (Laidlery Bunting, 1973). En el rango bajo de temperatura (30 °Cpara una enzima tipica), la inactivación enzimática es muylenta y la velocidad global de la reacción aumenta con latemperatura comolo haría cualquier reacción quimica. Amayor temperatura, la inactivación térmica se hace cada vezmás importante, de forma tal que la concentración de enzimaactiva disminuye a lo largo del tiempo de reacción. Lasenergias de activación para la reacción de inactivacióntérmica son mayores que las de la reacción catalitica; porlo tanto, a mayor temperatura la velocidad de inactivaciónaumentará más que la velocidad de reacción catalitica.

La inactivación térmica de las enzimas generalmentees debida a'la desnaturalización de la proteina y la energíade activación para la desnaturalización es alta. Estevalor se debe principalmente a una entropía de activaciónexcepcionalmente elevada y positiva, lo cual ha llevado ainterpretar que en la desnaturalización de una proteina serompen gran número de uniones débiles (puente hidrógeno),produciéndose entonces una .apertura de la molécula pordesdoblamiento. La inactivación de las enzimas dependemucho del pH, habiendo por lo general una zona de máximaestabilidad, que no es necesariamente cercana al pHisoeléctrico, y luego la velocidad de inactivación portemperatura aumenta hacia las zonas ácida y alcalina.'Fuerza iónica, concentración de proteína, presencia de

inhibidores y acción protectora de los sustratos tieneninfluencia sobre la velocidad de inactivación térmica. Laconcentración de agua también influye y las enzimas a bajaactividad de agua son más termoestables (DiXon y Webb,1964).

Con respecto a la influencia de 1a temperatura sobrela reacción enzimática en si, se debe considerar que estaúltima consta de varios pasos y que el efecto de latemperatura sobre todo el proceso será la resultante de losefectos sobre cada etapa. Para un análisis adecuado serequiere, idealmente, medir el valor absoluto de cada una delas constantes de reacción que intervienen en el procesopara diferentes temperaturas. Se ha verificado que la leyde Arrehnius se obedece en forma satisfactoria para grannúmero de enzimas, siempre que se consideren las constantesde reacción individuales. Solamente se cumple la ley deArrehnius sobre la velocidad global de la reacción cuandouna de las constantes individuales predomina sobre lasdemás de forma tal que se simplifique 1a expresión de laconstante global ó bien cuando la constante de reacción

global es, por ejemplo, K=k2.k1/k_1. Para este caso

y por lo tanto se cumple la ley de Arrehnius pero la energíade activación no corresponde a un paso elemental dereacción, sino que es la suma correspondiente a dos pasos dereacción. Para el caso en que la expresión de la constanteglobal sea más compleja, ya no será posible realizar estetipo de análisis requiriéndose la determinación de las

constantes individuales (Laidler y Bunting, 1973).

4.2.7. Termoestabilidad de las enzimas

La termoestabilidad de las enzimas , es decir sucapacidad de conservar su actividad a temperaturasrelativamente altas o por periodos prolongados (Hasserman,1984), es importante en dos sentidos. Primero, al aumentarla temperatura aumentan las velocidades de reacción y sepueden utilizar menores concentraciones de enzima o tiemposde reacción mas cortos para lograr la misma conversión.Segundo, temperaturas mayores pueden llegar a inhibir elcrecimiento de microorganismos mesófilos. El deterioromicrobiano constituye un problema, sobre todo cuando setrabaja con enzimas inmovilizadas.

Todas las enzimas conocidas se desdoblan al serexpuestas al calor, perdiendo por lo tanto su actividadbiológica.

La actividad enzimática está principalmentedeterminada por las fuerzas no covalentes que dan a lasproteínas su conformación secundaria y terciaria (uniónpuente hidrógeno, unión electrostática e interaccioneshidrofóbicas; aparentemente las uniones por puentedisulfuro no contribuyen en forma significativa (Singleton yAmelunxen, 1973)). Estas uniones no covalentes dependendirectamente de la estructura primaria de las proteinas:pegueños cambios en esta estructura pueden dar origen agrandes cambios conformacionales) dando lugar así a

diferentes resistencias a la temperatura según cual sea lafuente de la enzima (Perutz, 1978).

Otro factor importante que determina latermoestabilidad es la hidrofobicidad (Argos y col, 1979;Merkler y col. 1981). Los residuos hidrofóbicos formanzonas internas dentro de la molécula que impiden la entradade agua , favoreciéndose así la conservación de laestructura. Otros factores que también influyen en latemoestabilidad son: la unión de metales y la unión desustrato.

No existe un método simple que prediga si una enzimaserá termoestable; para cada forma enzimática deberádeterminarse el perfil de temperaturas en formaexperimental. Sin embargo se sabe que, por lo general,estas enzimas se obtendrán a partir de microorganismostermofilicos. También existen microorganismos que producenenzimas que son estables a temperaturas mayores que la decrecimiento del microorganismo. Por ejemplo Aspergillusniger crece a 30-40°C y muchas de sus enzimas extracelularesson estables a 55-80°C (Hasserman, 1984).

Con respecto a las lactasas comerciales, éstaspueden provenir de hongos o de levaduras. Las que provienende hongos tienen mayor estabilidad térmica que las delevaduras. Pero las lactasas de hongos no pueden serusadas al pH de la leche o del suero dulce (6.5), ya que suóptimo de pH se encuentra alrededor de 4,0-4,5.

4.2.8. Efecto de la composición del solvente

76

Una forma de modificar la composición del solvente espor agregado de electrolitos, es decir variando 1a fuerzaiónica. Los cambios en 1a concentración de electrolitospueden producir modificaciones en la estructura de laenzima, comoser agregación o separación de subunidades, quealteran la actividad enzimática. Los electrolitos puedentambién producir efectos iónicos especiales que activan oinhiben la actividad enzimática y por lo tanto una variaciónen la fuerza iónica puede afectar la velocidad de lareacción.

Tambiénpuede variarse la composición del solventepor agregado de solventes orgánicos a la mezcla de reacción.Como resultado de ello pueden producirse cambiosestructurales, reversibles o irreversibles; también algunasenzimas funcionan a concentraciones tan elevadas de solventeorgánico que si el agua participa comouno de los sustratos1a velocidad de reacción puede alterarse debido a ladisminución de su concentración. El Kmde la reacción puedeaumentar entre 1000 y 5000 veces en determinados casos alagregar un solvente al medio de reacción. Esta menorafinidad puede explicarse considerando que si el sustrato yla enzima poseen la misma carga neta al pH de la reacción,al disminuir la constante dieléctrica aumenta la repulsiónentre ambasespecies y 1a capacidad de fijación del sustratopuede disminuir si el sitio activo sufre solvatación con elsolvente agregado (Gutfreund, 1988).

4.2.9. Hidrólisis de lactosa

La lactosa es hidrolizada por la enzima lactasa,

llamada también fi-galactosidasa ó fi-D-galactósido-galactohidrolasa, a glucosa y galactosa. Hallenfels (1960) yShukla (1975) presentaron al mecanismo de la reacción comose describe en la Fig 4.2. Más esquemáticamente elmecanismo puede representarse como

1) Lactosa + fi - galactosidasa

l

complejo [ fi —galactosidasa + galactosa] + glucosa

2) complejo [ fi —galactosidasa + galactosa] + ROH

1

R0 - galactosa + fi —galactosidasa

En el caso que ROH represente una molécula de agua, elproducto de la reacción será galactosa. Si ROH representaotro azúcar se formarán oligosacáridos por medio de lareacción llamada de transgalactosidación. La cantidad deoligosacáridos formada depende del origen y naturaleza de 1aenzima, de la concentración del sustrato y de lascondiciones y tiempo de hidrólisis (Richmondy 001., 1981).Un tiempo de hidrólisis prolongado hará que losoligosacáridos formados vuelvan a desdoblarse (Roberts yPettinari, 1957).

La galactosa está más involucrada que la glucosa en1a formación de oligosacáridos. Utilizando lactasas

Figura4.2: Mecanismodelahidrólisisdelactosaporaccióndelafi-galactosidasa.

7B

79

solubles se pueden formar entre 5 y 13 Z en peso deoligosacáridos respecto del total de lactosa presente(Burvall y col., 1979). Para el caso de la lactasa MaxilactLX 5000, la enzima empleada en este trabajo. la formación deoligosacáridos aumenta con la concentración de lactosa.Esta enzima posee una alta especificidad para la formaciónde enlaces glicosidicos fi (1-8). Estos oligosacáridosfueron todos caracterizados por Asp y col. (1980) y poseenestructuras lineales con 1 ó 2 residuos galactosil unidospor unión fi (1-6) a glucosa, galactosa o lactosa.

Estudios realizados en suero de queso (7 Z p/p desólidos totales) y en soluciones de lactosa indican que losfactores que más influyen sobre la actividad de la enzimaMaxilact LX 5000 son el pH, la temperatura y 1a presencia deiones (Dalquist y col, 1977; Boletines Técnicos deGist-Brocades nv). El efecto del pH y la temperatura sediscutirá mas adelante. Con respecto a la influencia de losiones se sabe que los metales pesados como el zinc y el

4 H)‘ ejercencobre (ambos en concentración mayor que 5 10­un efecto fuertemente inhibidor sobre 1a enzima. El calcioiónico en concentraciones mayores que 10-4 M inhibe a laenzima. El ión sodio es otro catión que inhibe a la enzimaaunque en menor medida que el calcio. Por el contrario laactividad de la lactasa y' también su estabilidad esaumentada por iones magnesio y manganeso en concentraciones

-1—2

de 10-4 M y por el ión potasio en concentraciones de 10M. Asimismo, el ión fosfato en concentración de hasta 10Minfluencia positivamente la estabilidad pues liga calcio.

_1 M) tiene un efecto negativo sobreUn exceso de fosfato (10la actividad de la enzima ya que ésta desciende notablemente(Hahoney y Adamchuk, 1980; Guy y Bingham, 1978; Agbebavi y001., 1987; Dalqvist y 001., 1977).

80

La cinética de hidrólisis de lactosa ha sidodescripta en bibliografia utilizando diversos modelos, quese resumen en la Tabla 4.2.

Weetall y col. (1974) trabajaron con una enzimaproveniente de una levadura y otra de un hongo (en eltrabajo no se especifica el origen de las enzimasutilizadas) en sistemas de buffer fosfato y lactosa. Paradeterminar las constantes oinéticas Km y V utilizaron elmétodode las velocidades iniciales (conversión del sustratomenor al 5%) y el gráfico de Lineweaver y Burk. Paradeterminar la constante de inhibición de la galactosa, Kil,agregaron determinada concentración de galactosa a la mezclade reacción. Establecieron que la enzima proveniente de lalevadura es inhibida por la galactosa. Para describir elcomportamiento de un reactor de hidrólisis de lactosa de unultrafiltrado de suero de queso (15 Z p/p de sólidos)utilizaron 1a ecuación integrada de Michaelis y Menten coninhibición competitiva con los valores de Km, V y Kilobtenidos por el método de las velocidades iniciales.Asimismo, aclararon que el hecho de que los datosexperimentales pudieran ser representados por determinadomodelo no prueba la validez de dicho modelo, sino que éstese utilizó para describir matemáticamente1a reacción.

Hourigan (1977) estudió el desempeño de las lactasasde Saccharomyces lactis y Aspergillus niger en lechedescremadareconstituida con concentraciones iniciales delactosa entre 20 y 115 mH. Encontró que la reacción obedecea la ecuación integrada de Michaelis y Menten con inhibicióncompetitiva por galactosa. Para calcular Kmtrabajó con lasporciones iniciales de las curvas de concentración de

81

TABLA 4.2

Cinética de hidrólisis enzimatica de lactosa, reportada enbibliografia, en sistemas modelo, leche y suero de queso.

LACTASA MODELOSUSTRATO AUTOR(ORIGEN) CINETICO

Levadura Lactosa en Velocidades iniciales Heetall yy hongo buffer fosfato Inhibición competitiva col. (1974)

por galactosa

S. lactis leche descrema- Ecuación integrada HouríganA. niger da reconstitui- Inhibición competitiva (1977)

da por galactosa.

A. oryzae lactosa en Velocidades iniciales Friend yinmovili- buffer fosfato Inhibición competitiva Shahanizada por galactosa (1982)

A. niger lactosa en Ecuación integrada Ma'y col.buffer Inhibición competitiva (1983)

por galactosa

A. oryzae Soluciones de Ecuación integrada. vanlactosa, suero Inhibición competitiva Griethuysenreconstituido y por galactosa y col. (1985)permeatos

A. oryzae Soluciones de Ecuación integrada. vanlactosa con Inhibición competitiva Griethuysenagregado de por galactosa y col. (1988)sales

UZ

(continuación de la Tabla 4.2)

Células deK. bulga­ricus.

S. lactísA. niger

Novozym 231inmovili­zada

Maxilactinmobili­zada y so­luble

A. oryzae

A. niger

E. coli

Soluciones delactosa y ONPGsuero de queso

Lactosa enbuffer

Soluciones delactosa, per­meato

Soluciones deONPG

Soluciones delactosa u ONPG

suero de quesoácido concen­trado a varios%sólidos.

Soluciones deONPG

Velocidades iniciales.No considera inhibi­ción

Velocidades iniciales.No considera inhibi­ción

Velocidades inicialesNo considera inhibi­ción

Velocidades inicialesInhibición competitivapor galactosa.

Velocidades inicialesInhibición competitivapor galactosa

Velocidades iniciales.No considera inhibi­ción

Velocidades iniciales.Inhibición competitivapor galactosa. Sacarosay glucosa'son inhibido­res no competitivos.

Decleire ycol. (1985)

Peter y col.(1981)

Agbebavi ycol. (1987)

Kowhley yCheryan(1981)

Park y col.(1979)

Wierzwicki yKosikowski(1972)

Kuby yLardy(1953)

83

(continuación de 1a Tabla 4.2)

A. niger Soluciones delactosa

Células de Soluciones deK. ftagilis lactosa

Inhibición competitivapor galactosa

Inhibición competitivapor galactosa y no com­petitiva por glucosa

Flaschel ycol. (1982)

Cheng y col.(1985)

84

lactosa en función del tiempo obtenidas para diferentesconcentraciones iniciales de lactosa. Estas curvas seajustaron a ecuaciones cuadráticas que, diferenciadas,dieron una estimación de las velocidades iniciales de lahidrólisis en presencia de inhibición severa por unproducto. A partir de estas velocidades iniciales calculóKm con las ecuaciones de Eadie y Hofstee (1942) (para S.lactis Km = 63,7 mMy Kil = 8,55 mM).

Friend y Shahani (1982) utilizaron la enzima deAspergillus oryzae inmovilizada sobre sefarosa en un mediode lactosa 5 X p/p en buffer acetato (pH = 4,5) o fosfato(pH = 6,5). Para estudiar la cinética de la reacción dehidrólisis utilizaron velocidades iniciales obtenidas apartir de experiencias realizadas con concentraciones delactosa entre 10 y 100 mM. Calcularon Kmpor el método deWilkinson (1961). Para determinar el efecto inhibidor de lagalactosa (Kil) utilizaron los gráficos de Dixon (inversa dela velocidad.inicia1 versus la concentración de galactosa,(Dixon y Hebb. 1984)) con concentraciones de galactOSa entre0 y 20 mMy concentración de lactosa constante. Encontraronque la galactosa es un inhibidor competitivo de la enzima yque la presencia de 5 mMde galactosa en un medio con 200 mHde lactosa comosustrato inhibe la reacción en un 50 z.Estos autores aseguraron que él método de Lineweaver y Burkpara estimar Kmes el más inexacto y que el método decálculo que se utilice influye en los valores de Km,V y Kilobtenidos. Para predecir el funcionamiento de un reactorutilizaron el mismo método que Heetall y 001., (1974).Trabajando con enzima soluble obtuvieron buena concordanciaentre la curva teórica y los datos experimentales para elrango de conversión 40-60 %. A- menores conversiones ladesviación fue leve mientras que a altas conversiones los

85

valores experimentales fueron mucho mayores que lospredichos. Estas desviaciones se atribuyeron areversibilidad de la reacción de hidrólisis, formación deoligosacáridos e inhibición por galactosa.

Ha y col. (1983) investigaron qué modelo permite unamejor descripción de la hidrólisis enzimática de la lactosa.Trabajaron con una lactasa inmovilizada proveniente deAspergillus niger utilizando como sustrato lactosa ensolución. La reacción se llevó a cabo en un sistema tanquecontínuo idealmente agitado. Los modelos que emplearonfueron los siguientes: Michaelis y Henten sin inhibición,con inhibición competitiva por un producto P1, coninhibición no competitiva por producto P2, con inhibicióncompetitiva por P1 e inhibición no competitiva por PZ. coninhibición por sustrato, con inhibición por sustrato einhibición competitiva por P1 y con inhibición por sustrato,inhibición competitiva por P1 y no competitiva por P2. Cadaecuación de ‘velocidad se linealizó respecto de losparámetros cinéticos y se utilizó un método de regresiónlineal múltiple. Luego verificaron el ajuste de cadaexpresión con los datos experimentales y llegaron a laconclusión que el modelo más adecuado para describir lahidrólisis de lactosa es la ecuación que contempla lainhibición competitiva por P1. Es decir que 1a galactosainhibe competitivamente a la lactasa.

Scott y col. (1984) utilizaron las conclusiones deHeetall y col. (1974) con respecto a la cinética dehidrólisis de lactosa para estudiar la velocidad dedecaimiento de fi-galactosidasa inmovilizada operando en unreactor integral y utilizando como-sustrato ultrafiltrado desuero de queso ácido.

86

Van Griethuysen y col. (1985) postularon también unacinética de Michaelis y Henten con inhibición competitivapara describir el comportamientode 1a lactasa provenientede Aspergillus oryzae en soluciones de lactosa, sueroreconstituído y permeatos de suero de queso. Estudiaron lainfluencia de las sales sobre el pH óptimo de trabajo de laenzima. Para describir las curvas de hidrólisis utilizaronla ecuación integrada escrita de la siguiente forma:

[Eo]t= —1—([So]-[SJ)-L1n íï’lA A [S]

donde

A=k2 Ki ¡3sz Ki+ [501Ki - Km Ki - Km

Calcularon los parámetros A y B por el método de regresiónno lineal de Marquardt y analizaron la dependencia de losmismos con el pH. Todas las experiencias las realizaron conuna misma concentración de lactosa y no calcularonconstantes individuales, sino que sólo analizaron cómovariaban A y B. Van Griethuysen y col. (1988), en untrabajo posterior, desarrollaron un proceso para lahidrólisis de lactosa en suero de queso parcialmentedesproteinizado y utilizaron para describir la cinética elmodelodesarrollado en el trabajo anterior. Para estimarlos valores de las constantes Km,Kil y k2 realizaron unaserie de experiencias de hidrólisis con soluciones delactosa con agregado de sales a fin de que el desempeño dela enzima en este medio fuera semejante al comportamiento ensuero de queso, y luego aplicaron el algoritmo de Marquardta todo el conjunto de datos experimentales.

88

Otro grupo de autores directamente describió lacinética de hidrólisis de la lactosa por medio de laecuación diferencial de Michaelis y Menten y calcularonsolamente Km, ya que consideraron que trabajando convelocidades iniciales no es necesario tener en cuenta lainhibición. Decleire y col. (1985) trabajaron con célulasde Kluyveromycesbulgaricus y con extractos sin células ensoluciones de lactosa u o-nitrofenil-fi-galactopiranosa(ONPG)y en suero de queso. Calcularon Kma partir de losgráficos de Lineweaver y Burk (1934) y no mencionaron laposibilidad que exista inhibición por galactosa. Peter ycol. (1981) trabajaron con una lactasa de Saccharomyceslactis y otra de Aspergillus niger. Comosustrato emplearonsoluciones de lactosa en buffer. Utilizaron el método delas velocidades iniciales a fin evitar el problema de lainhibición por productos. Para calcular las constantesutilizaron varios métodosde linealización de la ecuación deMichaelis y Menten Lineweaver y Burk (1934), Hanes (1932),Eadie y Hoftee (1952) y el gráfico lineal directo. Agbebaviy col. (1987) estudiaron el efecto de los cationes del suerosobre las constantes cinéticas del modelo que describe lahidrólisis de lactosa por acción de una enzima inmovilizada(Novozym231) en un reactor tipo tanque continuo idealmenteagitado. Trabajaron con soluciones de lactosa y conpermeato de suero de queso. Compararon los resultados queobtuvieron con los predichos por la ecuación de Michaelis yHenten (sin inhibición por galactosa) utilizando el métodode las velocidades iniciales. Mencionaron que la enzima nofue inhibida por sustrato o productos en las concentracionesutilizadas (0,04 a 0,24 M). Kohlwey y Cheryan (1981)estudiaron el desempeño de la -enzima Maxilact LX 5000inmovilizada en un reactor de fibra hueca. Como sustrato

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utilizaron ONPG. La cinética de la enzima sin inmovilizarse describió asumiendo el modelo de Hichaelis y Menten yusaron el métodode las velocidades iniciales trabajando condiferentes valores de concentración inicial de lactosa paracalcular las constantes cinéticas por medio de Lineweaver yBurk.

Otro grupo de autores, sin bien utilizaron 1aecuación de Michaelis y Henten sin considerar inhibición,estudiaron por separado el efecto de la galactosa sobre 1areacción. Park y col. (1979) caracterizaron elcomportamientode la lactasa proveniente de Aspergillusoryzae tarbajando con soluciones de lactosa u ONPG.Calcularon Km y V a partir de gráfico de Lineweaver y Burky estudiaron la inhibición competitiva que produce lagalactosa comparando las velocidades de reacción con y singalactosa para diferentes concentraciones iniciales de lamisma. También encontraron que la glucosa no inhibe a laenzima. Hierzwicki y Kosikowski (1972a) estudiaron lahidrólisis de suero de queso ácido concentrado a diferentesporcentajes de sólidos de forma tal que la concentración delactosa variaba de 3,5 a 38% Utilizaron la enzima deAspergillus niger y midieron a1 velocidad inicial de 1ahidrólisis en la porción lineal de la curva, de reacción.Mencionaron que probablemente la velocidad de reaccióndisminuya en el tiempo debido a la inhibición por productos.Kubyy Lardy (1953) estudiaron la purificación y cinética de1a lactasa de Escherichia coli. Como sustratos utilizaronlactosa, ONPGy azúcares relacionados. Calcularon Km y Vcon el método de Lineweaver y Burk (1934). Encontraron que1a galactosa es un inhibidor competitivo y que la glucosa ysacarosa actúan como inhibidores no competitivos cuandoestan en altas concentraciones. Por debajo de 0,01 H su

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efecto es muypequeño. Flaschel y col. (1982), trabajandocon la enzima de Aspergillus niger y soluciones de lactosade diferentes concentraciones, observaron que debido a lainhibición por la galactosa las curvas de hidrólisis sonaltamente no lineales, aún para tiempos muycortos. Por lotanto postularon que no es correcto utilizar el método delas velocidades iniciales. Afirmaronque para describir enforma adecuada la cinética de esta reacción es necesarioconsiderar el equilibrio de mutarrotación de la galactosa,ya que la enzima que ellos emplearon era capaz de distinguirentre el anómero a y el fi y que la a-galactosa es uninhibidor más potente.

Finalmente Cheng y col. (1985) postularon que, paradescribir adecuadamente la cinética de hidrólisis delactosa, es necesario utilizar un modelo que contemplesimultáneamente la inhibición competitiva ejercida por lagalactosa y la no competitiva de la glucosa. Trabajaron consoluciones de lactosa y células de Kluyveromyces fragilisdeshidratadas en acetona. Objetaron la validez de1_ trabajode Heetall y col. (1974) y describieron la hidrólisisenzimática de la lactosa comouna cinética de Michaelis yMenten con inhibición competitiva y no competitiva.

91

4.3. Materiales y métodos

4.3.1. Materiales

Se utilizó comomateria prima para este trabajo suerodulce de queseria concentrado (SQC) aproximadamente al 50 Zp/p de sólidos totales. Este material fue provisto porSancor Cooperativas Unidas Ldta. (Santa Fé) y proveníaprincipalmente de 1a elaboración de quesos de pasta blanda.El suero liquido diluido, cuya composición media se muestraen la Tabla 4.3, se concentraba al vacio en un evaporador demúltiple efecto hasta llegar aproximadamente a un 50 Z p/pde sólidos. La temperatura máxima alcanzada durante elproceso era 70°C. La actividad de agua de este suero dequeso concentrado estaba comprendida entre O,94U-0,950 y elpH se encontraba en el rango 8,0-6,3. La concentraciónmedia de lactosa era 35 g lactosa /100 g suero de quesoconcentrado. El suero de queso concentrado se manteníarefrigerado hasta su utilización.

El suero de queso concentrado con 50 Z p/p de sólidostotales es de color amarillo claro y de olor agradable.Posee cristales de lactosa en suspensión que pueden ser, enalgunas partidas de suero de queso, perceptibles al tacto.Debido a la gran viscosidad del suero de queso concentradolos cristales no precipitan ó'lo hacen muylentamente. Laviscosidad del suero de queso concentrado y el tamaño de loscristales de lactosa puedenvariar de una partida a otra.pero en la mayoria de los casos los cristales son pequeños yla viscosidad alta. La consistencia es la de una cremaespesa y en determinadas partidas puede no fluir al inclinarel envase que lo contiene.

92

Tabla 4.3

Composición medía del suero de queso dulce diluido (a)

couronern CONCENTnAcnn4(xpz»)

sólidos totales 6-7lactosa 4,6-4,8proteínas Ü,8—0,9grasa 0.03cenizas 0,50acidez (comoácido láctico) 0,15

(a) Análisis proporcionado por Sancor Cooperativas UnidasLtda.

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Las diferentes partidas de suero de queso concentradorecibidas de Sancor Cooperativas Unidas Ltda. no eranexactamente iguales entre si. Una de las caracteristicasque variaba entre cada partida era el contenido de sólidos.A continuación se enumeran los contenidos de sólidos de laspartidas recibidas: 49,2; 54,6; 49,1; 45,5; 49,5; 55,8;50,7; 61,1; 57,0; 51,9; 51,3; 52,0; 51,9; y 49,9 X p/P desólidos. Para realizar las experiencias solamente fueronutilizadas aquellas partidas cuyo contenido de sólidosestaba comprendido entre 49,5 y 52,0 Z p/p, salvo que seespecificase lo contrario. De esta forma se lograba ciertahomogeneidaden las características del material empleadopara cada estudio, ya que era imposible realizar todos losensayos con la misma partida. Con concentraciones desólidos mayores o menores que las utilizadas, lascaracterísticas y el comportamiento del suero de quesoconcentrado variaba en gran medida. Es decir que en estetrabajo la concentración del suero de queso concentradoutilizada osciló entre 49,5 y 52,0, salvo que se especifiqueotra concentración de sólidos.

Los reactivos empleados, todos de calidad analítica,fueron: clorhidrato de metilamina, galactosa y sulfito desodio anhidro de Farmitalia Carlo Erba (Italia); lactosa,glucosa, ácido fosfotúngstico, hidróxido de sodio ehidróxido de potasio de Mallinckrodt Chemical Works (St.Louis, H0); ácido acético glacial, ácido fosfórico (85 Zp/p), glicerol (87 Z p/p) y acetato de zinc de Merck(Darmstadt, Alemania Occidental).

El sorbato de potasio y el propíonato de calcio

94

utilizados eran grado alimentario.

Para realizar la hidrólisis de lactosa se utilizó lalactasa Maxilact LX 5000, de Gist Brocades nv (Delft,Holanda). Esta enzima es obtenida de una cepa especial deKluyveromyces ó de Saccharomyces lactis.

4.3.2. Métodos

4.3.2.1. Determinación del pH

El pH de las muestras fue medido con un electrodo devidrio en un equipo MetrohmE 632, calibrado con buffers dePH 7.00 y 4,00.

4.3.2.2. Determinación de humedad del suero de quesoconcentrado

La determinación de humedad del suero de quesoconcentrado se realizó gravimétricamente por secado enestufa de circulación forzada a 100°C durante 5 horas(Kanterewicz, 1985a). Esta es una técnica propuesta por laA.0.A.C. (1980), sección 18032, para determinar humedad enleche. Cadadeterminación se realizó por triplicado, siendoel error porcentual de 0,70 %(nivel de confianza: 95 Z).

4.3.2.3. Determinación de iones de calcio, magnesio y sodio

La determinación de calcio; magnesio y sodio iónicos

95

se realizó por absorción atómica en el Departamento deQuímica Inorgánica, Analítica y Fisicoquímica de 1a Facultadde Ciencias Exactas y Naturales (UBA).

4.3.2.4. Determinación de actividad de agua

Para la determinación de la actividad de agua (au) delas muestras se utilizó un higrómetro NovasinaThermoconstanter Humidat TH2, manufacturado por Novasina AG(Zurich, Suiza). El mismo consta de una cámara de medicióncon temperatura controlada y un sensor de humedadrelativa ytemperatura modelo 88-3. El sensor de humedad está basadoen los cambios de conductividad de un electrolitohigroscópico al variar la humedadrelativa del ambiente alcual se encuentra expuesto. Las determinaciones de aw serealizaron a 25+0,05°C. Previo a su medición las muestraseran termostatizadas a 25°C durante 12 horas. Elprocedimiento para calibrar el higrómetro fue descripto porKitic y col. (1988). Para cada serie de mediciones seobtuvo una curva de calibración con soluciones salinas

saturadas de aw conocida (Greenspan, 1977; Resnik Iv col.,1984) en el rango de aw comprendido entre 0,750 y 0,975.Las soluciones salinas utilizadas y los valorescorrespondientes de aw se detallan a continuación:

sal aH

sulfato de potasio 0.874nitrato de potasio 0,925cloruro de bario 0,902cloruro de potasio 0,843sulfato de amonio 0,802

96

cloruro de sodio 0,752

La curva de calibración obtenida se verificabadiariamente y cada muestra se media por duplicado. El error

de la determinación experimental de la aH es ï 0,005unidades de aw (Kitic y col., 1988).

4.3.2.5. Determinación de lactosa

4.3.2.5.1. Elección de la técnica

Para poder conocer el grado de hidrólisis de lactosaen el sistema en estudio, es necesario determinar ladisminución de la concentración de lactosa o el aumento enla concentración de galactosa ó glucosa en función deltiempo. Para ello debe contarse con métodos analíticos quedeterminen un azúcar en presencia de los otros ydesafortunadamente existen pocas reacciones que distinganentre ellos. A fin de encontrar un método adecuado quepermitiera evaluar lactosa en presencia de glucosa ygalactosa o viceversa, se consultaron técnicas propuestaspor varios autores. Las técnicas sugeridas por la A.0.A.C.(1980) (método general de Munson-Halker y método volumétricageneral de Lane-Eynon) no son experimentalmente sencillas yotros métodos para dosar lactosa. como los que utilizanlevaduras (fermentación diferenciada y método manométrico)(Horowitz y col. 1959), son complejos y largos. Se optó porbuscar un método colorimétrico que fuera simple y a su vezdiera buenos resultados. El método enzimático deBoehringer-Hannheim se basa en la oxidación de la galactosaa ácido galactónico por el dinucleótido nicotinamida-adenina

U'I

(NAD)en presencia de galactosa deshidrogenasa y se mide eldinucleótido nicotinamida-adenina reducido (NADH) en unespectrofotómetro (Kleyn, 1985). El método propuesto porFeitosa-Telles y col. (1978) se basa en una reaccióncombinadaentre fenol, hidróxido de sodio, ácido picrico ybisulfito de sodio con lactosa, la cual origina un complejode color rosa que se mide en un espectrofotómetro. Pese aser sencillo no es adecuado para este caso, pues la glucosainterfiere en la formación del color. El método de Toren(1967) mide concentración de glucosa. Esta es oxidada poracción enzimática a ácido glucónico y como producto de lareacción se obtiene o-dianisidina oxidada, que tiene unmáximo de absorción a 440 nm. Otro método para medirglucosa es el de Nelson-Somogyi (Nelson, 1944), donde laglucosa reacciona con arsenomolibdato de amonio en mediobásico y en presencia de cobre se obtiene un complejo azul.El método de Tauber y Kleiner (1932) determina monosacáridosen presencia de disacáridos. Se mide el azul de molibdenoque se forma en presencia de cobre y glucosa. Este métodotiene el inconveniente que, si la concentración de lactosaes mayorque la de glucosa, la lactosa interfiere en ladeterminación. Otro método espectrofotométrico es el deGriffith y col. (1989), que se basa en la reduccióndiferenciada de cerio (IV) a cerio (III) por acción de losazúcares en un medio de ácido nítrico. Por último, elmétodo de Nickerson y col. (1976) utiliza la reacción deFearon (1942) para determinar lactosa, es decir, la reacciónde metilamina con los enlaces a-1,4—glucosidicos en mediobásico para dar un complejo rosa. Varios autores emplearonel método de Nickerson para medir lactosa en soluciones delaCtosa, leche o suero de queso de diversas concentraciones:Hhalen y col. (1988), Chiu y Kosikowski (1985), Baer y

98

Lowenstein (1979), Fain y col. (1980), Griffith y Miur(1980), Chen y Zall (1983), Lin y Nickerson (1977) y Vujicicy col. (1977). En base al trabajo de Chen y col. (1981),que analizaron la confiabilidad del método de Nickerson ycol. (1978), éste fue elegido para determinar lactosa ensuero de queso concentrado y en otros sistemas empleados eneste trabajo.

4.3.2.5.2. Descripción de la técnica

El método de Nickerson y col. (1976) se basa en ladeterminación colorimétrica del producto de la reacción delactosa y clorhidrato de metilamina en medio básico. A1cabo de 25 minutos de calentamiento a 65°C y 2 minutos deenfriamiento en un baño de hielo se obtiene un complejo rosaque se mide en un espectrofotómetro a 540 nm. Galactosa yglucosa no interfieren en 1a reacción.

Para analizar la factibilidad del métodoanalítico dedeterminación de lactosa en presencia de galactosa y glucosase realizaron las experiencias que se detallan acontinuación.

I Curva de calibraciónSe realizaron una serie de 10 curvas de calibración

con patrones de lactosa de la siguiente concentración: 0,50;0,75; 1,00; 1,25 y 1,50 mg lactosa/ml. En base a lasindicaciones de Chen y col. (1981), se tomaron lassiguientes precauciones: a) secar el clorhidrato demetilamina una hora a 100°C en estufa de circulación forzaday preparar la solución de este reactivo cada vez en el

99

momento de usarlo; b) leer las muestras en elespectrofotómetro dentro de los dos minutos luego deretirarlas del hielo (se miden tres tubos cada vez) ya queel complejo rosa formado es algo inestable. Tomando encuenta estas precauciones y respetando los tiempos decalentamiento y enfriamiento se obtenían resultados muyreproducibles. Unacurva de calibración tipica obtenida esla Siguiente:

concentración de lactosa (mg/ml) Absorbancia0,50 0,0380,75 0,1581,00 0,3141,25 0,4031,50 0,620

Para todos los casos se obtuvieron coeficientes decorrelación mayores que 0,99.

I Influencia.de la presencia de galactosa y glucosaSe determinó la influencia que ejerce sobre la

formación del complejo coloreado la presencia de galactosa yglucosa formadas en el medio de la reacción al progresar lahidrólisis de lactosa. Para esto se prepararon solucionesde lactosa, galactosa y glucosa en proporciones quesimulaban diferentes gradOS de hidrólisis. Lasconcentraciones utilizadas y los resultados obtenidos en lasdeterminaciones analíticas se encuentran en la Tabla 4.4.

En base a estos resultados se puede concluir que elmétodo de Níckerson y col. (1976) es adecuado para medirsistemas de lactosa que posean hasta el 80 Z de la lactosa

100

Tabla 4.4

Influencia de las concentraciones de galactosa y glucosa enla determinación de lactosa.

xHIDROLJSIsa LACTOSAb aLUCOSAb GALAGTOSAb LACTOSA CALCULADAc(mg/mL) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)

0 1,5000 0 0 1,5410 1,3500 0,0789 0,0789 1,4030 1,0500 0,2368 0,2388 1,0850 0,7500 0,3947 0,3947 0,7680 0,3000 0,8316 0,6316 0,2890 0,1500 0,7105 0,7105 amarillo

100 0 0,7894 0,7894 amarillo

a) Z de hidrólisis al que fueron preparadas las soluciones.b) Concentraciones a las que fueron preparadas lassoluciones.c) Concentración de lactosa calculada a partir de ladeterminación analítica utilizando el métodode Nickersony col. (1976).

101

presente hidrolizada. Conporcentajes de hidrólisis mayoresal Bb Z la glucosa y la galactosa formadas interfieren en ladeterminación, ya que el color amarillo que dan estos dosazúcares con los reactivos es lo suficientemente intensocomopara enmascarar el color rosa dado por la lactosa.Esta experiencia fue realizada por duplicado informándose unpromedio de los datos obtenidos.

4.3.2.5.3. Técnica de medición de lactosa en suero dequeso diluido, en suero de queso concentrado yen soluciones de lactosa

Para la determinación de lactosa en suero de queso serealizaron algunas modificaciones en la cantidad de muestrautilizada y en las diluciones realizadas con respecto almétodo propuesto por Nickerson y col. (1976).

Para determinar lactosa en suero de queso diluido sepesaba entre 7 y 9 gramos de suero de queso diluido (segúnel grado de hidrólisis alcanzado) en un matraz de 10 ml, elcual contenía 1 ml del agente desproteinizante. El agentedesproteinizante (ZAPT) estaba compuesto por ácidofosfotúngstico y acetato de zinc disueltos en un medio deácido acético (25,0 g de acetato de zinc, 12,5 g de ácidofosfotúngstico y 20 ml de ácido acético glacial diluidos a100 ml). Luego de diluir el suero desproteinizado a 10 ml selo dejaba una hora agitándolo ocasionalmente y se filtraba.1 ml de este filtrado más 1 ml de hidróxido de sodio 1 N sediluía a 25 ml, se filtraba y sobre este filtrado sedeterminaba lactosa por duplicado. Para la determinación delactosa se tomaban 5 m1del filtrado, se colocaban en un

102

tubo de ensayo y se agregaban 5 ml de un bufferglicina-hidróxido de sodio (pH=12,8). Luego se preparabauna solución acuosa de clorhidrato de metilamina(previamente secada una hora a 100°C) 5 Z p/p y unasolución acuosa de sulfito de sodio 1 X p/p. Se agregaba0,5 ml de cada una de estas soluciones a 1a muestra con elbuffer. Se agitaba y colocaba durante 25 minutos a 85°C.Una vez transcurrido este tiempo se enfriaba la mezcla dereacción durante 2 minutos en un baño de agua y hielo y semedia el color rosa del complejo formado a 540 nm en unespectrofotómetro Spectronic 21 (Baush y Lomb). Para cadaserie de mediciones se realizaba una curva de calibraciónpor duplicado a fin de verificar el buen funcionamiento dela técnica.

