PROPAGACIÓN in vitro DEL VIEJITO Cephalocereus senilis)
53
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA PROPAGACIÓN in vitro DEL VIEJITO (Cephalocereus senilis) INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: INGENIERO BIOTECNÓLOGO PRESENTA: ANGEL HERNÁNDEZ SORIANO DIRECTOR EXTERNO: Ing. Isaías Gil Vázquez DIRECTOR INTERNO: Dr. Germán F. Gutiérrez Hernández. México, D. F. Mayo del 2006 1
Transcript of PROPAGACIÓN in vitro DEL VIEJITO Cephalocereus senilis)
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
PROPAGACIÓN in vitro DEL VIEJITO (Cephalocereus senilis)
INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE:
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
INGENIERO BIOTECNÓLOGO
PRESENTA:
ANGEL HERNÁNDEZ SORIANO
DIRECTOR EXTERNO: Ing. Isaías Gil Vázquez DIRECTOR INTERNO: Dr. Germán F. Gutiérrez Hernández.
México, D. F. Mayo del 2006
1
ÍNDICE
1. ANTECEDENTES DEL CULTIVO IN VITRO DE CACTÁCEAS 1 2. INTRODUCCIÓN 2 2.1. Origen de la cactáceas 3 2.2. Distribución geográfica de las cactáceas 3 2.2.1. Zona de opuntias 4 2.2.2. Zona de cereus 4 2.2.3. Zona de cactáceas epífitas 4 2.2.4. Zona de las especies de tallo globoso 4 2.3. Importancia de las cactáceas 4 2.4. Problemática de las cactáceas en México 5 2.5. Ubicación taxonómica de Cephalocereus senilis 6 2.6. Descripción botánica de Cephalocereus senilis 7 2.7. Distribución geográfica de Cephalocereus senilis 8 2.8. Propagación de Cephalocereus senilis 8 2.9. El cultivo de tejidos 9 2.9.1. Sistemas de regeneración in vitro 10 2.9.1.1. Cultivo de puntos meristemáticos 10 2.9.1.2. Proliferación de yemas axiláres 10 2.9.1.3. Iniciación de brotes adventicios 10 2.9.1.4. Cultivo de callo 10 2.9.1.5. Cultivo de células individuales y protoplastos 11 2.9.2. El cultivo in vitro como método de propagación de cactáceas 11 2.9.3. Factores que influyen en el cultivo de tejidos 14 2.9.3.1. Medio de cultivo 14 2.9.3.2. Reguladores del crecimiento 14 2.9.3.3. Explante 15 2.9.3.3.1. Edad fisiológica 15 2.9.3.3.2. Tejido u órgano del que se extrajo 15 2.9.3.3.3. Condiciones de crecimiento y estado sanitario de la planta donadora
16
2.9.3.3.4. Tamaño del explante 16 2.9.3.3.5. Lesión 17 2.9.3.4. Condiciones de incubación 17 2.9.3.4.1. Iluminación 17 2.9.3.4.1.1. Fotoperiodo 18 2.9.3.4.1.2. Intensidad lumínica 18 2.9.3.4.1.3. Longitud de onda 18 2.9.3.4.2. Temperatura 19 3. JUSTIFICACIÓN 20 4. OBJETIVOS 21 4.1. Generales 21 4.2. Específicos 21 5. HIPÓTESIS 21 6. MATERIALES Y MÉTODOS 22 6.1. Lugar de realización 22 6.2. Periodo 22 6.3. Material vegetal 22 6.4. Establecimiento de la fase experimental 22 6.4.1. Unidad experimental 22 6.4.2. Número de repeticiones 22 6.4.3. Tipos de explante 22
2
6.5. Preparación de medio de cultivo 22 6.5.1. Formulación del medio de cultivo 23 6.6. Desinfestación de las plantas 24 6.7. Obtención y siembra de los explantes 27 6.7.1. Parámetros de evaluación 29 6.8. Establecimiento de las características del explante 30 6.9. Utilización de un nuevo método de desinfestación 30 6.10. Subcultivos 31 6.10.1. Parámetros de evaluación 31 6.11. Enraizamiento 32 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 33 7.1. Establecimiento de las características del explante 33 7.2. Formación de brotes en explantes 35 7.3. Velocidad de formación de brotes 38 7.4. Utilización de un nuevo método de desinfestación 39 7.5. Efecto del Ácido Giberélico 41 8. CONCLUSIONES 43 9. RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS 44 10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45 11. ANEXOS 49
3
1. ANTECEDENTES DEL CULTIVO IN VITRO DE CACTÁCEAS
El cultivo in vitro se ha aplicado en muchas especies vegetales, tanto forestales como
ornamentales, cultivadas, etc., abarcando a más de 40 familias diferentes (Hughes, 1987).
Las cactáceas han recibido muy poca atención (Minocha y Mehra, 1974). Sin embargo,
con el actual incremento de la demanda de cactáceas, se ha recurrido al cultivo de tejidos
como método para producir más plantas de calidad en el menor tiempo posible.
Colmas (1971), cultivó in vitro una cactácea columnar del norte de México (Fay y Graifon,
1992). Kolar et al. (1976) obtuvieron brotes adventicios a partir de callo en MammiIIaria
woodsii, mientras que Mauseth (1976) estudió los efectos de citocininas y ácido giberélico
sobre la estructura y metabolismo de los meristemos de Opuntia polyacantha. Corona y
Chávez (1982) lograron la germinación in vitro de Echinocactus grusonii y Echinacactus
polyacanthus iniciando así este tipo de estudios en México. Havel y Kolar (1983)
describieron un método de obtención de explantes sin causar daño sustancial a la planta y
lo probaron en 10 especies de cactáceas mexicanas. Sánchez (1993) reporta estudios en
Cephalocereus senilis, logrando formación de callo pero no hubo formación de yemas.
Starling (1985) realizó la propagación in vitro de varias especies de cactáceas mexicanas
y puntualizó el alto potencial de proliferación logrado con esta técnica, pero también que
su elevado costo impide su adopción para fines comerciales.
Fay y Graifon (1992) realizaron una revisión de los estudios hechos en cactáceas y otras
suculentas, algunas de las conclusiones a las que llegaron son las siguientes: a) para la
propagación in vitro, los explantes más comúnmente usados son las semillas y las yemas
laterales; b) Los géneros a los que se ha prestado más atención son Mammillaria y
Opuntia además de las especies en peligro de extinción en donde este interés se ha
intensificado en los últimos 10 años (Sánchez, 1993).
Bonness et al. (1993) realizaron el cultivo de callos y células en suspensión de
Cephalocereus senilis, utilizaron como explantes secciones de 1 cm de tallo, a los cuales
se les removió la epidermis, el medio empleado fue Murashige and Skoog (100%)
complementado con 1 mg L-1 de 2,4-D y 0.5 mg L-1 de BA y un pH de 5.7-5.8; para el
cultivo de callo el medio fue solidificado con 2% (v/v) de Gelrite®. En cuanto al cultivo de
células en suspensión no obtuvieron brotación.
4
2. INTRODUCCIÓN
Bravo (1978) define a las cactáceas como plantas con tallos crasos, espinosos, con
frecuencia de dimensiones gigantescas, carentes de hojas y de formas muy diversas
como cilíndricas, columnares, esféricas y candeliformes; entre otras se encuentran los
tipos globosos y columnares que son adaptaciones morfológicas que evitan la pérdida
excesiva de agua durante la transpiración, otra adaptación notable es la formación de
gruesa cutícula protectora de la epidermis.
