M.T.E. BIOLOGÍA CELULARProliferación celular en meristemos radiculares de

Allium sativumC. Gallardo, D. López, J. Almagro, R. Gómez y N. Perea

1

Introducción

De acuerdo con la teoría celular establecida por el biólogo alemán Rudolf Virchoff en el

siglo XIX, “las células sólo provienen de células”. Las células se reproducen mediante

un proceso conocido como división celular en el cual su material genético –el DNA– se

reparte entre dos nuevas células hijas.

En los organismos unicelulares, por este mecanismo aumenta el número de

individuos en la población. En las plantas y animales multicelulares, la división celular

es el procedimiento por el cual el organismo crece, partiendo de una sola célula, y los

tejidos dañados son remplazados y reparados. Una célula individual crece asimilando

sustancias de su ambiente y transformándolas en nuevas moléculas estructurales y

funcionales. Cuando una célula alcanza cierto tamaño crítico y cierto estado

metabólico, se divide. Las dos células hijas comienzan entonces a crecer.

Las células eucarióticas pasan a través de una secuencia regular de

crecimiento y división llamada ciclo celular. El ciclo celular se divide en tres fases

principales: interfase, mitosis, y citocinesis. Para completarse, puede requerir desde

pocas horas hasta varios días, dependiendo del tipo de célula y de factores externos

como la temperatura o los nutrimentos disponibles. Cuando la célula está en los

estadios interfásicos del ciclo, los cromosomas son visibles dentro del núcleo sólo

como delgadas hebras de material filamentoso llamado cromatina.

Antes de que una célula eucariótica pueda comenzar la mitosis y dividirse

efectivamente, debe duplicar su DNA, sintetizar histonas y otras proteínas asociadas

con el DNA de los cromosomas, producir una reserva adecuada de organelas para las

dos células hijas y ensamblar las estructuras necesarias para que se lleven a cabo la

mitosis y la citocinesis. Estos procesos preparatorios ocurren durante la interfase, en la

cual, a su vez, se distinguen tres etapas: las fases Gl, S y G2 (Figura 1).

La fase G1 es la etapa más larga y más variable, y en ella se produce

crecimiento celular hasta alcanzar el tamaño óptimo, sintetizándose proteínas y ARN.

La dotación genética de esta fase es de 2n y 2c y suele durar entre 6 y 12 horas. La

fase S (síntesis), comienza cuando la célula adquiere el tamaño suficiente y el ATP

necesario. Dado que el ADN lleva la información genética de la célula, antes de la

mitosis deben generarse dos moléculas idénticas para ser repartidas entre las dos

células hijas. Con esta duplicación el núcleo contiene el doble de proteínas nucleares y

de ADN que al principio de la fase (2n y 4c). La duración aproximada de la fase es de 6

a 8 horas. La última etapa de la interfase es la G2, más breve que la G1, en la cual se

acumulan los productos necesarios para la siguiente etapa, la fase M, en la que se

producirá la división celular. Durante esta etapa también tiene lugar síntesis de DNA

asociada a la reparación de posibles imperfecciones en el material genético.

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Se considera terminada cuando la cromatina empieza a condensarse,

lo que marca el inicio de la mitosis. La carga genética en esta fase es de 2n y

4c, y la duración de la misma va, aproximadamente, de 3 a 4 h.

La mitosis (o fase M) cumple la función de distribuir los cromosomas

duplicados de modo tal que cada nueva célula obtenga una dotación completa de

cromosomas. En dicho proceso es posible identificar cuatro etapas: profase, metafase,

anafase y telofase. La profase es el primer estadio de la mitosis. La cromatina se

condensa (recordar que el ADN de la cromatina se replica en la interfase), por lo que

en este punto existen dos cromátidas unidas. La membrana nuclear se disuelve y se

forma el huso mitótico. Los centrómeros (o constricciones primarias) se vuelven

claramente visibles, debido a que se le han asociados placas proteicas a ambos lados:

el cinetocoro. En el citoplasma el retículo endoplasmático y el complejo de Golgi se

fragmentan en vesículas, se desorganiza el citoesqueleto por lo que la célula pierde su

forma original y se hace esférica. La metafase sigue a la profase. Los cromosomas

(que a este punto consisten en dos cromátidas mantenidas juntas por el centrómero)

alcanzan su máxima condensación y migran al ecuador de la célula donde las fibras del

huso se "pegan" a las fibras del cinetocoro. La anafase comienza con la separación de

los centrómeros y el arrastre de las cromátidas (los llamamos cromosomas luego de la

separación de los centrómeros) a los polos opuestos. En la telofase los cromosomas

llegan a los polos de sus respectivos husos, la membrana nuclear se reconstituye, los

cromosomas se desenrollan y pasan a formar la cromatina y el nucleolo, que

desapareció en la profase se vuelve a constituir. Donde antes había una célula ahora

existen dos pequeñas con exactamente la misma información genética y número

cromosómico.

Figura 1. Ciclo celular de una célula eucariota. En él es posible identificar diferentes etapas, destacando la

interfase, la cual ocupa la mayor parte del ciclo.

3

La citocinesis es el proceso de separación de las células formadas. En tanto

la mitosis es la división del núcleo en la citocinesis ocurre la división y la relocalización

de los plástidos, Golgi y citoplasma en cada nueva célula, además de restablecerse el

citoesqueleto. En las células vegetales, una serie de vesículas divide al citoplasma en

la línea media. Estas vesículas, son producidas por los complejos de Golgi y contienen

polisacáridos. Las vesículas migran hacia el plano ecuatorial, transportadas por los

microtúbulos remanentes del huso mitótico; finalmente se fusionan y forman una

estructura plana limitada por membrana, la placa celular. A medida que se agregan

más vesículas, los bordes de la placa en crecimiento se fusionan con la membrana de

la célula y se forma una capa de polisacáridos entre las dos células hijas,

completándose su separación. Esta capa se impregna con pectinas y forma finalmente

la lamina media. Cada nueva célula construye, así, su propia pared celular,

depositando celulosa y otros polisacáridos sobre la superficie externa de su membrana

celular.

Cuando se completa la división celular, se han producido dos células hijas,

más pequeñas que la célula materna, pero indistinguibles de ésta en cualquier otro

aspecto (Figura 2).

Metodología experimental general

Los procedimientos experimentales desarrollaron en torno al estudio del ciclo celular de

meristemos radiculares de Allium sativum, una hortaliza cuyo bulbo se emplea

corrientemente en la cocina mediterránea. En todos los experimentos el procedimiento

experimental se inició con la preparación de los ajos, los cuales se pelaron, se les

insertaron fragmentos de dientes transversalmente al eje principal, los cuales actuarían

como soportes, y se introdujeron en recipientes de vidrio llenos de agua mineral,

procurando que el agua permanezca en contacto con los bulbos.