Para la determinación de lactosa en suero de quesoconcentrado se empleaban entre 0,5 y 2,5 gramos de muestra,según el grado de hidrólisis alcanzado, siendo el resto dela técnica empleada igual a la descripta para suero de quesodiluido.

Para la determinación de lactosa en solucionesacuosas, si la solución era concentrada (15 Z p/p ó más), seempleaban 0,5 a 3 gramos de muestra y si se trabajaba consoluciones diluídas se empleaban de 5 a 8 gramos de muestray el resto de la técnica era igual a la descripta para suerode queso diluido.

4.3¡2.5.4. Error del métodode determinación de lactosa ensuero de queso concentrado

103

Para estudiar el error del método de determinación delactosa en suero de queso concentrado se utilizaron dospartidas de suero de queso diferentes y se determinó lactosaen 10 muestras de cada una de ellas mediante la técnicadescripta en el punto anterior. Los resultados obtenidos seencuentran en la Tabla 4.5. Cada determinación de lactosase realizó por duplicado. En base a los resultadosobtenidos se calculó:

Partida A: concentración promedio de lactosa: 34,7 Z p/pdesviación standard: 1,07

Partida B: concentración promedio de lactosa: 31,7 Z p/pdesviación standard: 1,11

La diferencia entre las desviaciones standard de lasdos partidas se debe a la heterogeneidad del suero de quesoconcentrado y a las diferencias que existen entre lasdistintas partidas del mismo (viscosidad, tamaño decristales de lactosa, etc.).

4.3.2.5.5.. Porcentaje de recuperación de lactosa

Se estudiaron los porcentajes de recuperación en ladeterminación de lactosa en_ suero de queso concentrado.Para ello se agregaron al suero diferentes cantidades delactosa. Se utilizó suero de queso concentrado con 35,5 Zp/p de lactosa, determinada por este método. Se diluia elsuero de queso concentrado a 7 Z p/p de sólidos totales, sepesaba la cantidad estipulada de lactosa en un matraz de 25m1 y se llevaba a volumen con el suero diluido. Luego de

104

Tabla 4.5

Determinación de lactosa en dos partidas de suero de quesoconcentrado

MUESTRA PARTIDA A PARTIDA Bx p/p LACTOSA x p/p LACTOSA

1 35,3 31,42 33,7 30.93 32,7 31,54 34,9 32,65 35,9 31,56 36,4 30,67 34,4 30,68 35,1 32,89 34,2 33,0

10 34,7 31,0

105

agitar bien se determinaba lactosa según la técnicadescripta para suero de queso diluido (sección 4.3.2.5.3).Los resultados obtenidos se encuentran en la Tabla 4.6.Cada muestra se preparó por duplicado y todas lasdeterminaciones de lactosa también se realizaron porduplicado. Como se puede observar, los porcentajes derecuperación son altos, lo cual indicaria que el métodopermite determinar toda la lactosa presente en el suero. Elagregado de lactosa se hizo a suero de queso diluido, puessi se agregaba más lactosa al suero de queso concentrado sedificultaba el manejo del mismo por la alta viscosidadobtenida.

En base a todas las experiencias realizadas, seconcluye que el método de determinación de lactosa propuestopor Nickerson y col. (1976) para suero diluido es adecuadopara medir el contenido de lactosa en suero de quesoconcentrado siempre que el porcentaje de hidrólisisalcanzado no supere el 80-85 Z.

4.3.2.6. Hidrólisis de lactosa

La hidrólisis de lactosa se llevó a cabo utilizandola enzima Maxilact LX 5000 (Gist Brocades nv, Delft,Holanda).

Las condiciones experimentales en que se realizarontodas las experiencias de hidrólisis de lactosa, ya sea ensuero de queso como en otros sistemas, fueron lassiguientes:

106

Tabla 4.8

Porcentajes de recuperación de lactosa (a).

u LACTOSA VERDADERO x LACTOSA CALCULADO x RECUPERACION

42,2 41,7 98,8349,0 45,8 93,1655,8 55,3 99,1962,2 82,2 99.9768,8 69,8 101,34

(a) Los porcentajes de lactosa se calcularon sobre la basede suero de queso concentrado.

107

I Equipo:

Se utilizó como reactor para la hidrólisis unrecipiente cilíndrico de vidrio de 500 ml de capacidad, 7 cmde diámetro interno y 14 cm de altura. La muestrautilizada, que ocupaba aproximadamente un tercio del volumentotal del reactor, se agitaba con una paleta que giraba a 7revoluciones por segundo. A su vez, durante la hidrólisisel recipiente permanecía bien tapado para evitar cambios en

la aw de la muestra debido a la evaporación. Todo el equipose termostatizaba en un baño de agua a la temperatura detrabajo.

I Metodología de trabajo:

Para cada corrida se utilizaron 300 g de la muestra ahidrolizar. El día anterior a la realización de laexperiencia se ajustaba el pH con ácido fosfórico 85 Z p/p ócon hidróxido de potasio 40 Z p/p (se utilizó hidróxido depotasio en vez de hidróxido de sodio pues el ión sodioinhibe a la lactasa). Este pH se verificaba en el momentode utilizar la muestra. Al final de cada experiencia semedía el pH para determinar si el mismo había variado. Enningún caso, salvo cuando se estudió la influencia del pH,se ajustó el pHdurante la hidrólisis.

Antes de agregar la enzima para comenzar la reacciónse termostatizaba todo el equipo y la muestra a latemperatura de trabajo. La reacción de hidrólisis seiniciaba por el agregado de la enzima a la muestra ya enagitación. Se tomaban muestras periódicamente, porduplicado, las cuales se desproteinizaban inmediatamente con

108

ZAPTa fin de inactivar la enzima. La cantidad de muestrapesada dependía de la concentración inicial de lactosa y delgrado de hidrólisis alcanzado en ese sistema, de forma talque luego de las diluciones necesarias, la cantidad delactosa presente estuviera dentro del rango de la curva decalibración. Una vez desproteinizadas las muestras, sedeterminaba lactosa mediante el método de Nickerson y col.(1976). Cada experiencia se realizó por duplicado (i.e. doscorridas de hidrólisis para las distintas condicionesestudiadas). Para cada duplicado se tomaban dos muestras acada tiempo y en cada una de ellas se determinaba lactosapor duplicado. En la Figura 4.3 se muestran los resultadosobtenidos cuando se trabajó a 37°C , pH=6,0 y con 0,1 Z p/pde lactasa. La experiencia se realizó por duplicado (o:corrida 1; A : corrida 2); para cada duplicado se tomaron acada tiempo dos muestras y en cada una de ellas se determinólactosa por duplicado. Los datos están representados comoXhidrólisis versus tiempo, siendo el Z hidrólisis el grado deconversión porcentual de la lactosa, es decir:

[lactosajimciaL [lactosa]ümLZ Hidrólisis = x 100

[laCtosa1intcLoL

En la Figura 4.3 se puede observar que a tiemposmenores que 80 minutos, la dispersión de los valores de Zhidrólisis (dentro de la mismacorrida y comparando las doscorridas entre si) es mucho mayor que a tiempos mayoresdonde, para una misma corrida, los valores obtenidos son muysemejantes entre si.

Considerando una desviación.standard promedio de 1,1y que cada determinación de lactosa se realizó por

109

cuatriplícado el intervalo dentro del cual está comprendidoel valor verdadero de la determinación analítica es de 1 1,2Z p/p lactosa (nivel de confianza: 95 X).

4.3.2.7. Determinación de la actividad de agua desoluciones de galactosa y de manosa

Para la determinación de la capacidad de reducción de

la aw de la galactosa y de la manosa se prepararonsoluciones del azúcar en agua destilada. Los azúcares eranpreviamente desecados en estufa de vacio en presencia deperclorato de magnesio a 40°C. Cada solución se preparaba

por duplicado e inmediatamente se le determinaba su aw porla técnica anteriormente descripta.

4.3.2.8. Determinación de 1a actividad de agua del suerode queso concentrado en función del grado dehidrólisis

Para determinar la aw del suero de queso concentradocon diferentes grados de hidrólisis era necesario evitarcompletamente la evaporación de agua. Por lo tanto, setrabajó de la siguiente manera: se tomaron 300 g de suero apH=6,0 y a una temperatura de 5°C y se le agregó 0,1 Z p/pde lactasa. Se homogeneizó bien la muestra y se colocaron20 g en frascos de polietileno con cierre hermético. Secerraron los frascos y se colocaron en un baño termostáticocon agitación a 37°C. Periódicamente se tomaba uno de ellosy se calentaba 2 minutos a 80°C (Guy y Bingham, 1978) a finde inactivar la enzima y frenar la hidrólisis. Se tomó una

SlSI’lOHGIH 95

110

filllflllll

100

rÍÍÏIFIIIÍ

200

TIEMPO(min)

rhrïïrlllrïlllllílllll

300

Figura4.3: Puntosexperimentalesdeporcentajedehidrólisisenfuncióndel tiempo,obtenidospara1ahidrólisisdelactosaensuerodequesoconcentrado.oexperiencia1,Aexperiencia2.

111

muestra de 2 g de cada frasco para 1a determinación delactosa y el resto de 1a muestra se congeló hasta el momentode determinar la actividad de agua, lo que se realizaba deacuerdo a la técnica ya descripta.

4.3.2.9. Hidrólisis de lactosa en sistemas modelo

Los sistemas modelo utilizados, compuestos porsoluciones de lactosa en buffer fosfato de pH=6,0 con elagregado de sacarosa ó glicerol, se detallan en la Tabla4.7. Todos los reactivos empleados fueron provistos porMerck Quimica Argentina. Los sistemas se prepararon porpesada de cada uno de los componentes. La actividad de aguainicial se midió en forma experimental según la técnicadetallada en la sección 4.3.2.4. Dada la mayor capacidaddel glicerol con respecto a la sacarosa para disminuir laaw, las soluciones de sacarosa tenian mayor contenido desólidos que las de glicerol. En los sistemas utilizados semantuvoconstante la relación lactosa/buffer. En todosellos se utilizó 0,02 Z p/p de lactasa. Se trabajó a trestemperaturas: 37°C, 47°C y 53°C. La metodologia dehidrólisis y de determinación de lactosa fueron lasdescriptas en las secciones 4.3.2.8 y 4.3.2.5.3respectivamente. Las aw elegidas para los sistemas modelofueron del mismo orden que las que posee el suero de quesoconcentrado al ir procediendo la hidrólisis. salvo en elsistema 1 (control) y el sistema 2. Todas las experienciasse realizaron por duplicado.

112

Tabla 4.7

Composicióny actividad de agua inicial de los sistemasmodelo.

SISTEMA LACTOSA SACAROSA OLICEROL BUFF‘ER a inicial.(g ) ( g ) (g ) ( g ) v

1 10 - 90 0.9932 10 20 90 0,9813 10 70 90 0,9454 10 130 - 90 0,8945 10 - 25 90 0,9418 10 47 90 0,888

113

4.4. Resultados y discusión

4.4.1. Influencia de la velocidad de agitación en lavelocidad de hidrólisis de lactosa

El suero de queso concentrado es un medio deviscosidad relativamente alta. Por lo tanto es necesarioagitar el reactor durante la hidrólisis para que la reacciónentre la enzima y la lactosa no esté controlada por la etapadifusional. Asimismoal agregar la enzima Maxilact a mediosviscosos, por ejemplo leche concentrada, es necesario agitarregularmente a fin de mantener homogéneala concentración deenzima; en caso contrario ocurre aglomeración de la misma,disminuyendo asi su actividad (Nijpels, 1978a).

Para encontrar el nivel de agitación adecuado seutilizaron dos velocidades de rotación de la paleta: 7 y 20revoluciones por segundo (r.p.s). Se trabajó a 37°C, pH=6,0y 0,1 Z p/p de lactasa. Los resultados obtenidos seencuentran en la Figura 4.4. Se puede observar que 'lascurvas resultantes para las dos condiciones de agitación sonmuysemejantes. Por lo tanto se puede concluir que en esterango de trabajo no existe resistencia difusional a latransferencia de masa. Para las restantes experiencias setrabajó a 7 r.p.s., ya que a mayor velocidad se forma espumay se dificulta la toma de muestra para la determinación delactosa.

4.4.2. Influencia de la concentración de enzima en lavelocidad de hidrólisis de lactosa

T=37°CpH=6,0

70,

0,1sep/penznmo

6OoC3,d.

om

SISIWOHGIH 35

CDCd

o

oo oQ

4.

1o3° OYFTTÑIITTlIFTÏIITTÍIÍÍÍIIIIIIIIIIÏIITIFÏÏÏIII

O1OOZOO300400

TIEMPO(mín.)

Figura4.4: Influenciadelavelocidaddeagitaciónenlavelocidaddehidrólisisde lactosaensuerodequesoconcentrado.o7rps,O20rps.

114

115

La enzima Maxilact fue utilizada por varios autoresen diferentes sustratos. En los boletines técnicos de GistBrocades nv se recomienda utilizar entre 0,02 y 0,04 genzima/100 g suero de queso diluido (7 Z sólidos totales)para lograr un 80 Z de hidrólisis luego de 2,5-5 horas dereacción, trabajando en las condiciones óptimas de la enzima(T=37°C y pH=6,5). Los autores Chiu y Kosikowski (1985)utilizaron para suero desproteinizado y desmineralizado,concentrado hasta un 30 Z p/p de lactosa, 0,33 Z p/p de lalactasa Maxilact LX5000 para conseguir 80 X de hidrólisistrabajando a 40°C y pH=6.5 durante 5 horas. Guy y Bingham(1978), en leche concentrada (41 Z p/p sólidos totales) con0,16 Z p/p de la enzima Maxilact 40000 ONPG a‘ pH=6,5 yT=30°C, llegaron a un 70 Z de hidrólisis en 2 horas. Guy yEdmonson (1978), trabajando con 0,1 Z p/p de enzima Maxilact40000 ONPGen soluciones de lactosa (18,5 Z p/p) a 30°C ypH=6,4, lograron un 75 Z de hidrólisis en 2 horas. Giec yKosikowski (1983) encontraron que, trabajando a 4°C y pH=6,8en permeatos de suero de queso concentrado al 25 Z p/p desólidos, en 25 horas se alcanza un 58 Z de hidrólisis con0,7 Z p/p de Maxilact 40000 ONPG.

Pese a que existen en bibliografia numerosos trabajosen los que se utilizó la enzima Maxilaot, en muchos de ellosla actividad de la lactasa empleada era diferente de la quese empleó en este trabajo y el sustrato utilizado enbibliografia no era suero de queso concentrado. En esteúltimo la concentración de lactosa y de calcio y sodio(ambos inhibidores de la enzima) son mayores que en losejemplos citados. Debido a esto es dificil realizarcomparaciones o extrapolar resultados.

116

Para determinar la concentración adecuada de enzimanecesaria para la hidrólisis de la lactosa en el suero dequeso concentrado se hicieron experiencias usandoconcentraciones en el rango de 2,2 a 0,8 Z p/p de enzima apH=6,0 y T=37°C. A las 1,5-2 horas aproximadamente dereacción en estas condiciones habian desaparecido loscristales de lactosa para las concentraciones de enzimaempleadas. Comoestos tiempos fueron relativamente cortos,se decidió emplear una menor concentración de lactasa. Serealizaron entonces una serie de experiencias en las que seutilizaron las siguientes concentraciones de enzima: 0,5;0,4; 0,3; 0,2; 0,1 y 0,05 z p/p. Se trabajó a T=37°c ypH=6,0. Los resultados obtenidos se encuentran en la Figura4.5. Cuando se trabajó con 0,4 y 0,5 Z p/p de lactasa, lascurvas obtenidas en ambos casos fueron coincidentes y a los130 minutos se logró más de un 80 Z de hidrólisis. Estoindica que el agregado de una concentración de enzima mayorno aumentaría la velocidad de hidrólisis. Al utilizar 0,3 zp/p de enzima la hidrólisis fue bastante rápida llegándose aun 77,0 %de hidrólisis a los 100 minutos. Con 0,2 y 0,1 Zp/p de lactasa para alcanzar un 60 Z de hidrólisis fueronnecesarios 150 y 350 minutos respectivamente. Con 0,05 Z deenzima sólo se alcanzó un 45 Z de hidrólisis luego de 420minutos de reacción.

Dado que el proceso propuesto no plantea larecuperación de la enzima, para elegir la concentraciónadecuada de la misma se debe tener en cuenta su costo yminimizar la cantidad de lactasa utilizada. Sin embargo,como la hidrólisis se lleva a cabo a 37°C de temperatura. esnecesario evitar una excesiva proliferación de la floramicrobiana presente en el mismo, durante el tiempo de

SISIÏOHÜIH 35

T=37ï:pH=6D

O#IIIIIÏFÏI[TTIIIIÍIFIIIIIlllllllllllrrïrrfílll

o100200300400

NEMPOonm)

Figura4.5:

la

Concentracionesde

n0,2zp/p,A0,3Zp/p,00.4Zp/p,

Influenciadelaconcentracióndeenzimaende

utilizadas:

I0,5Z

velocidaddehidrólisis

lactosaensuerodequsoconcentrado.enzima o0.0574p/p,00.12p/p, p/p.

118

reacción, cuando todavia el pH no ha sido ajustado al valorfinal de almacenamiento (5,5 ó 5,0), utilizando tiempos dehidrólisis no excesivamente largos.

Conrespecto al porcentaje de hidrólisis necesarioque debe alcanzar el suero de queso concentrado hay variosfactores a considerar:

I El suero de queso concentrado (50 % p/p de sólidostotales) tiene alrededor de 35 Z p/p de lactosa. Estecontenido de lactosa excede la solubilidad (solubilidad delactosa en agua pura: 17,86 g lactosa anhidra/IUU g solucióna 25°C (Shah y Nickerson, 1978)) y parte de la misma seencuentra suspendida en el suero de queso concentrado enforma sólida. La alta viscosidad del suero de quesoconcentrado posibilita que los cristales permanezcan ensuspensión. La presencia de estos cristales en el suero dequeso es una gran desventaja debido a que no sólocontribuyen a aumentar la viscosidad, sino que tambiéncausan problemas texturales cuando el suero de quesoconcentrado se agrega a cualquier formulación alimentaria.Durante la hidrólisis, el suero de queso se examinóperiódicamente al microscopio verificándose que al alcanzaraproximadamente un 60 Z de hidrólisis no habia más cristalesde lactosa en suspensión (para suero de queso concentradocon 49,5-52 2 p/p de sólidos), siendo este hecho coincidentecon la obtención de un jarabe de textura suave y cremosa.La concentración de lactosa en este jarabe fue 11-13 Z p/p(corresponde a 18-20 g lactosa/ 100 g agua + lactosa),semejante al valor de la solubilidad. Por lo tanto, paralograr la desaparición de los cristales es necesarioalcanzar como minimo un 80 Z de hidrólisis.

119

I Dada la forma de las curvas de hidrólisis, la obtenciónde una alta conversión del sustrato (mayor a 80-90 Z) seriaun proceso excesivamente costoso, ya sea porque deberiaagregarse una alta concentración de enzima o porque lostiempos de reacción serían muyprolongados.

I A bajos porcentajes de hidrólisis la lactosa está ensuspensión pero a altos porcentajes de hidrólisis precipitala galaotosa, cuya solubilidad es menor que la de la glucosa(solubilidad de la galaotosa en agua pura: 34,0 g galaotosaanhidra/IUÜ g solución; solubilidad de la glucosa en aguapura: 50,5 g glucosa anhidra/100 g solución (Shah yNickerson, 1978)). Guy y Edmonson (1978) encontraron que enjarabes de lactosa, galaotosa y glucosa almacenados a 23°C(preparados a partir de la hidrólisis de soluciones delactosa con la enzima Maxílact 40000 ONPGy con 60 Z p/p desólidos totales) ocurría precipitación de la galaotosadentro de los 7 dias en el caso de haberse alcanzado un 95 Xde hidrólisis. Para jarabes con 75 Z de hidrólisis, eltiempo de almacenamientosin que ocurriera cristalizaciónfue de más de 250 días.

I El proceso de hidrólisis disminuye la concentración delactosa presente en el suero de queso concentrado a fin deevitar los problemas que causa en personas que sonintolerantes a la misma. Estudios realizados por diferentesautores (Nijpels, 1978b; Miller y Brand, 1980) indican quedichas personas toleran unos pocos gramos de lactosa pordia. Para el caso de la leche se considera que un 60-80 Zde hidrólisis de lactosa es suficiente en la mayoría de loscasos. Sin embargo, para el caso de suero de queso, se debe

tener en cuenta que pese a que su contenido de lactosa esmucho mayor que el de la leche, seria incorporado como partede la formulación de un determinado producto, por lo cual unalto porcentaje de hidrólisis (mayor al 80-70 %) no esnecesario desde este punto de vista.

Cuando se trabaja con 0,05 Z de enzima, al cabo de 7horas de reacción se llega a un 45 Z de hidrólisis y aúnquedan cristales de lactosa presentes, lo cual no esdeseable desde el punto de vista de la textura del suero dequeso. Comotiempos de reacción mayores son inconvenientespues favorecerian el crecimiento de la flora microbiana, esnecesario emplear una mayor concentración de lactasa.Teniendo en cuenta estas consideraciones, lascaracteristicas de textura y aspecto del suero de quesoconcentrado con varios porcentajes de hidrólisis se eligióuna concentración de 0,1 z p/p de laotasa como la másadecuada para realizar los ensayos posteriores. Con estaconcentración de enzima se alcanza un 64-88 Z de hidrólisisen 7 horas trabajando a T=37°C y pH=6,Ü. El suero de Quesoconcentrado y parcialmente hidrolizado obtenido en estascondiciones no presenta cristales, es de color amarillo ytextura suave y cremosa. Además, durante un almacenamientode 3 meses a 25°C, no presenta visualmente separación defases.

4.4.3. Influencia de la temperatura y del contenido desólidos en la Velocidad de hidrólisis de lactosa

La temperatura de hidrólisis es un parámetro muyimportante a estudiar, ya que influye significativamente en

121

la velocidad del proceso. La mayoría de los autores quetrabajaron con la enzima Maxilact usaron temperaturas entre37°C y 41°C. Los boletines técnicos de Gist Brocades nvinforman que el rango de temperaturas entre las cuales puedetrabajar la enzima es de 4°C a 37°C, según el sustrato y lametodologia de trabajo, siendo el óptimo de temperatura37°C. Por ejemplo, para hidrolizar la lactosa de 1a lecherecomiendan realizar la incubación a 4°C utilizando tiemposlargos de hidrólisis. No hacen referencia al empleo de lamisma a temperaturas mayores que la óptima. Otros autores,como Baer y Loewenstein (1979), Gekas y López Leiva (1985),Guy y Bingham (1978) y Niápels (1976a) sugirieron valoressimilares. Chiu y Kosikowski (1985) encontraron que enpermeatos de suero con 15 Z p/p de lactosa la temperaturaóptima es de 40°C. Dalquist y col. (1977), Miller y Brand(1980) y Kohlwey y Cheryan (1981) informaron que atemperaturas mayores de 40°C 1a enzima Maxilact comienza adesactivarse cuando se la utiliza en leche o en solucionesdiluídas de lactosa. Sin embargo, Mahoneyy Wilder (1987,1989) establecieron que la lactasa proveniente deEscherichia coli tiene mayorestabilidad térmica en leche óen suero de queso que en medio buffer.

Ya que ninguno de los autores mencionados trabajócon suero de queso concentrado, se estudió el comportamientode la enzima a diferentes temperaturas. Se trabajó primerocon suero de queso concentrado de 49,5 Z p/p de sólidos ylas siguientes temperaturas: 25°C, 37°C, 43°C, 47°C, 50°C,53°C y 58°C. Comola concentración de sólidos del suero noes la mismapara las diferentes partidas, se estudió tambiéncómose ve afectada la velocidad de hidrólisis, a 37°C y47°C, cuando se utiliza suero de 48,0; 51,9 y 57,0 Z p/p de

122

sólidos. En todas las experiencias se trabajó a pH=6,Ü con0,1 X p/p de enzima. También se estudió la velocidad dehidrólisis en suero de queso diluido a 37°C, 43°C y 47°C.

En la Figura 4.6 se presentan los resultadosobtenidos para suero de queso concentrado de 49,5 Z p/p desólidos totales a 25°C; 37°C; 43°C; 47°C; 50°C; 53°C y 58°C.A 37°C, la temperatura más utilizada para reaccionescatalizadas por enzimas, para alcanzar un 60 Z de hidrólisisse necesitan 6,5 horas, pero si se aumenta la temperatura a47°C se logra dicho porcentaje de hidrólisis al cabo del 4horas de reacción. Un mayor aumento de la temperaturatiene un efecto adverso sobre la velocidad de hidrólisis, yaque ésta disminuye notablemente. A 50°C se alcanzaun 30 Z deconversión a los 100 minutos de reacción, la cual ya novaría con el tiempo de reacción debido a la inactivación dela enzima. Por lo tanto, para esta partida de suero dequeso concentrado de 49,5 Z p/p de sólidos la temperaturaóptima de trabajo (entre los valores ensayados) de lalactasa es 47°C ya que a mayor temperatura haydesactivación.

Se sugieren dos factores posibles para explicar esteóptimo de temperatura, tan diferente al reportado en otrossistemas:

I El alto contenido de sólidos del suero de quesoconcentrado. Esto implica también un relativamente altocontenido de proteínas (7 %p/p). Mahoneyy Wilder (1987)encontraron que la desnaturalización de la lactasa de E.coli en buffer fosfato es de primer orden con una vida mediade 1,18 minutos a 60°C, mientras que en leche la vida media

CDa)

pH=6,00,1xp/penzima

oooo[snow-á oro

SlSl’lOHGIH 3320

AA

IIIIÍWIÏIlIFÏTÏIl’ÏÏÏlIIÏjj

O100200300400

TIEMPO(mín)

Figura4.6: Influenciadelatemperaturaenlavelocidaddehidrólisisdelactosaen suerodequesoconcentradocon49,52p/pdesólidos.o25°C,u37°C,

A43°C,O47°C.a50°C,A53°C,o58°c.

123

124

es de 115 minutos a la misma temperatura. Es decir, lalactasa de E. coli es muchomás estable en leche de lo queseria previsible en base a los resultados obtenidos en lasolución buffer. Recientemente estos mismos autores(Mahoney y Wilder, 1989) realizaron un estudio más ampliosobre diversas sustancias que estabilizan térmicamente a lalactasa de E. coli. Encontraron que 1a mayor estabilidad dela enzima en leche se debe principalmente a la presencia decaseína y lactosa y a su vez depende de la concentración deambas. Otro azúcar que agregado a la leche dializadaaumenta el tiempo de vida media de la lactasa, aunque no enel mismo grado que la lactosa, es la galactosa. Noobservaron el mismoefecto con la glucosa. Sugirieron quela estabilización con proteinas depende de la presencia deazúcares que puedan unirse a la enzima, ya sea comosustrato(lactosa) o comoinhibidor (galactosa) y que el efecto delazúcar es específico y no un efecto osmótico general.Observaron además, que la lactosa sola (sin la presencia deproteína) no es capaz de estabilizar a la lactasa de E.coli, aunquesi estabiliza a lactasas de otros orígenes,como las de Kluyveromyces marxianus (Mahoney y Wilder, 1985)y de Streptococcus thermophilus (Greenberg y col. 1985).Para la lactasa de E. coli, la estabilidad térmica en suerode queso diluido (7 X p/p sólidos totales) es cinco vecesmenor que en leche, aunque treinta veces mayor que enbuffer. De las proteínas del suero, agregadasindividualmente a un sistema con 5 Z p/p de lactosa y salesde la leche, la seroalbúmina bovina es la que muestra mayorefecto estabilizador, aumentandocasi cuatro veces el tiempode vida media con respecto al sistema sin proteina.

No se encontraron datos sobre los factores que

125

influyen sobre la estabilidad térmica de la lactasaMaxilact; solamente se menciona en el trabajo de Dalquist ycol (1977) que la seroalbúmina humana actúa como unestabilizador de la enzima durante el almacenamiento.

I La baja actividad de agua del suero de queso concentrado ydel suero de queso concentrado y parcialmente hidrolizado.El suero de queso conCentrado (aproximadamente 50 Z sólidostotales) tiene una actividad de agua de 0,94-Ü.95 y al finalde la hidrólisis la misma desciende a 0,89-Ü,90. Estos

valores de aw son menores que la de los de los sistemasempleados en los trabajos anteriormente citados. Laestabilidad de las proteínas y por lo tanto de las enzimases influenciada por la actividad de agua. Por ejemplo, parala lipasa pancreática porcina una disminución en elcontenido de agua del medio aumenta notablemente el tiempode vida media de la enzima (Hahn-Hagerdal, 1985). Hulton yGuilbot (1975) estudiaron la inactivación de la enzimaribonucleasa en granos de trigo enteros ( humedad (baseseca) = 4,5 a 45 Z p/p) y en ribonucleasa cristalizada(humedad (base seca) = O a 45 % p/p). En base a susresultados concluyeron que el agua juega un importante papelcatalítico en la reacción al disminuir la energía deactivación.

El grado de concentración alcanzado por el suero dequeso determina sus propiedades: contenido de sólidos, pH,aw, viscosidad. fuerza iónica, etc.; por lo tanto esnecesario conocer cómo influye dicha variable en lavelocidad de hidrólisis de lactosa.

' Luego, se analizó también el .comportamiento de la

126

lactasa Maxilact en sueros con diferentes contenidos desólidos totales: 48,0; 51,9 y 57,0 Z p/p trabajando a 37°C y47°C. El suero de 48,0 X de sólidos fue obtenido pordilución y el de 57,0 corresponde a una partida que fueconcentrada en la industria un tiempo mayor que el standard.

En la Figura 4.7 se encuentran representados losresultados obtenidos a 37°C y a 47°C para las tresconcentraciones de sólidos utilizadas. En todos los casosse trabajó con 0,1 Z p/p de enzima y el pH se ajustó a 6,0previamente a la hidrólisis y no fue corregido durante laexperiencia. En los sueros con 48,0 y 51,9 Z p/p desólidos, éste se mantenía constante, pero en el suero con57,0 %p/p de sólidos al final de la hidrólisis el pH era5,70, cercano al pH inicial (este pH no fue corregidodurante la hidrólisis). Los resultados obtenidos muestranque, para una misma temperatura, cuanto más concentrado esel suero de queso, menor es la velocidad de hidrólisis delactosa. Resultados semejantes fueron encontrados porJackson y Jelen (1989) trabajando con sueros de queso de'7 a25 2 p/p de sólidos: a mayor contenido de sólidos lavelocidad de hidrólisis es menor. Aunque, en el caso delsuero de queso concentrado con 57 X p/p de sólidos, alefecto del contenido de sólidos se superpone el efecto de ladisminución del pH, que también afecta negativamente 1avelocidad de hidrólisis. Para los sueros con 48 y 51,9 Xp/p de sólidos al aumentar la temperatura aumenta el gradode hidrólisis alcanzado. Para suero de queso concentrado de57 Z p/p de sólidos hay un aumento al principio de lareacción pero el porcentaje de hidrólisis alcanzado luego delas 7 horas de reacción es menor a mayor temperatura.

100:__pH=6,0

-OAzp/penánm

o 4 C)4I

o 4044:

0404*

0.4

SISI'IOHGIH 95

OG u

I

a

I

i

a

04_o<t ID

4

lod.

ID

<HIÜ.0.A A B

D

2-23

oIIIÍIIIII|IIlllllllllllllïrlllrllfllllíllll

OTOOZOO300400

TIEMPO(mín.)

Figpra4.7: Influenciadelatemperaturaen1avelocidaddehidrólisisde suerodequesoconcentradocon48,0,51,9y57,0Z

lactosapara

p/pdesólidos.

Temperatura:37°C:o48,0Zp/p,A51,9Xp/p,c57,0Zp/p. Temperatura:47°C:O48,0Zp/p,A51,9Zp/p,I57,0Zp/p,¡.57,0Xp/p +0,5Zp/pdeE.D.T.A.

127

128

Al variar el contenido de sólidos, aún dentro de unrango pequeño, hay cambios en el suero:

I Una viscosidad mucho mayor en el suero de 57,0 2 desólidos con respecto al de 48,0 Z.

I El pH inicial del suero más concentrado es 5,6 mientrasque para las otras dos concentraciones es 6,3.

I A mayor porcentaje de sólidos 1a concentración total delactosa aumenta (34 Z p/p para suero de queso concentradocon 48,0 %de sólidos y 40 Z para suero de queso concentradocon 57,0 Z de sólidos).

De acuerdo a lo reportado en bibliografía, laconcentración total de lactosa ejercería cierta influenciasobre la velocidad de hidrólisis. Chiu y Kosikowski (1985)reportaron que existe una concentración óptima de lactosa.Trabajando con permeatos desmineralizados de diferentesporcentajes de sólidos de forma tal que las concentracionesde lactosa fueran 7,5; 15,0; 22,5 y 30 Z p/p encontraronque la velocidad de hidrólisis máxima corresponde alpermeato con 15,0 Z p/p de lactosa. Con respecto a laposibilidad que, a altas concentraciones de lactosa, seproduzca inhibición de la enzima por sustrato, Dalquist ycol. (1977) encontraron que, trabajando con soluciones desuero en polvo desmineralizado de diferentes concentracioneshasta un 30 Z p/p de lactosa, no hay inhibición porsustrato. Este resultado fue corroborado por Giec yKosikowski (1983) utilizando permeato concentrado.

I A mayor porcentaje de sólidos la concentración íónica esmayor. Dentro de los iones presentes en el suero de queso

129

los que están en mayor concentración son el calcio y elsodio (aproximadamente 0,30 y 0,84 Z p/p respectivamente enun suero de queso de 49,5 %p/p de sólidos) y ambos soninhibidores de la enzima (Agbebavi y col., 1987; BoletinesTécnicos de Gist Brocades nv). Por lo tanto la hidrólisisde 1a lactosa deberia ser más lenta cuanto más alto es elcontenido de sólidos.

I A1 aumentar el porcentaje de sólidos y por ende el delactosa, manteniendo constante la concentración de enzima,disminuye la relación enzima/lactosa y por lo tanto lavelocidad.

Unode los posibles factores que afectarían elcomportamiento de la enzima en el suero de queso con 57,0 Zp/p de sólidos es el mayor contenido de calcio. Paraanalizar este fenómeno, se realizó una experiencia agregandoa dicho suero de queso concentrado, previo a la hidrólisis,0,5 X p/p de E.D.T.A. (ácido etiléndiamino tetracético), afin de complejar parte del calcio y otros iones divalentespresentes (relación molar entre el calcio y el E.D.T.A.:0,075/0,013). No se agregó mayor cantidad de E.D.T.A. puesuna mayor concentración del mismo en el suero de quesoconcentrado produce una separación de fases que dificulta lahidrólisis. Se trabajó a pH=6,0, T=47°C, 0,1 Z p/p deenzima y 0,5 z p/p de E.D.T.A.. El resultado obtenido seencuentra también en la Figura 4.7. A1 cabo de 7 horas dereacción se llega a un 59,6 X de hidrólisis, casi un 100 Zmás que sin quelante. En esta experiencia el pH tambiéndisminuyó durante la hidrólisis hasta 5,7. Pese a que larelación calcio/E.D T.A. no es equimolar, el quelanteagregado es suficiente para mejorar -el desempeño de la

130

enzima en el suero de queso con 57,0 Z p/p de sólidos.Estos resultados indicarian la fuerte influencia inhibidoray desestabilizadora del calcio sobre la lactasa.

El hecho de que el valor óptimo de temperaturaobtenido trabajando con suero de queso concentrado sea 47°Cpodria deberse a un efecto especifico del suero sobre laenzima, el cual, estabilizando su estructura, le permitareaccionar a una temperatura mayor que la esperada. O a queesta enzima en particular tuviera una mayor temoestabilidadque las utilizadas en otros trabajos.

Para analizar qué hipótesis justifica mejor elcomportamiento de la enzima, se realizaron experiencias consuero de queso concentrado (de 49,5 Z p/p de sólidos)diluido a 7 Z p/p sólidos totales a tres temperaturas: 37°C,43°C y 47°C. Se trabajó a pH=6,Ü y con 0,02 7. p/p de enzima(se trató de mantener la mismarelación enzima/lactosa queen el resto de las experiencias). Los resultados seencuentran en la Figura 4.8. Como puede observarSe.trabajando a 43°C al cabo de 30 minutos la enzima seinactiva y a 47°C ya a los 10 minutos no hay más actividadenzimática. Esto demostraría que el suero de quesoconcentrado tiene un efecto estabilizador sobre la lactasa,permitiendo que la enzima hidrolice lactosa a temperaturasóptimas mayores que en suero de queso diluido.

Es evidente la fuerte influencia que ejerce elcontenido de sólidos en la velocidad de hidrólisis. Enmuchas de las partidas de suero de queso concentradorecibidas se verificó que la temperatura óptima era 47°C.Sin embargo, en alguna de ellas a '47°C la hidrólisis

CDP\

pH=6,0 .

0,02zp/penzimao

O

C)

C) CD CDGD U7 <T

or0

SISI'IOEJGIH 99

131

C)Cu

oÜgÜÜÜ

109J

AA

O‘FllIIFÍIÍIIIIFTFÏIII[TIIIIrllírrllllTllllllÍTÏ

0100200300400

TIEMPO(mín.)

AAAA

Figura4.8: Influenciadelatemperaturaenlavelocidaddehidrólisisdelactosaensuero dequesodiluido(7zp/_psólidos).o37°C,c143°c,A47°C.

132

procedía más lentamente que a 37°C y no se pudo establecerla causa. Para evitar el problemade la desestabilizaciónde la enzima dependiendo de la partida de suero utilizada,se trabajó para todas las experiencias realizadas con suerode queso concentrado de 49,5-52,Ü Z p/p de sólidos y a 37°C,salvo que se indicaran otras condiciones.