En las culturas mesoamericanas, las cactáceas tuvieron un papel muy importante en la
vida económica, social y religiosa; incluso se menciona que influían directamente en el
establecimiento de los centros de población, tal es el caso de los aztecas para fundar
Tenochtitlán (Bravo, 1978).
México, es uno de los países con mayor diversidad de cactáceas en el mundo, misma que
ha sido sobreexplotada por los países avanzados, que comúnmente llegan a México para
saquear sus recursos naturales. La carencia de una política de protección en nuestro país
da como resultado la pérdida cada vez más aguda de tales recursos y que una proporción
importante de las especies animales y vegetales endémicas se encuentren en peligro de
extinción. Por lo que respecta a las cactáceas y especialmente aquellas con valor
ornamental o que son sumamente raras, se encuentran en peligro de desaparecer debido
al creciente interés de éstas como plantas de interior.
Entre las especies de cactáceas apreciadas por su valor ornamental está el denominado
“viejito o cabeza de viejito“, cuyo nombre científico es Cephalocereus senilis. Es una
planta de tallo columnar de hasta 15 m de alto y 40 cm de diámetro, de color verde pálido
y su principal característica es que en la porción del tallo producen pelos cerdosos de
color gris-blanco, los cuales llegan a medir hasta 30 cm de longitud, dando la apariencia
de la cabeza de una persona anciana (viejito).
La Norma Oficial Mexicana (NOM-ECOL-059-94) cataloga a esta especie como
Amenazada y define éste término como sigue:
5
“Una Especie y subespecie amenazada es aquella que podría llegar a encontrarse en
peligro de extinción si siguen operando factores que ocasionen el deterioro o modificación
del hábitat o que disminuyan sus poblaciones. En el entendido de que especie
amenazada es equivalente a especie vulnerable “
2.1. Origen de las cactáceas
Las cactáceas son plantas originarias de América. Gibson y Nobel (1986) señalan que
son de Sudamérica, aunque en este punto se tienen divergencias, dado que, otros
autores como Forrest, citado por Bravo (1978), opinan que las cactáceas constituyen una
familia muy bien definida y por esta razón sólo deben haber tenido un único centro de
distribución y un sólo periodo evolutivo y asevera que éste centro podría estar situado en
México. En contraste Backeberg, citado por Bravo (1978), supone que existen dos centros
de diversificación que podrían ser, uno situado al norte del continente y otro al sur. Ésta
teoría se basa en que los géneros sudamericanos son en su mayoría distintos a los de
América del Norte, ambos alcanzaron un desarrollo análogo y las zonas cactológicas se
encuentran materialmente separadas por el istmo de Panamá, cuyo clima impide la
progresión de los géneros de un lugar a otro. Lo que si se tiene claro en cuanto al origen
de las cactáceas es que surgieron en los trópicos y que a través de sus adaptaciones han
logrado sobrevivir en las zonas áridas.
2.2. Distribución geográfica
Las cactáceas se distribuyen principalmente en América, desde la provincia de Alberta,
Canadá, hasta la Patagonia, Argentina; sin embargo, también las podemos encontrar en
otras regiones del mundo, tal es el caso de Rhipsalis que se ha localizado en
determinados sitios de África tropical; en un principio se consideraba que estos géneros
eran autóctonos de la zona, pero después se concluyó que fueron llevados de América
por aves migratorias (Bravo, 1978).
De los 125 géneros que comprende la familia Cactaceae, 61 están presentes en México
(Bravo, 1978), esto equivale aproximadamente a 850 especies de las poco menos de
2000 especies que comprende la familia. Arias, citado por Reyes (1995) estima que 700
de estas especies son endémicas de México. La distribución de las cactáceas en México,
aún no se ha precisado con exactitud (Bravo, 1978), pero una aproximación es la
siguiente:
6
2.2.1 Zona de Opuntias
Corresponde a la altiplanicie Mexicana, que comprende los estados de San Luis Potosí,
Zacatecas, Aguascalientes y se extiende hacia el sur por los estados de Querétaro e
Hidalgo.
2.2.2. Zona de Cereus
Se encuentra al sudeste de Puebla y se extiende por el cañón de Tomellín hasta el valle
de Oaxaca; existe otra zona importante que se encuentra en Meztitlán, Hidalgo.
2.2.3. Zona de las cactáceas epifitas
Esta se encuentra en los bosques húmedos de Veracruz, Tabasco y Chiapas.
2.2.4. Zona de especies de tallo globoso Ocupa la zona desértica del norte del estado de Chihuahua, Durango, Coahuila y Nuevo
León. En el estado de Hidalgo, específicamente en Ixmiquilpan y en los limites con
Querétaro.
2.3. Importancia
Su importancia radica en el complejo ecosistema que forma, el cual es poco conocido y
apreciado, además de su utilización con fines alimenticios, forrajeros, medicinales y
ornamentales.
Los tallos, flores, frutos, semillas y hojas (presentes únicamente en el género
Pereskiopsis) son comestibles.
Los tres primeros órganos se consumen como verduras, aunque en algunas zonas se
hacen confituras con ellos, mientras que los frutos se consumen en fresco, pero ya
existen algunas plantas piloto que obtienen jaleas, jugos enlatados y hasta bebidas
fermentadas o destiladas. De las semillas se obtienen aceites y harinas. Los tallos de las
cactáceas también se pueden usar como forrajes para el ganado caprino, bovino, ovino e
incluso para el porcino; a pesar de su escaso valor alimenticio, le permiten al ganado
sobrevivir a las grandes sequías aprovechando el contenido acuífero del parénquima.
Otro uso es como plantas medicinales, por ejemplo, desde la época prehispánica se han
utilizado las propiedades farmacológicas del peyote (Lophophora williamsii) considerado
que tiene cualidades útiles para las prácticas médico-religiosas (Bravo, 1991).
7
Además, el valor de las cactáceas mexicanas como plantas de ornato era apreciado por
los pueblos mesoamericanos, entre los cuales destacaban los mexicas (Sánchez, 1982).
De entre la flora llevada a Europa después del descubrimiento de América, las cactáceas
fueron las que más llamaron la atención, por su forma caprichosa, su apariencia exótica,
el variado colorido de sus espinas y la belleza de sus flores (Bravo, 1991). El interés por
las cactáceas como plantas de ornato sigue aumentando día con día, debido a su fácil
cultivo y a su adaptabilidad al ambiente de interiores. Asimismo las cactáceas se han
usado exitosamente en la protección y mejoramiento del suelo, como combustible, como
material de construcción, artesanías, en la obtención de mucílago, gomas y pectinas, así
como para la extracción de pulpas y fibras para la fabricación de papel, e incluso en la
obtención de colorantes para la industria cosmetológica.
En México se encuentra la mayor diversidad de especies de cactáceas de América y
aproximadamente el 80% de ellas son endémicas. Además, es una de las familias más
representativas de la flora mexicana, debido a que aproximadamente el 65% del territorio
nacional está constituido por zonas áridas y semiáridas, sitios donde estas plantas son
muy abundantes y constituyen una opción para el desarrollo de estas regiones.
Montaño et al (1993) afirman que el uso racional de este recurso podría atraer una
importante cantidad de divisas al país sin ponerlas en peligro de extinción y proponen que
se favorezca la formación de agrupaciones técnicas mexicanas para el buen
aprovechamiento del recurso.
2.4. Problemática de las cactáceas en México
La problemática en la propagación de cactáceas tiene varios factores, la rápida pérdida de
viabilidad de las semillas (Ault y Blackmon, 1978), la producción de semillas estériles y un
crecimiento lento (Mouseth, 1977), estos aspectos provocan que la regeneración de las
poblaciones sea lenta, lo que no les permite soportar las presiones a las que actualmente
son sometidas, como el desarrollo urbano, la apertura de nuevas áreas agrícolas y el
sobrepastoreo (Corona y Chávez, 1982).