Figura 2. Etapas de la mitosis. (1) Profase: la cromatina se esta condensando y el nucleo está esmpezando a

desaparecer. (2) Prometafase: los cromosomas comienzan a ser visibles, cada uno de los cuales está constituido

por dos cromátidas hermanas. En un estado más avananzado de esta etapa se desorganiza la membrana nuclear.

(3) Metafase: el uso mitótico es claramente visible y los cromosomas, asociados a los microtúbulos, se encuetran

dispuestos sobre la placa metafásica. (4) Anafase: las cromátidas de cada cromosoma se han separado y migran

hacia los polos opuestos de la célula. (5) Telofase: los núcleos hijos comenzan a formarse, mientras se inicia la

formación del fragmoplasto.

4

Tras ello los bulbos fueron introducidos en la cámara de cultivo (Figura 3) ,

en la que los eran mantenidos en condiciones constantes de 25ºC de temperatura,

oscuridad y burbujeo constante (o ausencia del mismo, según dicte el diseño

experimental). El objetivo de mantener las condiciones constantes durante la

incubación es conseguir que el material biológico alcance un equilibrio dinámico

proliferativo, el cua le caracteriza porque la duración de todas las fases del ciclo celular

tienen una duración constante.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación establecido para cada caso,

se procedió a la preparación de los meristemos radiculares para su observación al

microscopio (Figura 4) , para lo cual se cortaban las raíces con mejor aspecto y se

introducían en solución de fijación Carnoy (constituida por una mezcla de alcohol y

ácido acético en proporciones 3:1) para de este modo fijar las raíces. Una vez fijadas

las raíces podrían ser teñidas, para lo cual se empleó la orceína acética, un colorante

que se asocia a las histonas, permitiendo poner de manifiesto la estructura de la

cromatina.

Figura 3. Cámara de cultivo de los bulbos. En la imagen puede verse detalladamente el sistema empleado para

llevara a cabo las incubaciones de los bulbos de A. sativum. En la imagen de la derecha aparecen bulbos con tres

días de incubación, en los cuales es posible apreciar claramente las raíces.

5

Para llevar a cabo la tinción se era necesario verter en cada caso 500 µL de

orceína en un tubo Eppendorf, en el cual se introducían entre 4 y 5 raíces, dejándolas

incubar durante 8 minutos a 60ºC al baño maría. Tras ello, las raíces debían dejarse

incubar al menos durante 1 hora a temperatura ambiente. Hay que apuntar que la

tinción con orceína se llevó a cabo en todos los casos excepto en el caso del

experimento de impregnación argéntica nucleolar. Tras la incubación de una hora a

temperatura ambiente, podía pasarse al montaje de la muestra, para lo cual las raíces

eran extraídas, colocadas de forma individual sobre un portaobjetos y mediante el

empleo de una lanceta se les seccionaba aproximadamente 3 milímetros de tejido del

extremo distal, que se corresponde con las células meristemáticas del ápice radicular.

Una vez realizado el corte se desechaba el resto de la raíz, se añadía una gota de

orceína sobre la muestra y se cubría con un cubreobjetos. Finalmente para la extensión

de la muestra, empleando la punta de un lápiz de grafito, se presionaba la muestra

mediante golpes suaves hasta conseguir que la muestra se extendiera sobre el

cubreobjetos. Tras ello se procedió a la eliminación de los restos de la orceína acética

con papel de filtro.

Figura 4. Detalles de la preparación de las muestras. En las fotografías se describe el proceso de montaje de las

muestras, las cuales, una vez fijadas eran extraídas de la solución de Carnoy (izq. Sup.), se depositaban sobre un

porta y se le seccionaba el extremo (Dcha. Sup.), se les añadía una gota de orceína (Izq. Inf.) y se procedía al

proceso de aplastamiento (Dcha. Inf.).

6

Una vez montadas las preparaciones, estas eran almacenadas en una placa

de petri que contenía un fragmento de papel de filtro empapado en ácido acético. Hay

que apuntar que en todos los experimentos a la hora de llevar a cabo el conteo no hay

que tener en cuenta a las células diferenciadas o en diferenciación (G0). Podemos

considerar que una célula está en ciclo cuando visto su núcleo no cabe otro igual que él

en el espacio restante. Así mismo, para realizar el conteo en primer lugar

seleccionaremos el objetivo de x10 para buscar campos buenos.

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Primer experimento:

Estimación de los parámetros del ciclo proliferativo

Introducción

El índice mitótico de una población celular, definido por Champy como la proporción de

células de una población que se encuentra en cualquier etapa de la mitosis, ha sido

considerado como un criterio muy importante para la caracterización del crecimiento y

multiplicación de tejidos. A partir del índice mitótico es posible inferir el índice

interfásico, que es la proporción de células que se encuentran en dicha etapa del ciclo

celular. Así mismo, dadas las diferencias morfologías que caracterizan a las distintas

etapas de la mitosis en lo referente al grado de empaquetamiento y la distribución de

los cromosomas, mediante la observación a microscopía es también posible estimar los

índices profásico, metafásico, anafásico y telofásico (Figura 5).

Figura 5. Morfología células en las distintas etapas del ciclo celular. (A) Célula en interfase, en la cual es posible

identificar claramente en núcleo, así como una zona mas clara en su interior, lo cual corresponde al nucleolo. (B)

Profase, en la cual se aprecia que el núcleo se ha desorganizado y la cromatina comienza a condensarse. (C)

Célula en metafase, en la cual se identifican nítidamente los cromosomas alineados en la placa metafásica.

(D) Anafase, en la cual se aprecia el efecto sobre los cromosomas de la despolimerización de los microtúbulos

cinetocóricos, lo que provoca la migración de los mismos. (E) Célula en telofase, en la cual los cromosomas,

constituidos ya por una única cromátida, han alcanzado sus respectivos extremos. (F) Célula diferenciada.

A B C

D E F

8

Procedimientos experimentales

Para la estimación de los índices, las cabezas de ajo fueron incubadas en agua mineral

durante 72 horas en el incubador, a una temperatura de 25ºC, oscuridad y burbujeo

constante, tras lo cual las muestras fueron preparadas de acuerdo con la metodología

descrita en el apartado introductorio.