4.4.4. Influencia del pH en la velocidad de hidrólisisde lactosa

El pH es otro factor que influye notablemente sobrela actividad enzimática, ya que la mayoria de las enzimasposeen un valor óptimo de pH donde su actividad es máxima.La actividad de muchas enzimas varía con el pH de la mismaforma en que lo hacen la ionización de ácidos y bases, puesen los sitios activos generalmente hay grupos ácidos obásicos que tienen efecto catalitico solamente paradeterminada conformación. También el contenido de iones delmedio en que se encuentra el sustrato afecta marcadamente elpH de máxima actividad de la enzima (Van Griethuysen y col.,1985), variando éste según el medio en que se encuentre elsustrato.

Para la enzima Maxilact, los boletines técnicos deGist Brocades nv informan que el rango de pH óptimo es6,5-7,0. A pH 5,5 la inactivación es casi total y a pH 6,0se retiene un 60 Z de la actividad. Estos ensayos fueronrealizados con suero diluido (7 Z sólidos totales) a 37°Ccon 0,01 Z p/p de enzima y el tiempo de hidrólisis fue de 4horas. Con respecto a los pHutilizados por otros autorescon esta lactasa, Guy y Edmonson (1978) trabajaron consoluciones de lactosa a pH=G,4; Chiu y Kosikowski (1985)

trabajaron con permeatos de suero de queso con pH 6,5; Giecy Kosikowski (1982) emplearon la enzima en permeatos desuero concentrado (15 Z p/p lactosa) a pH 6,8; Gekas y López(1985) en suero de queso informaron un pH óptimo de 6,7.Roger y col. (1978), utilizando ultrafiltrados con 5 X delactosa, trabajaron a pH 8,8. Dalquist y col (1977) dieroncomopHde óptima estabilidad y actividad para esta lactasaun valor de 7,0, trabajando en leche y suerodesmineralizado.

Comoel comportamiento de la enzima al estudiar elefecto de 1a temperatura sugiere que existen ciertasinteracciones entre los componentes del suero de queso y laenzima, se procedió a verificar cuál es el pH óptimo parala hidrólisis de lactosa en el suero de queso concentrado.Se trabajó a los siguientes valores de pH: 5,0; 5,5; 6,0;6,5 y 7,0. Todos los ensayos fueron realizados a 37°C, con0,1 Z p/p de enzima y suero de queso concentrado de 50,7 Zp/p de sólidos. En la Figura 4.9 se encuentran losresultados obtenidos. El pH al cual se logra un mayorporcentaje de hidrólisis al final del tiempo de reacción es6,0. Sin embargo, a pH 6,5 y a tiempos cortos, lahidrólisis procede más rápido que a pH 6,0. Pero hacia elfinal de la experiencia, para conversiones mayores, laenzima pareciera perder actividad obteniéndose asi unporcentaje de hidrólisis final menor que a pH 6,0. Algosimilar ocurre a pH 7,0 a muy baja conversiones. A pH 5,5 y5,0 la actividad de la enzima disminuye notablemente conrespecto a pH 8,0.

Cuando se trabajó a pH mayores que el normal delsuero (6,1-6,3), es decir pH 6,5 y -7,0, fue necesario

SISIÏOHGIH 2570

T=37°C0,196p/penzima

60 50 40 30 20 10

O

O

O

134

TÏIÏ

Figura4.9:

ÍIÏFFÏFÏÉÏII100

lll

200

TIEMPO(m¡n.)

InfluenciadelpHen1avelocidadde quesoconcentrado.

obH=5,0,

IpH=5,5,

hidrólisis

ÜpH=6,0,

ÍIÍIÍTÏTFI

rI

3OO

delactosa

ApH=6,5,

ensuero

opH=7,Ü.

de

135

ajustar el pH continuamente durante la experiencia ya que elmismotendía a descender. Esto indicaria que se produciríaalguna reacción donde participaria el álcali agregado. Nofue posible establecer qué fenómenoera responsable de estehecho. Cuando se partió de un pH inicial de 6,5 ó 7,0(ajustado con hidróxido de potasio) y no se lo ajustóconstantemente a lo largo de la hidrólisis, el pHdel suerodisminuyó en función del tiempo hasta llegar a1 valor normaldel suero de queso y las curvas obtenidas eran semejantes alas obtenidas a pH 6,0.

Podria considerarse, en base a estos resultados, laposibilidad de trabajar primero a pH 6,5 hasta conversionescercanas a1 50 X y luego trabajar a pH 8,0, pero el ajustecontínuo del pH es un problema adicional que complica elproceso y 1a disminución conseguida del tiempo de reacciónno es tan significativa frente al tiempo total de reacción apH 6,0. Teniendo en cuenta estos resultados se eligió 8,0comovalor de pHpara realizar la hidrólisis de lactosa enel suero de queso concentrado.

Si se utiliza suero de queso concentrado de pHnatural 6,1-6,3 (i.e. sin ajuste inicial de su pH), tambiénes posible realizar 1a hidrólisis llegando a resultadossemejantes a los de pH 6,0.

4.4.5. Influencia de la variabilidad de distintas partidasde suero de queso concentrado en la hidrólisis delactosa

.Diferentes partidas de suero de queso concentrado

136

presentan pequeñas variaciones en su composición. debidasprincipalmente a que no siempre reciben exactamente el mismoprocesamiento en 1a planta industrial. Es asi comodiferentes partidas pueden presentar diferencias en 1aviscosidad, el tamañoy distribución de los cristales delactosa, el contenido de sólidos, la composición iónica,etc.. Todos los factores enumeradospueden ejercer ciertainfluencia sobre el comportamiento de la lactasa, de formatal que los resultados obtenidos para las diferentespartidas no sean similares.

Para estudiar el efecto de las diferencias entre lasdistintas partidas en la conducta de la enzima, se analizóla velocidad de hidrólisis para sueros cuyo contenido desólidos estaba entre 49,5 y 52,0 Z p/p. La experiencia dehidrólisis de lactosa se realizó en las siguientescondiciones: T=37°C; pH:8,Ü y 0,1 Z p/p de enzima. En laTabla 4.8 se comparan, para cada tiempo, el porcentaje dehidrólisis alcanzado en las distintas partidas de sueroensayadas.

Los resultados obtenidos indican que la hidrólisis delactosa procede aproximadamente a la misma velocidad endiferentes partidas de suero con 49,5-52,Ü %p/p de sólidos.Por lo tanto, las conclusiones obtenidas para una partida sepueden aplicar para cualquier suero de queso concentrado conese rango de concentración de sólidos. Asimismo se debetener en cuenta que los diferentes sueros hidrolizados noevidencian diferencias visuales en su aspecto, textura,color, viscosidad, etc..

4.4.6.'Influencia de los agentes antimicrobianos utilizados

137

Tabla 4.8

Porcentajes de hidrólisis en función del tiempo de reacciónen diferentes partidas de suero de queso concentrado(49,5-52,0 Z p/p sólidos totales) a T=37°C ; pH=6,0 y 0,1 Z

concentraciones de sólidos de lasdiferentes partidas utilizadas son: 1) 49,5, 2) 50,7, 3)51,9, 4) 51,3, 5) 52,0, 6) 51,9; 7) 49,9 Z p/p de sólidos.

p/p de enzima. Las

96 HIDROLISIS

PARTIDA 1 2 3 4 5 6 7

TIEMPO(min)

0 0 0 0 0 0 0 0

15 9,2 7,5 8,9 10,2 12,6 10,6 11,630 15,5 17,7 10,5 17,4 16,2 16,2 14,645 20,1 19,9 14,4 21,1 19,5 20,8 18,780 22,3 20,5 20,3 22,8 21,7 21,9 _21,490 29,0 23,5 23,8 28,2 27,9 26,6 28,6120 35,1 29,6 29,4 32,8 30,7 32,0 35,2180 42,4 45,7 43,2 41,8 38,2 37,4 42,7240 49,4 53,5 50,5 49,2 47,5 43,3 48,2300 54,6 61,3 56,6 55,5 56,5 55,5 56,5360 59,0 62,9 60,2 59,9 60,0 80,7 58,5420 63,7 65,4 64,1 66,4 65,6 64,2 63,9

138

en la velocidad de hidrólisis de lactosa

Para la obtención de suero de queso concentrado yparcialmente hidrolizado estable microbiológicamente atemperatura ambiente se utilizaron dos agentesantimicrobianos: sorbato de potasio (SK) y propionato decalcio (PCa). Ambos conservadores se emplearon en unaconcentración máximade 0,2 X p/p. Pese a que esta cantidades pequeña, comoel agregado del conservador se debe hacerantes de realizar la hidrólisis, se analizó si el sorbato depotasio y/o el propionato de calcio ejercen algún efectosobre la actividad de la enzima. Se realizaron dosexperiencias, con suero de queso concentrado, en lassiguientes condiciones: T=37°C, pH=6,0, 0,1 Z p/p de enzimay 0,2 Z p/p de SK ó PCa. En la Figura 4.10 se encuentranlos resultados obtenidos, comparados con los del control(sin conservador). Se puede observar que ninguno de los dosagentes antimicrobianos ejerce una influencia notable en lavelocidad de hidrólisis y por lo tanto en la actividad de laenzima. Se concluye que ambos pueden ser agregados alprincipio del proceso a fin de retardar y/o inhibir elcrecimiento microbiano.

4.4.7. Influencia de la galactosa y de la glucosa en lavelocidad de hidrólisis de lactosa

Galactosa y glucosa son los productos resultantes dela hidrólisis de lactosa por acción de la enzimafi-galactosidasa. Varios autores (Van Griethuysen y 001.,1985, Friend y Shahani, 1982; Hourigan, 1985, Park y col.,1979, Van Griethuysen y 001.. 1988, Ma'y 001., 1983, Heetall

SISIÏOHOIH 9€

T=37°CpH=6,0

-0,15%p/penzima

4.0

¡ l

C)(O

0.

1|!OÑ

{MD

l lI

CDCH

C

lllllllllC)

9a

CD

O100200

TIEMPO(mín)

300

Figura410: Influenciadelosconservadoresutilizadosen1avelocidadde lactosaensuerodequesoconcentrado. Xpropionatodecalcio,Ocontrol(sinconservador).

a0,2Zp/psorbatodepotasio,

TIÍÍIIIIIFÏÍFIÍÍÏIIIIIIFFÏÏFÍIrlTrlllllerrlll

400

hidrólisis

de

O0,2

139

¡40

y 001.. 1874, Scott y 001., 1984, Flaschel y 001.. 1982)coinciden en que la galactosa inhibe en forma competitiva lareacción de hidrólisis de lactosa. Cheng y col. (1985)afirman. además, que un tratamiento correcto de dichacinética debe incluir la inhibición no competitiva de laglucosa. En la sección 4.4.9. se discute con más detallela cinética de esta reacción.

A fin de verificar la posible inhibición por ambosazúcares y de establecer su importancia relativa, sedeterminaron las curvas de hidrólisis sobre suero de quesoconcentrado, agregando inicialmente 5 Z p/p de galactosa ó 5X p/p de glucosa. La hidrólisis se realizó en lassiguientes condiciones: T=37°C; pH=6,0 y 0,1 % p/p deenzima. En la Figura 4.11 se encuentran los resultadosobtenidos. Cuandoinicialmente hay glucosa presente, sellega hasta un 49 2 de hidrólisis, 14 Z menos que en elcontrol (suero sin agregado de glucosa o galactosa), al cabode 420 minutos de hidrólisis; mientras que en presencia. degalactosa, la reacción procede solamente hasta un 28 Z deconversión de la lactosa al cabo del mismo tiempo. La grandiferencia en la capacidad inhibitoria de ambos azúcaresjustificaria el hecho de que la mayoria de los autores sólotengan en cuenta la inhibición competitiva de la galactosadespreciando la acción de la glucosa. Por ejemplo, Friend yShahani (1982), reportaron que la galactosa es un inhibidormuyeficaz de la lactasa. Encontraron que, trabajando consoluciones de lactosa 200 mM a pH=8,5 con la enzima deAspergillus oryzae, la presencia inicial de 5 mM degalactosa en el sistema disminuye la actividad de la enzimaen un 50 Z.

SISIÏOHGIH 95

—T=37°cpH=6,0_ -0,1sep/penzímo

TTIÏIIIÍIÏÏIllïílllT

OáïrlïlfïllIÏÍIIIÍIIFÏÏÏI

O3004OO

200

TIEMPO(min)

Figura4.11: Influenciadelapresenciadeglucosaóvelocidadde

o5z

galactosaenla

hidrólisisdelactosaensuerodequesoconcentrado.p/pgalactosa.

A5Xp/Pglucosa,

Ocontrol(sinazúcaragregado).

141

VW

4.4.8. Evolución de la concentración total de lactosa y dela concentración de lactosa soluble durante lahidrólisis

El suero de queso concentrado sin hidrolizar presentagran cantidad de cristales de lactosa en suspensión quedesaparecen durante la reacción de hidrólisis. Se analizóla variación de la concentración total de lactosa y laconcentración de lactosa soluble a lo largo del proceso. Sehidrolizaron 600 g de suero de queso concentrado. A cadatiempo se tomaron muestras de aproximadamente 40 g de suero,en las que se inactivaba la enzima ajustando el pH a 5,0.Se separaba una muestra de 2 g para la determinación delactosa total y el resto se centrifugaba 30 minutos a 2000rpm a fin de lograr una completa precipitación de loscristales. En el sobrenadante se determinaba lactosasoluble. Los resultados se encuentran en la Figura 4.12.donde se puede observar que, dentro del error, laconcentración de lactosa soluble permanece aproximadamenteconstante hasta transcurridos unos 220-240 minutos dereacción, mientras que la concentración de lactosa totaldecrece más rápidamente. A1 final de la hidrólisis ambasconcentraciones coinciden.

Debidoa estos resultados. se planteó el interrogantesi la enzima es capaz de actuar sobre los cristales delactosa, ademásde la lactosa en solución. En bibliografiano fue encontrada ninguna referencia al respecto, aunquedebe tenerse en cuenta que por lo general se trabaja conconcentraciones de lactosa menores que la saturación. Unahipótesis para explicar porqué la concentración de lactosatotal decrece muchomás rapido que la de lactosa soluble es

C)d.

u)V3

T=37°CpH6,00,15%p/penzima

C) U)F) Ci

FEH

CDC4

U)

ro4

VSOlOVÏ d/d %

“GD

If}!

POfl

H31

CD 5CIÏÉTIF

O

Tr¡ÏI¡ÏTÏIlI

100

Ïllllílflllfllllllrl

200 l300

TIEMPO(mín)

FIIÏIIÍÍII

400

¡1¡5OO

Figura4.12: Variacióndelaconcentracióndelactosasolubleydelactosatotaldel dequesoconcentradoenfuncióndelgradodehidrólisis.lactosasoluble.i eltiempode observadoenelmicroscopio(40X).

suero

total,

cristales,

Olactosa

de

O

indicadesapariciónlos

143

144

que la enzima hidroliza preferentemente a la lactosa ensolución y los cristales se van disolviendo a una velocidadsuficiente de forma tal de mantener una concentración delactosa soluble cercana a la saturación (es decir que lavelocidad global de reacción esté controlada por la etapa dereacción química). El leve descenso de la concentración delactosa soluble a porcentaje de hidrólisis altos se deberiaa que el aporte de lactosa por disolución de cristales esmenor que el consumo por reacción quimica. Por otra parte ,a los 390 minutos aproximadamente se observaba almicroscopio (40X) la desaparición de los cristales delactosa en suspensión.

Para esclarecer un poco más este hecho, se trabajó ensistemas con diferentes concentraciones de lactosa total.Para variar la concentración total de lactosa se podriadiluir el suero de queso concentrado a diferentesconcentraciones de sólidos. Sin embargo de esta forma nosólo variaría la concentración total de lactosa sino quetambién 1a viscosidad, fuerza iónica, aw. pH, concentraciónde inhibidores y activadores de la enzima, factores todosque afectan a la reacción enzimática. Por lo tanto unsistema diluido no seria comparable al suero de quesoconcentrado. También se debe considerar que el suero dequeso concentrado posee cristales de lactosa en suspensión.Cuando se diluye el suero a un contenido de sólidos menor,disminuirá el contenido de cristales de lactosa y laconcentración de lactosa soluble será la de saturación. Esdecir, no se podria variar la concentración de lactosasoluble, que seria la atacada por la enzima. Esto severifica siempre que no se diluya al punto en que laconcentración de lactosa total sea menOr a la solubilidad

145

(este punto corresponde a un suero de 30 Z p/p de sólidosaproximadamente).

Unaalternativa para el análisis sería variar laconcentración de cristales de lactosa, manteniendo laconcentración de lactosa soluble constante. Si la lactasasolamente hidrolizara a la lactosa en solución, no deberíanexistir diferencias entre experiencias realizadas condiferentes concentraciones totales de lactosa (manteniendola concentración total de lactosa por encima de su valor desolubilidad).

Asi, se realizaron una serie de experienciasutilizando diferentes concentraciones totales de lactosa.Se procedió de la siguiente manera: el suero de quesoconcentrado se centrifugó 30 minutos a 2000 rpm hasta lacompleta precipitación de los cristales y se separó elsobrenadante. A una masa fija de sobrenadante se agregócantidades crecientes de cristales de lactosa (precipitado)a fin de aumentar la concentración de lactosa total. Sehomogeneizó y se determinó la concentración de lactosa paracada caso, siendo los valores: 13,4 X p/p (sin cristales),17,1 Z p/p, 24,1 Z p/p y 28,9 Z p/p. De esta forma se pudovariar la concentración total de lactosa sin variar otrascaracterísticas del suero de queso concentrado. Cada uno deestos sistemas se hidrolizó según el método ya descripto.Para todos las casos se trabajó a 37°C, pH=8,0 y 0,1 Z p/pde enzima. En la Figura 4.13 se presentan los resultadosobtenidos. Las curvas de hidrólisis para 24,1, 28,9 y 35,8(suero sin centrifugar) Z p/p de lactosa coinciden,indicando que las conversiones que se logran en cada casoson iguales (dentro del error experimental). Esto indicaria

SlSHOHGIH 3€70

T=37°CpH=6,00,1SBp/penzima

60 50 40 30 20

lÏ7

TIEMPO(min)

Figura4.13: Influenciadelaconcentracióndecristalesde

de

O13,4ZP/P.

hidrólisisdelactosaensueroqueso lactosautilizadas: y¿z35,8zp/p.

o17,1Zp/p,

lactosa

concentrado.

A24

,1

ll100

en

la

velocidad

Concentraciones

Zp/p.

Ü74

de dep/p

T47

150

146

147

que la presencia de los cristales de lactosa no afecta lavelocidad de hidrólisis. La curva del sistema con 17,1 Xp/p de lactosa, pese a tener cierta cantidad de cristales ,no se superpone a las demás, probablemente pues al ser muypequeña la cantidad de cristales agregados éstos sesolubilizaron en las primeras etapas de la reacción pasandoa ser un sistema sin cristales. Estas experienciasrefuerzan la hipótesis de que la enzima hidrolizaríapreferentemente la lactosa soluble.

4.4.9. Análisis cinético de la hidrólisis de lactosa

4.4.9.1. Modelosaplicados

Como se mencionó anteriormente, existen diversosenfoques en la bibliografia para describir la cinética dehidrólisis enzimática de lactosa. Para el caso particularen el que el sustrato es lactosa en suero de queso y laenzima Maxilact LX5000, el modelo utilizado en bibliografíapara describir la cinética de hidrólisis enzimática delactosa, cuando se emplean ecuaciones integradas, es el deMichaelis y Menten con inhibición competitiva de lagalactosa. Tambiénpor lo general el efecto inhibidor de laglucosa no se toma en cuenta.

Cuando se plantea un modelo matemático para ajustarlos datos experimentales de una dada reacción, no debeolvidarse que el hecho de que haya acuerdo entre lapredicción teórica y los datos experimentales no prueba queel mecanismodel modelo sea necesariamente válido, sino quesimplemente sugiere que en ese caso en particular dichomodelo puede ser utilizado comoherramienta matemática para

148

predecir el desempeñodel reactor.

En el punto 4.4.7 se estudió la inhibición relativade la galactosa y la glucosa en la reacción de hidrólisis.Si bien 1a inhibición que ejerce la glucosa es menor que laque ejerce la galactosa, ambasdeberían, en principio, sertomadas en cuenta al postular un modelo para predecir eldesarrollo de la reacción. En la sección 4.4.8 se estudióla evolución de la concentración de lactosa soluble y totala lo largo del tiempo de hidrólisis. La lactosa solublepermanece aproximadamente constante durante 220-240 minutos

cuando se trabaja a 37°C; en la misma sección (4.4.8) sevió también que distintas concentraciones de cristales delactosa no afectan la velocidad de hidrólisis. Por ello, esprobable que el reactor se comporte como un reactorsemi-batch, es decir, a medida que se consume lactosasoluble por hidrólisis enzimática, se disuelven cristalespara mantener la concentración de lactosa soluble constantee igual a la solubilidad. Por lo tanto en la postulación deun modelo se deberían tener en cuenta estos fenómenos

Por otro lado un modelo que considere que laconcentración de lactosa soluble permanece constante nopuede ser utilizado para describir toda la curva dehidrólisis y para cada condición experimental en la que setrabaje se debe determinar el rango de validez de dichomodelo. Para facilitar la descripción de la reacción dehidrólisis para que pueda ser utilizada con finesindustriales, tomando en cuenta lo expresado por labibliografía, se emplearon también modelos que poseen lamisma funcionalidad que la ecuación de Michaelis y Menten,considerando la variación de la concentración de lactosatotal. Es decir, se trata como si la misma estuviera

149

disponible en su totalidad para reaccionar con la enzima,independientementede si está solubilizada o precipitada.

Es importante tener en cuenta que la materia primaque se empleó en este trabajo es muy compleja, habiendomuchos factores que pueden influir en el mecanismo de acciónde la enzima, a saber: la presancia de proteínas que afectanla estabilidad de la enzima (Mahoneyy col., 1989; Dalquisty col., 1974; Decleire y col., 1985); la presencia de salesque activan o inhiben a la enzima, por ejemplo Agbebavi ycol. (1987) encontraron que las sales del suero ejerceninhibición incompetitiva sobre la lactasa; Flaschel y col.(1982) encontraron que la velocidad de hidrólisis por lalactasa de Aspergillus niger se ve afectada por elequilibrio de mutarrotaoión de los azúcares.

Resumiendo, para describir matemáticamente las curvasobtenidas se utilizaron los siguientes modelos:

I Cinética de Michaelis y Henten con inhibición competitivapor galactosa y no competitiva por glucosa considerando quela concentración de lactosa soluble se mantiene constantedurante un largo lapso de la reacción.

I Modelo con la misma funcionalidad que la cinética deMichaelis y Henten con inhibición competitiva por galaotosaconsiderando que la variación de la concentración desustrato es igual a la variación de la concentración delactosa total.

I Modelo con la misma funcionalidad que la cinética deMichaelis y Henten con inhibición competitiva por galactosay no competitiva por la glucosa, considerando que la

150

variación de la concentración de sustrato es igual a lavariación de la concentración de lactosa total.

No se consideró una posible inhibición por sustrato,ya que trabajando con leche concentrada con 30 % p/p delactosa la enzima no se vió inhibida por la lactosa(Dalquist y col., 1977). Tampoco se consideró lainhibición de las sales presentes en el suero de queso paraevitar complicaciones excesivas en el modelo matemáticoutilizado.

4.4.9.2. Problemas específicos del suero de quesoconcentrado para el tratamiento matemático de lacinética de hidrólisis

El análisis de los datos experimentales de hidrólisisde lactosa en función del tiempo se realizó utilizandoecuaciones integradas pues existen problemas que impidenrealizar un análisis basado en velocidades iniciales, asaber:

I La imposibilidad de variar la concentración total delactosa sin que varien otros factores. Efectivamente, paravariar la concentración total de lactosa es necesario diluirel suero de queso concentrado, con lo cual no sólo varía laconCentración del azúcar sinó también la viscosidad, fuerzaiónica, aw y pH del suero de queso, factores que afectan laactividad y estabilidad de la enzima, resultando asi unsistema diferente del que se desea estudiar.

I A1 ser la enzima fuertemente inhibida por uno de susproductos, es difícil realizar una determinación exacta de

151

la velocidad inicial, pues ésta decrece muy rápidamente.Salvo que una curva de concentración de producto en funcióndel tiempo presente una porción lineal significativa, esdifícil medir en forma exacta las velocidads iniciales ycualquier error sistemático que resulte de una apreciaciónsubjetiva equivocada es muy difícil de detectar (VanGriethuysen y 001., 1985; Cornish-Bowden, 1975). Heetall ycol. (1974) han recomendadoque, para utilizar el método delas velocidades iniciales, los ensayos de hidrólisis delactosa se realicen en condiciones tales que menos de un 5%del sustrato sea convertido en producto, pues si laconversión es mayor la actividad de la enzima varía muchodebido a la inhibición por la galactosa.

I Dada la alta viscosidad del suero, al agregar la enzimapara iniciar la reacción se requiere un cierto tiempo paraque ésta se distribuya homogéneamenteen todo el suero. Porlo tanto muestras tomadas a tiempos muy cortos no sonrepresentativas del verdadero grado de avance de lareacción.

Todas estas consideraciones hacen inconveniente eluso del método de las velocidades iniciales, por lo que seanalizaron los datos experimentales de concentración desustrato versus tiempo de reacción por medio de ecuacionesde velocidad integradas.

4.4.9.3. Procedimientos matemáticos utilizados paracalcular los parámetros cinéticos de la reacción

Para calcular los parámetros de las ecuaciones

152

cinéticas por medio de ecuaciones integradas se puedeproceder de diferentes formas. Se pueden aplicar métodos deregresión no lineal o sino linealizar la ecuación y aplicarregresión lineal para el cálculo de 1a ordenada al origen yla abcisa. Este último método es el más sencillo paraobtener una estimación de las constantes, pero es aplicablesolamente cuando la función es linealizable y algunosautores consideran más confiable el uso de un método deregresión no lineal (Wilkinson, 1961; Colquhoun, 1989;Matiska y Kovar, 1985). Los métodos de regresión no linealson más versátiles para trabajar con ecuaciones cinéticas ygeneralmente dan una mejor estimación de los parámetros(Atkins y Nimmo, 1975). Respecto de los numerosos métodosde regresión no lineal que existen, es dificil decidir 'apriori' cuál se ajustará mejor a las ecuaciones que seemplearán.

Los siguientes métodos de cálculo fueron empleadospara estimar los coeficientes de las ecuaciones cinéticas:

I Regresión no linealSe utilizaron dos métodos de regresión no lineal: el

método de Marquardt (Apéndice 1) y la rutina para regresiónno lineal del Departamento de Biomatemática de laUniversidad de California, Los Angeles, USA (BMDP AR)(Apéndice 2). El método de Marquardt se usó para ajustarlos coeficientes de las ecuaciones a dos parámetros del tipo

t = P1 f([S]) + P2 g([S]) (4.21)

donde f1 y f2 son los coeficientes de 1a ecuación querepresentan las constantes cinéticas agrupadas y losparámetros que se ajustarán por el método de regresión no

153

lineal; f([S]) y g([S]) representan funciones de laconcentración de sustrato que dependerá del modelo que seconsidere. Por medio de esta ecuación se puede representaral modelo de igual funcionalidad que la cinética deMichaelis y Menten con inhibición competitiva y también almodelo que considera que la concentración de lactosa solubleno varia durante un lapso de la reacción. Cuando se aplicóel método de Marquardt a los resultados experimentales paracalcular ?1 y P2 el valor encontrado de estos parámetros eraindependiente del valor inicial con que se comenzara laiteraoión. Hatyska y Kovar (1985) compararon diferentesmétodos de regresión no lineal para ajustar los datosexperimentales de la ecuación de Michaelis y Henten ycalcular los parámetros de la ecuación. Recomendaron elempleo del método de Marquardt para análisis de rutina ysugirieron el uso de 10 a 15 datos para obtener mejoresresultados.

La rutina BHDPAR se empleó para ecuaciones delmismo tipo que la anterior pero con un término más

t = P1 f([S]) + P2 g([S]) + f3 h([S]) (4.22)

de forma tal que quedan tres parámetros a ajustar. Estaecuación representa el caso en que se considera inhibiciónsimultánea de galactosa y glucosa teniendo en cuenta lavariación de lactosa total. Se intentó ajustar estaecuación con el método de Marquardt pero los resultadosobtenidos dependían fuertemente del valor inicial dado a losparámetros para comenzar a iterar. Con una mínima variaciónen el galor inicial.de uno de ellos el valor final de lostres parámetros variaba mucho, llegando'incluso a producirsecambios de signo en los mismos. El motivo de esto

154

probablemente sea que no se tiene una buena estimacióninicial de los parámetros para comenzar a iterar. Con larutina BMDPAReste problema no existia y por lo tanto se 1autilizó para este caso. Por lo general cuanto mayor es elnúmerode parámetros de una ecuación, se dificulta el ajustede los datos experimentales dado que se requiere de una muybuena estimación del valor inicial de los parámetros parafavorecer una rápida convergencia del método de regresión.

I Regresión linealLas ecuaciones cinéticas que corresponden a1 modelo

con inhibición competitiva por galactosa y con concentraciónde lactosa soluble constante pueden ser linealizadas (versecciones 4.2.4 y 4.4.9.5) y los parámetros P1 y P2calcularse a partir de la ordenada y abcisa de la recta.Pese a que teóricamente esta regresión no es válida, pues eltiempo es la variable independiente y la concentración desustrato la dependiente (es decir, se trata de una ecuaciónimplícita), Fisher y Nimmo (1972) encontraron que lasestimaciones de los parámetros que se obtienen no presentandesviaciones y son precisas. Atkins y Nimmo (1973)utilizaron este método para ajustar curvas simuladas deavance de reacción en función del tiempo y comparan estosresultados con los obtenidos por regresión no lineal. Suconclusión es que, pese a no ser teóricamente correcto, laestimación que se obtiene de los parámetros es buena.siempre que los datos que se utilicen sean suficientementeprecisos y las concentraciones iniciales de sustrato mayoresque Km.

4.4.9.4. Descripción matemática de las Curvas de hidrólisis

En las secciones 4.4.3 y 4.4.4 se presentaron lascurvas de hidrólisis de lactosa obtenidas a diferentestemperaturas y pH en suero de queso concentrado. En estasección se analizará la descripción matemática de las mismasutilizando los diferentes modelospropuestos.

4.4.9.4.1. Modelo cinético con concentración de sustratosoluble constante, inhibición competitiva porgalactosa y no competitiva por glucosa

Se verificó experimentalmente que para lascondiciones en que se realiza la hidrólisis del suero dequeso concentrado, en este trabajo. 1a concentración delsustrato en solución, es decir de lactosa, permaneceaproximadamente constante durante 220-240 minutos cuando lareacción transcurre a 37°C (ver sección 4.4.8). Además laglucosa y galactosa inhiben la reacción de hidrólisis (versección 4.4.7). En vista de estos resultados se dedujeronlas ecuaciones matemáticas que contemplan estos fenómenos.

La ecuación de velocidad de Michaelis y Menten coninhibición competitiva y no competitiva puede integrarseconsiderando que 1a concentración de lactosa soluble novaría a lo largo del tiempo, y que la enzima sólo es capazde actuar sobre la lactosa que está soluble. La ecuación develocidad para la reacción es:

v:_dL11 -d[S1‘] v . [Ss]

dt dt Km [ 1 + L%¿% + LEÏ% ] + [Ss]

156

donde[ST]: es la concentración de sustrato total.[Ss]: es la concentración de sustrato soluble.[P1]: es la concentración del producto que inhibe en forma

competitiva.Kil: es la constante de inhibición debida a P1.[P2]: es la concentración del producto que inhibe en forma

no competitiva.KiZ: es la constante de inhibición debida a P2.

Si se considera que [P1] = [SOT] —[ST], donde [SOT] es laconcentración de lactosa total inicial y [ST] es laconcentración de lactosa total a un tiempo t de reacción(por concentración de lactosa total se entiende a 1a lactosasoluble más la cristalizada) y se reemplaza la expresión deP1 en la ecuación de velocidad se llega a:

d[S'r]: - v . [Ss] I

dt Km { 1 + ([SoT] — [ST]) [ ¡%Ï + Káï ]} + [Ss]

(4.24)

Separando variables se íntegra esta ecuación considerando[Ss] constante, obteniendo la siguiente expresión:

Km + [Ss] . 1 1 1t = ——*—————- ( [SOT] - [5T]) + -———————. Km —?— + —w—

V [Ss] 2 v [ss] [ Kll Kiz ]

([SOT] - [STD2 (4.25)

157

La ecuación 4.25 se puede escribir en función de losparámetros P1 y f2 de la siguiente manera:

t = m < [Sor] - Ls-rJ ) + :Pz < [Sor] - [Sr] >2

(4.23)

donde f1 = -EE—1—LÉ51— [f1] min/ mHV [SS]

1 1 . 2

wz = ————-——-. Km [ —r— + —Tr ] [w2] mln/ mM2 v [Ss] Kll K12

La ecuación 4.25 puede también ser linealizada y se obtienela siguiente expresión:

t : Km + [SS] + 1 . Km -¿“ + -¿­[Sor] - [ST] v LsS] 2 v [Ss] [ “11 “12 ]

([SOT] - [ST]) (4.27)

Para este caso se define f1 y P2 igual que para 1a ecuación4.26.

Los parámetros f1 y P2 se calcularon por el método deMarquardt y por regresión lineal de la ecuación linealizada.Los resultados se encuentran en la Tabla 4.8 Se analizópor este método sólo la experiencia realizada a 37°C y pH8,0 ya que fue en estas condiciones en las que se estudió laevolución de 1a concentración de la lactosa soluble. Losparámetros obtenidos por el método de Harquardt son

158

Tabla 4.8

Parámetros de la ecuación que describe la hidrólisis delactosa considerando la concentración de lactosa solubleconstante, inhibición competitiva por galactosa y nocompetitiva por glucosa, a T = 37°C y pH = 6,0.

'l' (0C) MARQUARDT R. LINEAL

.Pl P2 .‘Pl .‘PZ

37°C 7.10’4 110'5 1.1u‘6 19.1u‘8 u,0819 10‘3 '/.1u“4 :3.10’5

diferentes que los encontrados por regresión lineal. En laFigura 4.14 se encuentran las predicciones teóricas y lospuntos experimentales. Cuando se calculan los parámetros dela ecuación por el método de Marquardt (Figura 4.14a) elajuste de los datos experimentales con la predicción teóricaes muy bueno. Lo mismo ocurre cuando se calculan porregresión lineal (Figura 4.14b).

Al utilizar este modelo para representar los datosexperimentales se debe tener en cuenta que solamente esválido mientras la concentración de lactosa solublepermanezca aproximadamente constante. Dado que paraalcanzar un porcentaje de hidrólisis del 60-85 %, necesariopara la desaparición de los cristales, es necesario utilizartiempos de hidrólisis mayores se emplearon otros modelospara describir la hidrólisis que son válidos para todo eltiempo de reacción.

Para todos.los casos en el cálculo de los parámetrosse emplearon las siguientes unidades: minutos para el tiempoy mMpara la concentración de lactosa.

4.4.9.4.2. Modelo cinético con inhibición competitivapor galactosa y concentración de sustrato iguala la concentración de lactosa total

La ecuación que representa la cinética tipo Michaelisy Menten con inhibición competitiva por la galactosa yconcentración de sustrato igual a la concentración total delactosa (ecuación 4.7b ), escrita en función de losparámetros P'l y P'Z. es:

160

Figura 4.14:Predicción de la curva de hidrólisis de lactosa en suero dequeso concentrado, mediante el modelo que consideraconcentración de lactosa soluble constante, inhibicióncompetitiva por galactosa y no competitiva por glucosa,obtenida a T = 37°C y pH = 8,0. Los parámetros de la ecuaciónse calcularon por: a) método de Harquardt y b) regresiónlineal. D datos experimentales; predicción teórica.

161a)

T = 7 °C EpH = 6.0LACTOSA SOLUBL CONSTANTE70: Marquordt

É c1

GOÉ c1

3 D

50':EL) .4(n Z3 40*O 2g :Ï 30-:6Q Z20:

105q

o IÍrÍIIIIIIIÍIIÍÏIÏI'III'IIIÍÍIIIÍÏÍÍ‘IIIIIÍWO 100 200 300 400

TIEMPO (min.)

b) T = 37 °C ¿DH = 6,0LACTOSA SOLUBL CONSTANTE70-_ Regresíon lineal

E n60: u

i u

50-:(-12 _cn Z:1 40:g Z uo _.Ï 30-:R Z

201

10-:

OEIllIÍÍIÏÏIIIIÏIIIÏll|III'ÍÍÏIIÍIÏIIIIÍÍlÍÍrfiO 100 200 300 400

TIEMPO (mín.) '

162

t = P'l ( [SOT] — IST] > + fi'z ln LÉ914[ST]

(4.28)

donde [SOT]y [ST] representan la concentración de lactosatotal, inicial y al tiempo t, respectivamente. La ecuación4.29 es la expresión linealizada para este modelo, puestaen función de P'l y P'Z:

_______L________ 1 ?'2 >n Lsggl (4.29)( [SOT] - [ST] ) ( [So'r] - [ST] ) [STJ

Los parámetros P'l y P'Z se calcularon por regresión nolineal según el método de Marquardt y por regresión lineal.No se analizan las curvas a partir de los tiempos dereacción a los cuales es evidente la inactivación de laenzima, es decir a partir de los cuales el grado de avancepermanece sin variación (caso de las curvas a pH 6,5 y 37°C.En las Tablas 4.9 y 4.10 se presentan los valores de f’l yP'Z obtenidos y en las Figuras 4.15, 4.16 la representacióndel modelo y los puntos experimentales cuando se analiza lainfluencia de la temperatura y el pH por el método deMarquardt y por regresión lineal: Cabe aclarar que lapartida de suero de queso concentrado utilizada paraanalizar la influencia de la temperatura es diferente de lautilizada para analizar la influencia del pH, por lo tantolos resultados obtenidos a 37°C y pH 6,0 difieren levementepara amboscasos. Para el análisis de la influencia del pHno ee consideraron los tres últimos puntos de la curvaobtenida a pH 6,5 pues hubo inactivación de la enzima. Entodos los casos se obtiene buena concordancia entre elmodelo teórico y los datos experimentales.