La explotación y el saqueo indiscriminado para el comercio de los especímenes cotizados
principalmente como lo son las plantas exóticas, han puesto en algunos casos a estas
especies en peligro de extinción.
8
Mauseth (1979) afirma que una cuarta parte de las cactáceas de Norteamérica se
encuentran en esta situación. Por otro lado la Secretaría de Desarrollo Social (1994)
estima que de 250 especies de cactáceas a punto de perderse por diversas razones,
aproximadamente 50 son endémicas de México. Éstas especies han sido las más
afectadas ya que en muchos de los casos se presentan únicamente en áreas restringidas
o en poblaciones muy pequeñas (Ortiz y Vargas, 1995); lo que las convierte en especies
muy demandadas por los coleccionistas de plantas raras, esto aunado a que en México
no se cuenta con los lineamientos legales adecuados para aprovechar y proteger estos
recursos eficientemente.
Los principales países importadores de cactáceas (Cárdenas y Torres, 1994) son Japón,
Alemania y Estados Unidos, y los principales países distribuidores y productores de
cactáceas mediante cultivo in vitro son Holanda, en donde una sola empresa distribuye
más de 15 millones de cactáceas anualmente en Europa y Asia; el segundo más
importante es Japón, líder en el mercado asiático. Sin embargo, México aunque es uno de
los principales proveedores de material parental de estas plantas, no figura en su
comercio y por esta razón no obtiene beneficio económico alguno.
2.5. Ubicación taxonómica de Cephalocereus senilis
Cuadro 1. Ubicación taxonómica de Cephalocereus senilis (viejito)
Reino Vegetal
Clase Cereus
Orden Cactales
Familia Cactaceae
Género Cephalocereus
Especie senilis
Bravo, (1978)
9
2.6. Descripción botánica de Cephalocereus senilis
El género Cephalocereus incluye unas 5 especies de cactus columnares de crecimiento
muy lento. El nombre Cephalocereus deriva del griego “cephalo" que significa cabeza y
“senilis”, viejo o anciano; por lo que el nombre de Cephalocereus senilis significa “cabeza
de viejito”. Es una planta de tallo columnar de hasta 15 m de altura y 40 cm de diámetro.
De color verde pálido y tiene de 10 a 15 costillas en los individuos jóvenes que se
duplican en los ejemplares de más de 1 m de altura. Esta especie no suele ramificar y
cuando lo hacen las ramificaciones se presentan a nivel basal.
Las agrupaciones de espinas denominadas “areolas” están muy cercanas unas de otras y
tienen de 1 a 5 espinas de color amarillo y entre 20 y 30 pelos blancos. A medida que la
planta crece, la parte inferior del tallo pierde estos pelos, quedando la parte superior
densamente cubierta, por tal aspecto recibe el nombre común de “viejito”.
Las flores aparecen en los laterales de la planta cerca del ápice, tienen forma de embudo
y emergen del cefalio. Los segmentos internos son de color crema y los externos rojizos.
A) B)
Figura 1. A) Planta de Cephalocereus senilis y B) Floración de Cephalocereus senilis.
10
2.7. Distribución geográfica de Cephalocereus senilis
Su distribución en México, se encuentra en 2 estados; Hidalgo, específicamente en la
zona montañosa de Meztitlán y en la Barranca de Tolantongo y en Guanajuato.
Esta especie se desarrolla en suelos alcalinos y con abundante limo, requiere alta
intensidad de luz solar.
2.8. Propagación de Cephalocereus senilis
La propagación de las cactáceas se puede hacer por vía sexual o asexual, esta última se
realiza de diversas formas, las cuales dependen principalmente de la especie de que se
trate y las características del material que se desea obtener.
El problema primordial de la propagación sexual de Cephalocereus senilis es que florea
de los 60 hasta los 200 años de edad, de tal modo que es muy difícil encontrar semillas.
Por otra parte la propagación asexual puede ser por medio de vástagos, esquejes,
injertos, o por el cultivo in vitro (Choreño, 2001).
La propagación por vástagos se usa principalmente en cactáceas globosas que presentan
brotes, es un método relativamente fácil, pues consiste únicamente en desprender los
brotes que emergen alrededor de la planta madre y plantarlos en forma independiente;
con este método podemos obtener plantas adultas en menos tiempo. La propagación de
Cephalocereus senilis por el método de vástagos es muy difícil ya que esta planta no
produce vástagos adventicios a partir de ella (Choreño, 2001).
La propagación por esquejes es otro método y consiste en fragmentar en trozos las
cactáceas y dejar que cada uno de ellos cicatrice, para poder sembrarlos y promover su
enraizamiento, obteniendo plantas completas de cada uno de los trozos, en este método
se obtienen muchas plantas de un solo individuo y, además, se obtienen plantas
completas en poco tiempo. Por el método de esquejes, hasta el momento no existen
reportes de su utilización en Cephalocereus senilis (Choreño, 2001).
Por otro lado, la propagación por injertos consiste en unir porciones de dos distintas
especies y se usa para ayudar a aquellas plantas que tienen dificultades para sobrevivir
directamente en determinado suelo y también para obtener ejemplares raros y llamativos.
11
Para Cephalocereus senilis se describe que existen muchas dificultades para realizarlo,
ya que la planta sufre en demasía el estrés hídrico al cual se somete en el momento de
realizar el injerto. Por lo anterior, se puede afirmar que una de las mejores opciones para
la propagación del “viejito” es el cultivo in vitro.
2.9. El cultivo de tejidos
Losoya (1985) afirma que los términos cultivo de tejidos, cultivo in vitro y
micropropagación son generalmente usados como sinónimos. Pierik (1990), define como
cultivo in vitro ”el cultivo sobre medio nutritivo, en condiciones estériles, de plantas,
semillas, embriones, órganos, explantes, tejidos, células y protoplastos de plantas
superiores”.
El fundamento del cultivo in vitro es la “Teoría de la Totipotencialidad” de Schwann y
Schleiden (1838), que establece: “las células son autosuficientes y en principio son
capaces de regenerar una planta completa” (Pierik. 1990). Haberlandt (1902), postula que
“si el ambiente y la nutrición del cultivo celular son manipulados, estas células podrían
recapitular la secuencia de desarrollo de una planta con un crecimiento normal”,
marcando de esta forma la pauta para el cultivo de tejidos (Hughes, 1987); sin embargo,
los primeros intentos fracasaron. Según Pierik (1990), el primer cultivo de tejidos
vegetales es obtenido por Nobécourt, Gautheret y White en 1939, aún cuando algunos
investigadores ya habían reportado previamente éxito en el cultivo de semillas, embriones
y órganos de plantas.
En 1955 se dio un notable estímulo al desarrollo de esta técnica. El descubrimiento de las
hormonas vegetales y particularmente de la Citocinina, a partir de entonces han tenido
lugar enormes avances en el cultivo in vitro de plantas (Pierik, 1990).
En México las actividades en este campo se iniciaron en 1970 a raíz de la firma de un
convenio de colaboración científica entre México y Japón. En junio de 1980 se establece
la Asociación Mexicana del Cultivo de Tejidos Vegetales y, hasta la fecha, el uso de esta
técnica se extiende a mínimo 17 instituciones que emplean este método en
investigaciones básicas y aplicadas, sin embargo, la participación de la industria y de la
iniciativa privada en esta área es muy limitada o nula, aun cuando ofrece posibilidades
interesantes de desarrollo para la horticultura y la industria farmacéutica (Robert y Loyola,
12
1985). Actualmente es difícil calcular la cantidad de especies que han sido trabajadas con
esta técnica, pero son muchas las especies en las que se reporta haber obtenido éxito.