Cada uno de los integrantes del grupo contó dos preparados, mil células por

preparado, diferenciando en cada caso la etapa del ciclo en que se encontraban las

células (Figura 5). A partir de ello fue posible estimar los índices mitótico, interfásico,

profásico, metafásico anafásico y telofásico mediante la aplicación de las siguientes

fórmula:

Índice de fase = (Células en fase /células totales) ·100

Por otor lado, para la estimación de los índices de G1, S y G2 se llevo

haciendo uso de la morfometría, a través del análisis de imágenes mediante una

herramienta informática denominada Visilog. Para ello se contó con la colaboración del

Servicio Central de Informática de la Universidad de Málaga (Figura 6).

Figura 6. Captura de pantalla del software Visilog.

9

Para llevar a cabo el análisis de

imagen, se emplearon algunos de los

preparados empleados para la estimación

de los índices en el laboratorio, de los

cuales se tomaron una serie de imágenes

mediante el empleo de un microscopio

con una cámara acoplada. Las imágenes

fueron analizadas mediante el software

Visilog, intentando seleccionar únicamente

aquellas células que se encontraban en

interfase, lo cual permitió estimar diversas

variables, como el área celular.

De este modo tras el análisis 2000 células por parte de nuestro grupo de

prácticas, obtuvimos una colección de valores, los cuales fueron agrupados en

intervalos de 10 µm y representados de menor a mayor, lo que permitió la estimación

las proporciones de G1, S y G2, partiendo de la idea de que el tamaño de las células

en fase G1 (2C) debe ser aproximadamente el doble que el de las células en G2 (4C)

(Figura 7).

Resultados y discusión

Los resultados obtenidos por el grupo A a partir del contaje de las células en las

distintas etapas del ciclo aparecen recogidos en la tabla 1. A partir de los valores

medios de los distintos índices obtenidos es posible afirmar que los resultados

obtenidos se ajustaron bastante a lo esperado (Figura 8), dado que, por ejemplo, en el

caso del índice mitótico, el valor medio estimado por los miembros del grupo fue del

13%, siendo el valor esperado entorno al 10%. En el caso de los índices

correspondientes a las distintas etapas de la mitosis, los valores obtenidos también

mostraron un patrón similar a lo esperado de acuerdo con los estudios previos,

obteniéndose valores de 7,2% para la profase (el valor esperado era entorno al 5%), un

1,4% para la metafase (el valor esperado era de un 1%) un 1,5% para la anafase (en al

cual el valor esperado era de un 2%), y un valor de índice telofásico medio de 2,9%

(siendo el valor esperado de un 3%).

Es por ello por lo que es posible considerar que la aproximación de los

índices de fases mediante conteo celular es bastante adecuada, dado que los valores

obtenidos fueron bastante aceptables, a pesar de que los integrantes del grupo de

prácticas carecían experiencia.

Figura 7. Cantidad de ADN a lo largo del ciclo

celular de una célula eucariota.

10

En el caso de los valores obtenidos por el grupo A a partir del análisis de

imagen, los valores obtenidos agrupados en intervalos de 10 aparecen en la figura 8.

Hay que apuntar que los valores extremos, resultado de estimaciones erróneas, fueron

eliminados, con lo que el valor total de datos que fue considerado finalmente fue de

2003. A partir del gráfico fue posible inferir que los tamaño de las células cuya carga de

ADN es 2C oscilaban entre 80 y 120, mientras que los tamaños de las células carga es

4C oscilaban entre 190 y 310. Así pues, la proporción de células cuya carga era

2C y por tanto se encuentran en fase G1 fue 251/2003 (12,5%), la proporción

de células cuya carga de ADN es 4C, es decir, que es encuentran en la fase G2 es

678/2003 (33,85 %), y finalmente la proporción de células que se encuentran en fase S

(el resto) fue 1074/2003 (53,65 %). Los valores obtenidos al recalcular los índices,

considerando que el índice interfásico medio obtenido fue de 86,7 %, son 10,9% el

índice de G1, 46,5% el índice de S, y 23,9 el índice de G2.

La principal dificultad que plantea esta estrategia es que no se tienen valores

de referencia de tamaños correspondientes a células 2c y 4c, dado que, aunque en

ocasiones se ha intentado emplear las células diferenciadas (en estado G0 y por tanto

con dotación 2c) como referente, esta aproximación se reveló como poco adecuada,

dado que es muy dependiente del grado de condensación del DNA, de forma que en

aquellas células que se expresan mas genes el volumen nuclear tiende a ser mayor.

Tabla 1. Valores de índices interfásico, mitótico, profásico, metafásico, anafásico y telofásico obtenidos por los

miembros el grupo A.

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Es por esta razón por la que los valores obtenidos tanto para la fase G1

como para la fase G2 se alejaron bastante de lo esperado (Figura 8), dado que en una

población celular sincrónica a 25 ºC los índices para las distintas etapas de la interfase

deberían rondar en torno 26,1% para G1, 43,35 para S y 17,34 para G2. Esto es debido

en gran parte a que la asignación de los límites entre las fases G1, S y G2 se llevo a

cabo de acuerdo con el criterio inexperto de los miembros del grupo.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

G1 S G2

Observado

Esperado

Figura 8. Distribución de los tamaños celulares agrupados en intervalos de 10 µm2. Los datos fueron obtenidos

mediante el análisis morfométrico realizado con el software Visilog.

Área celular (µm2)

Frecuencia absoluta

Figura 9. Comparación entre los valores obtenidos por el grupo 1 y los valores esperados para los

índices de G1, S y G2.

Índice de fase

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En la figura 10 aparecen representadas las frecuencias de las superficies

celulares correspondientes a los tres grupos. Como es posible observar, incluso en

este caso, en el que las estimaciones fueron llevadas mediante una aplicación

informática, aparecen desviaciones en las frecuencias, lo que refleja que el empleo de

la morfometría para la estimación de los índices de G1, S y G2 es muy dependiente del

criterio del observador, por lo que sería conveniente recurrir a otras estrategias como el

la tinción de Fulgen para el estudio de los índices interfásicos.

Finalmente en la figura 11 aparecen representado en diagramas de sectores

los resultados obtenidos para los índices de fase de las distintas etapas del ciclo celular

de los tres grupos. En ellos es posible observar que mientras que en el caso de los

índices profásico, metafásico, anafásico y telofásico los valores obtenidos en todos los

casos son bastante similares, los índices de G1, S y G2 muestran grandes

divergencias, lo cual vuelve a poner de manifiesto que el empleo de la morfometría

requiere para su aplicación de personal con experiencia, ya que de lo contrario los

resultados que rinde son de escasa fiabilidad.

Figura 10. Representación de la distribución de las superficies celulares llevada a cabo mediante el uso de la

herramienta informática Visilog.