163

TABLA 4.9

Parámetros para la ecuación que describe la hidrólisis delactosa considerando inhibición competitiva por la galactosay concentración de sustrato igual a 1a concentración delactosa total. Influencia de 1a temperatura (pH = 8,0).

1' (oC) MARQUARDT R. LINEAL

w'1 y'z y'1 p'z

25°C —1,1110,28 13481212 -0,8810,10 1182117437°C -0,8810,07 874152 —0,7710,03 95215543°C -0,5110,08 808150 —0,8210,07 888110347°C -0,5010,04 573123 -0,4510,04 541158

TABLA 4.10

Parámetros de la ecuación que describe las curvas dehidrólisis de lactosa considerando inhibición competitiva de1a galactosa y concentración de sustrato igual a laconcentración de lactosa total. Influencia de pH (T =37°C). '

pH MARQUARDT R. LINEAL

fi'l ?'2 fi'l f'Z

6,0 -0,5810,08 874154 -0,8210,04 9941806,5 —0,8710,40 10511202 -1,5110,22 14881252

164

Figura 4.15:Predicción de la curva de hidrólisis de lactosa en suero dequeso concentrado por medio de un modelo tipo Michaelis yHenten con inhibición competitiva por galactosa considerandoque la variación de la concentración de sustrato es igual ala variación de la concentración de lactosa total. Influenciade la temperatura (pH = 6,0). Los parámetros de la ecuaciónse calcularon por: a) método de Harquardt y b) regresiónlineal. o T=25°c; n T=37°C; ¿x T=43°c; <>T=47°c;

predicción teórica.

58HIDROLISIS

165

INFLUENCIA DE LA TEMPERATURAINHIBICION COMPETITIVA POR GALACTOSA

80 Morquordt

70

NU#AUIG)OOOOO

I

10CYÍfilIIIÍÏIIIIIIllllllllllTfilIlÍ‘ll‘lIIFÏIIIII

0 100 200 300 400TIEMPO (min.)

b)INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA

INHIBICION COMPETITIVA POR GALACTOSARegresion lineal

#UÍO'JNGJ OOOOO

ssHIDROLISIS

uo

20 ,/:.'.. ‘Oyr10’1CTITÏIIIIIIIIIIIIIWIIIIIIIIIIIIIIIIIIIITIIIIII1

0 . 100 200 500 400TIEMPO (min.)

166

Figura 4.18:Predicción de la curva de hidrólisis de lactosa en suero dequeso concentrado por medio de un modelo tipo Hichaelis yHenten con inhibición competitiva por galactosa considerandoque la variación de 1a concentración de sustrato es igual ala variación de la concentración de lactosa total. Influenciadel pH (T=37°C). Los parámetros de la ecuación se calcularonpor: a) método de Marquardt y b) regresión lineal. ¿3 pH=6,Ü;

A pH=6,5; predicción teórica

SHIDROLISIS

167

INFLUENCIA DEL PHINHIBICION COMPETITIVA POR GALACTOSA

Marquordt

CÏ'IÍ'IÍÍFÏÍI'IIÍÍÍÏÍÏI'ÍIÍÍÍ'¡Í'ÍÏÍIÏÍÍÍIIÍ'Ífio 100 200 300 400

TIEMPO (min.)

b)

sHIDROLISIS

u4e­oo

NO

llllllllllllllllllllll

—LO

INFLUENCIA DEL PHINHIBICION COMPETITIVA POR GALACTOSA

Regresion lineal

O

O

ÍÍÍIIIIII|IlIIIIIII[IIrIIIIIIIIIIIIIIIÍ|IÍI|I100 200

TEMPO onm)3004 400

168

Se puede observar que los parámetros dependen delmétodo utilizado para su cálculo, lo cual es razonable. Esimportante notar que todos ellos siguen la misma tendenciacon la temperatura, independientemente del método de cálculoutilizado, y pese a las discrepancias que presentan losvalores entre si todos están dentro del mismo orden; elvalor absoluto de P'l y el valor de f’Z disminuyen con latemperatura. Se realizó una recopilación de datos debibliografia (Tabla 4.11) a fin de verificar si lastendencias entre dichos datos y los obtenidos en estetrabajo eran las mismas. En esta tabla se encuentranvalores de Kmy Kil obtenidos por diferentes autores. Salvoun autor, todos trabajaron con soluciones de agua-lactosa yenzimas 6 preparados enzimáticos de diversos orígenes.Todos los resultados de esta tabla coinciden en que Kil esmenor que Km, lo que da cuenta de la fuerte inhibición queejerce la galactosa sobre la lactasa. Si Kil es menor queKmel parámetro P'l

y'1=—1—-[1—K“—'] [:P'l] min/ mMv Kil

es menor que cero y P'Z

y'z = —K—'“—[1 + [2'21 minv Kil

es positivo, siendo estos los signos de los parámetrosencontrados para la hidrólisis de lactosa en suero de quesoconcentrado en este trabajo.

'La influencia de la temperatura_en los parámetros P'ly P'Z coincide con lo reportado por Ma y col. (1983).

169

Tabla 4.11

Valores de bibliografia de Kmy Ki determinados en diferentessistemas.

Km K i. CONDICIONES REFERENCIA(mil) (mM)

63,7 8,8 Leche, [lactosa]: 20-115 mM HouríganT = 35°C. Lactasa de (1977)Saccharomyceslactis.

62,5 77 Soluciones buffer-lactosa, Cheng y[lactosa]: 5 X p/p. col. (1985)T = 37°C, pH = 7,0. Célulasde Kluyveromycesfragilis.

30°C: 53,6 , Soluciones agua-lactosa, May col.40°C: 51,9 , [lactosa]: 5-10 z p/p (1983)50°C: 53,3 , T = 3D, 40 y 50 °C,

pH = 4.5. Lactasa deAspergillus niger.

112 9,5 Soluciones agua-lactosa, Friend y[lactosa]: 10-100 mM. ShahaniT = 50°C, pH = 6,5. (1982)Lactasa de Aspergillus oryzae.

41.1 1,4 Soluciones de agua-lactosa, van[lactosa]: 5 Z P/PT = 50°C, pH = 6,0Lactasa de Aspengillus oryzae.

Griethuyseny col.

(1988)

1'10

(continuación de 1 T_ab1al4_.11)

de buffer-lactosaïv HeetaI y‘ï."' ' ‘qol,Á¿1974)

Soluciones[lactosa]:

I 5 X p/p._“T = 37°C m

171

Trabajando a tres temperaturas estos autores, obtuvieronlos valores de las constantes cinéticas. Conestos valoresse calcularon los parámetros P'l y e'z, siendo éstos:

TEMPERATURA P'l P'Z

30°C —a,15 894,9840°C -3,47 409,9150°C —1,54 205,73

Pese a que trabajaron con lactasa de Aspergillus niger ysoluciones de agua-lactosa, los valores de P'Z soncomparables a los obtenidos en este trabajo con suero dequeso concentrado (para el modelo con inhibición competitivade galactosa y los parámetros calculados por el método deHarquardt) y también disminuyen con la temperatura. Encuanto a P'1.el signo es el mismo y su valor absolutotambién disminuye con 1a temperatura. En 1a Figura 4.17 secomparan la variación con la temperatura de los parámetrosP'Z obtenidos para este trabajo y los calculados a partir delos datos del trabajo de Ma. y col. (1983). Como puedeobservarse ambos tienen la misma tendencia, corroborándoselos resultados obtenidos en Suero de queso concentrado.

4.4.9;4.3.Modelo cinético con inhibición competitiva porgalactosa y no competitiva por glucosa yconcentración de sustrato igual a la concentraciónde lactosamtgtal

La ecuación que representa esta cinética (ecuación

172

C) C3 CD

l

PARAMETROPQ

03 CDí”

soo­

4005

2003

O._ l _ | I | I l ' l 444411o 20 3o 4o 50

TEMPERATURA ( c)

Figura 4.17:Comparación de las tendencias de lbs parámetros P'Z obtenidosen este trabajo a diferentes temperaturas , utilizando elmodelo tipo Michaelis y Menten con inhibición competitiva porgalactosa (parámetros calculados por el método de Marquardt).con los calculados a partir de los datos obtenidos por Ha ycol. (1983) (Tabla 4.13). o este trabajo; O Ha y col. (1983).

173

4.19) escrita en función de los parámetros P"1, ?"2 y ?"3BS:

[SO]

[St = y"1( [So] —[s1 >+ J="2 ln —5°"3 ([5012 - [812)

(4.30)

Los tres parámetros fueron ajustados utilizando la rutinapara regresión no lineal BMDPAR. Los valores encontradospara los parámetros se encuentran el las Tablas 4.12 y 4.13y el ajuste del modelo a los datos experimentales en lasFiguras 4.18 y 4.19, para analizar la influencia de latemperatura y del pH respectivamente. Se puede observar quepara todos los casos el ajuste del modelo a los datosexperimentales es bueno.

Comparandolos valores de las Tablas 4.12 y 4.13con los de las tablas 4.9 y 4.10, para la ecuación con dosparámetros, se ve que los valores absolutos de P"1 y P"2son muysemejantes a f’l y P'2. ?"3 es muypequeño o cero.por lo que el último término de la ecuación tiene poco peso.

4.4.9.4.4.Comparaciún de los ajustes obtenidos por cada modelo

La comparación de los ajustes obtenidos con cadamodelo se realizó por medío del error standard de laestimación (S.E) definido como:

s. E. = ——1—1— (4.31)Nx — Np

donde yi : datos experimentales

¡74

TABLA 4.12

Parámetros de la ecuación que describe la cinética dehidrólisis de lactosa considerando inhibición competitiva yno competitiva y concentración de sustrato igual a laconcentración de lactosa total. Influencia de latemperatura (pH = 6,0).

TEMPERATURA ?"1 ?"2 f”3

25°C -1,11 l 0,09 1349 l 71 8 .10’ZÚ(*>37°C -o,13 í 0,02 600 l 63 2 .10’4 + 10’543°C -0,53 1 u,03 622 l 20 z 10‘19<*>

47°C -o,50 ; 0,01 573 I 7 2 .10‘19 w)

TABLA 4.13

Parámetros de la ecuación que describe la cinética dehidrólisis de lactosa considerando inhibición competitiva yno competitiva y concentración de sustrato igual a laconcentración de lactosa total. Influencia del pH (T =37°C).

pH ?"1 ?"2 ?"3sr _ ’ _ _6 - -6, ,b¿ + 0,U4 845 + 24 4.10 + 2,3 10

, , 1 í 0,08 1051 l 67 2 .10‘ 2«*>

(*)El programa considera que este parámetro es cero, porlo tanLu no calcula su desviación standard.

2HIDROLISIS

175

INFLUENCM DEL PHINHIBICION COMPETITIVA POR GALACTOSA

Y NO COMPEWTNA POR GLUCOSA70: BMDP AR

60­Z Ad A50: i

40-:3 A

30-: . A

20-:

10€5o llllIIIlÍIIIIJlllllllllllllllllIIIIIlllrllífi0 100 200 300 400

TEMPO ÜMn)

Figura 4.19:Predicción de la curva de hidrólisis de lactosa en suero dequeso concentrado por medio de un modelo tipo Michaelis yHenten con inhibición competitiva por galactosa y nocompetitiva por glucosa considerando que la variación de laconcentración de sustrato es igual a 1a variación de 1aconcentración de lactosa total. Influencia del pH (T=37°C).

predicción teórica.A pH = 8,0; Ó pH = 6,5;

176

|NFLUENCIA DE LA TEMPERATURAINHIBICION COMPETITIVA POR GALACTOSA

Y NO COMPEWTNA POR GLUCOSA80 BMDP AR

(n oz ' -.J OC) Oo:9:1:

ü

GÏIIIIII'IIIIIIlllllllll’lllll[IIIIIIIIIIIITIIO 100 200 300 .400

TEMPO Ümn)

Figura 4.18:Predicción de la curva de hidrólisis de lactosa en suero dequeso concentrado por medio de un modelo tipo Hichaelis yHenten con inhibición competitiva por galactosa y nocompetitiva por glucosa considerando que 1a variación de laconcentración de sustrato es igual a la variación de 1aconcentración de lactosa total. Influencia de la temperatura(pH=8,Ü_). o T = 25°C; u T = 37°C; A T = 43°C; <> T = 47°C;

predicción teórica.

177

Yi valor dado por el modeloNx : número de datosNp : número de parámetros

En la tabla 4.14 se detallan los valores de S.E. encontradospara todos los modelos utilizados.

Para el modelo que contempla que la concentración delactosa se mantiene constante a lo largo de cierto períodode la reacción el ajuste para la curva obtenida es levementemejor por el método de Marquardt que por el de regresiónlineal. Sin embargode las representaciones gráficas sepuede ver que los dos modelos son potencialmente útiles paradescribir la hidrólisis.

Para el modelo con inhibición competitiva por lagalactosa se puede ver que con el método de Marquardt seobtiene un menor valor de S.E.

Los valores de S.E. obtenidos para el modelo con tresparámetros son muysimilares a los obtenidos para el métodode Marquardt con dos parámetros.

Con respecto a 1a experiencia a pH=6,5 los datosexperimentales presentan mayordispersión que los obtenidosen iguales condiciones a pH 8,0, lo cual se ve reflejado enlos mayores valores de S.E. encontrados.

De los resultados presentados en la Tabla 4.14 y enlas Figuras 4.14, 4.15, 4.16, 4.18 y 4.19 se puede concluirque cualquier modelo es adecuado para representar los datosemperimentales de hidrólisis enzimática de lactosa en suerode queso concentrado. Sin embargo para poder representar

178

TABLA 4.14

Errores standard de la estimación (S.E.) para los diversosmodelos utilizados para representar las curvas dehidrólisis. Influencia de la temperatura y del pH“).

MODELO CON CONCENTRACION DE LACTOSA SOLUBLE CONSTANTE (2)

MARQUARDT R. LINEAL

TEMPERATURA

37°C (pH=6.o) 45.4 60,8

MODELO CON INHIBICION COMPETITIVA POR GALACTOSA YCONCENTRACION DE SUSTRATO IGUAL A LA CONCENTRACIONDE LACTOSA TOTAL

MARQUARDT R. LINEAL

TEMPERATURA

25°C (pH=s,o) 99,8 129,137°C (pH=6,0) 18,9 50,943°C (pH=6,0) 54,2 245,447°C (pH=6,0) 15,2 30,1

pll

8,0 (T=37°C) 23,1 108,16,5 <T=37°C> 77,6 739,3

179

(continuación de la Tabla 4.14)

MODELO CON INHIBICION POR GALACTOSA Y GLUCOSA YCONCENTRACION DE SUSTRATO IGUAL A LA CONCENTRACIONDE LACTOSA TOTAL

BMDP AR

TEMPERATURA

25 °c (pH=6,U) 99.737 °c (pH=8,Ü) 11,843 °c (pH=6,Ü) 74,247 °c (pH=6,Ü) 15,2

p"

6,0 (T=37°C) 19,86,5 (T=37°C) 77,5

(1) Para los resultados obtenidos a pH 6,5 no seconsideran los tres últimos puntos.(2) Los valores de S.E. se ca}culan considerando los datosobtenidos hasta un 55%de hidrólisis.

180

toda la reacción por una mismaecuación se prefieren los dosmodelos que contemplan la variación de la concentración de_lactosa total. Otro hecho a tener en cuenta para elegir elmodelo a utilizar es 1a sencillez matemática de los mismos.De todos los casos considerados, los modelos linealizablespermiten determinar muyfácilmente los parámetros de lasecuaciones. El ajuste obtenido por medio de estas ecuacioneses lo suficientemente bueno como para que puedan serutilizadas para describir los datos experimentales sí no esposible determinar los parámetros por medio de un método deregresión no lineal.

18]

4.4.10. Predicción de la actividad de agua del suero dequeso concentrado durante la hidrólisis de lalactosa

La hidrólisis de lactosa del suero de quesoconcentrado produce un descenso de la actividad de agua amedida que avanza la reacción. Este descenso se produce, enparte, porque la lactosa parcialmente cristalizada presenteen el suero de queso concentrado se hidroliza a galactosa yglucosa, aumentando de esta forma 1a molalidad de losazúcares en el suero. Este aumento no sólo es debido a laaparición de nuevas especies químicas en el medio sinotambién a la mayor solubilidad en agua de la galactosa y laglucosa comparada con la de la lactosa (Nijpels, 1976b; Shah

y Nickerson, 1978). También contribuye al descenso de la awla mayor capacidad de reducción de la aw que poseen lagalactosa y glucosa respecto de la lactosa. Por lo tanto, amedida que avanza la hidrólisis del suero de queso

concentrado,. desciende la aw llegando hasta un valor finalde aproximadamente U,90 ( valor correspondiente alun 65 %de hidrólisis).

Se estudió la variación de la aw del suero de quesoconcentrado durante el avance de la reacción de hidrólisisde la lactosa. Asimismo se intentó predecir. en forma

aproximada, la aw del suero de queso concentrado yparcialmente hidrolizado a partir de su composición.

4.4.10.1. Descenso de la actividad de agua durante lahidrólisis

182

Siguiendo la metodología detallada en las secciones4.3.2.4. y 4.3.2.5.. se determinaron la aw y laconcentración de lactosa del suero de queso con diferentesgrados de avance de la reacción de hidrólisis. En la Figura4.20 se encuentran los resultados obtenidos. En la parte a)de 1a figura se representa la variación de la aw y de laconcentración de lactosa en función del tiempo y en la parte

b) la variación de la aw en función del porcentaje dehidrólisis. Como puede observarse existe una relaciónlineal entre la aw y el porcentaje de hidrólisis dada por lasiguiente ecuación:

4 x z hidrólisis ro2 = 0,993(4.31)

aw = 0,942 - 8,70 10‘

Esta relación lineal facilitaria el control del porcentajede hidrólisis en forma rápida a través de la determinaciónde 1a aw del suero de queso concentrado.

4.4.10.2. Predicción de la actividad de agua del suero dequeso concentrado y parcialmente hidrolizado apartir de 1a composición del mismo

4.4.10.2.1. Determinación de- la capacidad de reducción de1a actividad de agua de la galactosa

Para poder. predecir la aw del suero de quesoconcentrado y parcialmente hidrolizado, es necesario conocerla capacidad de reducción de la aw de sus constituyentes,entre ellos los diferentes azúcares involucrados. Dado quepara la galactosa no se encuentran datos en bibliografia, se

ACTIVIDADDEAGUA

183

ñ

0.93

0.92

0.91

0.87

¡|11|LllllllllllllllLlll¡[|1111111L1¡¿|lhall]

¡rIIlllIII[llITÏffïïI]

QAJ> CDCD

FJ C3

llIll[lll¡IIIIIIIII

—.LC)

0.86O 100 200 300

TIEMPO (min)400

Figura 4.20:a) Actividad de agua del suero de queso en función delde hidrólisis (o) y(Z p/p) en función del tiempo de hidrólisis (O).

llllllllllTlllllllllllllllllIÏÍIIIIIIIIIÍIII!IÍII|IIII o500

tiempovariación de la concentración de lactosa

58LACTSA(p/p)

184

0.95

0.94

0.93

0.92

0.91

0.90

ACTIVIDADDEAGUA

0.89

0.88

0.87

LlLllLlllll¡[[111lllllllllllLlllllllllLllmlll

O

0.86 IIIÏÍÏIIIIÏÏIIIIIIIIÏIIllllllilllIÏÍIIÍIIIIIIO 20 40 60 80

98 HIDROLISIS

Figura 4.20:b) Actividad de agua del suero de queso en función delporcentaje de hidrólisis.

185

determinó experimentalmente la aw de soluciones acuosas degalactosa y también, con fines comparativos. la aw desoluciones de manosa.

En la Figura 4.21 se muestran los datos

experimentales de aw en función de la concentración (Z p/p)de las soluciones de galactosa. Se observa que sucomportamiento es similar al que presentan la mayoría de losno-electrolitos, incluyendo otros azúcares, mostrandodesviaciones negativas de la ley de Raoult (Chirífe y col.,1980; Chirife y col., 1982; Miracco y 001., 1981).

Los datos experimentales obtenidos fueroncorrelacionados por la ecuación de Norrish (1968):

aw = x1 exp ( - K x2 ) (4.32)

donde x1 es la fracción molar del agua, x2 la del soluto (eneste caso galactosa) y K la constante de Norrish. Laconstante K fue calculada por medio de un programa deregresión no lineal, resultando su valor 2,24;U,07 (para unnivel de confianza del 95 %). En la Figura 4.21 seencuentra representada la curva predicha por la ecuación4.32, observándose la bondad del ajuste.

Este valor de K es prácticamente el mismo que elencontrado por Chirife y col. (1982) para glucosa yfructosa, i. e., 2,15ï0,05 y 2,11:0,11 respectivamente (paraun nivel de confianza del 95 Z). Una característica encomun que poseen estos azúcares es que son todos hexosas(glucosa y galactosa son aldosas y fructosa es una cetosa).Para verificar si otro azúcar de Biátomos de carbono poseía

186

1.00

0.95

0.90

ACTIVIDADDEAGUA

0.85

11Lll1|LLLI!¡1lllllIllilLIllllllllllL4LJ0.80IIÏIIIIÏÍÏIIIIIIIIIIIIIIIIIllll30 50 70

CONCENTRACION DE AZUCAR (95 p/p)CD

Figura 4.21:Determinación de la constante de Norrish para la galactosa y1a manosa. Variación de 1a actividad de agua en función de laconcentración del azúcar: o galactosa, O manosa, (——)ecuación de Norrish (k = 2,24).

187

también un valor de K similar se midió la aw de solucionesde manosa. Los datos experimentales se encuentran tambiénen la Figura 4.21 y fueron ajustados por la ecuación deNorrish (ecuación 4.32), siendo el valor de la constante2,2810,22 (para un nivel de confianza del 95 Z).

Estos resultados llevan a la conclusión de queglucosa, fructosa, galaotosa y manosa tienen el mismo

comportamiento respecto a su capacidad de disminuir la aw.Se puede explicar este hecho considerando que:

I Los cuatro azúcares poseen igual número de gruposhidroxilo en la molécula y el otro grupo funcional presente(aldehído para glucosa, galactosa y manosa y oetona parafructosa) es semejante para todos ellos.

I Los cuatro azúcares presentan, preferentemente, unaconformación tipo silla cuando están en solución (Morrison yBoyd, 1978).

I Salvo la fructosa, los otros tres azúcares son epimerosentre si, difiriendo tan sólo en la posición de un grupohidroxilo.

En consecuencia los factores que pueden modificar laestructura del agua (i. e. númeroy tipo de grupo funcional,estereoquímica de los azúcares considerados, impedimentosestéricos y efectos de grupos vecinos (Di Paolo y Belleau,1977)) son similares para glucosa, fructosa, galactosa ymanosa .

JBB

4.4.10.2.2. Cálculo de la actividad de agua de] suero dequeso concentrado y parcialmente hidrolizado

De acuerdo a lo visto en la introducción, parapredecir la aw de un sistema de multicomponentes se puedeutilizar la ecuación de Ross (1975) (ecuación 2.16).

El suero de queso concentrado y parcialmentehidrolizado está compuestopor lactosa, galactosa, glucosa,proteinas, sales y agua. Cada uno de estos componentes

contribuye al descenso de la aw del suero; por lo tanto, suaw se puede expresar como:

aw=(aw)l.actoaa(aw)galaclosa<aw)glucooo(aw)protolnaa(aw)ealoa(4.33)

Se analiza a continuación la contribución de cada

componente al descenso de la a“:

I Proteinas: La Tabla 4.15 muestra la composición y lospesos moleculares de las proteinas del suero (Bernal yJelen, 1985). Dado el alto peso molecular de las mismas, su

aporte al descenso de la aw es despreciable. Efectivamente,100 g de suero de queso concentrado con 50 Z p/p de sólidoscontienen 50 g de agua. A su vez, basándose en lacomposición media del suero de queso diluido (7 Z p/p desólidos, Tabla 4.2), el contenido de proteinas del suero dequeso concentrado es de 6,43 Z p/p. Tomando como pesomolecular de las proteinas del suero un promedio pesadoentre los pesos moleculares medios de la fi-lactoglobulina,d-lactalbúmina, albúmina, inmunoglobulinas y fracción

Proteínas del suero:

189

TABLA 4.15

composición y pesos moleculares.

PROTEINA 96 P/I’ PESO MOLECULAR (g/rnol.)

fi-lactoglobulina 50 36.000a-lactalbúmina 12 14.400Albúmina 5 66.000Inmunoglobulinas 10 160.000-1.000.000Fracción proteosa-peptona 22 4000-22000

190

proteosa-peptona se obtiene:

FH = (0,5 x 36.000 + 0,12 x 14.400 + 0,05 x 88.000 + 0,10 x580.000 + 0,22 x 13.000) g/mol

FH = 83.888 g/mol

Suponiendo que las proteínas presentes seantotalmente solubles en agua, utilizando la ecuación de

Raoult, se puede calcular la aw de una solución con 50 g deagua y 6,43 g de proteinas del suero

a = x1: 50/18 = 0,999950/18 + 6,43/83.888

En el caso que la concentración de proteína soluble seamenora la utilizada para realizar este cálculo, la aw delsistema seria aún mayor.

Por lo tanto, es correcto considerar que dado su altopeso molecular las proteinas del suero no contribuyensignificativamente al descenso de la aw del suero de quesoconcentrado. Los azúcares y las sales son las principalessustancias responsables de la disminución de la aw

I Azúcares: Los valores de aH para las diferentesconcentraciones de los azúcares en agua se obtuvieronmediante la ecuación de Norrish (1988) (ecuación 4.32). Elvalor de K utilizado para la lactosa fue 10,2 (Miracco ycol., 1981) y el de la glucosa 2,25 (Chirife y 001., 1982).Comovalor de K para la galactosa se empleó , de acuerdo alo determinado en este trabajo, 2,24.

En cada muestra extraída a un dado tiempo, se midió

191

aw y se determinó contenido de lactosa. Conociendo laconcentración inicial de lactosa en el suero de quesoconcentrado y suponiendo que toda la lactosa que sehidroliza se convierte en una mezcla equimolar de galactosay glucosa, se puede conocer la composición de azúcares decada muestra. En realidad, debido a que la galactosa vuelvea reaccionar para dar origen a olígosacáridos (reacción detrasgalactosidación (Jeon y Mantha, 1985; Mozzafar y 001.,1985)), la concentración de la misma es siempre algo menorque la de glucosa. Sin embargo, a los fines de simplificarlos cálculos, se considera que ambas concentraciones soniguales (Cheng y col., 1985).

Con respecto a la lactosa se debe considerar que eldescenso de aw que produce es debido a la lactosa soluble(sección 4.4.8).

I Sales: dado que no fue posible realizar un análisiscuantitativo de todas las especies iónicas presentes en elsuero de queso concentrado, se estimó la aw de las mismas dela siguiente forma. Se centrifugó el suero de queso,precipitando todos los cristales de lactosa y quedando en elsobrenadante (38 Z p/p de sólidos y 62 Z p/p de agua)solamente lactosa en solución y otros componentes solubles.La concentración de lactosa en el'sobrenadante se determinóexperimentalmente, siendo su valor 20,2 g lactosa / 100 gagua. Con esta concentración de lactosa soluble, se calculópor medio de la ecuación de Norrish (ecuación 4.32) la aw deesta solución de lactosa, siendo su valor 0,988. La aH delsuero de queso concentrado antes de la hidrólisis, basándoseen la ecuación de Ross (ecuación 4.33), puede expresarsecomo:'

HH

(a (a (a )w >suero de queso concentrado : w )lc1cloea. x w soles

Conociendo la aw inicial del suero de queso concentrado(au: 0,944, determinada en forma experimental) y la de lalactosa (au: 0.988, determinada en base a su concentración),puede establecerse que la aH de las sales es de 0,955.

A fin de corroborar la factibilidad de este valor se

estimó la contribución de las sales a la reducción de la awen base a una composición iónica para el suero de quesoconcentrado reportada en bibliografía (Buera y col., 1990).En la Tabla 4.16 se encuentra detallada la concentración de

cada sal, el valor calculado de su aw y la ecuaciónutilizada para el cálculo.

En base a las aw individuales de cada solución yutilizando la ecuación de Ross (ecuación 2.16) puedecalcularse que la aw determinada por todas las salespresentes en el suero de queso concentrado es 0,941. Estevalor es semejante al calculado anteriormente (aw=0,955), locual avalaria el procedimiento seguido. La contribución ala reducción de la aw dada por las sales permanece constantea lo largo de la hidrólisis.

A medida que transcurre la reacción de hidrólisis la

aw disminuye en forma constante. Suponiendo que lavelocidad de disolución de los cristales de lactosa es losuficientemente alta como para que la concentración delactosa soluble se mantenga aproximadamente constante hastala desaparición de los cristales (ver sección 4.4.8), lacontribución al valor de la aw dada por la lactosa será

193

TABLA 4.16

Composición iónica media del suero de queso concentrado (50

2 p/p de sólidos) y descenso de aH producido por cada uno delos solutos.

ESPECIE x p/p av ESTIMADA MODELO EMPLEADO

NaHP04.2H20 2,25 0,988 Pítzer (1973)KCl 2,48 0,978 Pitzer (1973)

Acido cítrico.H20 0,80 0.998 Bromley (1973)Citrato de sodio 0,80 0,999 Bromley (1973)

CaCl2 1,00 0,991 Pitzer (1973)MgCl2 0,27 0,999 Pitzer (1973)KHCO3 0,18 0,999 RaoultK SO 0,15 0,999 Raoult2 4

constante e igual a U,988 hasta que el porcentaje dehidrólisis sea mayor a 6U Z, donde desaparecen los últimoscristales de lactosa. De esta forma se puede establecer,para cada porcentaje de hidrólisis, la aw debida a cadaespecie soluble presente en el suero de queso concentrado.En la Tabla 4.17 se encuentran las concentraciones de

lactosa, galactosa y glucosa, 1a aw calculada de las mismasy la aw determinada experimentalmente y la calculada delsuero de queso concentrado. Esta última se predijo deacuerdo a la ecuación 4.33. Dado que el aporte al descenso

de la aw por la lactosa es pequeño, un posible error encuanto al punto en que la misma deja de estar saturadaintroduce una muypequeña desviación en los valores de a

wpredichos.

Otra posible fuente de error es considerar que por lahidrólisis de lactosa se obtiene una mezcla equimolar deglucosa y galactosa. De acuerdo a la bibliografia (Asp ycol., 1980; Burvall y 001., 1979) la galactosa interviene enreacciones de transgalactosidación, por 10 tanto laconcentración de galactosa es menor que la de glucosa. Como

el aporte al descenso de 1a aw de los oligosacáridos esmenor que el de la galactosa la aw calculada, considerandola presencia de oligosacáridos, sería mayor que suponiendoque la mezcla de galactosa-glucosa es equimolar.

Se puede observar la excelente concordancia entre elvalor medido y el valor calculado de la aw del suero dequeso concentrado durante el proceso de hidrólisis, pese alas fuentes de error comentadas. En la Figura 4.22 seobserva que al graficar el valor calculado de 1a aw versusel real se obtiene una recta de pendiente 1,10 y ordenada alorigen - U,USy con un buen coeficiente de correlación(0,997).

195

TABLA 4.17

Concentración (Z p/p) de lactosa, glucosa y galactosa del

suero de queso concentrado, aw correspondiente a cada una delas concentraciones de azúcar, aH calculada y aw medidaexperimentalmentepara distintos porcentajes de hidrólisisdel suero de queso concentrado.

x 96 p/p 96 p/p CL a a. o.v v v vHIDROLISIS LACTOSA OALACTOSA LACTOSA OALACTOSA CALCULADA MEDIDA

onqusA (b) OLUCOSA m)

0 34,9 0 0,988 1 0,944 0,9443,7 33,0 1,0 0,988 0,999 0,941 0,9374,7 33,4 0,8 0,988 0,998 0,940 0,940

15,7 29,4 2,9 0,988 0,994 0,932 0,93015,8 29.4 2,9 0,988 0,994 0,932 0,93136,9 22,0 6,8 0,988 0,985 0,916 _0,91741,6 20,4 7,6 0,988 0,983 0,912 0,91560,8 13,7 11,2 0,988 0,975 0,898 0,90468,3 11,1 12,5 0,986 0,972 0,891 0,89479,9 7,0 14,7 0,991 0,967 0,887 0,89083,3 5,8 15,3 0,993 0,966 0,885 0,888

(a) Se ha considerado que la concentración de galactosa esigual a la de glucosa.(b) Los cristales desaparecen a partir de un 60 X dehidrólisis; hasta ese punto se considera que la concentraciónde lactosa soluble es constante. A partir de allí comienza adisminuiru

(c) La aH debida a las sales, constante a lo largo de 1a

197

< 0.94 -_o _5 ::3o __J _< _o ..

g 0.92 ÍCD _<3: ._

LL] _

o Ï.o _< .­D .4E 0.90 "¡__ _o _< :

0.88I.rllllllII|Illllll1ïrïflllllll|lIljl0.88 0.90 0.92 0.94

ACTIVIDAD DE .AGUA MEDIDA

Figura 4.22:Actividad de agua predicha en función de 1a actividad de agua medida

del suero de-queso concentrado durante la hidrólisis de lactosa.

198

4.4.11. Hidrólisis de lactosa en sistemas modelo

Cuandose estudió la dependencia de la velocidad dehidrólisis enzimática de lactosa con la temperatura en suerode queso concentrado, se observó que la máximavelocidad seobtenía, en muchasde las partidas analizadas, cuando lahidrólisis se realizaba a 47°C. Como hipótesis paraexplicar este hecho se postuló que tanto la baja actividadde agua comola alta concentración de sólidos del suero dequeso concentrado podrian ser los factores que ayudan aestabilizar térmicamente a la enzima, de forma tal que puedaactuar a mayores temperaturas respecto de su óptimotradicional. Para tratar de ampliar un poco más lainformación acerca de los factores que son capaces deestabilizar a la lactasa, se analizó la influencia de latemperatura en la velocidad de hidrólisis de lactosa ensistemas modelo de aw controlada, más sencillos que el suerode queso concentrado, compuestos por lactosa, buffer fosfatoy sacarosa ó por lactosa, buffer fosfato y glicerol.

Los resultados obtenidos para los distintos sistemasmodelo y a las tres temperaturas se muestran en la Figura4.23. Se representa el porcentaje de hidrólisis obtenidoversus el tiempo de reacción para los sistemas con sacarosay glicerol respectivamente. Para el control (buffer ylactosa) la temperatura óptima (entre las tres temperaturasensayadas) de la enzima es 37°C. En los sistemas modelo con

sacarosa, cuando se disminuye la aw a 0,981 (sistema 2), laenzima es más estable a 47°C y 53°C con respecto al control,aunque la temperatura óptima sigue siendo 37°C. Para el

sistema de aw 0,945 (sistema 3), el óptimo de temperaturapasa-de 37°C a 47°C y cuando la aw es 0,894 (sistema 4), el

199

Figura 4.23:Influencia de 1a temperatura en 1a velocidad de hidrólisisde 1a lactosa en sistemas modelo sacarosa-1actosa-buffer yglicerol-lactosa-buffor. 1) control (buffer-lactosa), 2) 20X p/p sacarosa, 3) 70 Z p/p sacarosa, 4) 130 X p/b sacarosa,5) 25 z p/p glicerol y e) 47 x p/p glicerol. o 37°C,

A 47°C y a 53°C.

200

TIEMPO (min)

703 1) 0W = 0,99 pH = 6,0603 control o

É o

(¿250-5(f) i

g 40: og É °Ï oER20-:

j Ü E] Ü Ü Ü10: 8

E 3 A A A A AOn I I I l | I l | I l

O 30 60 90 120TIEMPO (min)

70-; ) c1w= 0,98 pH = 6.02 2

SOCOFOSGE O

C250; oEQ Z 0 Ü

6’ 407; D(I - o Do —.

Ï 30-5 A A: ü A

R O A AZ ¡:1

1o: Ü3 ° A

OLE u l l l [ l l y I |

O 30 60 90 120

201

70: 5) aW = 0.95 pH = 6,060.: sacarosa D

E o0350: DcZ) :

(-3140-1" 0

g 30E ÜI S o

Z g A

1Q“; OD A A A AI A

0'? l Ï u l | l l ¡ I l

O 30 60 90 120TIEMPO (min)

7oq ow = 0,89 pH = 6,0

605 4) sacarosa A

E A(250: D(.040: A_l -: Ü8 2 A oa _Ï 3o? A Cl o

- o

R 205 A o 8

10€ 8

0ng l ¡ I l ¡ r | ¡ I l |

O 30 60 90 12OTIEMPO (min)

58HIDROLISIS

N(¡J-P01CD\I OOOOOO

nILLIIlllllllllllllLlLLlllllllllllll

O

0,, = 0,94

202

p H

cherol

O

\l O lI

03 OlLLlLlJ

#01 OO

I_Ll

SSHIDROLISIS

o: O

0,89

60TIEMPO (mm)

pH

cherol

-*N

OOO :lLLLllllllllllllllllllL

O 60TIEMPO (min)

O

203

óptimo es 53°C, si bien para las tres aw la conversiónmáximaalcanzada es de 60 %. En cuanto al glicerol, se

observa que al disminuir la aw del sistema a 0,941 ó a0,888, si bien el óptimo de temperatura permanece en 37°C,las conversiones de lactosa obtenidas a 47°C y 53°C sonmayores que para el control. Las conversiones que seobtienen para los sistemas con glicerol a 37°C son menoresque las del control a la misma temperatura, fenómeno que noocurre para los sistemas con sacarosa; esto indicaria unposible efecto inhibidor 'per se’ del glicerol sobre laenzima.

De estos resultados se puede concluir que en los

sistemas con sacarosa ó glicerol, al disminuir la aw (mayorcontenido de sólidos), la enzima es más termoestable que enel control. Sin embargola sacarosa estabiliza más a laenzima contra la desnaturalización por temperatura que elglicerol para la mismaaw. Aunquepara el caso del glicerolse debe tener en cuenta que se están evaluando dos efectosopuestos, la estabilización térmica y el posible efectoinhibidor "per se" de dicho soluto.