2.9.1. Sistemas de regeneración in vitro
Los métodos más comunes son los siguientes:
2.9.1.1 Cultivo de puntos meristemáticos. Método muy seguro porque mantiene la
integridad de la planta (Pierik, 1990) y consiste en continuar el crecimiento in vitro de una
punta meristemática aislada, provocando posteriormente su enraizamiento, con lo que se
obtiene una planta completa. En general, la finalidad de este método es obtener plantas
libres de patógenos, aunque también se usa para almacenar plantas libres de
enfermedades, para realizar transportes fitosanitarios, para coleccionar germoplasma y
para clonar plantas (Pierik, 1990).
2.9.1.2. Proliferación de yemas axilares. Proporciona material para un sistema de
multiplicación rápido, en el cual el número de plantas potenciales se incrementa
exponencialmente en cultivos sucesivos. Consiste principalmente en estimular el
desarrollo de los puntos de crecimiento laterales que se encuentran en el explante (Pierik,
1990).
2.9.1.3. Iniciación de brotes adventicios. Por este método es posible inducir la
formación de brotes adventicios en diversos órganos de la planta para lo cual se aísla in
vitro un explante de hoja, tallo, raíz, flor, etc., sin yemas o brotes preexistentes. Los brotes
adventicios pueden desarrollarse ya sea en forma directa, en el mismo explante o
indirectamente en masas no organizadas de tejido de callo (Pierik, 1990).
2.9.1.4. Cultivo de Callo. Pierik (1990) define el callo como un tejido fuertemente dividido
y más o menos indiferenciado, éste puede ser obtenido aislando in vitro tejidos, órganos o
embriones. El callo puede ser subcultivado in vitro sin formación de órganos o embriones,
pero es capaz de regenerar embriones somáticos o yemas adventicias.
La organogénesis en el cultivo de callo, consiste en la iniciación de tallos y raíces
adventicias a partir de masas de células, estas masas pueden desarrollar meristemoides
que en condiciones específicas darán inicio a los órganos. Por otra parte, la
embriogénesis es la formación de embriones individuales a los que se les ha llamado
13
embrioides o embriones somáticos, los cuales pueden ser producidos directamente
(embriogénesis directa), en el que se utilizan como explantes, tejidos que de inmediato
son capaces de producir embriones somáticos, como son tejidos nucleares de plantas
poliembriónicas, óvulos o embriones inmaduros; la otra forma de producir embriones
somáticos es la embriogénesis indirecta, en la que se utiliza un estado intermedio del
desarrollo de callo o un cultivo de suspensión de células (Pierik, 1990)..
2.9.1.5. Cultivo de células individuales y protoplastos. Estos al igual que los cultivos
de callo, constituyen un paso preliminar para la regeneración de plantas completas (Pierik,
1990).
El cultivo de células vivas libres puede ser obtenido por la transferencia de los callos a un
medio líquido. La disociación de células es activada por la continua y vigorosa agitación.
Algunas veces solamente se necesita la modificación de la composición de nutrientes,
incrementando la concentración de las sales y auxinas. Las células del cultivo en
suspensión son extremadamente variables en forma, tamaño, son genéticamente
inestables y eventualmente predomina la poliploidia (Murashige, 1979).
En cuanto al cultivo de protoplastos, la pared celular produce problemas de manipulación
que no se tienen con células animales. Por ello al remover enzimáticamente la pared para
exponer la membrana, se posibilita el cultivo de protoplastos, con lo que se hace posible
la fusión celular y la inserción de macromoléculas y a partir de esto se pueden recuperar
las células y en algunos casos regenerar la planta completa (Murashige, 1979).
2.9.2. El cultivo in vitro como método de propagación de cactáceas
El cultivo in vitro como método de propagación, permite producir cantidades grandes de
plantas a partir de pocos explantes, por esto facilita la propagación en el caso de que la
población de la especie sea pequeña. Además, reduce el ciclo de cultivo
considerablemente y promueve la precocidad favoreciendo el florecimiento temprano, otra
ventaja es que reduce la mortalidad que se presenta en lo primera fase del desarrollo
cuando se parte de semilla. Con este método es posible mantener reservorios de
cuantiosas plantas en áreas relativamente pequeñas de un laboratorio y reduce la
necesidad de tener que intervenir las áreas naturales para obtener plantas madre; por otra
parte, ya que se trata de un cultivo en condiciones asépticas facilita el movimiento del
14
material vegetal entre distintas zonas geográficas sometidas a regulaciones sanitarias,
eliminando procesos cuarentenarios (Sánchez, 1993).
Los problemas causados por aspectos fisiológicos surgen cuando se usan plantas
maduras, debido a que la edad está directamente relacionada con el éxito del cultivo in
vitro. La reversión de un estatus adulto al juvenil es muy poco frecuente aunque en
algunas plantas es posible mediante la aplicación de reguladores del crecimiento, injertos,
etc. (ASPAC, 1988).
La contaminación in vitro es un problema frecuente, la cual puede ser a causa de
bacterias, hongos y por micoplasmas (Schaffner, 1979). Puede provenir del equipo usado
(envases, jeringas, etc.), del material (soluciones, agua, antibiótico, tejido, etc.) y del
ambiente (Ozawa, 1979). Las dos primeras fuentes de contaminación pueden controlarse
con un eficiente sistema de esterilización, sin embargo, lo último puede representar un
problema mayor, dado que, durante el largo periodo de crecimiento en campo las plantas
son continuamente expuestas a numerosas contaminaciones, lo que provoca que la
desinfestación pueda ser muy difícil, algunas opciones para disminuir este problema,
pueden ser los pretratamientos del material en el campo, la incorporación de antibióticos
al medio, etc., complementando los procedimientos usuales de desinfestación; no
obstante, la respuesta depende mucho de la especie y de la situación del campo (ASPAC,
1988).
El problema de contaminación es reportado en cactáceas por Johnson y Emmo (1979a),
quienes lo mencionan como un problema muy serio, ya que es provocado en altos niveles
por patógenos internos y externos, los cuales no logran ser controlados con el proceso
previo de desinfestación.
Existen muchas metodologías para llevar a cabo el proceso de desinfestación pero, de
forma general se realiza de la siguiente forma, primero hay que eliminar las espinas
presentes en la planta, después lavarlas con agua y jabón para eliminar polvo y tierra que
pudiesen tener, enseguida someterlas a una solución desinfectante, después enjuagarlas
y colocarlas en una solución de antioxidante o una solución de hipoclorito y finalmente
enjuagarlas para tenerlas listas para la obtención de los explantes. Choreño (2001)
menciona el uso de Fungimicin 500®, ácido cítrico y ascórbico, además de etanol e
hipoclorito de calcio.
15
Otro problema también muy común es la oxidación de los tejidos que está relacionada con
la producción de fenoles y puede ser un indicador de la sensibilidad a trastornos físicos
(disección) y químicos (desinfestación), que cada especie presenta, aunque también se
sugiere que este fenómeno sea solamente la respuesta a la persistencia de alguna
infección fúngica o bacteriana (ASPAC, 1988). Una de las soluciones propuestas para el
combate de la oxidación, es la incorporación de antioxidantes o absorbentes al medio de
cultivo, manipulando la concentración de sales, dando un ambiente de cultivo que no sea
conductivo a las reacciones de oxidación o pretratando el explante por remojado en agua
destilada (ASPAC, 1988). Como ejemplos de estos antioxidantes o absorbentes
encontramos al acido ascórbico, vitamina C, el Pirogallol y el carbón activado;
compuestos que son frecuentemente adicionados al medio de cultivo (Manzo, 1995).