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Figura 11. Distribución de los índices de fase correspondientes a las distintas etapas del ciclo celular estimados por

cada uno de los grupos de prácticas.

Grupo A Grupo B

Grupo C

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Segundo experimento:

Estimación del flujo celular y duración de las fases

Introducción

El flujo celular es el porcentaje de células que pasan por un determinado punto del ciclo

celular por unidad de tiempo, lo cual es posible estimarlo mediante el uso de

poblaciones celulares marcadas, cuantificando el tiempo necesario para que las células

completen una vuelta completa del ciclo. Para llevar a cabo el marcaje en el presente

estudio se emplearon dos sustancias diferentes, la cafeína y la colchicina.

La colchicina es un alcaloide extraído de Colchicum autumnale, el cual

actúa como antimitótico inhibiendo la polimerización de moléculas de tubulina,

impidiendo la formación de los microtúbulos, con lo que no se forma el huso mitótico.

Ello evita la separación de las cromátidas hermanas y su migración a los polos de la

célula, provocando que los cromosomas queden dispersos por la célula, dando lugar a

tetraploides. Se tata de un marcador que genera poblaciones celulares por inducción ya

que actúa bloqueando el paso de las células a la siguiente fase.

Figura 12. Fotografía de Colchicum autumnale.

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La cafeína es un alcaloide del grupo de las xantinas, sólido cristalino, blanco y

de sabor amargo, presente en algunas semillas vegetales. La administración de cafeína

a tejidos vegetales inhibe la formación del fragmoplasto o tabique de separación

celular impidiendo la formación de la nueva pared celular durante las divisiones

citoplásmicas en la telofase, no dejando que la citocinesis se lleve a cabo y por lo tanto

y los dos núcleos permanecen separados pero dentro del mismo citoplasma, dando

como resultado células binucleadas. La diana de actuación de la cafeína es de muy

corta duración (aproximadamente el 1% del ciclo total), por lo que se trata de un

marcador muy fino. Así mismo, dado que esta sustancia no actúa bloqueando las

células en una etapa específica del ciclo, se considera como un generador de

poblaciones sincrónicas por selección, dado que las células afectadas en telofase

pasarán a interfase como binucleadas.

Procedimientos experimentales

El experimento se inició con la incubación de los bulbos en la cámara de cultivo durante

tres días a 25ºC, oscuridad y burbujeo continuo. Una vez las raíces se encontraban en

el estado adecuado y como paso previo al inicio de los tratamientos, se procedió a la

preparación de las soluciones de colchicina 0,05% y la cafeína 5 Mm (300 mL de cada

una de ellas). En el caso de la cafeína, para poder disolverla es necesario calentar el

agua, siempre procurando que se mantenga por debajo de 60ºC (dado que a esta

temperatura esta molécula se degrada).

Una vez preparadas las soluciones se procedió a llevar a cabo los

tratamientos específicos de este experimento. Para ello, se tomaron por un lado 4

bulbos y se incubaron durante 2 horas en la cámara de cultivo en cafeína 5 mM, y por

otro, se tomaron otros cinco bulbos y se incubaron también durante 2 horas en la

cámara de cultivo en colchicina 0,05 %. Tras las incubaciones, las raíces sometidas a

los tratamientos de colchicina se cortaron y se fijaron en solución de Carnoy, mientras

que los bulbos expuestos a las soluciones de cafeína se mantuvieron en agua mineral

en las condiciones iníciales durante una hora, con el objetivo de que las células

binucleadas generadas pasasen a G1 y poder distinguirlas de este modo de las células

mononucleadas en telofase no afectadas por el tratamiento, tras lo cual también se

cortaron las raíces y se fijaron. En el caso de las células tratadas con cafeína es

necesario fijarlas tras el tratamiento, ya que de lo contrario darían lugar a células

poliploides con un único núcleo, y por tanto prácticamente indistinguibles. Una vez

fijadas las raíces fueron montadas de acuerdo con el procedimiento experimental

descrito en el apartado inicial. Por último se procedió a la estimación de los porcentajes

celulares afectados por cada marcaje, lo cual fue posible gracias a la distinta

morfología que presentaban las poblaciones celulares e cada caso (binucleadas en el

caso de la cafeína y con los cromosomas condensados y dispersos por el citoplasma,

en el caso de los meristemos tratados con colchicina) (Figura 13).

16

Para ello cada uno de los integrantes del grupo empleó cuatro preparados,

contando 1000 células en cada uno de ellos.

A

B

Figura 13. (A) Fotografía de un preparado correspondiente al tratamiento con cafeina; las células binucleadas

aparecen marcadas con asteriscos. (B) Preparado de una muestra tratada con colchicina; las células afectadas

aparecen marcadas con un asterisco.

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Resultados y discusión

Los resultados obtenidos por el grupo A aparecen en la tabla 2. Como era de esperar,

los valores obtenidos para la colchicina fuero ligeramente superiores a los obtenidos

para la cafeína, lo cual es debido a que la diana sobre la que actúa la colchicina es

mucho más amplia, lo que introduce mayor error (afecta a las etapas de la mitosis

dependientes de microtúbulos, es decir desde profase a telofase), debido a lo cual se

procedió a realizar una corrección de los datos, restando un 1% a los valores obtenidos

para la colchicina para de este modo poder normalizar los resultados (dado que al

tratar con colchicina, además de verse afectadas las células que pasan de profase a

metafase, se ven afectadas todas las células que se encuentran en metafase y

anafase).

Flujo celular (% de células / hora) Alumno Cafeina Colchicina Corrección colchiclina

Diego 6,3 7,07 6,07 4,9 6,8 5,8

Nicolas 4,4 7,11 6,11 5,81 7,86 6,86

Cristóbal 5,55 6,8 5,8 6,1 7,7 6,7

Javier 5,3 6,8 5,6 5,7 7,2 6,2

Rafael 5,7 6,9 5,9 5,1 7,4 6,4

Media 5,49 6,144

Media total 5,817

Los porcentajes obtenidos se corresponden con el doble del flujo celular

(dado que las muestras fueron expuestas durante dos horas a los tratamientos), por lo

que para la estimación de los flujos (φ) únicamente habría que dividir entre dos los

valores obtenidos. De este modo fue posible estimar que el flujo celular obtenido a

partir del tratamiento con cafeína fue de 2,74 % de células / hora, para el tratamiento

con colchicina normalizado 3,072 % de células / hora, mientras que el valor obtenido a

partir del promedio de los resultados obtenidos para ambos tratamientos fue de 2,91 %

de células / hora. Si comparamos los resultados obtenidos en nuestro grupo con los de

los otros dos grupos (Tabla 3) podemos observar que en todos ellos se conserva la

tendencia de valores de flujos celulares mayores en la estimación llevada a cabo

mediante el marcaje mediante colchicina, resultado de la mayor diana de acción de

este marcaje.