Es sabido que las enzimas son más resistentes a ladesnaturalización si están en presencia de su sustrato(Dixon y Webb, 1964). No se ha encontrado en bibliografiaque el glicerol ejerza algún efecto específico sobre lalactasa (activador, inhibidor o sustrato). Conrespecto ala sacarosa, Dalquist y col. (1977) informan que la enzimaMaxilact 40000 ONPG, tiene un 10-20 % de actividad desacarasa. Sin embargo este autor trabajó con una enzimamenos pura que la empleada en este trabajo. A fin deverificar si la lactasa Maxilact LX5000, utilizada en este

trabajo, tiene actividad de sacarasa se realizó 1a siguienteexperiencia: se preparó una solución de sacarosa y bufferfosfato de pH=6,0 (53 %p/p de sólidos totales) y se midiósu actividad de agua; este valor fue 0,925. Luego se agregó1,0 % de enzima y se incubó 24 horas a 37°C. Se utilizóuna alta concentración de enzima fin de detectar másfacilmente la actividad de sacarasa. Junto con esta muestrase incubó un control al que no se le agregó enzima. Luego

de las 24 horas se le midió la aw a ambas muestras por latécnica descripta anteriormente (sección 4.3.2.4). Losresultados obtenidos fueron:

Actividad de agua del control: 0,924Actividad de agua de la muestra con enzima: 0,915

Considerando que el error en las mediciones de actividad deagua es 1 0,005 (Kitic y col., 1986) no se puede asegurar,por medio de este método, que la lactasa tenga tambiénactividad de sacarasa. Sin embargo,este caso particular,dado que la enzima tiene muchamayor especificidad por lalactosa que por la sacarosa, es posible que el aporte deesta última en la estabilización de la enzima sea de otraíndole.

Los resultados obtenidos se pueden explicarparcialmente analizando cuáles son los factores queestabilizan a las proteínas, ya que las enzimas sonproteínas con actividad catalítica. En su estado nativo lasproteínas son estructuras tridimensionales estabilizadas porfuerzas no covalentes (uniones puente hidrógeno, fuerzaselectrostáticas, interacciones hidrofóbicas y fuerzas tipoVan der Waals, con contribuciones. adicionales, para

205

determinadas proteínas, de entrecruzamientos por puentesdisulfuro, formación de complejos con metales y uniones deiones y cofactores), que son muysensibles a la temperatura,pH y composición del solvente. Los estados activadosnecesarios para que ocurra una reacción se forman en agua ysolamente en determinadas condiciones de composición delmedio y condiciones externas. Pequeños cambios puedenproducir inactivación. Moléculas ó iones que se comportancomoespecies hidrofóbicas en solución acuosa son capaces deestabilizar los estados nativos contra la desnaturalizaciónpor efecto de altas temperaturas, posiblemente por medio deinteracciones hidrofóbicas que involucran residuos deaminoácidos apolares localizados sobre la superficie de lamolécula (Franks, 1984).

La geometría única del agua y su capacidad departicipar en estructuras tridimensionales dacaracterísticas especiales a las soluciones acuosas. Cuandose introduce un soluto en agua, la forma en que laestructura del 'agua se modifica (direccionalidad eintensidad de las fuerzas de unión entre las moléculas deagua) determina las propiedades del sistema solvente-solutoresultante. Si se adiciona a un medio acuoso un solutohidrofóbico los mismostienden a interaccionar entre sí, enun fenómenollamado de interacción hidrofóbica, a fin deminimizar las interacciones agua-soluto desfavorables(Franks, 1984). Estas interacciones hidrofóbicas son unacontribución importante a la estabilización de lasmacromoléculas "in vivo".

Al introducir en agua un soluto altamente polar, porejemplo un azúcar, el comportamiento _de la solución está

206

gobernado por las uniones puente hidrógeno entre el agua yel soluto. Todos los puentes hidrógeno (agua-agua,agua-soluto, soluto-soluto) tienen igual fuerza e igualposibilidad de ocurrir. Sin embargoazúcares muysemejantestiene diferentes propiedades en agua. Esto es debido a lasorientaciones y espaciamientos de los grupos que forman elpuente hidrógeno. La capacidad de hidratación de unamolécula depende enormemente de su conformación¿ Por lotanto el número de moléculas de agua que lleve consigo unazúcar depende no sólo del número de grupos oxhidrilo queposea, sinó también de sus orientaciones (axial oecuatorial). Los oxhidrilos ecuatoriales se hidratanpreferentemente a los axiales pues existe compatibilidadespacial y direccional con la estructura del agua. Estolleva a que cuando un azúcar está en solución se favorezcael confórmero que posea mayor número de oxhidrilosecuatoriales.

Por lo tanto los efectos de solvatación contribuyensignificativamente a las energias libres conformacionales delas moléculas polares y el agua da lugar a estructuraspreferenciales que son diferentes a las que se obtienen enotros solventes (Franks, 1984). Por lo tanto puedeestablecerse que los azúcares y moléculas relacionadas soncapaces de alterar 1a estructura del agua y en consecuenciaafectar la estabilidad y propiedades de otros solutospresentes, en este caso de las proteínas.

Ball y col. (1943) estudiaron el efecto de lasacarosa, glucosa, manosa, arabinosa y manitol sobreciertas proteinas. Encontraron que la coagulación por calorde la ovoalbúmina y de las proteínas del suero se retarda en

207

presencia de los mismos, ya que se inhibe la formación degrupos sulfhidrilo.

Laksmi y Nandt (1976) profundizaron sobre losmecanismosque estabilizan a las proteínas con respecto a latemperatura cuando se encuentran en presencia de sacarosa yglucosa. En una proteína nativa la mayoría de las cadenaslaterales de los aminoácidos permaneceen el interior de lamolécula; al ocurrir desnaturalización, éstos son expuestosal solvente aumentandoasí la concentración de los mismos.Los grupos no polares de la proteína encuentran másdesfavorable a un medio con azúcar que al agua; por lotanto, su resistencia a verse expuestos (fenómenoque ocurreal desnaturalizarse la proteína) es mayor. Esto induciríauna estabilización de las proteínas en un medio con azúcar.Asimismo se comprobó que en presencia de azúcares aumentanlas interacciones hidrofóbicas entre los residuos no polaresde la proteínas (Gratzer y Bevan, 1969), favoreciendo suestabilidad.

Giles y-McKay(1962) analizaron interacciones entreproteínas (gelatina, plasma, albúmina bovina) y azúcares(xilosa, ribosa, glucosa, galactosa, sacarosa, lactosa,maltosa). Concluyeron que entre las proteinas y losazúcares estudiados existen uniones puente hidrógeno con elazúcar como donor de protón.

Back y 001., (1979) midieron el aumento de latemperatura de desnaturalización de varias proteínas(ovoalbúmina, lisozima, conalbúmina y quimotripsinógeno) alser calentadas en presencia de varios azúcares y polioles(glucosa, sacarosa, sorbitol y glicerol). Este aumento de

208

temperatura aparentemente estaría relacionado con cambios enlas propiedades del solvente. Con respecto al poder deestabilización, glucosa y sorbitol son igualmente efectivospara aumentar la temperatura de desnaturalización de lasproteínas- Sacarosa lo es un poco menos, mientras queglicerol estabiliza muypoco a las proteínas con respecto alcalentamiento. Para sacarosa y sorbitol estos autoresanalizan el efecto de la concentración de los mismos, siendomayor la temperatura de desnaturalización a mayorconcentración de azúcar. Otros azúcares y polioles quetambién estabilizan a las proteinas son: galactosa,fructosa, arabinosa, manosa,maltosa, rafinosa, eritritol,sorbitol y manitol. También encontraron que sacarosa yglicerol fortalecen las interacciones hidrofóbicas que, comoya se ha discutido, es uno de los factores más importantesen la estabilidad de la estructura de las proteínas.

Oakenfull y Fenwick (1979) demostraron que lasmáximasinteracciones hidrofóbicas ocurren en mezclas desolventes o soluciones de solutos que permiten un máximodesarrollo de la estructura tridimensional del agua. Asi,el efecto que ejercen los azúcares y polioles sobre laestabilidad térmica de las proteínas depende también delefecto que ejerzan sobre la estructura del agua.

Lo explicado en los párrafos anteriores sugiere quela sacarosa es un soluto que favorece más la estabilidadtérmica de las proteinas, y por lo tanto de las enzimas, queel glicerol, lo cual explicaría los resultados obtenidos.

Durante la hidrólisis de lactosa en suero de queso seencontró que al pasar de suero diluido.(7 %p/p de sólidos)

209

a suero concentrado (50 %p/p de sólidos) hay una aumento enla estabilidad térmica de la enzima, lo cual permitetrabajar a temperaturas mayores que 37°C. Este aumento en

la estabilidad es probablemente debido a la menor aw delsuero concentrado y a la mayor concentración de lactosa(Mahoney y Wilder, 1989). Dado que el mismo efecto fueencontrado al trabajar con los sistemas modelo se puedeinferir 1a importancia de la concentración de solutos en laestabilidad térmica de la enzima. Sin embargo, al aumentaraún más la concentración de sólidos en el suero de quesoconcentrado el óptimo de temperatura para la enzima es 37°C,posiblemente debido al aumento de la concentración decalcio iónico, inhibidor y desestabilizador de la enzimacomo pudo comprobarse en la sección 4.4.3.

Unaexplicación rigurosa de las diferencias en losefectos estabilizadores de la sacarosa y del glicerol yporqué en el suero de queso concentrado (50 % p/P desólidos) la enzima es más estable térmicamente que en suerodiluido, pero por'encima de cierto límite de concentraciónhay una desestabilización de la enzima, requiere de unanálisis más extenso y específico que el aquí realizado.También se debe considerar 1a complejidad de la composicióndel suero de queso concentrado que dificulta establecer lascausas del comportamiento de la lactasa.

210

4.4.12. Conclusiones

La lactosa presente en el suero de queso concentrado,parte en forma soluble y parte en forma cristalizada, puedeser hidrolizada enzimáticamente por medio de la enzimaMaxilact LX5000 para obtener un jarabe. Este jarabe notiene cristales en suspensión, por lo tanto su textura essuave, su viscosidad es menor que la del suero de queso

concentrado y debido a su menor aw es más fácil de lograr laestabilidad microbiológica evitando el agregado dehumectantes.

En las experiencias realizadas se definieron lascondiciones para llevar a cabo la hidrólisis enzimática dela lactosa en el suero de queso concentrado. La hidrólisisse realizó por medio de un reactor batch agitado. Previo ala hidrólisis el suero debe ser llevado al pHde trabajo yse debe agregar el agente antimicrobiano seleccionado. Esteúltimo no afecta el desarrollo de la reacción de hidrólisis.

I La concentración de enzima y tiempo de hidrólisis autilizar están relacionados. A mayor concentración deenzima se necesita un menor tiempo de hidrólisis para lograrun determinado porcentaje de hidrólisis y viceversa.Hubiera sido deseable utilizar una alta concentración deenzima a fin que los tiempos de hidrólisis fueran cortos.Sin embargo dado que el método propuesto no recupera laenzima se debe utilizar la menor cantidad posible de lamisma. Tanto una alta concentración de enzima, como untiempo largo de hidrólisis tienen desventajas económicas.Tambiénse debe considerar que un tiempo de hidrólisisdemasiado largo podría perjudicar el estado microbiológico

211

del suero de queso concentrado parcialmente hidrolizado ypreservado. Se eligió una concentración de enzima de 0,1 %p/p. Cuando se trabajó a 37°C y pH = 6,0, al cabo de 7horas de hidrólisis se lograron porcentajes de hidrólisismayores al 60 %con lo cual se aseguraba la dasaparición delos cristales de lactosa.

I La temperatura óptima de la reacción depende delcontenido de sólidos del suero de queso. Cuando laconcentración de sóliodos estaba comprendida entre 48,0 y52,0 %p/p la temperatura óptima era de 47°C, salvo paraalgunas partidas de suero concentrado. Esto determinó que

I u °todas las experien01as restantes se realizaran a 37 C.

I El pH óptimo para la hidrólisis de lactosa es 6,0, cuandose trabajó con tiempos de reacción de 7 horas. A tiemposmás cortos 1a reacción procede más rápido a pH 6,5, aunquese debe tener en cuenta que es necesario ajustarcontinuamente el pH del suero, lo que constituye unacomplicación adicional. Es importante considerar. quepequeñas desviaciones del valor óptimo de pH no afectan losresultados finales. Esto permite trabajar sin ajustar el pHoriginal del suero de queso concentrado, siempre que elmismo se encuentre comprendido entre 6,0 y 6,3.

I Los resultados obtenidos en este trabajo se puedenextrapolar a otras partidas de suero de queso concentrado,siempre que las caracteristicas del mismoestén comprendidasdentro de las descriptas.

I La concentración de lactosa soluble permaneceaproximadamente constante durante los primeros 220-240minutos de la reacción de hidrólisis. Este hecho fue tomado

212

en cuenta al postular los modelos para describir 1ahidrólisis. En base a lo expresado en bibliografía seeligió el modelo de Michaelis y Menten para la descripciónde la hidrólisis. El modelo se modificó para tener encuenta que la concentración de lactosa soluble se manteníaconstante durante cierto tiempo y también para considerar lainhibición que ejercen los productos de la reacción. Segúnfue discutido en la sección 4.4.9, el modelomás sencillo deutilizar es el que plantea una cinética tipo Michaelis yMenten con inhibición competitiva por la galactosa yconsiderando la variación de la concentración de lactosatotal (sin tomar en cuenta si está precipitada ósolubilizada). El cálculo de los parametros se puederealizar tanto por regresión no lineal como por regresiónlineal. Este último método es el más sencillo, sin embargoel ajuste a los datos experimentales es levemente peor.

I El descenso que se produce en la actividad de aguafacilita el logro de la estabilidad microbiológica del suerohidrolizado, sin necesidad del agregado de humectantes. La

correlación lineal que existe entre el descenso de la aw yel porcentaje de hidrólisis brinda un método sencillo paraestimar el avance de la reacción. Comola aw del suero dequeso durante el proceso de hidrólisis puede ser predicha,utilizando los modelos de Norrish (1966) y de Ross (1975),conociendo la concentración de lactosa a cada momentode la

reacción es posible calcular la aw.

I La estabilidad térmica que la lactasa demostró tener ensuero de queso concentrado es excepcional para este tipo deenzimas, por lo tanto se estudió en sistemas modelo algunosde los factores que podrían influir en la misma. Losresultados encontrados indican que tanto la concentración

comoel tipo de soluto utilizado influyen en la estabilidadtérmica de la misma, cuando se trabaJa a la misma aw.Asimismoa menor aw el efecto estabilizador del soluto esmayor .

I Con respecto a las precauciones que se deben tomar en unproceso industrial de obtención de suero de quesoconcentrado parcialmente hidrolizado, se recomiendacontrolar cuidadosamente la concentración de sólidos delsuero de queso concentrado a fin que no exceda un 50 % p/p.En caso de cumplirse esta última condición y que el agregadode calcio haya estado dentro de los limites normales, sepuede trabaJar a 47°C. En caso de trabajar a estatemperatura, la misma se debe controlar en forma estrictadurante la hidrólisis de la lactosa ya que a 50°C seproduce inactivación parcial de la enzima. Si lascondiciones del proceso de concentración del suero no hansido ciudadosamente controladas ó existen dudas en cuanto ala concentración de calcio presente se recomienda trabajar a37°C. El tiempo'de hidrólisis es mayor, sin embargo seevitarán problemas en la hidrólisis de lactosa porinactivación de la enzima. Una forma sencilla de controlarsi la hidrólisis está procediendo en forma adecuada es miraral microscopio los cristales de lactosa. En el suero dequeso concentrado los cristales .de lactosa presentan laforma característica y sus aristas son agudas y biendefinidas. A medida que avanza la reacción de hidrólisislos bordes de los cristales aparecen irregulares y su tamañova disminuyendo hasta desaparecer. Tambiénel control delavance de la reacción de hidrólisis se puede realizarmidiendo el descenso de la actividad de agua, aunque estemétodo es más lento y se necesita el equipo adecuado.

La hidrólisis de la lactosa del suero de quesoconcentrado es un método sencillo y fácil de implementar quepermite la obtención suero de queso concentradoparcialmente hidrolizado cuyas propiedades y posibilidadesde utilización son mayores que para el suero concentrado.

215

5. ESTABILIDAD MICROBIOLOGICA DEL SUERU DÉ_QUESU CONCENTRADOY PARCIALMENTE HlDROLIZADU DURANTE SU PROCESAHLEHTU Y

ALMACENAMIENTO

5.1. Objetivos

La estabilidad microbiológica del suero de quesoconcentrado parcialmente hidrolizado fue estudiada en dosetapas: durante la hidrólisis de la lactosa y durante elalmacenamiento del suero de queso concentrado yahidrolizado.

Unade las caracteristicas del proceso de hidrólisis,desde el punto de vista microbiológico, está dada por eldescenso de la actividad de agua que se produce debido al

desdoblamiento de la lactosa en glucosa y galactosa. La awdesciende de 0,94-Ü,95 a 0,90-0,89 al final de la hidrólisis(65 Z de conversión de lactosa). Este factor es fundamentalpara lograr la.estabilidad microbiológica del suero de quesoconcentrado parcialmente hidrolizado, ya que haceinnecesario el agregado de humectantes para disminuir la aw.

Dadoque el manejo industrial del suero no se realizaen forma estéril es importante conocer cómose comporta estematerial frente a contaminaciones que ocurran durante suelaboración, transporte y almacenamiento.

El objetivo de esta parte del trabajo fue determinarlas condiciones de pH, asi comoel tipo y concentración deconservador a utilizar, a fin de lograr una vida útil detres meses del suero de queso concentrado, parcialmentehidrolizado y preservado, ouando- se lo almacena a/ .

les/5.2.51/4¡”L-3

216

temperatura ambiente. Dos factores influyeron en ladeterminación del tiempo de almacenamiento: 1) Buera y col.(1990) determinaron que en un tiempo de almacenamiento mayorde tres meses a 25°C el cambio de color en el suerohidrolizado, por pardeamiento no enzimática, afecta elaspecto del mismo y 2) se consideró que como el suerohidrolizado es un producto de uso principalmente industrialno es necesario que tenga una vida útil mayor a tres meses.

52. Elección de los microorganismos a utilizar

Kanterewickz y col. (1986a) realizaron un estudiosobre la carga microbiana de suero de queso concentrado,provisto también por Sancor S.A., al igual que el suero dequeso concentrado utilizado para este trabajo. En la Tabla5.1 se encuentran los resultados de dicho estudio.Inicialmente existe una baja contaminación, atribuible altratamiento termico que el suero recibe durante suconcentración (calentamiento a 70°C durante 8 horas). Enefecto. según Kanterewickz y col. (1985a), en variaspartidas de suero de queso concentrado analizadas, elrecuento total inicial promediode bacterias mesófilas fuede 103-104 UFC/g de suero de queso concentrado; el deStaphylococcus aureus fue de 10 UFC/g de suero de quesoconcentrado y no se encontraron hongos ni levaduras. Estosbajos valores iniciales favorecen 1a obtención de un suerode queso concentrado parcialmente hidrolizado con una bajacarga microbiana y en consecuencia con una mayor vida útil.Sin embargo hay que tener en cuenta que, durante el procesode hidrólisis de la lactosa, se trabaja a la temperaturaóptima para el crecimiento de los microorganismos mesófilos.

217

Tabla 5.1

Carga microbiana inicial de suero concentrado comercial(Kanterewicz, 1985a).

MICROOROANISMO UFC/g

Hesófilas aerobias 104Hicrococcaceae 10Staphylococcus aureus 10Enterobacteriaceae 10Coliformes 25Estreptococos fecales 25Esporulados aerobios 25Esporulados anaerobios 102Hongos -­Levaduras

218

o u - a a s37 C, a fin de lograr una mayor ve1001dad de reaccion. Porlo tanto los microorganismos presentes pueden multiplicarsey/o el suero puede contaminarse accidentalmente, lo quepodria deteriorar al mismodurante su almacenamiento.

Dadas las caracteristicas del suero de quesoconcentrado (pH=6,0; aw=Ú,95al principio y aw=U,9Ual finalde la hidrólisis) y del proceso de hidrólisis de la lactosa(se realiza en forma aeróbica), el patógeno con másposibilidades de crecer en el suero de queso es elStaphylococcus aureus. S. aureus puede crecer y producirenterotoxina en gran cantidad de sustratos y bajo diferentescondiciones del medio, como pH, temperatura y aw (Tatini,1973). En aerobiosis puede crecer hasta aw tan bajas como0,88 (Vaamondey 001., 1982; Lotter y Leistner, 1978).Debido a esta causa fue elegido para ser inoculado con elfin de estudiar su crecimiento durante el proceso dehidrólisis y el almacenamiento del suero de quesoconcentrado parcialmente hidrolizado.

Otras bacterias con posibilidades de crecimiento enel suero de queso concentrado parcialmente hidrolizado sonlos lactobacilos. Su aw limite de crecimiento, en sistemasmodelos salinos, es 0,91 (Christian, 1987);por lo tanto laaw del suero de queso concentrado' parcialmente hidrolizadono es óptima para su desarrollo. También se debe considerarel efecto de los conservantes utilizados. Sofos (1989)reportó que el crecimiento y producción de ácido de variasespecies de lactobacilos son inhibidas por concentracionesde sorbato de potasio mayores a 0,1 %p/p. La aw dcl suerode queso concentrado parcialmente hidrolizado es Ü,90-0.89,cercana al limite de crecimiento. y recibe un tratamiento

219

térmico previo, con lo cual la contaminación inicial esbaja. Estos factores limitan la posibilidad de crecimientode este tipo de microorganismo en el suero hidrolizadopreservado.

Los estreptococos y micrococos pueden crecer a la awfinal del suero de queso; sin embargolas caracteristicas depH y los conservadores utilizados inhiben su crecimiento.

Los bacilos tienen aw límite de crecimiento alrededor de0,93, es decir que podrian crecer solamente durante 1ahidrólisis del suero y no en el suero ya preservado.

Otrostiposde microorganismos que crecen en el suerode queso concentrado parcialmente hidrolizado y cuyasposibilidades de contaminación a partir del medio ambienteson amplias, son los hongos y las levaduras. Existenaproximadamentediez especies de levaduras responsables deldeterioro de alimentos procesados y envasados (Pitt yHocking, 1985).. De todas ellas se seleccionaron cuatro en

base a su capacidad de crecer a bajas aw y en preductosazucarados: Saccharomycescerevisjae, Saccharomyces rouxii,Saccharomyces bailii y Debaryomyceshansenii.

Saccharomyces cerevisiae es un contaminante ubicuoque fermenta fácilmente productos azucarados, jugos de frutay sus concentrados. Puede crecer hasta aw 0,89 en un mediode glucosa y a pH=6,U (Juven y 001., 1978). Saccharomycesrouxii (también Zygosaccharomyces rouxii según Barnett ycol. (1983)) fermenta y deteriora jugos concentrados,mieles, mermeladas, productos azucarados, etc.. Es elsegundo microorganismo más xerofilico que se conoce pudiendo

crecer hasta aw=0,62 en soluciones de fructosa (von

Schelhorn, 1950) y hasta aw=U,B5en soluciones de sacarosa yglicerina (Tilbury, 1980). El hecho que crezca a aw muybajas, conjuntamente con su habilidad de fermentar hexosas,la convierten en la segunda responsable, luego deSaccharomyces bailii, de deterioros fermentativos dealimentos. Aún una pequeña contaminación inicial de S.rouxii puede llegar a producir grandes daños en alimentosalmacenados, ya que es capaz de liberar considerablescantidades de dióxido de carbono. Los conservadores másusuales son eficaces para detener el crecimiento de S.rouxii, la que también se inactiva fácilmente por calor.Saccharomycesbailii (también Zygosaccharomycesbailii segúnBarnett y col. (1983)) fermenta soluciones de glucosa adióxido de carbono y no es inhibida fácilmente por el excesode gas presente. Puede fermentar glucosa en presencia de400 mg/kg de ácido sórbico o ácido benzoico. En ausencia dedióxido de carbono S. bailii puede crecer bien a bajos pH y

aw (Pitt, 1974). Esta levadura tiene la capacidad deadaptarse a bajas concentraciones de conservador, y luego dela adaptación puede sobrevivir y crecer a concentracionesmuchomayores de conservador que las anteriores (Harth,

1977). La aw mínima de crecimiento es 0,80 y es unalevadura contaminante tipica en la industria alimentaria.Puede crecer en una amplia variedad de productos como salsasde tomate, mayonesa, aderezos) jugos y concentrados defrutas, etc. Debaryomyceshansenii es capaz de crecer hastaaw=0,84en soluciones salinas y utiliza una amplia variedadde fuentes de carbono. Aparte de crecer en productossalados también se la encuentra en jugos de fruta, yogur yquesos (Barnett y 001., 1983).

En lo que respecta a los- hongos también fueron

seleccionados en base a su capacidad de crecer en productos

azucarados y a bajas aw; así todos los hongos empleadosfueron aislados de dulce de leche. ¡büüfilthI roquefortiicrece en un amplio rango de pH y su aw minima de crecimientoestá alrededor de 0,80. Está ampliamente distribuido y sufacilidad para crecer a bajas temperaturas lo hace uno delos principales contaminantes de productos refrigerados(Pitt y Hocking, 1985). ¡bnhfillhm1 funiculosum es una

especie que tolera muybien los ácidos y crece hasta aw=0,89(Milisvec y Tuite, 1970). Se encuentra frecuentemente ennueces, cereales y frutas secas. Eurotium herhariorum es un

hongo xerofílico que puede crecer hasta asz,74 a pH=3,8(Pitt y Christian, 1968). Es una especie muy difundida yproduce deterioro en frutas secas, quesos, carnes y arroz.Eurotium amstelodami puede crecer hasta aw=0,70 pero sucrecimiento es máximo a aw=0,90. Es también un hongo muycomúny se lo encuentra en quesos, pan, carnes y dulces.Paecylomyces variotti es levemente xerofílico pudiendocrecer hasta aw=0,84. Se lo encuentra como contaminante dealimentos, materias primas y medios de cultivo (Pitt yHocking, 1985). Con respecto a Aspergillus Niger, se

encontró que puede crecer a aw=0,85 en un medio de glicerola una temperatura de 30°C (Gonzáles, 1984) y es uncontaminante de nueces, dulces y frutas. Wallemja sebi

puede crecer en un rango muy amplio de aw, entre 0,99 y0,69, en medios zucarados (glucosa y fructosa)(Pitt yHocking, 1985). Se encuentra diseminado muy ampliamenteespecialmente en frutas secas, arroz, leche condensada,etc..

5.32 Materiales y Métodos

5.3.1. Mediosde cultivo y reactivos

Se utilizaron los siguientes medios de cultivo parael estudio microbiológico del suero de queso (todos ellosfueron provistos por MerckQuimica Argentina):

I Agar Baird-Parker, composición (8/1): peptona de caseína10,0; extracto de carne 5,0; extracto de levadura 1,0;piruvato de sodio 10,0; glicina 12,0; cloruro de litio 5,0;agar 15,0; emulsión de yema de huevo 50 ml; telurito depotasio 0,105; pH del medio preparado a 37°C, 6,8;U,Z.

I Agar para Recuento en Placa, composición (g/l): peptona decaseína 5,0; extracto de levadura 2,5 ; D(+) glucosa 1,0;agar 14,0; pH del medio preparado a 37°C, 7,0 10,1.

I Agua peptona, composición (g/l): peptona de carne 10,0.

I Caldo Infusión Cerebro-Corazón, composición (g/l):infusión de cerebro 12,5; infusión de corazón 5,0; proteosapeptona 10,0; D(+) glucosa 2,0; cloruro de sodio 5,0;disodio hidrógeno fosfato 2,5; pH del medio preparado a37°C, 7,410,1.

I Agar Papa-Glucosa, composición (g/l): infusión de papa(preparada a partir de 200 g de papa) 4,0; D(+) glucosa20,0; agar 15,0; pH del medio preparado a 37°C, 5,8;Ü,1.

I Caldo Glucosa 2% según Sabouraud, composición (g/l):peptona de carne 5,0; peptona de caseína 5,0; D(+) glucosa20,0; pH del medio preparado a 37°C, 5,6;Ü,1.

Los reactivos utilizados fueron: sorbato de potasiopropionato de calcio, ambos grado alimentario; ácidofosfórico (85 z p/p) y Tween 80(polioxietilen-sorbitano-monooleato), ambos provistos porMerck Química Argentina.

5.3.2. Microorganismosutilizados

Se utilizaron los siguientes microorganismos:

l Bacterias: Staphylococcus aureus ATCC 6538 P y C-243,ambasprovistas por el Instituto Nacional de Microbiologia“Dr Carlos G. Malbrán".

I Levaduras: Saccharomyces cerevisiae MI, donada por lacátedra de Microbiologia Industrial de 1a Facultad deIngenieria (UBA); Saccharomyces rouxii ATCC 8383;Saccharomyces hailii NRRL7239 y Debaryomyces hansenii NRRL1448.

l Hongos: Penicillium roquefortii, Penicjujum funiculosum,Eurotium herbariorum, Eurotium amstelodami, Paecylomycesvaríotti, Aspergillus niger y Wallemiasebi. Todos ellosfueron aislados a partir de muestras de dulce de lechecontaminado e identificadas por el Ing. Agr. Lucas H.González de la cátedra de Microbiología Industrial de laFacultad de Ingenieria (UBA).

224

5.3.3. Determinaciónde la estabilidad microbiológica delsuero de queso concentrado durante la hidrólisis delactosa

Para estudiar la evolución de la carga microbiana alo largo de la hidrólisis de la lactosa, dicha reacción sellevó a cabo a 37°C con 0,1 Z p/p de lactasa y el pHajustado a 6,0 con ácido fosfórico 85 Z p/p. En todos loscasos el suero de queso concentrado utilizado para losensayos de microbiológicos fue suero recién recibido de laplanta de fabricación, a fin de que el tipo y el número delos microorganismos presentes no se viera afectado por elalmacenamientobajo refrigeración.

Se analizó el recuento total aeróbico y el recuentode S. aureus (previa inoculación) a lo largo de lahidrólisis.

Se sembraron en el suero de queso concentrado doscepas de S. aureus: ATCC 6538 P y 0-243, en unaconcentración de 104-105 bacterias/g de suero de quesoconcentrado. El inóculo provino de incubar cada cepa porseparado en caldo BHI durante 24 horas a 37°C. Una vezinoculado el suero de queso concentrado, se agregó la enzimay se realizó la hidrólisis siguiendo el método descriptoanteriormente. La reacción duró 7 horas y se alcanzóaproximadamente un 65 % de hidrólisis. A las O, 3, 5 y 7,0horas se tomaron muestras para realizar en ellas el recuentoaeróbico total y el de S. aureus. El recuento aeróbico serealizó en Agar para Recuento en Placa y el de S. aureus en

Agar Baird-Parker. Para esta experiencia se utilizó suerode queso concentrado sin conservador (control), suero de

queso concentrado con 0,2 Z p/p de sorbato de potasio (SK),suero de queso concentrado con U,2 Z p/p de propionato decalcio (PCa) y suero de queso concentrado con 0,1 Z p/p desorbato de potasio + 0,1 Z p/p de propionato de calcio. Lasexperiencias fueron realizadas por duplicado al igual quelos recuentos.

5.3.4. Determinación de la estabilidad microbiológica delsuero de queso concentrado parcialmente hidrolizado

BacteriasSe analizó en suero de queso concentrado parcialmente

hidrolizado, previa inoculación con Staphylococcus aureus,la evolución de los recuentos de S. aureus y de bacteriasaerobias propias del suero. Por otro lado en suero de quesoconcentrado deteriorado e hidrolizado se analizó laevolución de los recuentos de las bacterias aerobias propiasdel suero.

En la primera experiencia, el suero concentrado(recién recibido de la planta de fabricación) se hidrolizósiguiendo la metodologia descripta en el ítem anterior. Elconservador se agregó 24 horas antes de realizar el proceso.Una vez hidrolizado el suero se ajustó el pH al valordeseado (5,0 ó 5,5) para el' almacenamiento. Losconservadores y las concentraciones utilizadas de los mismosfueron: 0,2 Z p/p de sorbato de potasio, 0,2 Z p/p depropionato de calcio y 0,1 Z p/p de sorbato de potasio + 0,1Z p/p de propionato de calcio. Comocontroles se utilizó:suero de queso concentrado sin hidrolizar a pH=6,0 y doscontroles de suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado (sin agregado de conservante), uno a pH=8,Ü y

226

otro a pH=5,Ü.

Para obtener el inóculo de S. aureus se preparó unasuspensión de cada cepa en caldo BHI y se incubó 24 horas.Para preparar las muestras a ser almacenadas se colocaron,en forma estéril, 50 g de cada suero en frascos de vidrioestériles con cierre hermético. Estas muestras seinocularon con 0,5 ml de cada cepa de S. aureus de forma talde obtener un recuento inicial de 104-105 UFC/gsuero. Semezclaron en forma estéril, se cerraron y se almacenaron losfrascos a 37°C. Se realizó periódicamente el recuentoaeróbico total y el de S. aureus. Para esto se diluía 1 g omás de cada suero en 9 ml de agua peptona estéril, seagitaba bien, se hacian las diluciones necesarias y serealizaba el recuento aeróbico total en Agar para Recuentoen Placa (Elliot y col., 1987) y el recuento de S. aureus enAgar Baird-Parker (Baird-Parker, 1969).

En la segunda experiencia se analizó la evolución delos recuentos de la flora nativa del suero. Para esto sedejó 3 semanas a temperatura ambiente suero de quesoconcentrado. A1 cabo de este tiempo se obtuvo un recuentode bacterias aerobias de 3,5 10. UFC/g. Este suero sehidrolizó según la técnica descripta anteriormente, previoagregado de 0,2 Z p/p de sorbato de potasio ó 0,2 Z p/p depropionato de calcio ó 0,1 X p/p de sorbato de potasio + 0,1Z p/p de propionato de calcio y ajuste del pH a 6,0 en cadacaso. Una vez alcanzado aproximadamente un 65 Z dehidrólisis se llevó a pH=5,0 y se almacenó de la misma formaque las muestras del párrafo anterior (todas las muestras sealmacenaron por duplicado). Como controles se utilizó:suero de queso concentrado a pH 6,0 y suero de queso

227

concentrado parcialmente hidrolizado a pH 5,0, ambos sinconservador. Los recuentos de bacterias acrobias serealizaron por duplicado en Agar para Recuento en Placa.

LevadurasEl inóculo de levaduras se obtuvo por incubación de

una suspensión de células de cada levadura en Caldo Glucosa2 2 p/p, según Sabouraud, durante 24 horas a 25°C. Seestimó el crecimiento de las mismas por medio de la cámarade Neubauer. Una vez obtenido el inóculo, la forma deoperación fue la misma que la empleada para S. aureus. Eneste caso se trabajó con suero de queso concentradoparcialmente hidrolizado preservado a pH=5,0 y comocontroles se utilizó suero sin hídrolizar a pH=8,0 y suerohidrolizado sin conservador a pH=5,0. Los recuentos serealizaron en Agar Papa-Glucosa y se incubaron 3-4 dias a25°C. Todas las experiencias se realizaron por duplicado,como asi también los recuentos.

HongosPara obtener la suspensión de esporas de hongos a ser

inoculadas, se incubaron durante 7-10 dias estrías en AgarPapa-Glucosa inclinado para cada hongo. Una vez que loshongos esporularon se tomó el inóculo con 5 m1 de agua yglicerol al que se habia agregado 0,5 ml de Tween 80 (Horner

y Anagnostopoulos, 1973). La aw de esta solución fue 0,90,igual a la del suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado. De esta forma se evitaba crear, al inocular,una zona de mayor actividad de agua dentro del suero quepudiera favorecer la germinación de las esporas de loshongos en el lugar de la siembra. Se colocaron 20 g de:

228

suero de queso concentrado parcialmente hidrolizado a pH=5,Upreservado con 0,2 Z p/p de sorbato de potasio, 0,2 Z p/p depropionato de calcio ó 0.1 Z p/p de sorbato de potasio + 0,1Z p/p de propionato de calcio, y de los controles (suero dequeso concentrado y suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado ambos a pH 5,0 y Agar Papa-Glucosa) en cajas de

Petri. Se inoculó el centro de cada caja con 20 ul dÉ lg-10esporas/ml, calculado por medio de la cámara de Neubauer.suspensión de esporas cuya concentración fue 10

Las placas inoculadas se almacenaron a 25°C, envasadasherméticamente en polietileno a fin de evitar la pérdida dehumedadde las placas. El crecimiento de las placas fuedefinido comola formación de una colonia superficial 10suficientemente grande comopara ser visible a simple vista.Todas las placas fueron sembradas por duplicado.

El tiempo de almacenamiento para todos los casos fuede tres meses a la temperatura óptima de crecimiento para elmicroorganismo en estudio.

5.4. Resultados y discusión

5.4.1. Estabilidad microbiológica del suero de quesoconcentrado durante la hidrólisis

Dado el valor de la actividad de agua del suero dequeso concentrado (que varia de 0,94-U,95 a Ü,90-0,89 alprincipio y fin de la hidrólisis repectivamente) y a lascaracterísticas aeróbicas del proceso de hidrólisis, no esposible el crecimiento de otro patógeno que no seaStaphylococcus aureus (Vaamonde y 001., 1982; Lotter yLeistner, 1978). Por lo tanto en esta parte del trabajo se

229

estudió cómo evolucionó la flora aeróbica nativa y uninóculo de S. aureus durante el proceso de hidrólisis.

En las Figuras 5.1, 5.2 y 5.3 se representa laevolución del recuento total aeróbico y de S. aureus a lolargo de las 7 horas de hidrólisis para suero sinconservador y para suero con 0,2 Z p/p de sorbato depotasio, 0,2 Z p/p de propionato de calcio ó 0.1 Z p/p desorbato de potasio + 0,1 X p/p de propionato de calciorespectivamente. Para las figuras se utiliz la siguientenomenclatura: SQC: suero de queso concentrado, SCQH: suerode queso concentrado parcialmente hidrolizado, SK: sorbatode potasio, PCa: propionato de calcio. Cuando se trabajósin conservador, al cabo de 7 horas de hidrólisis, lapoblación de S. aureus y de bacterias aerobias aumentó suconcentración en aproximadamente 0,3 ciclos logaritmicos.Al utilizar cualquiera de las combinaciones propuestas deconservador, los recuentos se mantuvieron aproximadamenteestables, es decir que no hubo crecimiento de bacteriasmesófilas ni de S. aureus durante 1a hidrólisis de lactosa.