Kolar et al., (1976) encontraron que en Mammillaria woodsii después de
aproximadamente una semana de cultivo el color de algunos explantes cambiaba a café y
después son afectados con necrosis, en otros explantes el color verde cambió a rojo o a
diferentes tonalidades de violeta.
También se presenta la emisión de exudados de la superficie de corte, que puede causar
un problema en el manejo del explante y puede interferir en el proceso de esterilización de
la superficie (ASPAC, 1988). En algunas especies los exudados son inhibitorios para el
cultivo. En el cultivo de las cactáceas M. profilera y M. carmenae se liberaron algunas
sustancias que se difundieron en el medio de cultivo (Vyskot y Jara, 1984).
Otro problema es la pérdida del potencial morfogenético que se reporta muy comúnmente.
Pueden ser varias las razones de este problema, entre los cuales se menciona la
reducción de los niveles endógenos de hormonas, la contaminación sistemática del cultivo
con microorganismos y la presencia de gases inhibitorios.
La vitrificación de los tejidos también es un problema muy frecuentemente reportado y es
considerado como un desorden fisiológico que afecta a la planta en el curso de la
multiplicación vegetativa (ASPAC, 1988). La vitrificación aparece principalmente en
plantas que disponen de grandes cantidades de agua, como ocurre en los medios líquidos
o con bajas concentraciones de agar (Pierik, 1990). Debergh y Maene (1977) indican que
para combatir o minimizar la vitrificación, es conveniente usar altas concentraciones de
agar, bajas temperaturas de incubación, cultivos basales con mejor aireación, cultivos de
duraciones cortas y bajos niveles de citocininas (ASPAC, 1988).
16
2.9.3. Factores que influyen en el cultivo de tejidos
Para tener éxito en el cultivo de tejidos es importante considerar los factores que lo
afectan, de los cuales encontramos el medio de cultivo, el explante y las condiciones de
incubación, dentro de las cuales se pueden mencionar:
2.9.3.1. Medio de cultivo. Este es uno de los factores más relevantes, pues influye
directamente en el crecimiento y la morfogénesis de los tejidos ya que proporciona los
nutrientes esenciales para el crecimiento y desarrollo del explante. Además de proveer
carbohidratos y algunas substancias orgánicas como son las hormonas (reguladores del
crecimiento), vitaminas, etc.
2.9.3.2. Reguladores del crecimiento. Las hormonas o comúnmente llamadas
reguladores del crecimiento, son compuestos orgánicos sintetizados por las plantas
superiores que influyen sobre su crecimiento y desarrollo; generalmente actúan en un
lugar diferente de donde son producidas; aparte de las hormonas naturales, se han
desarrollado productos sintéticos que tienen actividades semejantes (Pierik, 1990).
En el cultivo in vitro los reguladores más recurridos son las auxinas y las citocininas, esta
predilección obedece al estudio realizado por Skoog y Miller en 1957, en el que afirman
que la proporción de auxinas y citocininas determina el tipo y grado de la organogénesis.
Las concentraciones de auxinas y citocininas requerida para producir la morfogénesis son
particulares para cada especie y por lo tanto deben determinarse los niveles requeridos
de estas hormonas para cada una de ellas.
En las cactáceas cultivadas in vitro, la concentración de auxinas en el medio tiene una
correlación directa con la formación de raíces (Ortiz y Vargas, 1995), pero las
concentraciones óptimas reportadas varían enormemente. Otro tipo de respuesta a la
aplicación de auxinas es la proliferación de callo (Cárdenas y Torres, 1994).
La aplicación de citocininas propicia la formación de brotes in vitro de cactáceas (Johnson
y Emmo, 1979b) y concentraciones altas tienen como respuesta la formación más rápida
de brotes (Ortiz y Vargas, 1995); pero Mauseth (1979) afirma que si las concentraciones
son muy elevadas (50 y 100 mg L-1) causan la muerte en los explantes.
17
Otros reguladores que se han aplicado, aunque de manera muy poco frecuente, son las
giberelinas, de las que la más usada es la AG3; cuando se usan estos reguladores es muy
importante tomar en cuenta su sensibilidad al calor, ya que pierden hasta un 90% de su
actividad biológica durante el proceso de esterilización. Específicamente en cactáceas,
Mauseth et al., (1975) observó que la aplicación de giberelinas también activa las areolas
meristemáticas, pero en esta ocasión produjeron espinas, además, menciona que las
concentraciones requeridas son muy altas (50 ppm).
2.9.3.3. Explante. Este es un fragmento de tejido u órgano que es removido de una planta
con el propósito de cultivarlo in vitro. El éxito en el cultivo de tejidos es influenciado por
factores inherentes al explante, entre los más importantes tenemos, el genotipo, la edad
fisiológica de lo planta donadora, el tejido u órgano del cual fue extraído, las condiciones
de crecimiento y el estado sanitario de la planta donadora, el tamaño del explante y el tipo
de lesión (Pierik, 1990).
2.9.3.3.1. Edad fisiológica. La edad fisiológica de la planta que provee el explante influye
en el tipo y la extensión de la morfogénesis, los tejidos embrionarios tienen una alta
capacidad regenerativa y conforme una planta envejece su capacidad regenerativa tiende
a disminuir (Pierik, 1990).
Vyskot y Jara (1984), afirman que en cactáceas es recomendable usar como plantas
donadoras, aquellas plantas jóvenes de 2 o 3 años de edad, las cuales no hayan formado
tejido muy compacto lo que permite la manipulación en los cortes del explante y que no
pueda influir negativamente en su habilidad regenerativa.
2.9.3.3.2. Tejido u órgano del que se extrajo. Los tejidos internos de las plantas difieren
en su grado de diferenciación y de esta forma en su habilidad para sufrir morfogénesis.
Los tejidos capaces de producir embriogénesis son muy limitados y además varían de
tejido a tejido y de una especie a otra; aunado a esto, las células vegetales pueden perder
la capacidad embriogenética pero retener la habilidad para formar órganos.
Los explantes en cactáceas se han obtenido de la parte aérea de la planta, esto es, de la
zona originada a partir del epicótilo; en algunos trabajos se reportan intentos de obtener
callo a través del cultivo de raíz pero según Cárdenas y Torres (1994) y Minocha y Mehra
(1974) esto no fue posible; por otro lado este último autor menciona haber tenido
formación de callo a través del cultivo de partes florales.
18
2.9.3.3.3. Condiciones de crecimiento y estado sanitario de la planta donadora. Las
plantas cultivadas expuestas a las condiciones ambientales naturales y a los
microorganismos, presentan respuestas diferentes a aquellas que hayan crecido en
invernadero, que en general están más etioladas y regeneran con más facilidad (Pierik,
1990) y las que se desarrollaron in vitro, se encuentran adaptadas a estas condiciones y
están libres de patógenos tanto internos como externos. Las condiciones de cultivo
influyen directamente en el estado sanitario de la planta donadora y según Pierik (1990)
menciona que existe más posibilidad de éxito en el cultivo in vitro, si la planta tiene un
buen estado de salud en el momento del aislamiento. Al elegir los individuos donadores,
se deben de tomar los más sanos como material experimental ya que esto repercute
directamente sobre el porcentaje de infección después del aislamiento.
Solórzano (1989) menciona que específicamente para cactáceas, las plantas etioladas y
las que provienen de invernadero son las que tienen mejores resultados; sin embargo no
siempre es posible obtener plantas de estas condiciones y en la mayor parte de las
investigaciones se reporta haber usado plantas obtenidas de condiciones ambientales
naturales. En cualquiera de los casos, es recomendable realizar algún tratamiento de
desinfestación del material vegetal para disminuir la contaminación que se presente en el
cultivo in vitro. Estos tratamientos de desinfestación varían mucho dependiendo de la
especie que se trata y del grado de contaminación que ésta presente.