Tabla 2. Resultados de los índices de fase obtenidos por los miembros del grupo A, así como la media total.

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Sin embargo a pesar de ello llama la atención a que las mayores diferencias

aparecen en las estimaciones llevadas a cabo mediante el marcaje con cafeína (desde

2,74 a 3,3), lo cual se debe probablemente a que la morfología resultado de las

alteraciones provocadas por la exposición a cafeína (células binucleadas) son más

difíciles de identificar en los preparados, lo cual resulta en que muchas de las células

marcadas no sean consideradas como tal , con lo cual es posible que mediante esta

técnica se subestime el número de células marcadas.

Flujo celular (células/hora)

Cafeína Colchicina * Media

Grupo A 2,74 3,08 2,91

Grupo B 2,7 3,78 3,24

Grupo C 3,3 3,48 3,39

Total 2,91 3,44 3,18

A partir de la estimación del flujo celular es posible también realizar una

estimación de la duración total del ciclo (Tabla 4):

Tiempo total grupo A (h) = 100/φ

Duración del ciclo (horas)

Cafeína Colchicina* Media

Grupo A 36,5 32,5 34,4

Grupo B 37,0 26,5 30,9

Grupo C 30,3 28,7 29,5

Total 34,4 29,1 31,4

Dado que la duración esperada del ciclo celular a 25ºC es de una 30 horas,

es posible aceptar que la metodología basada en el marcaje celular para la estimación

de la duración permite obtener resultados bastante aceptables, y todo ello a pesar de

los errores experimentales introducidos por los componentes del grupo a la hora de

llevar a cabo el contaje de las muestras.

Tabla 3. Comparación de los valores de flujos celulares obtenidos por los tres grupos de prácticas.

* El valor de la colchicina se corresponde con los valores corregidos al restarles el 1%

Tabla 4. Comparación de las duraciones de ciclo celular obtenidos por los tres grupos de prácticas.

* El valor de la colchicina se corresponde con los valores corregidos al restarles el 1%

19

Con todo ello hay que apuntar que, dada a la inexperiencia de los alumnos a

la hora de identificar a las células marcadas, mediante el marcaje con cafeína se tiende

a sobrevalorar la duración del ciclo, con lo que en el caso de personal inexperto, el

marcado mediante cafeína parece una alternativa más adecuada, a pesar de que su

marcaje es menos específico.

A partir de los índices de fase obtenidos en el primer experimento y el flujo

celular fue posible estimar la duración en horas de cada una de las etapas del ciclo

celular (Tabla 5). Como es posible observar en los resultados obtenidos, tanto en el

caso de los valores obtenidos a partir de los datos del grupo A como en el conjunto de

los datos de todos los grupos, la interfase es con diferencia la etapa de mayor duración,

y dentro de ésta, la fase S, lo cual concuerda con los resultados esperados. Sin

embargo, de acuerdo con los resultados obtenidos el periodo G1 tendría una duración

inferior al periodo G2, lo cual no se ajusta a la realidad dado la duración del periodo G1

es superior a la de G2 (en un ciclo de 30 horas la etapa G1 tendría una duración

aproximada de 8 horas, frente a las 6 horas de la etapa G2 y las 14 horas de la fase S).

Duración (h)

Etapa Grupo A Total

Interfase

29 h 48 min 27 h 28 min

G1 3 h 42 min 5 h

S 16 h 15 h 10 min

G2 10 h 6 min 7 h 18 min

Metafase

4 h 30 min 3 h 36 min

Profase 2 h 30 min 1 h 42 min

Metafase 30 min 33 h 6 min

Anafase 30 min 36 min

Telofase 1 h 48 min

Tabla 5. Comparación de los resultados sobre la duración de cada una de las etapas de ciclo celular obtenido por

los tres grupos de prácticas.

20

Tercer experimento:

Efecto de la tensión de O2 sobre la sincronía de una

población celular

Introducción

Diversas condiciones ambientales pueden afectar a la cinética del ciclo celular, de

modo que una de las estrategias empleadas para su estudio es la generación de

poblaciones celulares sincrónicas, lo cual es posible, como se puso de manifiesto en el

experimento anterior, mediante la exposición de los meristemos radiculares a cafeína

5 mM durante 1 hora. Uno de los factores que provoca alteraciones en la cinética del

proceso es la disponibilidad de oxígeno dado que las condiciones de hipoxia provocan

un incremento de estrés en la célula, lo cual se ve potenciando en las raíces del ajo, las

cuales presentan un metabolismo heterotrófico.

Procedimientos experimentales

Del mismo modo que en los experimentos anteriores, el procedimiento se inició con la

preparación de los ajos, y su incubación en la cámara de cultivo durante 48 horas en

condiciones constantes de oscuridad, 25 ºC y oxigenación proporcionada mediante

burbujeo, con el objetivo de que el material biológico alcanzase el equilibrio dinámico

proliferativo.

El siguiente objetivo fue el marcaje de poblaciones sincrónicas, para lo cual

se incubaron todos los bulbos en soluciones de cafeína 5 mM durante una hora, tras lo

cual los bulbos se lavaron para eliminar los restos de cafeína y se reintrodujeron en los

recipientes de vidrio con agua, tomando este momento como tiempo 0. A partir de aquí,

la mitad de los bulbos se incubaron en burbujeo constante, y la otra mitad sin burbujeo,

y a una temperatura de 20-21 ºC, para de este modo alargar de duración del ciclo

celular, lo cual era un requisito necesario para poder tomar las muestras en horarios

adecuados para los alumnos. Así pues, se tomaron muestras a las 12 horas, 13 horas,

17 horas, 19 horas y 21 horas tras el inicio de la incubación. Las muestras se fijaron, se

tiñeron y se prepararon de acuerdo con los procedimientos presentados con

anterioridad, llevando a cabo el conteo de células mediante la discriminación de las

binucleadas, diferenciando aquellas que se encontraban en interfase de las que se

encontraban en mitosis.