Comoconclusión, puede decirse que una contaminaciónaccidental con S. aureus no tendrá consecuencias gravessobre 1a estabilidad microbiológica del suero hidrolizadopreservado durante el tiempo que dura la hidrólisis. Sinembargo, si puede verse afectado el suero hidrolizado sinconservador. Asimismo se concluye que, pese a que el sueropermanece 7 horas a 37°C, los recuentos de bacteriasmesófilas y de S. aureus no sufren gran variación enpresencia de sorbato de potasio, propionato de calcio y/o lacombinación de ambos.

LOGUFC/G

230

600.­- T = 37°C pH 6,0

5.50 ­

.U' oo

.4) 01 o

4.00 É 0"“0'95 owwo,9o

3.50 ­

3.00 Illllllll[lllllïlllllllllllllIIIÏIIIIIIIIIITÍo 100 200 300 400

TIEMPO (mm)

Figura 5.1:Evolución del recuento total aeróbico y de S. aureus, enpresencia de 0,2 Z p/p de SK. durante la hidrólisis de lactosaen SGC. D Recuento total aeróbico, .Ü,2 X p/p de SK; IRecuento total aeróbico, control; o S. aureus, 0,2 X p/p SK:O S. aureus, control.

LOGUFC/G

231

6.001o_ T=37C pH=6,0

5.50­

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450-b‘-*—s‘s\s““_‘_n. "‘ U O

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4.00 j OwNOv95 Ow"0»90

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UEMPO onm)

Figura 5.2:Evolución del recuento total aeróbico y de S. aureus, enpresencia de 0,2 Z p/p de PCa, durante la hidrólisis de lactosaen SQC. D Recuento total aeróbico, 0,2 Z p/p de PCa; IRecuento total aeróbico, control; o S. aureus. 0,2 Z p/p PCa:O S. aureus, control.

6.00­- T _ 37°C pH = 6,0

5.503Í5.005 4/.

o Í3 .4L'- 'CD4.50­o Lo _._l _

400 j Ow"0.95 owN0.9O

3.505

3.00—IIIIÏIIIIIIIIIIIIIIIllllllllllllllIllllllllllo 100 200 300 400

TIEMPO (min)

Figura 5.3:Evolución del recuento total aeróbico y de S. aureus, enpresencia de 0,1 Z p/p SK + 0,1 Z p/p de PCa, durante lahidrólisis de lactosa en SQC. D Recuento total aeróbico, 0.1 zp/p SK+ 0,1 X p/p de PCa; I Recuento total aeróbico, control;o S. aureus, 0,1 Z p/p de SK + 0,1 Z p/p PCa; O S. aureus,control.

233

5.4.2. Estabilidad microbiológica del suero de quesoconcentrado y parcialmente hidrolizado preservadodurante el almacenamiento

Una vez comprobado que durante las 7 horas a 37°C quepermanece el suero en el reactor no hay deterioromicrobiológico bacteriano y que una contaminación accidentalcon Staphylococcus aureus no producirá problemas sanitariosen el mismo, se procedió a estudiar la estabilidadmicrobiológica del suero de queso concentrado parcialmente

hidrolizado de aw=0,89—0,90,preservado por ajuste del pH a5,5 ó 5,0 y agregado de 0.2 Z p/p de sorbato de potasio, 0,22 p/p de propionato de calcio ó 0,1 Z p/p de sorbato depotasio + 0,1 Z p/p de propionato de calcio, a lo largo detres meses de almacenamiento. Los almacenamientos serealizaron a la temperatura óptima del microorganismoestudiado (37°C para bacterias y 25°C para levaduras yhongos).

5.4.2.1. Bacterias aerobias totales y Staphylococcus aureus

Se estudió la evolución durante el almacenamiento delas bacterias aerobias totales propias del suero y de S.aureus inoculado en el suero de queso concentradoparcialmente hidrolizado preservado. Se utilizó sueroconcentrado fresco con un recuento inicial de bacteriasaerobias de 103 UFC/g. Se inoculó S. aureus (ATCC6538 P y

4 UFC/g y serealizaron los recuentos de bacterias aerobias totales y deC-243) en una concentración del orden de 10

S. aureus a lo largo del tiempo de almacenamiento. Se

234

trabajó con dos pH, 5,0 y 5,5 y tres combinaciones deconservador: 0,2 Z p/p de sorbato de potasio, U.2 Z p/p depropionato de calcio y 0,1 Z p/p de sorbato de potasio + 0,1Z p/p de propionato de calcio. En todas las muestras laactividad de agua fue de 0,89-0.90. Se utilizaron comocontroles suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado a pH=8,0 y a pH=5,0 y suero de queso concentradoa pH=6,Ü, ambos sin conservador. En las Figuras 5.4 y 5.5se encuentran los resultados obtenidos para los recuentosdurante el almacenamientopara bacterias aerobias totales yS. aureus respectivamente, ambas en la misma muestra desuero .

Con respecto al crecimiento de S. aureus (Figura 5.4)en los controles, se puede observar que, mientras en elcontrol de suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado a pH=6,0 creció sin problemas, en el control depH=5,0esta bacteria tiene dificultades para crecer. Encambio las bacterias aerobias (Figura 5.5) presentesaumentaron a lo largo del tiempo en ambos controles. Estoindicaria que una pequeña variación en las condiciones delsuero de queso concentrado parcialmente hidrolizado, en estecaso pasar de pH 6,0 a pH 5,0, dificulta el crecimiento delS. aureus en el mismo, aunque no impide el crecimiento delas bacterias aerobias. Por lo 'tanto el suero de quesoconcentrado parcialmente hidrolizado cuyo pH ha sidoajustado a 5,0 no seria el sustrato ideal para el desarrollode S. aureus. Según los resultados obtenidos por Notermansy Heuvelman (1983) en caldo BHI de actividad de agua

reducida por agregado de sacarosa, a aw 0,90 (la aw delsuero de queso concentrado parcialmente hidrolizado) y pH5,5, el S. aureus es capaz de crecer a 30°C y 24°C pero no

T=37°C0.,ru0.90

0.00l1Il¡TIIlÏIllllllllÏlllI1lllll|ÏlÏllIÏllIllÏTÍÏIÏÑT]

ozo4o60801oo

TIEMPO(dio)

Figura5.4 EvolucióndelrecuentodeS.aureusenSQCHcon0,2Zp/pdeconservador,almacenadoa37cC.A0,2XP/PSK,pH=5,Ü;A0,2Zp/pSK,pH=5,5;D0,2X p/pPCa,pH=5,Ü;I0,2Zp/pPCa,pH=5,5;o0,1ZP/pSK+0.1Zp/PPCa. pH=5,0;o0.1zp/pSK+0,1zp/pPCa,pH=5.5.Controles:*sec.pH=S,Ü;

€989CH,pH=5.Ü:*:SGC,pH=8.Ü.llrecuentonuloómenora30UFCporplaca.

235

37°CGWMOBO

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0.00rlÏlÏlÏIÏIÏrIrÏIIIÍTÏIIIIÏITIlTrIlÏÏIÏIIlÍÏÍÍl

o204o6080

TIEMPO(dío)

Figura5.5: Evolución.delrecuentodebacteriasaerobiastotalesenSQCHcon0.2Xp/Pde conservador(enpresenciadeS.aureus),almacenadoa37°C.A[3,2Zp/p‘SK, pH=5,Ü;A0,2Zp/pSK,pH=5,5;u0,2Zp/ppropionatodecalcio,pH=5,Ü;I 0,2Zp/pPCa,pH=5.5;o0,12p/pSK+0,12p/pPCa,pH=5,Ü;O0,1Zp/P SK+0,1zp/pPCa,pH=5,5.4SQCH,pH=6,Ü;eSQCH,pH=5,0; *SQC;PH=6,Ü.

Controles:

237

30°C.COTI

No

cloruroel

delparcialmente

a menor temperatura y a pH 4,9 sólo crece a

observaron crecimiento cuando la aw se ajustóde sodio. Es decir que esta última condición inhibecrecimiento de S. aureus en el caldo BHI. Para el caso

de dehidrolizado en el que S.control suero queso concentrado

la temperatura de

incubación fue la óptima, 37°C, la aw Ü,89—Ü,90y el pH 5,0,condiciones un poco menos favorables que las

aureus no creció,

empleadaslo

porlos autores Notermans y Heuvelman (1983); por tanto esexplicable que no crezca.

En el caso de suero de queso concentrado parcialmenteel de

recuentos bacteriashidrolízado es decir con agregado

depreservado,

conservadores y ajuste de pH, losrápidamente

de

A pH=5,0 el descenso de los recuentos fue muchoal

aerobias totales y de S. aureus, disminuyeronllegándose a la pérdida casi total de viabilidad al cabo15-30 días.más rápido que a pH=5,5, pero para ambos casos se llegómismoresultado final.

lado,conservadores.

El efecto del pH debe explicarse, por un porLa

delde

potasio1982;

tener

su efecto sobre la disociación de losefectividad de los conservadores utilizados es funciónpH y ésta aumenta a medida que el pH se acerca al valorsu pKa ó es menor que el mismo(4375 para sorbato de

de y 001.,debe

empleado

y 4,90 para propionato calcio (Parada1980)).

efectoPor otro lado, se en

delaureus 0-243,

hafosfórico

Corlett y Brown,cuenta el 'per se' ácido paraacidificar el medio. Para S. una de las cepasempleadas en este trabajo, se reportado a bajos

elinhibir el crecimiento.

que

niveles de aw ácido es muy efectivo paraPara pH=5,6.y aw=0,91 el tiempo de

5

238

generación cuando se acídifica con ácido fosfórico es de9,05 horas mientras que si se acidifica con ácido cítrico,acético o clorhídrico los tiempos de generación son de3,2-4,9 horas (Troller, 1985).

Dadoque en las condiciones ensayadas anteriormentelos recuentos disminuían muy rápidamente, se realizó unaexperiencia utilizando menor cantidad de conservador: 0,1 Zp/p de sorbato de potasio ó 0,1 Z p/p de propionato decalcio, ambos a pH=5,0. En la Figura 5.6 se encuentran losresultados obtenidos. Comopuede observarse la población deS. aureus y de bacterias aerobias totales disminuyó de formatal que a los 20-30 dias los recuentos eran de alrededor de10 UFC/g. Los resultados obtenidos indican que las menoresconcentraciones de conservador/es utilizadas también puedenreducir en forma rápidamente y con igual efectividad lapoblación inicial de bacterias mesófilas y de S. aureus.

Para estudiar la estabilidad microbiológica del suerode queso concentrado parcialmente hidrolizado con una altacarga microbiana inicial, se utilizó suero deteriorado(dejado a temperatura ambiente durante 3 semanas) hasta

5 UFC/g.Luego se ajustó el pH a 5,0 y se agregó el conservador (0,2llegar a un recuento de bacterias aerobias de 3,5 10

Z p/p de sorbato de potasio, 0,2' Z p/p de propionato decalcio ó 0.1 Z p/p de sorbato de potasio + 0,1 Z p/p depropionato de calcio). De esta manera pudo estudiarse elcomportamiento de 1a flora aerobia propia del suero, conmayorconcentración inicial y ademássin que interfiriera ensu evolución la presencia de S. aureus. Los resultadosobtenidos se encuentran en la Figura 5.7. Como se puedeobservar, los recuentos, tanto del control de suero de queso

T =37°CGwruO,90

rTFIIIIIIIIIIH

2.00

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H

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0.00 IIÏTÏÍÍÍIIIIIÍÍIIIIIIIÏIIÏIIIlIIIIIIÍlllIIÏÍFIIÍIÏÍIIIIIIIÏIÍII¡IIÏIII

o1o20304o50607o

TIEMPO(dio)

Figura5.6: EvolucióndelosrecuentosdeS.aureusydebacteriasaerobias(unoen presenciadelotro)enSQCHapH5,0con0,1Zp/pdeconservadoryalmacenadoa37°C.Bacteriasaerobias:A0,1Zp/pSK;U0,12p/pPCa;(3control SQCH,pH=5,0.S.aureus:A0,1Zp/pSK;I0,1zp/pPCa;53controlSQCH,pH=5.0.llrecuentonuloómenoraSÜLWCporplaca.

T =37°COWNO,9O

240

lllllllllllllllllllllllllf

0.00 IIIIIÏIII1IIIIIÏIÏTIIÏÏÏÏTIIFIIÍIIIÏIlïïlïïllIIIIl

o204o608O100

TIEMPO(dio)

Figura5.7: EvolucióndelosrecuentostotalesdebacteriasaerobiasenSQCHcon0,2Zp/p deconservador,almacenadoa37°C.A0,27:p/pSK,pH=5,Ü;r:0,27;p/pPCa, pH=5,Ü;o0.1Zp/pSK+0,17€p/pPCa,pH=5,0.Controles:eSQCH, pH=6,Ü;.#.SQCH.pH=5.Ü;'*SQC,pH=6,Ü.

241

concentrado parcialmente hidrolizado a pH=5,0 como de lasmuestras preservadas, disminuyen a lo largo del tiempo. Enlos otros controles hubo crecimiento. Si se comparan loscontroles de suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado a pH 5,0 de las figuras 5.5 y 5.7 se observa quepara esta última los recuentos disminuyeron en función deltiempo, mientras que en la Figura 5.5 al principio hubocrecimiento. Esto puede explicarse en base a lasdiferencias que existían entre los dos sueros de quesoconcentrado empleados. Para la primera experienciarealizada se trataba de suero concentrado que habia sidomantenido siempre bajo refrigeración. El suero de lasegunda experiencia fue dejado a temperatura ambientedurante bastante tiempo a fin de aumentar los recuentos y nose sabia en qué fase de su crecimiento se encontraban lasbacterias aerobías presentes en el mismo. Es posible que seencontraran en su fase estacionaria o declinante, lo cualexplicaría el descenso de los recuentos. Estos resultadosno deben considerarse para concluir que en el suero de quesoconcentrado parcialmente hidrolizado a pH=5,0sin preservarno pueden crecer las bacterias aerobias.

5.4.2.2. Levaduras y hongos

El limite de aw para el crecimiento de Saccharomycescerevisiae es 0,89 (Pitt y Hocking, 1985) en un medio de

glucosa a pH 6,0. Debido a que esta aw es muy cercana a laaw del suero de queso concentrado parcialmente hidrolizadose proCedió, en primera instancia, a determinar si estalevadura era capaz de crecer en el suero de quesoconcentrado parcialmente hidrolizadO' a pH=5,U sin ningún

242

conservador. Se inoculó esta levadura en el suerocorrespondiente en cantidad tal que resultó un recuento de7,11 104 UFC/g y se incubó a 25°C. Luego de 14 días deincubación el recuento fue de 8,12 104 UFC/g y a los 21 díasde 1,01 108 UFC/g. Estos resultados demuestran que, si bienno crece rápidamente en este sustrato, su crecimiento no esinhibidozpuede desarrollarse en el mismo. Dado que estalevadura crece con dificultad en suero de queso concentradoparcialmente hidrolizado, para realizar el estudio dealmacenamiento correspondiente se preservó el suero de quesoconcentrado parcialmente hidrolizado sólo con 0,1 z p/p desorbato de potasio ó con 0,1 X p/p de propionato de calcio yse ajustó el pH a 5,0. Comocontroles se utilizaron suerode queso concentrado a pH=6,0 y suero de queso concentradoparcialmente hidrolizado a pH=5,0, ambos sin conservador.Se inoculó la levadura de forma de obtener un recuento

5 UFC/g y las muestras fueron incubadas a 25°C.inicial de 10Los resultados obtenidos se encuentran en la Figura 5.8.Comopuede observarse S. cerevisiae no puede crecer en elsuero de queso concentrado parcialmente hidrolizadopreservado con 0,1 Z p/p de cada uno de los conservantesutilizados. Al cabo de 30-40 días los recuentosdisminuyeron en 3 y 2 ciclos logaritmicos en presencia desorbato de potasio ó propionato de calcio respectivamente. Sibien los recuentos obtenidos con 0,1 Z p/p de propionato decalcio son un orden mayor que con sorbato de potasio, son losuficientemente bajos comopara no producir deterioro. Porlo tanto se puede concluir que el crecimiento deSaccharomyces cerevisiae es inhibido en suero de quesoconcentrado parcialmente hidrolizado preservado con 0,1 %p/p de sorbato de potasio ó 0,1 % p/p de propionato decalcio durante los tres meses de almacenamiento.

800

T=37°c0.,N0.90

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204oeo80100

TIEMPO(dio)

C)

Figura5.8: EvolucióndelosrecuéntosdeS.cereviciaeydeS.rouxiienSGC.con0,1X p/pdeconservadoryalmacenadoa25°C.S.cerevicjae:A(3,1Xp/pSK, pH=5,Ü;D0,1Zp/pPCa,pH=5,0;GacontrolSQCH,pH=5,0;x:controlSGC, pH=6,Ü.s.rouxii:A0,1Zp/pSK,pH=5,0;u0,1zp/pPCa,pH=5,Ü;+ controlSQCH,pH=5.Ü;C>controlSGC,pH:6,0.(1)Roturadelfrascoque conteníalamuestraporexcesivaproduccióndegas.

244

Respecto de la levadura Saccharomyces rouxii. enprimer lugar se verificó la posibilidad de crecimiento de lamisma en suero de queso concentrado parcialmente hidrolizadopreservado con 0,1 Z p/p de sorbato de potasio ó 0,1 Z p/pde propionato de calcio a pH=5.U. Los resultados obtenidosse encuentran también en la Figura 5.8. Se utilizó comocontrol suero de queso concentrado a pH 6,0 y suero de quesoconcentrado parcialmente hidrolizado a pH 5,0, ambos sinconservador. Comopuede observarse de la Figura 5.8, unaconcentración de 0,1 Z p/p de propionato de calcio no escapaz de inhibir el crecimiento de S. rouxii, ya que surecuento aumentó hasta 5,0 106 UFC/g, produciendo gas encantidad suficiente como para romper el recipiente quecontenía a la muestra. Con 0.1 Z p/p de sorbato de potasio.si bien no se llegó a tal extremo, hubo producción de gas ylos recuentos llegaron hasta valores cercanos a 106 UFC/g alos 17 dias y luego descendieron lentamente. Estecomportamiento indicó que estas condiciones no son adecuadaspara controlar el crecimiento de S. rouxii.

Se trabajó entonces aumentando la concentración totalde conservador hasta 0,2 Z p/p. Se utilizaron lassiguientes concentraciones de conservador: 0,2 X p/P desorbato de potasio, 0,2 Z p/p de propionato de calcio ó 0,1Z p/p de sorbato de potasio + 0,1 Z p/P de propionato decalcio. Los resultados obtenidos se encuentran en la Figura5.9. Con 0,2 Z p/p de sorbato de potasio no sólo seconsiguió un muybuen control del crecimiento de S. rouxii,sinó que se eliminó casi toda la población a los 20 dias dealmacenamiento. A1 utilizar 0,2 Z P/P de propionato decalcio los recuentos obtenidos fueron aproximadamente tres

245

órdenes mayores que con sorbato de potasio y 1aconcentración bacteriana se mantuvo levemente inferior alnivel inicial. Para el caso de la mezcla de sorbato ypropionato los recuentos fueron intermedios entre los dosanteriores llegando a ser al final del almacenamiento unorden menorque el valor inicial. Evidentemente el sorbatode potasio, en una concentración de 0,2 Z p/p, es elconservador más efectivo para impedir el deterioro del suerode queso concentrado parcialmente hidrolizado por acción deS. rouxii. Sin embargo cuando se utilizó la mezcla desorbato de potasi04-propionato de calcio ó solamentepropionato de calcio, se logró controlar el crecimiento deesta levadura pues los recuentos obtenidos al final delalmacenamientono superaron los recuentos iniciales. Estopermite concluir que tanto 0,2 Z p/p de cualquiera de losdos conservadores empleados como la mezcla de ambos sonaptos para controlar el crecimiento de S. rouxii en suero dequeso concentrado parcialmente hidrolizado a pH 5,0 a lolargo de un almacenamiento de tres meses.

En todos los estudios microbiológicos que serealizaron a continuación no se analizaron las condicionesde 0,1 Z p/p de sorbato de potasio ó 0,1 Z p/p de propionatode calcio, ya que demostraron no ser suficientes paracontrolar el crecimiento de S. rouxii en suero de quesoconcentrado parcialmente hidrolizado.

Otra levadura estudiada fue Saccharomycesbailii. Enla Figura 5.10 se muestran los resultados obtenidos con S.bailíi inoculada en suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado a pH 5,0 y preservado con 0,2 Z p/p de sorbatode potasio, 0,2 Z p/p de propionato de calcio y 0,1 Z p/p de

246

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0.00 [TTTÏÏIIIFIIIIIÏTI[IIIIIÏIIÍIIIIITIFÏFIÏIÍIIÏÏFÏIII

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1.00¡rï¡ïrrT1F]rrrIrrïrr¡írrrlI¡¡¡¡¡¡nlerrrrrrïilrrII¡

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NEMPO(me)

Figura5.10: CrecimientodeS.bailiienSQCHcon0,2Xp/pdeconservadoryalmacenadoa 25°C.0,2zp/psx,pH=5,Ü;a0,2zPCa.pH=5,Ü;o0,1zp/psx+0,1z p/pdePCa.pH=5,0;{9controlSQCH,pH=5,0;*controlSQC,pH=8,0.

248

sorbato de potasio + 0,1 Z p/p de propionato de calcio yalmacenado a 25°C. De todas las levaduras ensayadas. S.bailií demostró ser la más resistente a las condiciones delmedio. Si bien no fue capaz de desarrollar en exceso (suconcentración aumentó un orden o menos), su población semantuvo aproximadamente constante a lo largo delalmacenamiento para todas las condiciones ensayadas. Se debetener en cuenta que S. bailji es resistente a determinadasconcentraciones de sorbato de potasio, con lo cual laeficacia de este conservador es menor que para los otrosmicroorganismos utilizados. Los resultados aqui obtenidosconfirman la gran resistencia de esta levadura a losfactores de estrés, lo cual hace peligrosa su presencia encualquier alimento que se desee almacenar. Para suero dequeso concentrado parcialmente hidrolizado preservado, todaslas condiciones en que se trabajó demostraron ser igualmenteefectivas para impedir el crecimiento de S. bailii.

Los recuentos obtenidos con Debaryomyces hanseniidurante el almacenamiento se encuentran en la Figura 5.11.Se trabajó con suero hidrolizado preservado en las mismascondiciones que para la levadura anterior. En estascondiciones, al cabo de una semana la población habiadescendido a menos de 10 UFC/g, lo cual demuestra que estalevadura no puede crecer en el suero de queso concentradoparcialmente hidrolizado preservado.

Por último se analizó el crecimiento de variasespecies de hongos. En la Tabla 5.2 se presentan losresultados obtenidos con los hongos inoculados en: AgarPapa-Glucosa (control); suero de queso concentrado(control); suero de queso concentrado parcialmente

QWN0,90T=25°C

249

H)

1.00‘ “a

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406080100TIEMPO(dic)

Figura5.11: CrecimientodeD.hanseniienSQCHcon0,2 25°C.0,2Zp/PSK,pH=5,0;a0,22PCa,pH=5,0;o0,1Zp/pSK+0.1 P/pdePCa,pH=5,0;(9controlSQCH,pH=5,0;*controlSQC,pH=6,Ü.

Zp/pdeconservadoryalmacenadoa

2

250

TABLA 5.2

Crecimiento de hongos en suero de queso concentradoparcialmente hidrolizado, preservado con 0,2 % p/p de

oconservador, almacenado a 25 C.

HONGO AGAR SOC SQCH SQCHP SQCHP SQCHP

PAPA CONTROL CONTROL SK PCG SK+PCO

TIEMPO DE RECHAZO «Km

P.roguefortii 2 7 16P. funiculosum 2 7 55E herbariorum 3 3 45E. amstelodami 2 4 4A niger 2 4 7P variotti 2 16 16W sebi 3 21 ­

I Agar Papa: Agar Papa-Glucosa

I SQCcontrol: suero de queso concentrado a pH=5,0 y aw=0,94(sin conservador).

I SQCHcontrol: suero de queso concentrado parcialmente

hidrolizado a pH=5.Üy au=0,90 (sin conservador).

I SQCHP SK: suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado preservado con 0,2 Z p/p de sorbato de potasio,

DH=5.0 y aw=0,90.

251

(continuación de la Tabla 5.2)

I SQCHPPCA: suero de queso concentrado parcialmentehidrolízado preservado con 0,2 Z p/p de propíonato de

calcio, pH=5.0 y aw=0,90.

I SQCHP PSK: suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado preservado con 0,1 Z p/p de sorbato de potasio

y 0,1 %p/p de propionato de calcio, pH=5,0 y aw=0,90.

252

hidrolizado (control) y suero de queso concontradoparcialmente hidrolizado preservado con 0,2 Z p/p de sorbatode potasio, 0,2 Z p/p de propionato de calcio ó Ü,1 Z p/p desorbato de potasio + 0,1 Z p/p de propionato de calcio, a pH5,0. En la tabla 5.2 se detallan las condiciones empleadaspara cada medio y el tiempo de rechazo. Se define comotiempo de rechazo el tiempo necesario para que se formesobre la superficie del medio una colonia lo suficientementegrande comopara ser visible a simple vista. Todos loshongos crecieron en los controles, sin embargo ninguno deellos fue capaz de hacerlo en el suero preservado en ellapso de tres meses

5.5. Conclusiones

En base a los resultados obtenidos con losmicroorganismos estudiados, los que producirían mayoresproblemas, en caso de contaminarse el suero con ellos, sonlas levaduras S. bailii en primer lugar y S. rouxii ensegundo lugar. Estos fueron los microorganismos cuyosrecuentos se mantuvieron aproximadamente constantes duranteel almacenamientopara las distintas condiciones ensayadas.Sin embargo. debido al calentamiento al que se somete alsuero diluido para su concentración, las levaduras quepudieran estar inicialmente presentes mueren.Efectivamente, si se realiza un recuento de hongos ylevaduras en el suero concentrado fresco (utilizando AgarPapa-Glucosa) se obtiene un recuento nulo. El mismoresultado fue encontrado por Kanterewicz y col. (1985b).Con respecto a la resistencia térmica de S. bailii y S.rouxii, se sabe que S. rouxii raramente sobrevive a uncalentamiento a 62,5°C durante 10' minutos (Put y 001.,

1976). Gibson (1976) estudió la influencia de la aw sobrela resistencia al calentamiento de S. rouxii en solucionesque contenían glucosa y sacarosa. El valor del tiempo de

reducción decimal (D) a55°c a una aw de 0,98 fue 0,1minutos; a aw=0,94 de 0,6 minutos y a una aw=0,90 de 7minutos. Durante la concentración del suero diluido la awvaria de 0,99 a 0,94-Ü,95; el tratamiento térmico realizadodurante la concentración del suero a 70°C seria suficientepara eliminar a esta levadura, en caso de hallarse presenteen el suero de queso. Con respecto a S. bailii. Put yDeJong (1982) encontraron que las células vegetativas deesta levadura tienen una baja resistencia al calentamiento.El D a 60°C es Ú,1—Ü,3 minutos, con lo cual serianeliminadas durante la etapa de concentración del suero. Sinembargo se .debe tener especial ciudado en evitarcontaminaciones durante la etapa de hidrólisis y depreservación del suero a fin de evitar problemasposteriores. En caso de producirse una contaminaciónaccidental luego de preservado el suero, con las cantidadesde conservador que se emplearon se asegura el control. sobreel crecimiento de estos microorganismos.

En cuanto a la elección del conservador a utilizar,todas las combinaciones empleadas (concentración total deconservador = 0,2 Z p/p) fueron. efectivas para evitar laproliferación de los microorganismos inoculados. El sorbatode potasio fue el más eficaz para inhibir el crecimiento detodos los microorganismos ensayados, salvo para S. bailii,donde su eficacia es similar a la de las otrascombinaciones. Con las otras dos condiciones de conservadorempleadas se obtuvieron también resultados adecuados. Elpropionato de calcio presenta el problema que aumenta

254

levemente la viscosidad del suero de queso concentrado,dificultando la agitación y mezclado de la enzima alprincipio de la hidrólisis.

Puede concluirse que la estabilidad microbiológicadel suero de queso concentrado parcialmente hidrolizado

(au=0,90) puede lograrse con un ajuste del pH a 5,0 y elagregado de 0,2 Z p/p de sorbato de potasio; 0,2 Z p/p depropionato de calcio ó 0,1 X p/p de sorbato de potasio + 0,1Z p/p de propionato de calcio. En estas condiciones elproducto puede ser almacenado a 25-37 °C durante tres mesessin sufrir alteraciones microbiológicas.

255

6. REOLOGIA DEL SUERO DE QUESO CONCENTRADO Y DEL SUERO DE

QUESO CONCENTRADO Y PARCIALMENTE HIDROLIZAUO

6.1 Objetivos

Las propiedades de flujo del suero de quesoconcentrado y del suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado difieren en forma considerable. Debido a laimportancia de las mismas en el manejo industrial de losalimentos se estudió el comportamiento reológico de ambossueros de queso concentrados (sin hidrolizar e hidrolizado),a fin de caracterizar sus comportamientos reológicos y podercuantificar las diferencias existentes entre ambos.

6.2. Introducción

Una caracteristica importante de los alimentos,asociada a su calidad y aceptación, son sus propiedades deflujo. Las propiedades de flujo de un alimento 'estándirectamente relacionadas con el procesamiento y la textura.Ademásfrecuentemente están vinculadas a otras propiedadesdel mismo, a saber: densidad, estabilidad y contenido desólidos (Shoemaker y col., 1987).

Existen varias razones para realizar medicionesreológicas sobre un alimento (Sherman, 1970):

I Controlar la calidad de materias primas ó ingredientespara la fabricación de un producto.

I Controlar la calidad de un proceso de fabricación y/o del

256

producto final.

I Estudiar la influencia de los ingredientes y de lascondiciones de procesamiento sobre las propiedadesreológicas de un determinado producto. Esto también puededar información sobre la relación entre la estructura de unproducto y sus características reológicas.

I Suplementar la información dada por un panel de expertossobre la textura del producto.

El conocimiento de las propiedades reológicas de unalimento es esencial para el diseño adecuado de los equiposy para realizar las diferentes operaciones unítarias. Porejemplo, para describir el flujo en caños, es necesarioconocer la dependencia del esfuerzo de corte con elgradiente de velocidades dentro del caño, información que seobtiene de las curvas de flujo del alimento (Rao yAnantheswaran,.1982; Rao, 1986).

A pesar que 1a reología abarca el estudio de todos losaspectos del flujo y 1a deformación que resulta del mismo,la viscosidad es el principal parámetro que caracteriza laspropiedades de flujo de los alimentos fluidos.

Se entiende por viscosidad a la resistencia internaa1 flujo que presenta un fluido, la cual determina que, alser sometido a un esfuerzo, no fluya indefinidamente.

De acuerdo a su comportamiento de flujo, losmateriales se clasifican en:

257

I Newtonianos: los fluidos asi llamados cumplen con 1a leyde Newton, la cual expresa la relación entre 1a viscosidad,el esfuerzo de corte y el gradiente de velocidad mediantela siguiente ecuación:

T=-n—=—nD (8.1)

donde:esfuerzo de corte 0 fuerza por unidad de área(Pascal).

n: coeficiente de viscosidad del fluido (Pascal s).u: velocidad del fluido (m/s).du/dx: D: gradiente de velocidad existente entre lasdos superficies, equivalente a la velocidad dedeformación (5-1).

En ellos la relación entre el esfuerzo de corte y lavelocidad de deformación es constante y representa laviscosidad del fluido. Las soluciones verdaderas (sales yazúcares diluidos en agua), las dispersiones diluidas demacromoléculas, las emulsiones diluídas y varios jarabespresentan este comportamiento (Muller, 1973; Scott Blair,1969; Howard, 1991).

I No-newtonianos: son los fluidos para los cuales larelación entre el esfuerzo de corte (T) y la velocidad dedeformación (D) no es constante. En este caso, 1a relaciónentre T y D está dada por la viscosidad aparente (nep), lacual es función de la velocidad de deformación. -De acuerdoa Rha (1978), la viscosidad aparente se puede definir de dosformas diferentes: a) como 1a relación T/D en cada punto, locual es dimensionalmente correcto y b) como ar/üD, que da

más información acerca del comportamiento del flujoalrededor de la velocidad de deformación en estudio. _Losflujos no-newtonianos pueden ser independientes ódependientes del tiempo. En los sistemas independientes deltiempo, la viscosidad cambia cuando varia la velocidad dedeformación, pero, a un dado valor de esta última, tiene unvalor finito independiente del tiempo. En los sistemasdependientes del tiempo, la viscosidad varía con el tiempocuando se aplica un gradiente de deformación constante.

Según la relación funcional existente entre T y D sepueden distinguir cuatro tipos de fluidos no-newtonianos(Rao, 1977):

I Pseudoplásticos: en este tipo de fluidos 1a viscosidadaparente disminuye a medida que aumenta la velocidad dedeformación. Este comportamiento es muy común en losalimentos e indica que existe en el mismo una continuadisgregación y reacomodación de la estructura, lo queproduce una disminución de la resistencia al flujo.Ejemplos de fluidos pseudoplásticos son las dispersiones ylas emulsiones.

l Dilatantes: en este caso se produce un fenómeno deespesamiento opuesto a la pseudoplasticidad. A1 aumentar lavelocidad de deformación aumenta la viscosidad aparente.Este tipo de comportamiento es menos frecuente en alimentosy es característico de fluidos con alta concentración desólidos suspendidos. Por ejemplo, el almidón de maiz enagua, según su concentración, puede comportarse comodilatante.

259

I Plásticos de Bingham: Este tipo de fluidos no fluye hastaque se excede cierto valor To del esfuerzo de corte, llamado"umbral de fluencia". Por encima de este valor fluyensiguiendo la ley de Newton, pero el coeficiente deproporcionalidad se denomina viscosidad plástica. Pocosalimentos exhiben este comportamiento.

l Mixtos: Estos fluidos presentan un comportamientodilatante o pseudoplástico pero sólo una vez que se superóel "umbral de fluencia". Alimentos que presentan estecomportamiento son: mayonesas, salsas concentradas, etc..

La descripción del flujo de fluidos no-newtonianosindependientes del tiempo se realiza utilizando diferentesmodelos matemáticos. Algunos de los más empleados sedetallan a continuación:

I El modelo de la ley de la potencia ó de 05twald-de-Haeleha sido utilizado ampliamentepara describir el flujo defluidos pseudoplásticos ó dilatantes en un amplio rango degradientes de deformación. Se lo representa por lasiguiente expresión (Rao, 1986):

1' = K o“ (6.2)

donde K: indice de consistencia.n: indice de comportamiento de flujo.To: umbral de fluencia.

El indice de comportamiento de flujo es una medida del gradode desviación del comportamiento newtoniano; si n es igual a1 el fluido es newtoniano y K coincide con el coeficiente de

viscosidad; si n es menor que 1 el fluido es pseudoplásticoy si n es mayor que 1 se trata de un fluido dilatante.

I El modelo de Herschel-Burkley (Sherman, 1970) es utilizadopara caracterizar el flujo de plásticos de Bingham ó defluidos de comportamiento mixto. Se lo representa pormedio de la siguiente expresión (Rao, 1986)

n (6.3)

donde To es el umbral de fluencia.

I La ecuación de Casson es otro modelo a dos parámetrosutilizado para describir el flujo de muchos alimentos,especialmente para calcular el esfuerzo de corte (Rao,1986):

T : To + K D (8.4)

La ordenada al origen elevada al cuadrado ha sidoconsiderada por varios investigadores (Mizrahi y Berk, 1972;Vitali y Rao, 1984; Bianchi y col., 1985) como el umbral defluencia. Para varios alimentos el umbral de fluenciacalculado por la ecuación de Casson es mayor que elcalculado por la ecuación de Herschel-Burkley ó eldeterminado experimentalmente.

I El modelo de Bingham se describe por medio de la siguienteecuación (Rao, 1988):

T : To + K D (8.5)

261

Este modelo supone que la muestra fluye con comportamientonewtoniano (n=1), luego de superar el umbral de fluenciar

Dependencia del flujo con respecto al tiempo

Los fluidos no-newtonianos dependientes del tiempopueden ser tixotrópicos o reopécticos:

I Tixotrópicos: son aquellos fluidos que, para un valorconstante del gradiente de deformación, presentan unadisminución de T ó de la viscosidad aparente en función deltiempo. Cuandoel cizallamiento desaparece estos fluidosrecuperan total o parcialmente su viscosidad original, peroeste proceso puede requerir un cierto tiempo. Los derivadosde celulosa, la pulpa de tomate y las salsas de frutas songeneralmente tixotrópicos. La tixotropía también esimportante en el uso de ciertos productos, por ejemplo, laaplicación de coberturas de chocolate.

I Reopécticos: son materiales que para un valor constante dela velocidad de deformación muestran un incremento en T ynop en función del tiempo. En los alimentos es másfrecuente un comportamiento tixotrópico que reopéctico.

Para caracterizar el comportamiento reológico de losfluidos dependientes del tiempo es necesario definir tresvariables, T, D y el tiempo. Para no utilizar gráficostridimensionales, se caracterizan relacionando dos de lasvariables mientras la tercera se mantiene constante. Así seobtienen dos tipos de reogramas:

I Los que relacionan T con D, llamados curvas de flujo, quetienen forma lobular, tipica de la histéresis.

I Los que relacionan T ó nop con el tiempo a velocidad dedeformación constante.

Generalmente se acepta que la dependencia de laspropiedades reológicas con el tiempo es una manifestación delos cambios estructurales que se producen debido alcizallamiento. Estos cambios estructurales pueden serreversibles o irreversibles. La estructura del sistema quepresenta tixotropia puede estar compuesta por moléculas decadena larga, partículas fuertemente solvatadas, flóculos,agregados formados por varias moléculas e incluso puedendarse estructuras entrelazadas reticulares por unión devarios agregados (Sherman. 1970; Holdsworth. 1971 y 1973).Los componentesde la estructura interactúan entre si porenlaces débiles de unión secundaria, principalmente fiuerzaseléctricas. La aplicación de fuerzas externas distorsiona orompe estas estructuras a lo largo del tiempo, oponiendocada vez menosresistencia al flujo, hasta que finalmentepuede llegar a alcanzarse un valor constante de T ó nop. A1cesar el cizallamiento las moléculas pueden volver arecuperar su estructura original luego de un cierto tiempo.Este es el caso de la tixotropía reversible.