2.9.3.3.4. Tamaño del explante. Por regla general se dice que explantes muy pequeños
tienen un bajo porcentaje de sobrevivencia in vitro (Conger, 1980), esto se explica porque
cada fracción aislada de una planta tiene su propia proporción de reservas y hormonas y
es obvio que cuanto mayor sea el fragmento vegetal, más fácil es inducir el crecimiento y
la regeneración (Pierik, 1990).
Mauseth et al., (1975) mencionan que el tamaño del explante influye directamente en la
velocidad, la producción y el crecimiento de los órganos desarrollados a partir de la
aplicación de alguna hormona, pues aunque el tejido del explante no es necesariamente
indispensable para la respuesta, si contribuye para su posterior desarrollo y crecimiento.
Otro factor importante que se debe tomar en cuenta en el tamaño del explante es la
proporción entre superficie herida e intacta, pues puede influir en la regeneración(Pierik,
1990).
19
En lo que se refiere al tamaño de los explantes en cactáceas, Graifon y Fay (1990)
afirman que el tamaño de los explantes usados para el cultivo in vitro es muy variado y
depende mucho de la estructura de la cactáceas y propone que los explantes sean tan
grandes como sea posible, para que al esterilizar la superficie, el daño al tejido sano sea
mínimo y sugieren que en las cactáceas con las areolas muy espaciadas, los explantes
deben ser tomados con varias areolas y 3 mm del tejido circundante, y en Mammillaria y
otros géneros con las areolas muy poco espaciadas, removerlas con tanto tejido
circundante como sea posible, haciendo un corte vertical en el tejido, cuidando de no
atravesar tejido útil y dividirlo después en pequeñas piezas. Por otro lado, Mauseth
(1979a) afirma que pequeñas porciones de tejido son suficientes para proveer yemas
axilares.
2.9.3.3.5. Lesión. En la obtención de los explantes, se debe tener en cuenta el efecto que
puede tener la superficie de tejido lesionada; Pierik (1990) menciona que un aumento en
la superficie lesionada, aumenta también la posibilidad de absorción de nutrientes y
reguladores, aumentando simultáneamente la producción de etileno; al mismo tiempo, las
heridas o lesiones pueden romper barreras de tipo anatómico en los explantes y facilitar la
formación de raíces adventicias.
Mauseth et al., (1975) asentó que el efecto de una incisión fresca puede ser el de alterar
el metabolismo del explante posiblemente por la promoción de la división celular o que
simplemente la nueva herida abre el camino para el libre movimiento de los nutrientes en
el explante.
2.9.3.4. Condiciones de Incubación. Debergh y Read (1991) definen el ambiente de
cultivo como el resultado de las interacciones entre el material de la planta (que está
determinado por el medio de cultivo), el contenedor y el ambiente externo del cuarto de
cultivo. En cuanto a este último, generalmente los cultivos de tejidos son incubados en
cuartos provistos con estantes para colocar el cultivo y controles de temperatura y luz
(Murashige, 1979).
2.9.3.4.1. Iluminación. La luz juega un papel critico en el proceso de inducción de
organogénesis in vitro (Murashige, 1979). Los efectos de la luz pueden estar
determinados por el fotoperiodo, la intensidad lumínica y la longitud de onda; uno o más
de estos factores cubren los requerimientos morfogéneticos de los cultivos in vitro. Para el
cultivo in vitro de cactus Minocha y Mehra (1974) proponen usar como fuente luminosa
20
una mezcla de lámparas fluorescentes e incandescente, otros investigadores optaron por
usar como fuente lumínica solamente lámparas de luz fluorescente.
2.9.3.4.1.1. Fotoperiodo. Los efectos del fotoperiodo son muy diversos y varían entre
“taxas”, además son influenciados por los niveles endógenos de hormonas. Pierik (1990)
afirma que en principio el fotoperiodo requerido in vitro, será el mismo que el requerido
por la especie in vivo. El fotoperiodo más comúnmente usado en cactáceas es de 16
horas luz y 8 horas oscuridad.
2.9.3.4.1.2. Intensidad lumínica. La intensidad lumínica óptima para cada tejido en
cultivo, puede diferir por si mismo de los requerimiento de la planta a la que pertenece
(Murashige, 1974). Generalmente se eligen irradiaciones bajas, ya que se asume que la
fotosíntesis in vitro esta limitada por la concentración de C02 y existe un suministro
externo de carbohidratos, sin embargo, una irradiación demasiado baja no puede ser
compensada por la adición de azúcar (Pierik, 1990). Las intensidades altas que
habitualmente se producen en campo abierto, son casi sin excepción dañinas para el
cultivo in vitro, esto se explica por las altas temperaturas que se producen en el recipiente
como resultado de la irradiación, lo que comúnmente se conoce como efecto invernadero
(Pierik, 1990). En cuanto a este factor, Dabekaussen et al., (1991) encontraron que la
irradiación en el cuarto de incubación no influye en el número o en el peso de los cactus,
sin embargo, sí se observa una fuerte influencia en la forma del cactus, bajas
irradiaciones (1.3 W/m2) causa alargamiento y un color verde claro en las cactáceas,
mientras que altas irradiaciones (8 W/m2) resulta en cactáceas pequeñas, compactas y
con un color verde oscuro; concluye que la radiación optima para la activación de las
areolas esta situada entre 2.3 y 5 W * m2.
2.9.3.4.1.3. Longitud de onda. La longitud de onda induce e inhibe gran cantidad de
eventos en la planta, estos han sido de interés científico desde 1900 y obedecen a que
muchos efectos morfogenéticos son controlados por el fitocromo, que es un ubicuo
pigmento de la planta que tiene una absorción máxima de 660 nm. La respuesta
morfogenética a una longitud de onda específica, es muy común en el reino vegetal y por
esta razón, no es extraño que se observe también en el cultivo in vitro. En forma general,
se puede afirmar que la luz blanca inhibe la formación de raíces adventicias y promueve
la formación de vástagos adventicios; el sistema de luz roja e infrarroja promueve la
formación de raíces y vástagos adventicios; la luz UV presenta un efecto inhibitorio en la
formación de vástagos adventicios (Pierik, 1990). Murashige (1979) recomienda usar
21
lámparas con emisiones relativamente altas en las regiones azul y roja para lo
propagación clonal, mientras que Pierik (1990) citando a Scheider-Moldricks (1983),
afirman que los mejores resultados se obtienen mediante el uso de lámparas que
proporcionen relativamente altas emisiones de luz roja-anaranjada.
2.9.3.4.2. Temperatura. La temperatura puede influir en eventos de tipo morfogénico
(Conger, 1980). La temperatura in vitro debe simular tanto como sea posible a la que tiene
el cultivo en su hábitat natural y se deben incluir las variaciones diurnas y estacionales
(Murashige, 1979), teniendo en cuenta que la temperatura en los tubos de ensaye es 3 o
4°C mayor que en la cámara de incubación. Pierik (1990) afirma que la temperatura
óptima in vitro es generalmente 3 o 4°C mayor que la correspondiente para el crecimiento
in vivo. En cactáceas la temperatura usada va de 20°C (Starling, 1985) hasta 28°C (Ortiz
y Vargas, 1995), pero en general el rango más frecuente es de 23 a 27°C. Debekaussen
et al., (1991) encontraron que a elevadas temperaturas se incremento la formación de
callo.