21

Resultados y discusión

En este experimento el número de células binucleadas por campo fue menor que en el

experimento anterior debido a que las los bulbos únicamente fueron expuestos a

cafeína durante 1 hora. En la figura 14 aparecen representados los índices bimitóticos

obtenidos a lo largo del experimento tanto para el tratamiento de los bulbos incubados

en presencia de burbujeo como en ausencia del mismo. Así, podemos ver que hasta

las 13 horas no comenzaron a aparecer células binucleadas en mitosis. La proximidad

al 50% obtenida por el pico que aparece a las 19 horas en los meristemos incubados

en presencia de oxígenos nos indica que el tratamiento mediante cafeína resultó muy

eficiente para conseguir una población sincrónica, dado que el 50 % es el límite teórico

superior que podría alcanzar una población sincrónica, ya que el 50% de las células

binucleadas abandonarán el ciclo y pasarán a un estado diferenciado, y el otro 50% se

mantendrá en el ciclo celular.

A partir e la gráfica es también posible observar como, a pesar de mantener

una tendencia similar, en la población celular incubada en ausencia de oxigeno

aparece un desplazamiento hacia la derecha, lo cual es indicativo de un alargamiento

del ciclo celular, de forma que el grueso de la población alcanzará la mitosis con 2 o 3

horas de retraso. Finalmente, en el caso de la población celular incubada sin burbujeo,

teóricamente la sincronía debería ser menor, de acuerdo con García-Herdugo et al., lo

cual se traduciría en un pico más bajo que en el caso de las raíces incubadas en

ausencia de burbujeo, aunque únicamente con los resultados del presente experimento

esto no puede ser inferido, dado que sería necesario haber seguido tomando muestras

más allá de la hora 21. Así mismo, las enormes desviaciones típicas obtenidas para

t = 21 dificultan aún más la posibilidad de extraer alguna conclusión, con lo que sería

necesario volverá realizar el experimento para confirmar los resultados.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

12 h 13 h 15 h 17 h 19 h 21 h

O2 +

O2 -

Figura 14. Evolución del índice de bimitosis en poblaciones celulares sincrónicas. La línea azul se

corresponde con las células incubadas en presencia de burbujeo, mientras que las rojas se corresponden con

las muestras incubadas en ausencia de burbujeo.

Índice de bimitosis

Tiempo tras tratamiento con colchicina

22

Cuarto experimento:

Efecto del 5-aminouracilo sobre la población proliferante de

Allium sativum

Introducción

El 5-aminouracilo (5-AU) es una molécula estructuralmente análoga al nucleótido

timina (Figura 15), y que se ha visto que puede tener efectos notables sobre el ciclo

celular. Esta molécula es capaz de inhibir la síntesis de DNA, concretamente inhibe a

una enzima conocida como timidilato sintasa. Dicha molécula también presenta la

característica de inhibir a la RNA-polimerasa de manera competitiva.

Se engloba dentro de lo que se conocen

como marcadores sincrónicos por inducción, ya que va

a bloquear el transito de las células a través del ciclo,

en una parte del ciclo conocida como “región 5-

aminouracilo”, de tal manera que tras la aplicación de

esta droga vamos a crear una población de células

sincrónicas. La zona de acción de esta sustancia, se

encuentra en el transito desde la fase S a la fase G2

gracias a que bloquea la síntesis tardía de DNA así

como la reparación.

En este experimento observaremos como dicha molécula induce la formación de una

población sincrónica, lo cual será apreciable ya que observaremos primero un

descenso en el numero de células en mitosis, y posteriormente tras la retirada de la

droga un aumento en el número de células en dicha fase, lo que nos indica que las

células se fueron acumulando en una parte del ciclo, y que en el momento que se retira

dicha droga, estas reanudan el ciclo celular.

Material y métodos

Las raíces fueron cultivadas a 25ºC, oscuridad, y aireación constante durante 48 horas,

cambiando el agua de cultivo cada 24 horas, como en los experimentos anteriores.

Para este experimento se llevo a cabo la preparación de la solución que contenía el

5-aminouracilo, concretamente se preparo una solución a 0,5 mM de 5-aminouracilo en

agua destilada. Se retiraron las raíces de los bulbos que presentaban un aspecto

desfavorable, y estos fueron sumergidos en la solución con 5-AU e incubados durante

17 horas, tras lo cual se paso a realizar un lavado de raíces y su posterior inmersión en

agua por otras 12 horas, estableciéndose así un periodo de recuperación.

Figura 15. Estructura del

5-aminouracilo

23

Durante estas horas de cultivo se fueron tomando muestras a diferentes

tiempos, concretamente durante las 17 horas de cultivo con 5-AU se tomaron muestras

a las horas 0, 2, 5, y 17. Por otro lado durante las 12 horas de recuperación también se

tomaron muestras, a las horas +5, +7, +8, y +12. Tras ello las muestras tomadas fueron

fijadas (fijador Carnoy), y posteriormente teñidas con orceína, para a continuación ser

visualizadas al microscopio diferenciando las células en interfase frente a las células en

mitosis. El recuento celular fue llevado a cabo mediante el conteo de 1000 células por

preparado, obviando las células diferenciadas, es decir solo teniendo en cuenta

aquellas que se encontraban en ciclo.

Resultados y discusión

Los resultados obtenidos por los tres grupos de prácticas aparecen recogidos en la

tabla 6 y representados en la figura 15.

Como podemos apreciar en la grafica, en la hora 0 de tratamiento, es decir

células pertenecientes a los meristemos de la raíz que no han sido tratadas,

observamos un índice mitótico de 8,3% cosa que es totalmente lógica puesto que el IM

generalmente ronda un 10% del ciclo celular, y teniendo en cuenta la poca experiencia

de conteo celular de los alumnos dicho resultado es satisfactorio. Posteriormente

podemos observar un descenso continuo y progresivo en los índices mitóticos en las

muestras tomadas a diferentes horas del tratamiento con 5-aminouracilo,

concretamente vemos como el IM se va reduciendo hasta alcanzar el valor mas bajo,

de 4,4% en la hora 17 de tratamiento, lo que es debido a la parada del ciclo en alguna

etapa anterior a la mitosis como consecuencia de la droga, lo que implica que lleguen

menos células a mitosis. Generalmente este índice mitótico debería tender a 0, pero su

valor un poco mas elevado puede deberse a no haber usado una concentración muy

alta de 5-AU (0,5 mM).

Finalmente tras la retirada de la droga vemos un aumento del IM el cual llega

incluso a hacerse mas elevado de lo normal, en torno al 12,4% en la hora +7, lo que es

debido a la llegada de una oleada de células que se encontraban retenidas en una fase

del ciclo celular previa a mitosis, y que tras la retirada de la droga han continuado su

curso por el ciclo celular, lo que nos indica también la obtención de una población

sincrónica. Por ultimo en la hora +12 vemos como el IM vuelve a tomar valores

normales (9,1%).