En el campo de los alimentos la información sobre elfenómenotixotrópico es bastante escasa. El primer trabajoaparecido se debe a Longree y col. (1986), que realizó unestudio empírico de las características de las curvas dehistéresis registradas al analizar el comportamientoreológico de varias salsas (compuestas por leche, huevo y

263

almidones). Posteriormente. en 1970. Tung y col. aplicaronlos modelos de Weltman (1943) y de Hahn y col. (1959)- aclaras de huevo con diferentes tratamientos (fresca,envejecida e irradíada). Higgs y Norrington (1971)evaluaron el comportamiento tixotrópico de leche condensadaazucarada, mostaza y salsa de tomate tipo "Ketchup". En1974, Tiu y Borger realizaron un estudio para evaluarcuantitativamente la tixotropia en muestras de mayonesautilizando una versión simplificada de la teoría estructuraldesarrollada por Cheng y Evans (1965). Este mismo modelofue empleado por Massaguer-Roig y col. (1984) paracaracterizar el comportamiento tixotrópico de quesos crema.En 1978 los autores Costell y Durán utilizaron los modelosde Heltman (1943) y Hahn y col. (1959) para describir latixotropía del puré de albaricoque, obteniéndose buenosresultados con ambos modelos. En 1988, Hough y col.utilizaron el modelode Heltman (1943) para cuantificar latixotropia del dulce de leche, obteniendo también con dichomodelo muybuena-concordancia entre los datos experimentalesy los predichos.

Evaluación cualitativa de la tixotropia

En 1943, Weltman describió las pruebas necesariaspara detectar la presencia de tikotropía en un material.Actualmente se utilizan básicamente los mismos ensayos,siendo éstos: 1) representar gráficamente T en función de Dy verificar la presencia de histéresís; 2) medir ladisminución de T en función del tiempo de aplicación de ungradiente de velocidad constante y 3) medir T en función deltiempo de aplicación de una determinada velocidad dedeformación en muestras sometidas a un período de reposo

264

luego de hnher sido ciznllndns previamente. Geno*ulmente sesupone que el área encerrada por la curva de T versus ,Ddebida a la histéresis está relacionada con el grado dedestrucción de la estructura de la muestra. Este áreadependerá de la velocidad a la que se rompan las unionesque conforman la estructura de 1a muestra y también de lavelocidad a la que se reestablezcan. Ambasvelocidades a suvez dependen de cómo se obtienen las curvas de flujo.Existe la posibilidad que un fluido newtoniano dé histéresissi hay aumento de la temperatura por fricción, o también sila experiencia se realiza en forma rápida y las fuerzasinerciales son grandes. Debido a esto se deben evaluarcuidadosamente las curvas de flujo y para confirmar lapresencia de tixotropia de una muestra se deben cumplir lastres condiciones anteriormente descriptas.

Evaluación cuantitativa de la tixotropia

Las propiedades reológicas se han ido incorporandopara caracterizar determinadas propiedades de losmateriales. Por lo tanto es necesario cuantificar estaspropiedades a fin de establecer relaciones entre loscomportamientos de distintos productos ó entre elcomportamiento reológico y caracteristicas del producto(composiciónquimica, estructura, calidad, etc.).

Se ha estudiado la posibilidad de calcular, a partirde los reogramas tixotrópicos, parámetros que permitanvalorar numéricamente este fenómeno. Según Oriol Pascual(1974), las técnicas utilizadas se pueden clasificar en dosgrupos: 1) medidas basadas en el desmoronamientotixotrópico, observable en el diagrama T versus D y 2)

265

medidas basadas en el equilibrio desmoronamíento­regeneración tixotrópica (T ó nop versus tiempo). Desde elpunto de vista teórico el mejor método es el primero, pero amenudo en la práctica interesa más la cinética deregeneración tixotrópica.

El primer aporte al estudio de la caracterizaciónreológica cuantitativa de los fluidos tixotrópicos es elmodelo teórico desarrollado por Heltman (1943) para explicarel flujo de aceites minerales y suspensiones de pigmentoscuando se les aplicaba un cizallamiento. La expresiónmatemática inicial del modelo es:

B =-----—- (6.5)

donde B es el coeficiente de ruptura tixotrópica, nl y nzson las viscosidades aparentes a los tiempos tl y t2respectivamentel Esta ecuación representa el valor de ladisminución de la viscosidad aparente del fluido durante undeterminado periodo de cizallamiento a un gradiente dedeformación constante. Este período de cizallamiento puedetener una amplitud variable entre el momento en que seinicia el cizallamiento (t1=0) v aquel en el que se llega aun valor de equilibrio (t=te), donde la nop ya no varia.Para el período de cizallamiento comprendido entre t1=0, alcual corresponde n=n1, y un tiempo menor al necesario paraalcanzar el equilibrio (t2 < te; nz < ne) 1a expresiónmatemática inicial se transforma en:

n : nl —B ln t (6.8)

La expresión del modelo de Weltman (1943) se puede escribirsustituyendo los valores de la viscosidad aparente por losvalores correspondientes de T (Tung y col. (1970))

T = To —B' ln t (6.7)

donde To es la presión tangencial necesaria para iniciar elcizallamiento, B' es el coeficiente de ruptura tixotrópica,indicativo de la velocidad a la que desaparece la tixotropíaa un gradiente de deformación constante, y t es el tiempo deaplicación del cizallamiento.

Este modelo solamente vale para aquellos materialesen los que la regeneración estructural durante elcizallamiento es practicamente nula y sólo se pone demanifiesto durante el reposo (Costell y Durán, 1978).

Sobre la base de la teoria general propuesta porGoodeve en 1939 (Cheng y Evans, 1965), que propone que elfenómenotixotrópico para fluidos se puede explicar’ enfunción de un proceso de ruptura y reconstituciónestructural simultánea por acción del cizallamiento, Hahn ycol. (1959) desarrollaron su propia teoría. Consideraronque en los fluidos tixotrópicos existen dos tipos demoléculas: unas formadas por cadenas enlazadas que fluyencon características no-newtonianas y otras aisladas que lohacen comofluidos newtonianos. Al ser sometido el materialal cizallamiento se altera el equilibrio que existe entreambostipos de moléculas. Asi se destruye la estructuratridimensional y hay una disminución de la viscosidadaparente del material. La expresión matemática del modeloes:

267

log (T —To) : p —a t (6.8)

y tiene en cuenta el valor de T cuando se alcanza elequilibrio (To) luego de cizallar al sistema a una velocidadde deformación constante durante un tiempo to. Latixotropía se cuantifíca por los valores numéricos delparámetro p (constante para cada material) que refleja elvalor de la presión tangencial a la que se inicia elcizallamiento y el parámetro a" que refleja la velocidad deruptura estructural.

6.3. Materiales y métodos

6.3.1. Materiales

Para las mediciones de viscosidad se empleó suero dequeso concentrado (SQC) (51,90 %p/p de sólidos totales) ysuero de queso concentrado parcialmente hidrolizado (SQCH)obtenido por hidrólisis del anterior en las siguientescondiciones: T:37°C, pH=6,0 y 0,1 X p/p de enzima; el gradode hidrólisis alcanzado fue 64,3 z, luego de 7 horas dehidrólisis.

6.3.2. Preparación de las muestras

Para obtener mayor reproducibílidad en losresultados, previamente a su medición, las muestras fuerondesgasificadas (Tiu y Borger, 1974). Dicha desgasificaciónfue realizada por aplicación de vacio a muestras de suero

refrigeradas (5°C) para evitar el deterioro microbiano yporque la menor viscosidad del suero de queso concentrado _abaja temperatura facilita la expulsión del aire. Luego dela desgasificación se dejaban las muestras en reposo yrefrigeradas durante al menos una semana con el objeto depermitir la regeneración de la estructura. Paraestandarizar y eliminar la influencia de la historia previade las muestras de suero utilizado, para cada medición seempleó una muestra nueva y se aplicó a todas el mismotratamiento. Se trabajó con suero de queso concentrado ysuero de queso concentrado parcialmente hidrolizado a pH 6,0y 5,0, ajustados ambos con ácido fosfórico 85 Z p/p. Seestudió la influencia de la temperatura trabajando a 25°C y5°C.

6.3.3. Equipo y metodología de trabajo

Se termostatizó la muestra, previamentedesgasifícada, a la temperatura de trabajo durante 12 horas.Las mediciones de viscosidad se realizaron con unviscosímetro marca Haake RV12 (Alemania) equipado con unprogramador Haake PG 142. La temperatura de las muestrasdentro del rotor se mantenía constante con un bañotermostático Haake (Alemania) cuya precisión era de l Ü,1°C.Comodispositivo sensor se emplearon cilindros concéntricosde acero inoxidable provistos por Haake (Alemania). Paralas muestras más viscosas se utilizó el sensor HVI(cilindrointerior (rotor): radio=20,04 mm;altura=60,00 mm; cilindroexterior (copa): radio=21,UÜ mm; volumen de muestra=40 cms)y para les muestras de menor viscosidad se utilizó el sensorNV(cilindro interior (rotor): radio interno=17,85 mm;radioexterno=20,10 mm;altura=80,00 mm;cilindro exterior (copay

radio interno=17,5U mm; radio externo=20.15 mm; volumen de3 .muestra=9 cm ). La muestra se introducia en el sensor

procurando manipularla lo menos posible, y se dejaba enreposo durante 30 minutos para eliminar los efectosinmediatos debido a la degradación de la estructura (Costelly Durán, 1978), luego se comenzaba la medición.

La obtención de las curvas de flujo (T versus D) delas muestras se realizó en forma automática utilizando elprogramador Haake PG 142. Para la determinacióncuantitativa de las curvas de flujo las muestras erancizalladas previamente hasta la eliminación de latixotropia. Luego se midió el esfuerzo de corte en funciónde 1a velocidad del rotor, primero en el sentido de lasvelocidades de deformación ascendentes y luego en el ordendecreciente. Las velocidades de rotación del rotorutilizadas estuvieron entre 0 y 64 revoluciones por minuto(rpm) y el tiempo empleado en efectuar cada barrido fue de 7minutos.

Para la obtención de las curvas de variación de napen función del tiempo, a velocidad de deformación constante,se trabajó a 64 rpm. Esta velocidad fue elegida como la másadecuada en base a ensayos preliminares. Cada muestra fuemedida por duplicado. La medición continuó hasta llegar aun valor de nop aproximadamente constante. Dadas lascomplejas características estructurales del suero de quesoconcentrado, en el cual hay asociación entre proteinas,lactosa (soluble y cristalizada) e iones (especialmentecalcio), en algunas muestras, en tiempos de hasta 5 horasde cizallamiento no se llegó a un valor de viscosidadaparente absolutamente constante. Por lo tanto se consideró

270

finalizada la medición cuando en cinco minutos la señalvariaba menosque 0,5 unidades de la escala de la señal.

Las fórmulas para calcular la viscosidad (mPa.s), elesfuerzo de corte (Pa) y la velocidad de deformación (l/s) apartir de la señal obtenida fueron:

donde S es la señal que se obtiene del equipo, n es lavelocidad del rotor (l/min) y A, M y G los factores decálculo de cada rotor, los cuales se detallan acontinuación:

SENSOR A M CI(Po/grado escala.) (min/9) (rnPa..s/grcdo escala.min)

HVI 3,22 2,34 1374NV 1,78 5,41 329

6.4. Resultados y discusión

8.4.1. Reología del suero de queso concentrado sinhidrolizar

6.4.1.1. Análisis de las curvas de flujo (esfuerzo decorte versus gradiente de deformación)

Para determinar las curvas de flujo (T versus D) de

271

suero de queso concentrado a 25°C se encontraron algunasdificultades. Cuando la muestra era cizallada a bajasvelocidades del rotor, la primera porción de las curvas deflujo (tanto la correspondiente a 1a porción ascendentecomoa la descendente) presentaba muchas fluctuaciones enlos primeros barridos. Asimismo, en algunas de lasdeterminaciones realizadas, los valores de T obtenidos abajas velocidades de rotación eran mucho mayores que loscorrespondientes a la máximavelocidad de rotación. Pese aque se variaron las condiciones de medición, no fue posibleobtener una curva de flujo correcta para ninguno de los dospH ensayados. Respecto de este comportamiento, observado abajas velocidades del rotor, Harper y El Sahrigi (1985)hallaron el mismo fenómeno trabajando con concentrados detomate. Las curvas de flujo de dicho material eranerráticas a bajos valores de D para las muestras másconcentradas. Encontraron que este comportamiento dependíamucho de cuán rápido aumentaba 1a velocidad de rotación ytambién de la existencia de un umbral de fluencia. Losresultados obtenidos en puré de pera por Harper y Lebermann(1962) confirman que el comportamiento de la muestra a bajosvalores de la velocidad de deformación se ve fuertementeinfluenciada por el umbral de fluencia, así como por ladependencia con el tiempo y los efectos de borde. Tampocodebe olvidarse que el suero de. queso concentrado es unsistema heterogéneo y es posible que la presencia de loscristales de lactosa, sin bien menoresque el espacio entrelos cilindros, introduzca perturbaciones en elcomportamiento del suero de queso concentrado.

Una vez cizallada la muestra durante cierto tiempo,es decir luego de la degradación de parte de la estructura

272

responsable de la tixotropía, el trazado de las curvas deflujo, a 25°C, se normalizaba y permitió la obtención _delos datos necesarios para efectuar el estudio cuantitativode las mismas. Cuando se trabajó a 5°C no se presentaronproblemas para obtener las curvas de flujo.

En las Figuras 8.1 y 6.2 se muestran, a modo deejemplo, las curvas de flujo obtenidas a 25°C y a 5°C,respectivamente, para suero de queso concentrado a pH 6,0.En la correspondiente a 25°C se pueden observar lasfluctuaciones descriptas en el párrafo anterior. Además,enambas curvas, aunque con mayor claridad en la obtenida a5°C, se puede apreciar la existencia del "loop" dehistéresis, tipico de una sustancia tixotrópica, y ladisminución del área a medida que la muestra va siendocizallada. La curvatura de la porción ascendente del cicloes,en todos los casos, mayor que 1a de la descendente,caracteristica ésta de los fluidos tixotrópicos (Heltman,1943). Las curvas obtenidas a pH 5,0 fueron semejantes alas obtenidas a pH 6,0, para las dos temperaturasconsideradas (no se muestran los datos).

En la Figura 6.3 se muestran las curvas de flujoobtenidas a 25°C y 5°C para suero de queso concentrado a pH6,0 y 5,0, cuando ya no existía' tixotropia. Para laobtención de los datos, la muestra era cizallada a velocidadconstante hasta que se verificara la desaparición de latixotropía y luego se realizaba la curva de flujo.

Al analizar el efecto de la temperatura, a pHconstante, se encuentra que a mayor temperatura el esfuerzode corte, y por lo tanto la viscosidad aparente (definida

como nop = T/D), aumentan. Este comportamiento es anómaloya que 1a ley de Arrehnius, que es obedecida por 1a mayoríade los alimentos (Rao, 1977), predice una disminución de laviscosidad al aumentar la temperatura. Con respecto a1efecto del pH, para las dos temperaturas estudiadas, aldisminir el pHdisminuye el valor del esfuerzo de corte parael mismo valor de D.

El análisis matemáticode estas curvas se realizóutilizando los siguientes modelos: ley de la potencia,Herschel-Burkley, Casson y Bingham. El valor de losparámetros fue obtenido por regresión lineal (modelos de leyde potencia, Casson y Bingham) y por regresión no lineal(modelo de Herschel-Burkley) El ajuste entre los modelos ylos datos experimentales se calculó por medio de 1adesviación media relativa (P) definida como(Rovedo y 001.,1991):

p = 100 É: _Á_IL;LlBLZ (6_9)

donde Ti es el esfuerzo de corte medido , Tpt es el esfuerzode corte predicho y N el número de observaciones. Valoresde P menores o iguales al 5 X representan un buen ajusteentre los datos experimentales y el modelo aplicado (Rovedoy 001., 1991). En la Tabla 8.1 y en la Figura 8.4 seencuentran los resultados obtenidos aplicando estos modelos.

Para suero de queso concentrado el modelo que, enpromedio, ajusta mejor los datos experimentales obtenidos enlas ‘diferentes condiciones. es el de Herschel-Burkley

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D(1/8)

CurvadeflujodesuerodequesoconcentradodepH=6,Üya25°C.Figura6.1:

2'74

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D(1/8)

Figura6.2: CurvadeflujodesuerodequesoconcentradodepH=8,Üya5°C.Laseñalde estegráficoestáaumentadatresvecesconrespectoasuvalorverdadero.

276

700 oo o

o600 o

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500 o Uo El

o Ü400 o Ü

Ü

o c1

D

300 0 Üu

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D A A AA

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0

o <> ° o oCvO

Figura 8.3:

ESFUERZODECORTE(Po)

Curvas de flujo de suero de queso concentrado de pH 6,0 y 5,0obtenídas'a 25°C y 5°C. o pH=6,0 y T=25°c, u pH=5,0 y T=25°c,

A pH=8,Ü y T:5°c, o pH=5,Ü y T=5°C.

277

Tabla 6.1

Curvas de flujo de suero de queso concentrado. Descripciónmatemática y ajuste de los diferentes modelos.

MODELO T pH To K n P(°c) (ra) (ra-a“)

Ley de potencia 25 6 0 145,79 0,34 21,04T = K Dn 25 5 0 16,99 0,67 1,07

5 6 0 17,56 0,50 2,755 5 0 1,61 0,81 4,65

Herschel-Burkley 25 6 235,32 11,81 0,73 1,38T - To = K Dn 25 5 2,63 15,23 0,69 1,10

5 6 37,17 4,44 0,74 0,765 5 0,85 1,17 0,68 3,15

Casson 25 6 212,57 0.89 . 2,33r": = ro": + 25 5 24,81 1,98 , 1,65+ K‘” D“z 5 6 32,81 0,55 , 1,83

5 5 0,26 0,60 , 4,10

Bingham 25 6 280,51 2,92 , 2,62r = ro + K D 25 5 79,41 2,80 , 4,03

5 6 54,20 1,17 , 3,095 5 4,56 0,63 , 3,43

Figura 8.4:Predicción de las curvas de flujo de suero de quesoconcentrado utilizando los siguientes modelos: a) ley de lapotencia; b) Herschel-Burkley; c) Casson y d) Bingham.o pH=6,0 y T=25°C, u pH=5,Ü y T=25°c, a pH=6,0 y T=5°c,

o pH=5,0 y T=5°C, (-———)predicción teórica.

279

Cl)

SUERODEQUESOCONCENTRADO

Laydepotencm

E

ESFUERZO DE CORÏE (Po)

6O¿“WWWÉ

rv

l'Izóo''150'

o(1/a)

SUERODEQUESOCONCENTRADO

Canon

8 8o oESFUERZO DE CORÏE (Pa)

b)

SUERODEQUESOCONCENTRADO

HaracheI-Burkley

8ocsruznzo DEcom: (Po)

8O

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vr.xvx¡ ruufir‘v’—ï—|

o501do150

D(1/3)

d)

SUERODEQUESOCONCENTRADO

Bmgnarn

g gESFUERZO DE CORTE (P0)

6o

(Figura 6.4 b) aunque con los modelos de Casson (Figura 6.4c) y Bingham(Figura 6.4 d) también pueden predecirse lascurvas de flujo. El modelo de Bingham se puede utilizarpara predecir los datos experimentales pues la curvatura quepresentan las curvas de flujo es pequeña. Esto permite unbuen ajuste de dicho modelo. El modelo que peor ajusta,sobre todo para suero a 25°C y pH 6,0, es la ley de lapotencia debido a que no contempla la existencia de unumbral de fluencia, que para este caso tiene un valorrelativamente alto.

Según se observa en la Table 6.1 el índice de flujo,calculado por el modelo de Herschel-Burkley y ley depotencia, es menor que uno para todos los casos, lo cualindica que el suero de queso concentrado es pseudoplástico.Sin embargo al disminuir el pH y 1a temperatura sucomportamiento se aproxima a1 de los fluidos newtonianos (n—» 1).

El umbral de fluencia para suero de queso concentradoes máximo para suero a 25°C y pH 6,0 y casi cero para sueroa 5°C y pH 5,0. El valor de To depende del modelo empleadopara calcularlo y a su vez este valor puede ser diferentedel encontrado experimentalmente (Pauletti y 001., 1988).

Con respecto a1 índice de consistencia predicho se veque disminuye bon la temperatura y el pH. Estos resultadosestán de acuerdo con lo encontrado experimentalmente.

6.4.1.2. Análisis de las curvas de viscosidad aparente enfunción de tiempo

281

Para obtener las curvas de viscosidad aparente- enfunción del tiempo de suero de queso concentrado fuenecesario trabajar a velocidades de rotación del rotormayores o iguales que 64 rpm. Si la velocidad de rotaciónera menor, cuando se trabajaba a 25°C, las curvaspresentaban grandes variaciones de los valores obtenidospunto a punto. Por lo tanto, para que el trazado de lascurvas no tuviera irregularidades se trabajó a 64 rpm. A5°C, si bien no se presentaba este problema, se trabajó a lamisma velocidad de rotación para poder comparar las curvasobtenidas con las correspondientes a 25°C. Todas las curvasde nap versus tiempo fueron realizadas con el sensor HVI.

En la Figura 6.5 se representa la variación delviscosidad aparente en función del tiempo de cizallamiento aun gradiente de deformación constante para suero de quesoconcentrado a pH=6.Üy T=25°C. Para la interpretación detodas las figuras en las que se representa nop en funcióndel tiempo se debe tener en cuenta que para la abcisa (ejedel tiempo) 1,5 cm corresponden a 1 minuto y que cadaporción de la curva (de izquierda a derecha del gráfico)dura 9 minutos. Es decir que a la curva superior lecorresponde una escala de la abcisa de 0 a 9 minutos; a lacurva inmediatamentre por debajo de ésta la escala de laabcisa va de 9 a 18 minutos y así sucesivamente. Comopuedeobservarse, en los primeros 10-15 minutos hay unadisminución muy acentuada del valor de nep; de alli en mássigue disminuyendo pero más lentamente. Este comportamientoes tipico de los fluidos tixotrópicos. Sin embargo no sellega a un valor de equilibrio (donde T o 1a viscosidadpermanezcan constantes en el tiempo), pues luego de 5 horas

(S'de) GVGISOOSIA

O¡D ­C4

¡lilllñülTT?oOON

"'Tf'."OIn¡x

1num

CURVAIOAQr-mnos WAa-SAfic-INUTOSWA3:18A27mnos CURVA4:27A36W108 CURVA5:36A45HNU'TOS

C)C)lO

O

¡Illlllllnlll¡li-Illllll.l|l|Ïlllllnl.lllll.llllllll|n.IIn.n¡ul

“EMPOOnm)

.II¡¡¡¡¡|.lI.lI....l

Figura8.5: Viscosidadaparenteenfuncióndeltiempodecizallamiento,agradientede deformaciónconstante,desuerodequesoconcentradodepH=6,Üya25°C(-——). Recuperacióndelaestructura(--).Curva1eslacurvasuperior,

lasdemás

senumeranenordendecrecientehaciaabajo.

2132

de cizallar a velocidad de rotación constante el valor de laseñal sigue variando. Estas variaciones son muypequeñas. ya los fines prácticos puede considerarse que se llegó a unvalor constante.

Se estudió también la recuperación de la estructuradegradada por el cizallamiento. Luego de cizallar lamuestra durante 3 horas a 1a máximavelocidad (512 rpm), seapagaba el equipo y se dejaba la muestra en reposo durante24 horas. Al cabo de ese tiempo se encendía el equipodeterminándose nuevamente 1a curva_ de nap versus tiempo.Los resultados obtenidos se muestran en la misma Figura 6.5(línea punteada). Si bien el valor inicial de la viscosidadde la muestra cizallada coincide con el de la muestrafresca, en 24 horas la recuperación de la estructura no fuetotal ó pueden haber ocurrido cambios irreversibles en partede 1a misma, pues el valor del viscosidad aparente disminuyemás rápido que en la muestra sin cízallar.

En la Figura 6.6 se representa la variación de laviscosidad en función de tiempo para suero de quesoconcentrado a pH=5,Ü y T=25°C. La viscosidad y el grado detixotropía de este sistema es menor que a pH 8,0 y ladegradación de la estructura hasta un valor aproximadamenteestable ocurre en un tiempo menor que para pH 6,0. Tambiénse estudió, con el mismo método empleado en el casoanterior, la capacidad de recuperación de la estructura delsuero de queso concentrado a pH 5,0. Los resultados sepresentan con la línea punteada de la Figura 6.8. Se puedeobservar que no hubo casi recuperación de la estructura alcabo_de 24 horas.

(S'de) OVGlSOOSIA

-1nün

CURVAtOASmUTos

-MVAZSAïer-W'ros

CLRVA3z18A27nNLnos cuzwx4:27A36mmos MVA5.36A45manos

¡llI]IIIIIIIIIIÍI|ÏII1IllnnllllllIIIIII-II|¡.ul|.¡I'lïT‘l’ll‘lI-Il

WEMPOÚnh)

Figura6.6:

de

deformaciónconstante,desuerodequesoconcentradodepH=5,Üya25°C(--).

las

Viscosidadaparenteenfuncióndeltiempodecizallamiento,agradiente Recuperacióndelaestructura(--).Curva1eslacurvasuperior,demás senumeranenordendecrecientehaciaabajo.

'¿’HÜ

Se analizó 1a influencia de la temperatura en laviscosidad del suero de queso concentrado a pH 8,0 y a pH5,0, para lo cual se trabajó a también a 5°C. En la Figura6.7 se muestran los resultados para el suero de quesoconcentrado de pH 6,0. Si bien la viscosidad del suero dequeso concentrado a pH 8,0 es menor a 5°C que a 25°C, lavelocidad de degradación de la estructura es más lenta amenor temperatura. Un comportamiento similar muestra elsuero de queso concentrado a pH 5,0 (Figura 6.8). El efectode la temperatura sobre la viscosidad del suero de queso esopuesto al que presentan la mayoría de los fluidos, en loscuales la viscosidad aumenta a1 disminuir la temperaturasegún lo predice la ley de Arrehnius.

Se intentó también medir la viscosidad del suero dequeso concentrado a 35°C pero éste aumentaba suconsistencia al punto de comportarse como un gel a dichatemperatura, y la muestra patinaba sobre las paredes delsensor, imposibilitando la obtención de resultadoscorrectos. Si bien no se pudo explicar porqué 1a viscosidadaumentaba con la temperatura, se piensa que este fenómenopuede estar relacionado con la gelificación reversible delas proteinas del suero a menores temperaturas que lasusuales.

Para realizar el análisis cuantitativo de las curvasde nop versus tiempo de suero de queso concentrado seutilizó el modelo de Weltman (1943) (ecuación 6.8). No seconsideraron para el tratamiento matemático los tresprimeros puntos de cada curva, ya que se desviaban muchorespecto de los otros valores, probablemente debido a lapresencia de un umbral de fluencia en las muestras (Harper y

(s'odw) ovcnsoosm

2000 1750

ÍIÏIÏIIIIIIÏIII|IIÏIÏIIIFIÏIIIÍÏ

CURVAt0A9F‘INUTOSCURVAa9A18PINUTOSCURVA3:18A27HTNUTOSCLRVA4.:27A36MINUTOS CURVA5:36A45MINUTOS

FÏITÏII

.lllrlllllll'llu:lllIl'llllllllllllllhlll.nll

TIEMPO(min.)

Figura8.7: Viscosídadaparenteenfuncióndeltiempode

...II..

cizallamíento,

8.

gradiente

de

deformaciónconstante,desuerodequesoconcentradodepH=6,0ya5°C.Curva1 eslacurvasuperior,

lasdemássenumeranenordendecrecientehaciaabajo.

287

CURVA1:oA9HNUTOS

1000;CURVAa9A18muros

1CURVA3:18A27HI'NUTOSd CURVA4-:27A36MINUTOS

CURVA5:36A4.5muros

288

¡[III

G IIlñlllllllllllllll'llIrlrlÏllI1I]rfirrlllllll‘l.l“lllllllllllIlIllïrllllrlllllll'l

NEMPOÚnh)

Figura6.8: Viscosidadaparenteenfuncióndeltiempodecizallamiento,agradientede deformaciónconstante,desuerodequesoconcentradodepH=5,0ya5°C.Curva1 eslacurvasuperior,lasdemássenumeranenordendecrecientehaciaabajo.

289

El Sahrigi, 1965). Los parámetros nl y B, que caracterizana la ecuación propuesta por Heltman (1943), los coeficientesde correlación (ro) obtenidos y el valor de P (definido porla ecuación 6.9) se encuentran en la Tabla 6.2 y en laFigura 8.9, se presentan los valores experimentalesde viscosidad aparente en función del tiempo y su predicciónteórica para suero de queso concentrado a 25°C y 5°C. Delas figuras y de los valores de P calculados se puedeconcluir que este modelo es adecuado para representarmatemáticamente el descenso de la viscosidad aparente a 10largo del tiempo de cizallamiento en suero de quesoconcentrado de pH 5,0 a 25°C y a 5°C, no siendo tan buenoel ajuste para suero de queso concentrado a pH 6,0 a 25°C y5°c.

De los resultados de la Tabla 6.2 se observa que elvalor de B, que indica cuán rápido desaparece la tixotropiaa una velocidad de deformación constante, es máximo parasuero de queso concentrado de pH 6,0 a 25°C. Al disminuirla temperatura ó el pH el valor de B disminuye notablemente.La temperatura tiene un efecto más pronunciado a pH 6,0 quea pH 5,0, siendo en este último caso muy pequeña ladiferencia entre los valores obtenidos a ambas temperaturaensayadas.

Con respecto al valor de nl, que representa el valorde la viscosidad de la muestra a tiempo cero y se puederelacionar con el umbral de fluencia, sigue las mismastendencias que B, siendo máximo para suero de quesoconcentrado a pH 6,0 y 25°C.

Se intentó ajustar los datos 'experimentales con el

290

TABLA 6.2

Parámetros del modelo de Heltman (ecuación 6.8) obtenidospara suero de queso concentrado a pH 6,0 y a pH 5,0 y atemperaturas de 25°C y 5°C.

MUESTRA 17i B ro P(mPo.e) (ml’a. e)

SQC, pH=6,0. T=25°C 1273128 25517 0.990 4,06sqc, pH=5,Ü, T=25°c 538i15 110ï6 0,980 4,47SQC. pH=6,Ü, T=5°c 996316 1171€ 0,977 7.56sec, pH=5,0, T=5°c 49sï14 8515 0,996 2,92

Figura 6.9:Predicción de la viscosidad aparente en función del tiempode suero de queso concentrado utilizando el modelo deWeltmen (ecuación 6.6): a) 25°C: o pH=6,0; D pH=5,0 y b)5°C: pH=6,o: pH=5,0; ( ) predicción teórica.

293

SUERO DE QUESO CONCENTRADOT = 25°CWeltmon

U1 OO

VISCOSIDAD(mPo.s)

Soo

Í Í Ï Í I I I I ' l Í I Ï I T Í I Í Í I I Í Ï l Í I I I Ï l I I l I T I Ï I I I

0 10 20 30 40TIEMPO (min.)

b) SUERO DE QUESO CONCENTRADOWeltmon T = 5°C

2000

131500cia

É,O :á 1ooo-_(7)OQ .(L)> l.

' O. . A A A A A

O

0 10 40 5020 30TIEMPO (min.)

294

modelo propuesto por Hahn y col. (1959). Para todos loscasos se obtuvieron bajos coeficientes de correlación.Posiblemente el ajuste de este modelo no sea bueno porque senecesita conocer el valor de Te (valor de T al que se llegaluego de degradar toda la estructura tixotrópica). Pese aque las muestras fueron cizalladas por tiempos prolongados,es posible que no se haya alcanzado el valor de To.Asimismo, se debe considerar que el modelo de Hahn y col.(1959) se basa en un equilibrio entre 1a ruptura y lareconstitución de la estructura, hipótesis que posiblementeno se cumpla en el suero de queso concentrado. Según sedeterminó experimentalmente en suero de queso concentrado depH 6,0 a 25°C y 5°C, a1 cabo de 24 horas la recuperación dela estructura es parcial.

6.4.2. Reología del suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado

6.4.2.1. Análisis de las curvas de flujo (esfuerzo de corteen función del gradiente de deformación)

Las curvas de flujo obtenidas para suero de quesoconcentrado parcialmente hidrolizado fueron del mismo tipoque las obtenidas para suero de queso concentrado y sepresentaron los mismos problemas. A 25°C las curvaspresentaban fluctuaciones en las primeras vueltas y luegoel trazo se normalizaba. A 5°C las curvas no presentaronanormalidades (no se muestran las figuras). Para suero dequeso concentrado parcialmente hidrolizado, debido a su

menor viscosidad se trabajó con el sensor NV.

En la Figura 6.10 se muestran las curvas de flujoobtenidas para suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado a los dos pH y a las dos temperaturas una vezque la estructura responsable de la tixotropía ha sidodegradada. Al igual que para suero de queso concentrado lamuestra fue cizallada a velocidad de rotación constantehasta la eliminación de la tixotropía y luego se determinóla curva de flujo.

Al analizar el efecto de la temperatura, a pHconstante, se ve que para pH 8,0 el esfuerzo de corte, y porlo tanto la viscosidad aparente, aumentan al aumentar latemperatura. Es decir que nuevamente no se cumple la ley deArrehnius. Sin embargo para suero de queso concentradoparcialmente hidrolizado a pH 5,0 a menor temperatura laviscosidad es mayor, es decir que en este caso particular seobedece la ley de Arrehnius. Con respecto al efecto del pH,trabajando a temperatura constante, a 25°C al disminuir elpH disminuye el esfuerzo de corte. A 5°C el pH casi noinfluye en los resultados obtenidos.

El análisis matemático de las curvas de flujo serealizó utilizando los mismos modelos que para suero dequeso concentrado y los resultados obtenidos se encuentranen la Tabla 6.3 y en la Figura 6.11.

El análisis de las curvas de flujo para suero dequeso concentrado parcialmente hidrolizado indica que, aligual que el suero de queso concentrado, las mismas puedenser descriptas por los modelos de Casson, Bingham y

ESFUERZODECORTE(Po)

296

_ 0

C)

100- o

J o

J oO

_ C) o AO o A

d A

0 X

50- o 2 2' o Q

a Ü D Ü

- o fi D u ÜO fi n Ü

_ a D8 80

OY! ll ll rï¡ l] rII lll r1 l| ¡Uñll ¡1 ll| Il r1 r1O 100 200 300

D (1/8)

Figura 6.10:Curvas de flujo de suero de queso concentrado parcialmentehídrolízado a pH 6,0 y 5,0 obtenidas a 25°C y 5°c.y T=25°C, a pH=5,0 y T=25°C,A.pH=6,Ü y T=5°c, OT=5°c.

O pH:6,0pH=5,0 y

297

Tabla 6.3

Curvas de flujo de suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado. Descripción matemática y ajuste de losdiferentes modelos.

MODELO T pH To K n P(°c) (Po) (“.9”)

Ley de potencia 25 8 0 0,65 0,88 2,42T = K Dn 25 5 0 3,21 0,41 6,55

5 8 0 0,29 0,93 5,495 5 0 0,24 0,97 5,27

Herschel-Burkley 25 6 2,28 0,48 0,94 2,02T —ro = K 0" 25 5 9,34 0,22 0,02 1,34

5 6 0,27 0,24 0,97 1,805 5 0,29 0,22 0,99 1,12

Casson 25 8 0,18 0,31 , 3,1671/2 = ro": + 25 5 7,72 0.03 , 2,68+ K“: 0"“ 5 6 0.02 0,20 , 1,96

5 0,001 0,21 , 1.31

Bingham 25 6 3,91 0,32 1,0 2,46r : To + K D 25 5 10,98 0,07 1,0 1,81

5 6 0,88 0,20 ,0 1,745 5 0,30 0,21 , 1,21

Figura 6.11:Predicción de las curvas de flujo de suero de quesoconcentrado y parcialmente hidrolizado utilizando lossiguientes modelos: a) ley de 1a potencia; b)Herschel-Burkley; c) Casson y d) Bingham. o pH=6,0 yT:25°c, a pu=5,0 y T=25°C, o pH=8,0 y T=5°C, o pH=5,0 yT=5°c, ( ) predicción teórica.

(°d) 3130:) 30 ozuanssa (0d) 3130:) 30 ozuanssa

a) SUERODEQUESOCONCENTRADOHIDROUZADO

Leydepotencia

ur-rrvvvu.vy.IVITI.Ir¡y

100r zoo

D(1/3)

c) SUERODEQUESOCONCDITRADOHIDROUZADO

Casson

(°d) 31803 30 oquana (0d) 31309 30 0183053

óN

,_óo

b) SUERODEQUESOCONCENTRADOHIDROUZADO

Hemchel-aundey

200

0(1/3)

d) SUERODEQUESOCONCENTRADOHIDROUZADO

Bingham

t10

200

D(1/3)

300

Herschel-Burkley. Las desviaciones del modelo de la ley dela potencia son apreciables para todas las condiciones,salvo para pH=6,0 y 25°C, por lo tanto se descarta parapredecir las curvas de flujo de suero de queso concentradoparcialmente hidrolizado. Los valores de las constantepredichas por el modelo de Herschel-Burkley y el de Binghamson semejantes ya que el indice de fluencia, predicho por elprimer modelo, es muy cercano a 1.

Los valores del indice de flujo encontrados parasuero de queso concentrado parcialmente hidrolizado sonmayores que para suero de queso concentrado y cercanos a 1,lo cual indica un acercamiento al comportamiento newtonianoal desaparecer los cristales de lactosa comoconsecuencia dela hidrólisis.

E1 umbral de fluencia calculado es menor que parasuero de queso concentrado, siendo muy pequeño y cercano acero para suero hidrolizado a pH 5,0.

Los valores del índice de consistencia son para todoslos casos considerados menores que los de suero de quesoconcentrado.