22
3. JUSTIFICACION
México representa uno de los principales países con mayor diversidad vegetal en el
mundo misma que ha sido sobre-explotada por las grandes potencias, que comúnmente
llegan para apropiarse y hacer uso de todos los recursos naturales.
Dentro de este sinfín de especies vegetales encontramos a las cactáceas, las cuales han
generado un creciente interés como plantas ornamentales de interior, especialmente las
que se encuentran en la norma NOM-ECOL-059-1994, que determina las especies y
subespecies de flora y fauna silvestres terrestres y acuáticas en peligro de extinción,
amenazadas, raras y las sujetas a protección especial y que establece especificaciones
para su protección.
Una de las especies endémicas que se encuentra en peligro de extinción de acuerdo a
esta norma es Cephalocereus senilis (viejito); catalogada así debido a que ha sido
sometida a una grave sobre explotación y a un saqueo inmoderado de su hábitat llegando
a dejar la superficie sin ningún ejemplar que pudiese ser fuente de su propia propagación.
Cabe mencionar que esta planta es hogar de diferentes especies animales dentro del
hábitat, por lo que si extinguimos esta especie vegetal perderíamos no sólo una planta
sino también una fuente de material genético así como una especie rara en el mundo.
Lo anterior, hace necesario buscar alternativas para la reproducción o propagación
masiva de esta especie y una buena opción resulta ser la micropropagación o cultivo in
vitro que representa un método eficiente para obtener un gran número de plantas con el
fin de propiciar un aprovechamiento racional y eficiente, evitando así la sobreexplotación
de las poblaciones.
23
4. OBJETIVOS
4.1. Generales
1. Desarrollar y establecer una metodología eficiente de propagación in vitro de
Cephalocereus senilis.
2. Obtener plantas de calidad in vitro
4.2. Específicos
1. Establecer la metodología apropiada para la desinfestación y siembra de los
explantes de Cephalocereus senilis.
2. Determinar las características de grosor de médula y tamaño del explante más
apropiado para la obtención de brotes in vitro de Cephalocereus senilis.
3. Determinar la posición más adecuada del explante (basal, medio y apical) para la
obtención de brotes in vitro de Cephalocereus senilis.
4. Evaluar el efecto del Ácido Giberélico ( AG3) en el crecimiento de los brotes in vitro
de Cephalocereus senilis
5. HIPÓTESIS
El uso de diferentes protocolos de desinfestación ayudará al establecimiento del cultivo in
vitro de Cephalocereus senilis.
El grosor de la médula y el tamaño del explante afectarán la obtención de brotes in vitro
de Cephalocereus senilis.
El origen de los explantes afectará la formación de brotes en Cephalocereus senilis.
El uso de Bencil Adenina y Ácido Giberélico afectarán la formación y desarrollo de brotes
de Cephalocereus senilis
24
6. MATERIALES Y METODOS
6.1. Lugar de realización: Laboratorio de Biotecnología, Sección Cultivo de Tejidos del Departamento de
Preparatoria Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo
6.2. Periodo:
Marzo del 2005 a Mayo del 2006
6.3. Material vegetal: Plantas de 1.5 - 2 años, provenientes del mercado de flores de Cuemanco, México, D. F.
6.4. Establecimiento de la fase experimental 6.4.1. Unidad experimental: Un explante por frasco
6.4.2. Número de repeticiones:
Cuadro 2. Número de repeticiones por explante
Medio de cultivo Repeticiones
MS + BA 8 6.4.3. Tipos de explante:
Cuadro 3. Simbología
Símbolo Explante
A Apical
M Media
B Basal
6.5. Preparación de medios de cultivo
El medio de cultivo base para la experimentación es el Murashige y Skoog (1962) (MS)
adicionado con bencil adenina, carbón activado y Pirogallol.
25
6.5.1. Formulación del medio de cultivo Cuadro 4. Componentes y concentraciones del medio de cultivo MS
COMPUESTO FÓRMULA CONCENTRACIÓN (mg L-1)
MACROELEMENTOS Nitrato de Amonio NH4NO3 1650 Nitrato de Potasio KNO3 950 Cloruro de Calcio CaCl2 . 2H2O 660
Sulfalto de Magnésio MgSO4 . 7H2O 370 Fosfato Ácido de Potasio KH2PO4 170
MICROELEMENTOS Ioduro de Potasio KI 0.83
Ácido Bórico H3BO3 6.20 Sulfato de Manganeso MnSO4 . H2O 16.90
Sulfato de Zinc ZnSO4 . 7H2O 8.60 Molibdato de Sódio Na2MoO4 . 2H2O 0.25
Sulfato Cúprico CuSO4 . 5H2O 0.025 Cloruro de Cobalto CoCl2 . 6H2O 0.025
SOLUCIÓN DE HIERRO Sulfato Ferroso FeSO4 . 7H2O 13.9
Ac. Etilen-Dinitriloto-Tracetato Disoico Na2 EDTA 18.62 VITAMINAS
TIAMINA HCl -- 0.4 Myo-Inositol -- 100
Cuadro 5. Componentes y concentraciones de los suplementos del medio Murashige y
Skoog
COMPUESTOS CONCENTRACIÓN (mg L-1)
Bencil-Adenina 1.125
Sacarosa 30000
Carbón Activado 500
Pirogallol 12.6
Agar 6500
El medio de cultivo se ajustó a un pH de 5.7 ± 0.1 y se vació un volumen de 10 ml en
frascos de 50 ml de capacidad.
26
6.6. Desinfestación de las plantas Con una navaja se cortó la ).
base del tallo eliminando las raíces (Figura 2
Figura 2. Eliminación de las raíces de las plantas
Las espinas y vellos ndo cuidado de no
Las plantas se lavaron durante 15 minutos para eliminar restos de vellosidades y tierra
idades de la planta se cortaron con tijeras tenie
dañar el tejido (Figura 3).
Figura 3. Eliminación de las espinas
que pudiesen tener (Figura 4).
Figura 4. Lavado de las plantas
27
Lavadas las plantas se pasar te 10 minutos con agitación
espués se colocaron en una solución desinfectante (Cuadro 6) durante 20 minutos para
Cuadro 6. Componentes de l
centración
on a una solución jabonosa duran
constante para eliminar también restos de tierra que hayan quedado del paso anterior
(Figura 5). El material se lavó tres veces con agua destilada para eliminar restos de jabón.
Figura 5. Lavado con solución jabonosa
D
eliminar contaminantes (Figura 6).
Figura 6. Solución desinfectante
a solución desinfectante
Compuesto Con
Captán 1 g L-1
Tecto 60 1 g L-1
Microdyn 1 0 gotas
ranscurrido el tiempo en la solución, se enjuagaron con agua destilada tres veces. T
28
Después, se colocaron en una solución de hipoclorito de sodio al 5 y 10% (v/v) más 3
0% (v/v)
nseguida, se colocaron en una solución de peróxido de hidrogeno al 10 % (m/v) durante
% (m/v)
erminado el proceso, las plantas se mantuvieron en una solución antioxidante (Cuadro
uadro 7. Componentes de la solución antioxidante
centración (mg L-1 )
gotas de Tween 20 durante 25 minutos (Figura 7). Transcurrido el tiempo se enjuagaron
las plantas con agua destilada estéril tres veces.
Figura 7. Solución de hipoclorito de sodio al 5 -1
E
30 minutos (Figura 8). Transcurrido el tiempo se enjuagaron con agua destilada estéril
tres veces.
Figura 8. Solución de peróxido de hidrógeno al 10
T
7) para disminuir la oxidación de los tejidos antes de la siembra (Figura 9).