Estos resultados nos corroboran lo observado en la bibliografía, es decir que

5-aminouracilo bloquea el ciclo creando una población sincrónica, y que además lo

hace en una fase previa a mitosis, concretamente en el paso desde la fase S a G2

(Díez et al. 1976). Tenemos que resaltar que la fase G2 suele tener una duración

aproximada de unas 3-4 horas, pero el valor mas alto de IM lo obtenemos a la hora 7

tras retirar el tratamiento, y esto puede ser debido a que la droga produzca algún tipo

de retardo en el ciclo (intoxicación celular).

24

Tratamientos

5-Aminouracilo 0,5 mM Agua mineral 0h 2h 5h 17h +5h +7h +8h +12h

Índices

Mitóticos (%)

8,1 5,1 4,3 1,3 8,1 14,5 12 10,3 8,6 10,47 4,7 1,6 10,6 10,8 11,3 6,8 7,1 4,7 4,8 5,9 9,8 8,7 9,6 9,7 9,4 8,7 9,2 15,4 7,6 9,4

11,1

Media 8,3 6,7 4,6 4,4 8,2 12,4 10,3 9,1

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0h 2h 5h 17h +5h +7h +8h +12h

Figura 15. Evolución de los índices mitóticos a lo largo del tratamiento con 5-AU. El intervalo que va desde 0

horas hasta 15 horas se corresponde con el tiempo en el que los bulbos estuvieron expuestos a la droga.

Tiempos de tratamiento

Índice mitótico

Tabla 6. Valores de los índices mitóticos obtenidos por los tres grupos de prácticas en conjunto a lo largo del

experimento de exposición a 5-aminouracilo.

25

Quinto experimento: Estudio del ciclo nucleolar

Introducción

El nucléolo es la manifestación morfológica de un conjunto de procesos bioquímicos

que tienen lugar en el interior del núcleo, y que culminan con el ensamblaje de las

subunidades ribosomales. Este se organiza entorno a unas regiones del genoma

conocidas como organizadores nucleolares (o NOR, del inglés: nucleolar organizer

region) que es el sitio cromosómico donde se localizan los clusters de genes

ribosómicos que codifican para el ARN ribosómico y que está asociado a una

constricción secundaria. Estas regiones NOR no aparecen en todos los cromosomas,

ya que, por ejemplo en humanos solo aparece en los cromosomas 13, 14, 15 21 y 22.

El nucleolo suele tener una forma más o menos redondeada aunque puede

adquirir formas muy irregulares, y en el los componentes principales a destacar son:

proteínas, ADNr (es decir el ADN que codifica a los ARNr que formarán los ribosomas)

y los propios ARNr. Hay que destacar que todos los ARN presentes en el nucléolo

provienen de un ARN 45s que será procesado, excepto un ARNr 5s que no tiene origen

nucleolar (transcrito por la ARN polimerasa III, a diferencia del ARNr 45s, que es

transcrito por la ARN polimerasa I).

El número de nucléolos es variable, de forma que generalmente las células

suelen tener uno o más nucléolos, aunque hay ciertos tipos celulares que pueden

carecer de este. El tamaño del nucléolo también puede ser variable siendo lo normal

1 µm, y su posición generalmente es centrada con respecto al núcleo. Así mismo, el

nucléolo puede ser dividido en dos partes diferentes :

• Parte amorfa o nucleoloplasma, que es una parte poco densa y que contiene gránulos

de ADN.

• Parte densa o nucleolonema, en la que se distinguen:

* Parte granular que contiene las ribonucleoproteinas.

* Parte fibrilar formada por fibrillas, también esta constituida por proteínas.

* Centro fibrilar, menos densa que las dos anteriores y abunda en ARN y ADN.

La técnica que emplearemos para la visualización de los nucléolos es

conocida como tinción argéntica nucleolar, fue desarrollada en 1975 y pone de

manifiesto la presencia de nucléolos puesto que va a reaccionar con las proteínas

acidas presentes de tal manera que los nucléolos van a quedar impregnados de una

gran cantidad de plata lo que les proporciona una tonalidad pardo-oscura, mientras que

el núcleo toma un color ocre débil y una tonalidad aun más leve el citoplasma.

26

El nucléolo también esta sometido a un ciclo (Figura 16), de forma que éste

no está presente durante todas las fases del ciclo celular. En el ciclo nucleolar

podemos destacar tres fases principales (Figura 17):

- Desorganización nucleolar: Esta fase se da durante la profase, en ella el nucléolo

disminuye de tamaño, y se hace irregular. Dejan de poder expresarse las regiones

codificantes para los componentes nucleolares debido a la compactación cromosómica.

- Transporte metafásico y anafásico: El nucléolo pierde su individualidad al diluirse y no

es observable.

- Organización nucleolar: Durante la telofase comienza la descondensación de los

cromosomas, se forman los cuerpos prenucleolares, y finalmente aparecen de nuevo

los nucléolos, siendo en G1 cuando el nucléolo vuelve a ser funcional. Destacar que la

inhibición de la síntesis de ARN no impide la formación de los cuerpos prenucleolares

pero si la nucleologénesis.

Procedimientos experimentales

Como ya se ha mencionado la técnica empleada nos servirá para diferenciar el

nucléolo del resto del núcleo así como del citoplasma y demás componentes celulares.

Figura 16. Morfología de los nucléolos a lo largo del ciclo nucleolar. (A) Nucleolo ausente. (B) Aparición de los

cuerpos prenucleolares. (C) Nucleolos claramente visibles. (D) Desaparición progresiva de los nucléolos.

A B C D

Figura 17. Correspondencias entre los ciclos nucleolar y celular.

27

Para la realización de esta técnica se procedió de la misma forma que para

las anteriores en cuanto a la obtención de raíces se refiere. Una vez tubimos las raíces

se preparó una solución 1:1 de formol al 10% e hidroquinona al 1% y se introdujeron

dichas raíces durante 2 horas para su fijación a temperatura ambiente. Posteriormente

se realizaron tres lavados de 10 minutos cada uno en agua destilada. A continuación se

llevó a cabo la tinción del material mediante su introducción en una solución de nitrato

de plata al 2%. El nitrato de plata es fotosensible por lo cual el bote que contiene la

solución y las raíces fue cubierto con papel de aluminio e introducido en la estufa a

70ºC durante toda la noche. A la mañana siguiente se realizaron tres lavados de 10

minutos cada uno de ellos con agua destilada y se precedió a la reducción de las

muestras, para lo cual fue necesario volver a introducir dichas muestras en la solución

formo-hidroquinona (1:1) durante 2 horas a temperatura ambiente.