6.4.2.1. Análisis de las curvas de viscosidad aparente versustiempo

Para realizar la determinación de las curvas de napversus tiempo para suero de queso concentrado parcialmentehídrolízado se utilizó la mismavelocidad de rotación quepara suero de queso concentrado (64 rpm), a fin de poder

301

comparar mejor los resultados obtenidos en cada caso:

En 1a Figura 6.12 se observa el comportamiento desuero de queso concentrado parcialmente hidrolizado a pH 6,0y 25°C. Cuando se trabaja a pu 5,0 y 25°C (Figura 6.13)no se nota gran diferencia respecto de los resultadosobtenidos a pH 6,0. Es decir que a 25°C el pH no influyedemasiado en la viscosidad del suero de queso concentradoparcialmente hídrolizado. Además en todo punto laviscosidad es menor que para el suero de queso concentrado.

En cuanto a la regeneración de la estructura,experiencia realizada de igual forma que para suero de quesoconcentrado, luego de las 24 horas de reposo, no se recuperótotalmente ó parte de la estructura se degradó en formairreversible pues los valores de viscosidad alcanzados sonmenores que los de la muestra sin cizallar (Figuras 6.12 y6.13, linea punteada).

Al trabajar a 5°C, el descenso de viscosidad que seproduce es muypequeño respecto de los valores a 25°C,pudiendo concluirse que 1a viscosidad del suero de quesoconcentrado parcialmente hidrolizado se ve poco afectada porla temperatura (Figuras 8.14 y 6.15).

Como1a mayor diferencia que existe entre el suero dequeso concentrado y el suero de queso concentradoparcialmente hídrolizado. desde el punto de vista de suestructura, es 1a ausencia de cristales de lactosa en elsegundo, podria suponerse que los cristales de dicho azúcarinfluyen sobre el comportamiento reológico del suero dequeso .

(9°du0 ovusoosm

1nfin.

CLRVA‘EOAQI-Mflos CLRVAZQAÏSHNUTOS CLRVA3z18A27HNUTosCURVA4:27A36HNU'ros WA5:36A45mJTOS

200 150

OO

OL0

302

IlllllllTlllllllllllllli

¡I¡¡|llïnllll¡|........¡

Illllulunllll|l-.ul

C¡IllnïltlnllllIll-IIIIIÍÍIIIIIlll|lulII1_]1Illnn

“EMPOÜmn)

Figura8.12: Viscosidadaparenteenfuncióndeltiempodede

hidrolizado

la

cizallamiento,agradiente

deformaciónconstante,desuerodequesoconcentradoparcialmenteapH=6,0ya25°C(-——).

lasdemássenumeranenordendecrecientehaciaabajo.

Recuperacióndelaestructura(--).Curva1es

curvasuperior,

(S'de) ovousoosm

Lug_u_l_u_!

1nfin 1:0A9F'INUTOS agA‘anos 3:18A27P‘INUTOS 4:27A36HINUTOS 5:36A45mu10s

CURVA CURVA WA CURVA WA

303

III‘IIÏIII'lll‘nullÏ'1IIII'IIIIlIllllllïfiñllllïllI'II.IIII|IIIIIII

WEMPOÜMnÁ

Figura6.13: Viscosidadaparenteenfuncióndeltiempodede

hidrolizado

1a

cizallamiento,agradiente

deformaciónconstante,desuerodequesoconcentradoparcialmenteapH=5,0ya25°C(—).

lasdemássenumeranenordendecrecientehaciaabajo.

Recuperacióndelaestructura(——-).Curva1es

curvasuperior,

(S'de) GVGISOQSIA

CURVA CURVA CURVA CURVA CURVA

1min.

tOA9"murosa-9A18mmos3:18A27"muros4:27A36MINUTOS5;36A45MINUTOS

OIDN

llll|llll|OON

IllllllIllllllllllllÏÏñïÏIlllllIIIIrl¡1ÍÍÍIIIllllllllllllIIÍÏÍÏñllllllIIÍÏIIIIII-nn

TlEMPO(min)

304

(FDdHÜ ovosoosm

1nfim

“ CURVAJ CURVAdCURVA í aRVA

cueva.

1:0A9H'INUTOS ¿9A18Hmuros 3:18A27HNUTOS 4:27A36HINUTOS 5:36A4-5F1NUTOS

305

...II.]fi.

C

[llulllI.Il-|II¡IIIIIII!II!IIIII|]IIIIIÏÍ.|ÍÍ¡Illllnl|lllIIIIIÏÏÏIrÏ-Ïrllll

TIEMPO(min.)

Figura6.15:

de

hidrolizado

Viscosidadaparenteenfuncióndeltiempodecizallamiento,agradiente deformaciónconstante,desuerodequesoconcentradoparcialmenteapH=5,Üyas’c.

decrecientehaciaabajo.

Curva1eslacurvasuperior,lasdemássenumeranenorden

306

Al igual que para el suero de queso concentrado, lascurvas de viscosidad versus tiempo fueron correlacionadascon el modelo de Heltman (1943) (ecuación 6.6). Los

resultados obtenidos para las constantes nl y B seencuentran en la Tabla 6.4 y en la Figura 6.16 semuestra el ajuste del modelo a los datos experimentales. Delas figuras se puede observar que el ajuste del modelo a losdatos experimentales es bueno, pudiendo ser utilizado parala predicción de los datos.

Si se comparan los valores obtenidos, en la Table6.4, para suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado en diferentes condiciones de trabajo, no existemuchadiferencia entre ellos. salvo para el caso de pH 5,0 y5°C, donde los valores son levemente menores. Es decir quetanto la temperatura comoel pH tienen poca influencia sobrela viscosidad del suero de queso concentrado parcialmentehidrolizado. Los valores de nl y B para este suero I sonsensiblemente menores que para suero de queso concentrado.En 1a Tabla 6.4 también se presenta 1a bondad del ajusteentre el modelo y los datos experimentales expresado pormedio del parámetro P.

También se intentó reproducir los datosexperimentales por medio del modelo de Hahn y col. (1959).A1 igual que para el suero de queso concentrado loscoeficientes de correlación obtenidos no fueron adecuados,por lo que se descarta el uso de este modelo para describirel comportamiento tixotrópico del suero de queso concentradoparcialmente hidrolizado.

307

TABLA 8.4

Parámetros del modelo de Heltman (1943) (ecuación 6.6)obtenidos para suero de queso concentrado parcialmentehídrolizado a pH 6,0 y a pH 5,0 y a temperaturas de 25°C y5°c.

MUESTRA 771 B ro P(mPa . e) (mPa, . s)

SQCH, pH=6,0, T=25°c 314ï4 2512 0.990 1,72SQCH, pH=5,0, T=25°c 29715 2211 0,971 1,48SQCH, pH=6,0, T=5°C 31914 2111 0,997 0.80SQCH, pH=5,0, '=5°C 28713 '11;0,5 0,997 0,36

Figura 6.18:Predicción de 1a viscosidad aparente en función del tiempoutilizando el modelo de Heltmann (ecuación 8.8) de suero dequeso concentrado parcialmente hidrolizado: a) 25°C, opH=6,0; a pH=5,Üyb) 5°c. a' pH=6,0, 0 pH=5,0, (—)predicción teórica.

VlSCOSIDAD(mPa.s)

a) 309

SUERO DE QUESO CONCENTRADO HIDROLIZADOWeltman T = 25°C

4-20

370_

.320­

27o;

3

É

220€

170-I'llIII'ÏIÏ'Í'Ï'Ï'ÍIIIIIIÏÍIIl'IIÏI’Ír'ÏIÏ'ÍÏÍÏÍÏÏIÏÍ0 10 20 30 40 50

TIEMPO (min.)

b“)SUERO DE QUESO CONCENTRADO HIDROUZADO

Weltmon T = 5°C420

370

'c'n‘óa5,320o<o _

g ­LJ27o(L)>

220

170.1ÍÍÍ'ï'r'r'IIIÍ'IÏÏ'IÏ'UÏ'Í'I'IÏÍIII'I'ÏIÏIÍ'ÍÍIÍÍ'Ï'0 10 40 5020 30

TIEMPO (min.)

310

6.5. Conclusiones

Unode los principales problemas que presenta elsuero de queso concentrado para su aprovechamiento es,además de su alta concentración de lactosa, su elevadaviscosidad, lo que impide un fácil manejo del mismo. Sinembargo, al eliminar los cristales de lactosa por medio dela hidrólisis, la viscosidad desciende obteniéndose así unproducto casi líquido. Otra de las ventajas que presenta elsuero de queso concentrado parcialmente hidrolizadorelacionado con su comportamiento reológico, es que secaracteriza por ser poco tixotrópico y poco afectado por elpH y la temperatura. Además al tener menos carácterpseudoplástico se podría aproximar su comportamiento al deun fluido newtoniano, simplificándose el tratamientomatemático para el cálculo de requerimientos de bombeo,circulación en caños, etc.

El aumento de la viscosidad que presenta el suero dequeso concentrado al aumentar la temperatura, es opuesto alcomportamiento de la mayoria de los fluidos. En efecto lamayoría de los alimentos cumplen con la ecuación deArrehnius (Rao, 1977; Scott Blair, 1969), que predice unadisminución de la viscosidad al aumentar 1a temperatura(Saravacos, 1970; Harper y El Sahrigui, 1965; Rao, 1977).

Con el objeto de obtener alguna explicación respectode este comportamiento del suero de queso se realizaron dospruebas cualitativas:

311

I Se calentó suero de queso concentrado a una temperatura° . , . . .mayor que 60 C y se V10 que la v150051dad descendia y el

suero se tornaba líquido (se disuelven los cristales delactosa).

I Se agregó 0,1 a 0,5 Z p/p de cloruro de calcio, 10 queprodujo un aumento gradual de la viscosidad con laconcentración de la sal. Con 0,5 Z p/p de cloruro de calciose transformó en una pasta muyconsistente. Para analizarlo que ocurre al disminuir la concentración de calcioiónico en el suero de queso concentrado se agregó ácidoetilendiaminotetraacético (E.D.T.A.), complejante del ióncalcio, en concentraciones de 0,5; 1,0 y 2,0 Z p/p. Con 0,5% p/p de E.D.T.A. la viscosidad de suero de quesoconcentrado disminuyó con respecto a suero de quesoconcentrado sin complejante. Con 1 y 2 Z p/p de E.D.T.A. eldescenso de la viscosidad fue mucho más pronunciado y seprodujo una separación de fases. Los cristales de lactosa,que normalmente están en suspensión, precipitaron al cabode 30 minutos cuando se agregó 1,0 2 p/p de E.D.T:A. einmediatamente cuando la concentración fue de 2,0 Z p/p. Elprecipitado consistió principalmente en cristales delactosa, quedando un líquido sobrenadante. Estos hechos"permiten inferir la importancia del calcio en 1a estructuray propiedades del suero de queso concentrado. Los autoresKuhn y Foegeding (1991) encontraron que en suspensiones depreparados comerciales de concentrados de proteinas de suero(10 X p/p de sólidos) el agregado de E.D.T.A. dificulta lagelación de dichas suspensiones. Estos autores asignan alcalcio una función importante en los mecanismos de gelaciónde la proteínas del suero.

312

La “solidificación” del suero de queso concentrado a1ser colocado a 35°C se podría explicar suponiendo unprincipio de gelificación de las proteinas del suero a unatemperatura menorque las reportadas en la bibliografia(70-90 oC trabajando con soluciones acuosas de concentradosde proteinas de suero en una concentración de 7,5-10 Z p/p(Kohnhorst y Mangino, 1985; Melachouris, 1984; Harwalkar yKalab, 1985)), facilitado por la presencia de calcio y porla alta concentración de lactosa. Schmidt y col. (1986)encontraron que la concentración de lactosa influia en laviscosidad del suero de queso concentrado, siendo ésta mayora mayor contenido de lactosa. El calcio iónico interactúacon las proteinas del suero, aumentando las interaccionesentre ellas y facilitando la formaciónde redes proteicas,lo cual favorece la gelificación (Schmidt y col, 1978;Kohnhorst y Mangino, 1985; Mangino, 1984). En el suero dequeso concentrado coexisten proteinas con cristales delactosa y altas concentraciones de calcio. La asociación deestos factores podria ser responsable de los aumentos de laviscosidad al aumentar la temperatura. El agregado 'de uncomplejante de calcio como el E.D.T.A., impediria laintervención del calcio en la estabilización de las redesproteicas, con lo cual se produciría un descenso brusco de1a viscosidad y la consiguiente precipitación de loscristales de lactosa. Las altas temperaturas (mayores a60°C) producen un descenso de la viscosidad. Esto puede serdebido en parte a la acción del calor sobre las proteinasdel suero y por otro lado a la solubilización de loscristales de lactosa.

La disminución del esfuerzo de corte ó de laviscosidad aparente al disminuir el pH, se puede explicar

313

considerando el efecto del pH sobre las proteínas. Reiner(1949) encontró que la menor viscosidad de una proteinacorresponde a su pH isoeléctrico, aumentando a medida queel pH aumenta o disminuye. El pH isoeléctrico de lasproteinas del suero es 4,2-5,1 (Horr, 1985)¡por lo tanto laviscosidad del suero a pH 5,0 debe ser menor que a pH 8,0,ya que este último pH está más alejado de puntoisoeléctrico.

Todas estas conclusiones son en realidad presuncionessobre lo que ocurre, ya que 1a mayoria de los estudios sobreel comportamiento de las proteínas del suero se hanrealizado trabajando con proteinas puras en sistemas modelo.Seguramente existen relaciones más complejas entre losdiferentes componentes del suero de queso concentrado que nopueden ser dilucidadas con las sencillas experienciasrealizadas.

314

7. Usos potenciales y breve estimación _flcl costo. deproducción del suero de queso concentrado y parcialmentehidrolízado

7.1. Usos potenciales del suero de queso concentrado yparcialmente hidrolízado

E1 suero de queso concentrado y parcialmentehidrolízado posee propiedades que lo hacen apto para serincorporado a ciertos alimentos a fin de otorgarledeterminadas características. Puede ser utilizado comofuente de azúcares y, en determinados productos, como fuentede proteína. A continuación se proponen usos para el mismo:

I Panifícación: Puede ser incorporado a la masa para hacerpan reemplazando a 1a leche y a la sacarosa. La lactosahidrolízada tiene una buena fermentabilidad y propiedades depardeamiento no enzimático. Las levaduras fermentan 1aglucosa, con el consiguiente aumento en el volumen dedióxido de carbono producido, y 1a galactosa contribuye a unmejor color de la corteza.

I Helados: A1 incorporarse" el suero concentrado ehidrolízado a una formulación para helados se puedereemplazar parte de la leche y de la sacarosa. Seobtendrían ventajas comopor ejemplo una textura más suaveya que no hay cristalización de lactosa (Rexroat y Bradley,1986; Harju y Kreula, 1978).

I Dulce de leche: Puede reemplazar parte de 1a leche y el

315

azúcar. Se obtiene un mejor color (Spurgeon y col. 1974).

I Productos varios: Se puede incorporar en cualquierzformulación comoendulzante o fuente de proteina.

I Alimentación animal: Podria utilizarse ventajosamente enla alimentación de cerdos ya que al tener bajos porcentajesde lactosa éstos pueden consumir más cantidad.

Se debe tener en cuenta el aumento en el valornutricional de los productos a los que se agregue el suerode queso debido a la incorporación de proteínas de altovalor biológico.

7.2. Análisis comparativo y breve estimación del costode producción del suero de queso concentradoparcialmente hidrolizado y preservado

La hidrólisis de la lactosa y preservación del 'suerode queso concentrado por métodos combinados se propone comalternativa al secado en spray del mismopara obtener sueroen polvo. Por lo tanto es interesante hacer una brevecomparación de los costos de ambos procesos.

En base a los datos proporcionados por SancorCooperativas Unidas Ltda. el costo de producción del quesoen polvo está compuesto por los siguientes ítems<los costosde cada etapa están dados en dólares (uSs a julio de 1990)por kilogramo de suero en polvo):

1) Pasteurización del suero diluido (7 Z p/p de sólidos

totales) y evaporación en un evaporador al vacio hastallegar a un 50 Z p/p de sólidos totales

0,13 a 0,15

2) Secado del suero de queso concentrado (50 X p/p desólidos) es un secadero tipo spray

0,10 a 0,12

3) Resto de los gastos de elaboración. Este item comprendeel costo de materia prima, envase, almacenamiento,amortización, etc.

0,15 a 0,17

4) Costo total de elaboración de un kilogramo de suero dequeso en polvo

0,38 a 0,44

5) Costo de los gastos administrativos, comerciales, fletes,etc.

0,12 a 0,14

6) Costo total estimado para la elaboración de un kilogramode suero de queso en polvo

0,50 a 0,58

Para la estimación del costo de producción del suero

317

de queso concentrado y parcialmente hidrolizado se tomaronen cuenta los datos proporcionados por Sancor CooperativasUnidas Ltda. Para realizar los cálculos para el suero dequeso concentrado y parcialmente hidrolizado se consideroque 2 kilogramos de suero de queso concentrado equivalen, encontenido de sólidos, a 1 kilogramo de suero en polvo y sereemplazó el costo de secado en spray por el agregado de laenzima y aditivos. El costo de cada etapa está dado endólares (USS) por kilogramo de suero concentrado.

1) Pasteurización del suero diluido (7 %p/p de sólidos) yevaporación en un evaporador al vacio hasta llegar a un 50 Xp/p de sólidos totales

0,065 a 0,075

2) Costo de los aditivos agregados para la hidrólisis ypreservación del suero de queso concentrado (50 z p/p desólidos) (enzima, conservadores, ácido fosfórico)

0,13

3) Resto de los gastos de elaboración. Este ítem comprendelos costos de materia prima, envase, almacenamiento.amortización, etc.

0,075 a 0,088

4) Costo total de elaboración de un kilogramo de suero dequeso concentrado y parcialmente hidrolizado establemicrobiológicamente a temperatura ambiente

318

0,27 a 0,29

Debe tenerse en cuenta que sólo se comparan loscostos operativos y de materia prima, no los de capital.Los costos de los equipos de secado en spray son mayores quelos necesarios para realizar la hidrólisis. Conrespecto alenvase el suero secado en spray posee mayores exigencias queel suero hidrolizado. Pero el transporte del suerohidrolizado es más caro que el de suero en polvo(considerando el transporte de 1 kilogramo de sólidos)

Al comparar el costo del secado en spray con el dehidrólisis y preservación del suero de queso concentrado sedebe tener en cuenta que el suero de queso concentrado yparcialmente hidrolizado y preservado posee propiedadesfuncionales superiores a las del suero en polvo. El suerode queso concentrado y parcialmente hidrolizado tiene menorconcentración de lactosa y por lo tanto no presentaproblemas de textura ni produce problemas digestivos y esfacilmente bombeable.

Es conveniente aclarar que no se pretendió hacer unestudio de costos de obtención del suero de quesoconcentrado y parcialmente hidrolizado, sinó simplementetener idea de su factibilidad económica.

319

8. CUNCrgglours

Se desarrolló un método simple de obtención de suerode queso concentrado y parcialmente hidrolizado establemicrobiológicamente a temperatura ambiente durante tresmeses. Las ventajas de este proceso son su factibilidad deimplementación y la obtención de un producto decaracterísticas mejoradas respecto del suero de quesoconcentrado. Efectivamente, el suero de queso concentrado yparcialmente hidrolizado es más dulce, menosviscoso, tienemenor actividad de agua (lo que facilita su preservación) yal no poseer cristales de lactosa su textura es suave ycremosa .

En base a los resultados obtenidos se propone comométodo de preservación del suero de queso el detallado en laFigura 8.1. El suero de queso obtenido luego de aplicar elproceso descripto posee las siguientes características:pH=5,Ü, Z hidrólisis = 63-66 Z, U,2 Z p/p de

conservador, aw=0,89-U,90, SU Z p/p sólidos totales,8-10 %p/p lactosa, no posee cristales de lactosa, esamarillo, de baja viscosidad, de textura suave y establemicrobiológicamente a temperatura ambiente durante 3 meses.

A continuación se resumen los principales estudios yhallazgos realizados:

I Se estudió el efecto de diversos factores (velocidad deagitación, concentración de enzima. temperatura, pH,presencia de conservadores, presencia de inhibidores de laenzima, concentración de sólidos del suero, concentración delactosa) en la cinética de hidrólisis enzimática de lactosa.

320

Figura 8.1

Métodopropuesto para el procesamiento y preservación delsuero de queso concentrado y parcialmente hidrolízado.

° 50 X p/p sólidos totales' pH = 6,2-6,3

w 0,94-U,9534-35 Z p/p lactosa

ll' a

SUERO DE QUESO CONCENTRADO «

Alta concentración de lactosaProblemas de texturaBaja digestibilidadAlta viscosidadNo es estable microbiológica­

k mente a temperatura ambiente

* Agregado de conservador0,2 %p/p de sorbato de potasio ó0,2 %p/p de propionato de calcio ó0,1 Z p/p de sorbato de potasio + 0,1 X

‘L p/p de propionato de calcio

* Ajuste del pH a 6,0 con ácido fosfórico(85 % p/p)

* Termostatización

* Agregado de la lactasa Maxilact LX 5000(Gist Brocades nv, Holanda). Concentración:

Ü 0,1 Z p/p

321

(continuación de 1a Tabla 8.1)

* Hidrólisis de 1a lactosa en un reactor batchtermostatizado. Condiciones de hidrólisis:T = 37 °c, pH = 6,0, tiempo de hidrólisis:7 horas

- 50 z p/p sólidos totales' pH = 6,0° a = 0,89-0,9U° 8-10 Z p/p lactosa

SUERO DE QUESO CONCENTRADOPARCIALMENTE HIDROLIZADO 4

Textura suave y cremosaMayordigestibilidadMenor viscosidadMayor dulzura

SUERO DE QUESO CONCENTRADO Y PARCIALMENTE HIDROLIZADO

* Ajuste del pH a 5,0 conácido fosfórico (85 %p/p)

SUERO DE QUESO CONCENTRADO PARCIALMENTE HIDROLIZADO ESTABLE

MICROBIOLOGICAMENTE A TEMPERATURA AMBLENTE

DURANTE TRES MESES

La importancia de este estudio reside en que en bibliografiano se encuentran trabajos realizados en medios tanconcentrados. Los resultados obtenidos permiten cuantificarel fenómenode la hidrólisis en función de los parámetros deoperación. Esto es particularmente útil a fin de realizarpredicciones para el diseño de un proceso. Un resultadoparticularmente interesante es que en este sistema (suero dequeso concentrado) la temperatura óptima de trabajo de laenzima, para ciertas partidas de suero, esta por encima dela normalmente utilizada en leche o suero de queso diluido.Esto permitiría trabajar a mayores temperaturas con elconsiguiente ahorro de tiempo. Sin embargo es necesarioprofundizar más sobre este tema.

I Se modeló el fenómenode hidrólisis enzimática de lactosaa través de ecuaciones de bibliografia y de una ecuación quecontempla las condiciones en que ocurre la hidrólisis delactosa en el suero de queso concentrado. Los resultadosexperimentales se pueden representar por medio de un modelotipo Hichaelis Menten con inhibición competitiva porgalactosa y por medio de un modelo tipo Michaelis Henten coninhibición competitiva por galactosa y no competitiva porglucosa.

I Se estudió el efecto del grado de hidrólisis en la aw delproducto resultante. Debidoa la hidrólisis de lactosa la awdel suero de queso concentrado disminuye de 0,95-0.94 HO,90-0,89 y es posible correlacionar matemáticamente elporcentaje de hidrólisis alcanzado con la aw ­

I Se determinó el efecto del agregado de solutos en laresistencia térmica de la lactasa en sistemas modelo. Se

323

encontró que el agregado de sacarosa ó glicerol estabilizana la enzima respecto de un control sin soluto. Losresultados permitieron aclarar el efecto observado de lamayor resistencia térmica de la enzima en suero de quesoconcentrado respecto de suero de queso diluido.

I Se determinó el efecto de diferentes factores: aw, pH yagentes antimicrobianos, en la inhibición del crecimiento debacterias hongos y levaduras capaces de crecer en suero dequeso concentrado. Los resultados permitieron plantear lascombinaciones de factores más efectivas para lograr lasupresión del crecimiento de microorganismos patógenos odeteriorativos durante el almacenamiento de suero de quesoconcentrado y parcialmente hidrolizado a 25-37°C.

I Se caracterizó el comportamiento reológico de suero dequeso concentrado y suero de queso concentrado yparcialmente hidrolizado. La hidrólisis produce un descensonotable de la viscosidad y tixotropía del suero de quesoconcentrado. Es también remarcable el efecto de latemperatura sobre la viscosidad del suero de quesoconcentrado, ya que la viscosidad es menor a menortemperatura, a la inversa que para la mayoría de losalimentos.

Los resultados expuestos en este trabajo son deutilidad a fin de mejorar y optimizar el aprovechamiento delsuero de queso mediante un método simple que puede serutilizado por cualquier fabricante de quesos, ya que norequiere de equipamiento costoso.

h-¿ecr/ca ber rá}

324

Método de Harquardt

El métodoutilizado para la regresión no lineal deecuaciones con dos parámetros a determinar fue desarrolladopor Marquardt (1963) e implementado por IBM SHARE LIBRARY.N° 309401, (1966). El mismo permite obtener una estimación

de los parámetros Bi (i=1,2.....p) de una regresión nulineal (ecuación A1) a partir de la minimización de la sumnde los cuadrados de los residuos (SC).

y = f(x1, xz,.....xq ; fi¡,fiz,.....fip) + error (Al)

sc = [yi - fi(x./3)]2 (A2)"MZi. 1

siendo fi(x,fi) la función usada para predecir los valores dey (fi(x,fi)=y).

El programa realiza una secuencia iterativa decálculos que finaliza cuando la SC es menor que una cotapreviamente establecida. Los usuarios deben proveer losdatos, el modelo matemático y los valores iniciales de losparámetros. El programa tabula los datos experimentales(x.y), los valores predichos de y (v), las diferencias (y-v)y calcula los siguientes valores:

....., BP) Vector de parámetros estimados (A3)

325

DEZ 100 [———Ég——] Desviación standard poréentualN - P del ajuste (A4)

_1 011 . . . . ..01p 1PTP = 3 Z = Matriz de varianza­z091 . . . . ..CPP DE

covaríanza (A5)

rtt . . . . ..r1pHR = Z. Z Matriz de correlación entre los

rpi . . . . ..rpp .parametros (A8)

SE (692 = DE: ch Varianza del parámetro (A7)

En base a la ecuación (A7) es posible calcular el intervalode confianza individual para cada parámetro de 1a siguientemanera:

[ Bj ; t SE (BJ) ] (A8)[N-1,1-0/2)

donde a es el parámetro estadístico que indica el nivel deconfianza.

326

10. APENDICE 2

Métodode regresión no lineal para el modelo de tres parámetrnn

El métodoutilizado para la regresión no lineal delas ecuaciones a tres parámetros forma parte de las rutinasde cálculo computacional del Biomedical Computer ProgramsP-Series (1979). Estas fueron diseñadas por L. Engelman,J.W. Frane y R.I. Jennrich y editadas por W.J. Dixon y H.B.Brown, University of California Press (Los Angeles). Dentrode estas rutinas se utilizó el programa PAR(Derivative-FreeNonlinear Regression). que estima los parámetros de unaecuación no lineal sin necesitar que se le especifiquen lasderivadas de la función.

El PARestima los parámetros de la función no linealpor cuadrados minimos utilizando un algoritmo depseudo-Gauss-Newton. El programa requiere los valoresiniciales de los parámetros, y se puede acotar el valor delos mismos dentro de un rango especificado. El programacalcula los siguientes items:

I El valor de los parámetros.

I La suma de los cuadrados de los residuos.

I La matriz asintótíca de correlación de los parámetros.

I El error cuadrático medio estimado.

I La desviación standard de cada parámetro.

327

1 TABLAS DE DATOS PARA LA HIDROLISIS DE LAC'I‘USA EN sumo

DE QUESQ

A continuación se detallan los datos obtenidos paralas experiencias de hidrólisis de lactosa eu suero de queso.Los tiempos de hidrólisis se expresan en minutos. Paratodos los casos, salvo que se indique lo contrario, laconcentración de sólidos del suero de queso concentradoutilizado fue 49,5-52,0 Z p/p.

a) lnfldencia de la velocidad de agitación.Temperatura = 37 oC, pH = 6,0, concentración de enzima = 0,174 p/p.

7 rps 2U rpstiempo Z hidrólisis tiempo Z hidrólisis

0 0 0 0

16,92 10,6 17,87 13,231,54 12,7 32,10 16,246,20 19,8 46,82 18,361,44 22,8 64,93 26,892,10 27,3 91,43 29,7

121,35 35,3 121,46 33,9184,13 42,3 181,03 42,2245,20 52,7 242,18 51,5301,10 55,1 345,20 55,6362,31 57,0 401,53 59,3421,50 62,5

328

b) Influencia de la concentración de enzimaTemperatura = 37°C, pH

0,05 Z p/p lactasatiempo

0

16,3330,1547,5659,0392,21

119,89,181,01242,52300,99360,38421,03

Z hidrólisis0

5,212,617,320,723,126,834,735,943,344,445,7

0,2 2 p/p lactasatiempo

0

16,2045,6177,73

121,12171,12240,91

X hidrólisis0

12,927,039,452,165,176,0

= 6,0.

0,1tiempo

U

16,5732,3146,1661,5291,40

121,48181,61241,84301,30362,40421,50

0,3tiempo

Ü

11,3020,6430,6941,1753,2361,1580,58

101,48122,66156,06

Z p/p lactasaZ hidrólisis

0

9,215,520,022,228,435,142,449,454,659,063,7

Z p/p lactasaZ'hidrólísis

0

16,624,732,143,450,960,468,577,182,187,0

0,4tiempo

0

10,9820,7332,3440,5750,8882,4782,78

102,63124,18,

z p/p lactasaZ hidrólisis

0

23,434,747,255,080,769,380,583,168,0

329

0,5 Z p/p lactasatiempo

0

13,9920,9731,3944,5353,0585,0381,88

101,97

X hidrólisis0

31,933,340,455,083,572,383,785,3

c) Influencia de la temperatura y del contenido de sólidospH = 6, 0, concentración de enzima 0,1 Z p/p.

i) Suero de queso concentrado de 49,5-52,0 X p/p de sólidos.

tiempo0

16,7531,5046,8261,6191,88

121,73183,40243,11361.15381.44421,83

T = 25°C

Z hidrólisis0

5,09,3

11,815,720,827,135,341,944,048,852,4

tiempo0

16.5732,3146,1861,5291,40

121,48181,81241,64301,30362,40421,50

T = 37°C

Z hidrólisis0

9,215,620,022,328,435,142,449,454,659,063.7

tiempo0

16,9731,8847,6462,1391,24

121,75181,75240,89301,68361,88421,68

tiempo0

19,0131,6546,3361,5192,66

123,39181,73241,33301,27361,80424,68

T

T

43°Cz hidrólisis

0

15,417,825,828,036,643,053,758,966,269,072,8

50°CZ hidrólisis

0

13,914,217,725,629,231,129,331,431,931,834,6

330

tiempoÜ

16,4331,0546,7461,6191,61

122,13181,28243,11302,32362,28421,83

tiempo0

17,0830,9046,2662,0291,37

121,38181,26242,13301,46361,49421,17

Ill

lll

47°CZ hidrólisis

0

11,722,526,432,639,547,056,062,787,872,075,1

53°CZ hidrólisis

0

7,711,123,221,022,623,824,622,623,824,823,9

T = 58°C

tiempo0

15,3431,5646,7862,1891,02

121,94180,90241.73302,12361,29421,88

Z hidrólisis0

HOOOHQHOOCH

HC)cncoa:

a x1

331

ii) Suero de queso concentrado de 48,0; 51,9 y 57,0 Z p/p desólidos

1) Temperatura-= 3748,0 z b/p sólidos

tiempo z hidrólisis0 0

16,21 9,331,95 17,562,27 19,7

120,61 37,2181,68 46,7242,10 54,1301,16 61,8360,90 64,5422,33 68,3

51,9tiempo

0

16,5732,3146,1861,5291,40

121,48181,61241,84301,30362,40

Z p/p de sólidosZ hidrólisis

0

9,215,820,022,328,435,142,449,454,659,0

57,0 Z p/p sólidostiempo %hidrólisis

0 0

18,67 4,332,17 9,246,62 9,961,60 9,793,58 14,8

122,20 16,9182,38 ’ 23,8241,48 29,7305,43 32,0361,63 37,5421,32 40,6

2) Temperatura : 47°C

48,0 Z p/p sólidostiempo

0

32,0462,50

121,95181,03241,84300,75383,67420,10

2 hidrólisis0

25,133,150,661,669,377,082,983,9

332

421,50

51,9 Z p/p sólidostiempo

0

16,4331,0546,7461,6191,61

122,13181,28243,11302,32362,26

Z hidrólisis0

11,722,528,432,639,547,056,062,767,872,0

421,83 75,1

57,0 Z p/p sólidos 57,0 X p/p sólidos(0,3 Z p/p EDTA)

tiempo Z hidrólisis tiempo Z hidrólisis0 U 0 0

18,48 8,4 18,40 8,231,45 8,9 35,83 13,547,18 12,1 81.22 18,082,00 15,3 92,43 24,0

91,48, 18,8 120,79 30,1121.25 21,5 181,99 37,2183,23 28,5 241,38 48,0243,15 29,4 301,55 49,9302,37 31,8 382,18 58,4382,50 32.5 421,43 80,7424,15 34,8

iii) Suero de queso diluido, 7 Z p/p sólidospH = 8,0, 0,02 Z p/p enzima

T = 37°C T = 43°C

tiempo Z hidrólisis tiempo Z hidrólisis0 0 0 0

9,23 8,9 10,98 7,111,08 15,8 31,55 16,358,29 27,5 81,48 15,8

122,18 39,2 123,88 18,4182,58 45,5 241,77 18,5238,74 50,5 419,91 15,9380,52 57,2419.89 81,3

334

T-= 47°Ctiempo Z hidrólisis

0 0

11,75 331,25 360,14 4

123,48 3,240,55 4421,46 4

d) Influencia del pH.Temperatura = 37°C, concentración de enzima = 0,1 X p/p.

pH = 5,0 pH = 5,5tiempo Z hidrólisis tiempo Z hidrólisis

0 0 Ü 0

30,83 5,5 18,67 6,861,08 5,8 30,63 10,1

121,25 5,2 45,50 12,8241,78 4,3 62,22 10,5301,52 4,7 92,15 10,2371,96 5,7 122,05 11,5422,25 5,5 180,97 12,5

240,71 11,7304,45 11,5360,84 11,4423,07 11,2

335

PH = 8,0 pH = 8,5

tiempo 2 hidrólisis tiempo 2 hidrólisis0 0 0 0

16,57 9,8 16,45 18,032,31 15,5 31,30 29,246,19 20,4 46,44 30,461,52 22,3 61,61 30,891,40 28,4 91,88 35,9

121,48 34,6 121,30 42,3181,61 42,4 180,77 50,6241,58 49,1 244,86 54,5301,22' 54,6 302,53 55,4362,34 58,9 361,47 51,6421,27 63,4 421,34 53,9

pH = 7,0tiempo Z hidrólisis

0 0

17,48 13,330,98 16,246,41 16,661,48 16,590,05 21,9

120,32 25,3182,89 29,3242,03 31.1301,60 31,9361,56 33,5422,51 33,9

336

e) Presencia de glucosa o galactosa.Temperatura = 37°C, pH = 8,0, concentración de enzima = 0,1p/p.

5 Z p/p glucosa 5 Z p/p galactosatiempo Z hidrólisis tiempo Z hidrólisis

0 0 0 0

8,35 7,8 18,87 2,510,97 8,8 30,92 3,915,85 9,3 48,87 3,730,83 12,6 81,98 8,448,22, 15,8 91,20 7,080,84 19,8 122,17 9,1

121,13 25,7 181,87 8,9181,15 29,8 245,13 13,5240,53 38,5 303,43 21,8381,08 39,5 381,27 23,7422,47 48,8 422,47 28,1

f) Influencia de los conservadores agregados.Temperatura = 37°C, pH = 8,0, concentración de enzima = 0,17o p/p.

0,2 Z p/p de sorbato de 0,2 %p/p de propionato depotasio calcio

tiempo Z hidrólisis tiempo %hidrólisis0 0 0 0

18,87 13,8 18,83 13,330,08 18,1 30,28 17,948,50 20,8 45,80 19,881,23. 24,3 80,87 24,591,88 28,6 91,53 30,8

337

120,96 35,0 121,27 34,2181,11 43,3 181,43 42,3242,18 49,7 241,75 50,1302,22 54,8 302,08 55,3361,88 56,6 361,43 59,1433,04 62,3 421,71 63,1

0,1 Z p/p de sorbato de potasio +0,1 Z p/p de propionato de calciotiempo Z hidrólisis

0 0

15,76 ' 10,631,22 17.446.56 21,661,25 23,691,53 26,5

120,65 34,9161,42 42,1246,00 50,1300,06 53,7360.76 56,9421.35 64,0

g) Variación de la concentración de lactosa soluble enfunción de avance de la reacción de hidrólisis.Temperatura = 37°C, pH = 6,0, concentración de enzima = 0,174 p/p

Suero concentrado completo Sobrenadante (sin cristales)tiempo Z lactosa tiempo Z lactosa

Ü 35,0 0 ­30,00 31,6 30,00 16,1

338

59,90 27,2 59,90120,90 24,2 120,90179,27 20,5 179,27241,38 18,9 241,38300,80 15,1 300,80361,20 12,2 361,20423,85 9,4 423,85481,22 7,2 481,22

h) Influencia del contenido de cristalesTemperatura = 37°C, pH = 6,0, concentraciónZ p/p.

13,4 Z p/p lactosa 17,1tiempo 2 hidrólisis tiempo

0 0 0

6,22 4,3 7,5016,56 21,7 17,8230,67 26,4 32,1747,73 36,9 52,2360,00 43,4 62,8390,37 54,0 92,93

121,77 62,3 122,93

24,1 Z p/p lactosa 29,0tiempo X hidrólisis tiempo

0 0 0

6,50 7,4 7,9316,00 8,2 17,7330,65 14,8 31,7447,75 19,5 45,9061,00 26,1 62,22

16,815,714,211,211,610,510,27,9

de enzima = 0,1

Z p/p lactosa%hidrólisis

0

8,311,118,927,736,048,655,7

X p/p lactosaZ hidrólisis

0

2,99,3

16,418,323,2

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