Finalmente se llevó a cabo el montaje en el portaobjetos, para lo cual

empleamos una gota de ácido acético al 50% en lugar de orceína. En este experimento

el aplastamiento final se llevó a cabo con la uña del dedo en lugar de con la yema, y

hay que tener bastante cuidado puesto que del aplastamiento puede depender mucho

la calidad final de la tinción. Tras el conteo de los nucleolos en las distintas etapas de

los preparados se calcularon los índices de células en cada una de las fases del ciclo

nucleolar. De este modo se obtuvieron los porcentajes de cada una de las fases: Con

nucléolo, desorganización nucleolar, sin nucléolo y reorganización nucleolar.

Resultados y discusión

Dicha técnica resulta ser bastante dificultosa para su realización, es por ello por lo que

no obtuvimos buenos preparados, por lo que fue necesario que el profesor

proporcionase preparados para poder realizar los conteos. Por lo general los nucléolos

eran fáciles de identificar pudiendo tener un nucleolo de tamaño grande o dos-tres

nucléolos de tamaño un poco menor.

Las células con nucléolo son fácilmente identificables por presentar su

nucléolo bien teñido de color pardo oscuro. Las células que presentan el nucléolo en

desorganización son apreciables por que su nucléolo presenta un estado ligeramente

fibrilar mientras que las células con el nucléolo en reorganización presentan un estado

más granuloso. Finalmente las células sin nucléolo se identifican por no presentar la

zona pardo-oscura correspondiente al nucléolo. Los resultados obtenidos acerca de los

índices en cada fase nucleolar aparecen recogidos en la figura 18.

De acuerdo con los resultados, la fase con nucléolo presente es la más

larga del ciclo celular y prácticamente se corresponde a toda la interfase, y es por ello

por lo que hemos obtenido un 92 % de células con nucléolo, lo que se asemeja mucho

al 90 % de la población que generalmente se encontrara en interfase.

28

Por otro lado tenemos un índice de desorganización nucleolar de en torno al

2 % esta fase comienza una vez a comenzado la profase, y cabría de esperar un

resultado un poco mayor de esta fase pero puede ser debido a su difícil observación ya

que puede ser confundida con la fase de reorganización. El porcentaje de células sin

nucléolo se aproximó al 3 % y este dato también debería ser un poco más elevado

puesto que esta fase se corresponde con la metafase, anafase y el comienzo de la

telofase. Finalmente para la reorganización nucleolar obtuvimos un 2,5 % y de nuevo

cabria de esperar para esta fase un porcentaje un tanto mayor debido a que se

corresponde con buena parte de la telofase y parte de G1. El descenso en esta última

fase puede ser debido de nuevo a que se confundieran células con la desorganización

nucleolar. A su vez los porcentajes bajos tanto en reorganización como

desorganización pueden ser debidos a que sean confundidos con situaciones en las

que presumimos que el nucléolo se encuentra intacto y por tanto encuadremos a

dichas células en el índice de fases de células con nucléolo.

Inhibición de la nucleologénesis

Introducción

La nucleologénesis es el proceso por el cual el nucléolo vuelve a formarse y se

convierte en un nucléolo funcional, fase del ciclo nucleolar que se corresponde con el

final de la telofase y el comienzo de G1. Ocurre en esta etapa pues es cuando los

cromosomas tras la mitosis comienzan de nuevo a descondensarse pudiendo

expresarse las regiones NOR, lo que desencadenara la formación del nucléolo.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Con nucleolo Sin nucleolo Desorganizandose Reorganizandose

Célu

las (

%)

Figura 18. Representación en tanto por ciento de cada una de las fases del ciclo nucleolar. Los tantos

porcientos obtenidos fueron los siguientes: Con nucléolo: 92%; Sin nucléolo: 3,5%; Desorganización

nucleolar: 2%; Reorganización nucleolar: 2,5%.

29

Procedimientos experimentales

En este experimento puesto que vamos a estudiar el nucléolo será necesario emplear

la tinción argéntica nucleolar, realizada del mismo modo que en el experimento

anterior. Además para el estudio de la nucleologénesis empleamos una sustancia

conocida como cordicepín, la cual es capaz de inhibir la síntesis de ARNr llevado a

cabo por la ARN polimerasa I. Para ello se seleccionaron dos lotes de raíces también

obtenidas del mismo modo que en los experimentos anteriores, de forma que uno de

los lotes se sometió a una concentración de 5 mM de cafeína durante una hora tras lo

cual se depositaron en agua, mientras que el otro lote de raíces fue sometido tanto a

cafeína 5mM como a cordicepín 0,1mM, durante una hora.

En ambos casos se tomaron muestras a diferentes tiempos, y se tiñeron con

la tinción de plata ya empleada en el experimento anterior, para finalmente contabilizar

en las distintas muestras las proporciones de células con nucléolo formado y células

con el nucléolo desorganizado.

Resultados y discusión

Como ya hemos dicho la nucleologénesis es el proceso por el cual se forma el nuevo

nucléolo tras la mitosis. Este proceso comienza en telofase con la descondensación de

los cromosomas, y la formación de los cuerpos prenucleolares. Mediante el marcaje

con cafeína conseguimos marcar a una serie de células que pasan por telofase

quedando como binucleadas.

En el caso de los bulbos tratados solo con cafeína se pudo observar que el

proceso de nucleologénesis transcurrió de forma normal, mientras que en el caso de

los bulbos tratados con cordicepín no tubo lugar la formación de nucleolos maduros,

quedando los cuerpos nucleolares dispersos por todo el núcleo. El cordicepín es una

molécula capaz de inhibir a la RNA polimerasa I. De este modo, a partir de los

resultados obtenidos es posible inferir que la formación de los cuerpos prenucleolares

es independiente de ARN. Así mismo, a partir de los resultados obtenidos es posible

afirmar que la formación de los nucleolos funcionales es dependiente de la actividad de

la RNA polimerasa I.

30

Bibliografía

Giménez-Abián J.F. , G. Giménez Martín, J.A. Suja and J.S. Rufas. Nucleolar organizer regions are associated with silver-stained chromatid cores in meiotic chromosomes of grasshoppers. Genome, 32: 829-833, 1989.

Giménez-Martín G., J.F. Giménez-Abián and M.I. Giménez-Abián (2003). Bases celulares del ciclo proliferativo. Cancer. pg.: 23-69

Goodpasture C. & S.E. Bloom (1975). Visualization of nuclear organizer regions in mammalia

chromosomes using silver staining. Chromosoma 53: 37-50.

Molecular Cell Biology (4th edition). Harvey Lodish, Arnold Berk, S. Lawrence Zipursky, Paul Matsudaira, David Baltimore and James Darnell; Freeman & Co., New York, NY, 2000.ISBN 0-7167-3136-3