C
Compuesto ConÁcido cítrico 150
Á cido ascórbico 100
29
Figura 9. Solución antioxidante
6.7. Obtención y siembra de los explantes Terminada la desinfestación obtuvieron los explantes, para esto se dividió a la planta en
tres, la parte basal, parte media y la apical (Figura 10),
MEDIO
BASAL
APICAL
Figura 10. Tipos de explantes a obtener de las plantas para sembrar in vitro
30
Para obtener los explantes que se sembraron in vitro fue necesario fraccionar las
plántulas en las tres partes: apical, media y basal. Cada fragmento debió de contar con 4
a 5 areolas (Figura 11) y durante cada disección se agregó solución antioxidante.
Figura 11. Obtención de los explantes basal, medio y apical.
Una vez que se obtuvieron los explantes con las características deseadas, se sembró un
explante por frasco (Figura 12).
Figura 13. Frascos en oscuridad
Figura 12. Siembra de explantes in vitro
Terminada la siembra, los frascos se colocaron en una incubadora con oscuridad durante
20 días a una temperatura de 25°C. Este proceso se hizo para disminuir la oxidación
(Figura 13).
31
Transcurrido el tiempo en os e colocaron en el cuarto de
Figura 14. Fr
.7.1. Parámetros de evaluación
Se ros que corresponderían a un porcentaje de oxidación (Cuadro 8).
ión
curidad, los frascos sembrados s
incubación a 16 horas de luz por 8 de oscuridad con una intensidad lumínica de 69 µM m-2
s-1 (Figura 14).
ascos expuestos a la iluminación del cuarto de incubación.
61) Oxidación
asignaron núme
Cuadro 8. Relación entre número y porcentaje de oxidación.
Numero Porcentaje de oxidac
0 Sin oxidación
1 Hasta 25 % de tejido oxidado
2 Hasta 50 % de tejido oxidado
3 D el 50 al 75 % de tejido oxidado
4 Del 75 al 90 % de tejido oxidado
5 Del 90 al 100 % de tejido oxidado
) Contaminación
Se je de incidencia de hongos y bacterias.
3) Número de brotes por explante
Se io o basal) genera el mayor número de brotes.
4) Velocidad de aparición de los brotes
Una vez sembrados los explantes en el medio de cultivo se evaluó cual de ellos daría más
rápidamente respuesta en la formación de brotes, por lo que se hicieron observaciones
periódicas a partir de la fecha de siembra para ver su respuesta.
2
determinó el porcenta
determinó qué explante (apical, med
32
6.8. Establecimiento de las características del explante Debido a que no se contaba con las características óptimas de los explantes para realizar
se realizaron los siguientes
xperimentos:
lante
SIEMBRA GROSOR DE MÉDULA (cm.) TAMAÑO DEL EXPLANTE (cm2)
su siembra (grosor de la médula y tamaño del explante)
e
Cuadro 9. Experimentos para determinar la relación entre el Grosor de la médula y el
Tamaño del exp
1 0.2 1.0
2 0.5 1.5
3 0.8 2.0
6.9. Utilización de un nuevo método de desinfestación
ebido a los altos porcentajes de contaminación y oxidación en la siembra in vitro fue
n.
mos ver existen diferencias
n cuanto a los componentes y las concentraciones utilizadas (Cuadro 10).
PROTOCOLO 1 PROTOCOLO 2
D
necesario desarrollar un nuevo tratamiento de desinfestació
Denominamos protocolo 1 al tratamiento que le veníamos dando a las plantas para
desinfestarlas y protocolo 2 al nuevo tratamiento, como pode
e
Cuadro 10. Diferencia de tratamientos para la desinfestación de las plantas
Compuesto Concentración Compuesto Concentración
Captan 1 g L-1 Captan 1 g L-1
Tecto 6 g L-1 Fungymi g L-10 1 cin 1
Mycrodin 10 gotas L-1 Phyton 2 ml L-1
Cloro 5 % (v/v) Mycrodin 10 gotas L-1
Per 2) 10 % (m/v) óxido (H2O Timsen 1 g L-1
Cloro 10 % (v/v)
Pe 2) róxido (H2O 10 % (m/v)
33
Cabe señalar que el protocolo 1 fue tomado como ba ido a los exp ntes
desarrollados con cactáceas en el laboratorio a y el fue
esarrollado teniendo como base lo encontrado para la eliminación de contaminación in
onsistió en pasar los brotes obtenidos in vitro a un medio de cultivo fresco, para obtener
de crecimiento.
e menor tamaño al medio de cultivo MS con Ácido
iberélico (AG3) a diferentes concentraciones (Cuadro 11).
MEDIO DE CULTIVO CONCENTRACIÓN -1)
se deb erimentos a
de biotecnologí protocolo 2
d
vitro en orquídeas.
6.10. Subcultivos
C
una mejor respuesta
1) Homogenización del tamaño de los brotes
Se realizó el trasvase de los brotes d
G
Cuadro 11. Tratamientos para la homogenización de los brotes
DE AG3 (mg LMS 1
MS 2
MS 3
.10.1. Parámetros de evaluación
1) Altura y diámetro de los brotes
ase a la punta del brote una regla de 30 cm y el
iámetro con un Vernier para observar el efecto de la concentración del AG3 en los brotes
trat
eterminó tomando en consideración el incremento en altura y diámetro de los
rotes a partir de la fecha en que empezaron a crecer.
6
La altura se evaluó midiendo de la b
d
ados.
2) Velocidad de crecimiento
Ésta se d
b
34
6.11. Enraizamiento
Después de haber sido subcultivados los brotes se procedió a enraizarlos. El medio de
ultivo designado para este proceso fue el Murashige y Skoog al 100% adicionado con
llol, sacarosa y agar (Cuadro 12).
TRACIÓN
c
carbón activado, Piroga
Cuadro 12. Relación de componentes y concentración para el medio de enrraizamiento
COMPONENTES CONCEN
Medio MS 100 %
Carbón Activado 0.5 g L-1
Pirogallol 0.0126 g L-1
Sacarosa 30 g L-1
Agar 6.5 g L-1
35
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1. Establecimiento de las características del explante De los experimentos mencionados en el apartado 6.8 se evaluó el porcentaje de
contaminación por hongos y bacterias y el porcentaje de oxidación, dando como resultado
la siguiente grafica:
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0.2 0.5 0.7
GROSOR DE MÉDULA (cm)
POR
CEN
TAJE
% HONGOS % BACTERIAS % OXIDACIÓN
Figura 15. Relación de porcentajes de contaminación por hongos, bacterias y oxidación
de acuerdo al grosor de médula.
Podemos observar en la Figura 16 el tipo de contaminación y oxidación que se presentó
durante el establecimiento in vitro de Cephalocereus senilis.
36
Figura 16. A) Contamina y C) Tejido
mos observar en la Figura 15, el porcentaje de contaminación por hongos en
o el menor comparado con los
donde se obtuvo un porcenta 23.8 y 16.67 respectivamente para los
con el porcentaje de contaminación por bacterias en
nto el valor de 30.43 % siendo este el más alto, el valor más bajo lo obtuvo el
de 0.7cm con un 23.63% y un valor intermedio el grosor de
(1995) los porcentajes de contaminación encontrados durante la
A) B)
C)
ción por hongos, B) Contaminación por bacterias
oxidado
Como pode
los explantes con un grosor de 0.5 cm. fue de 8.70% siend
otros 2 en je de
grosores de 0.2 y 0.7 cm., no así
donde prese
0.2cm con un 26.20%.
De acuerdo con Manzo
realización del proyecto de “micropropagación de viejito a partir de la activación aureolar”
no pudieron disminuir de un 80%, de modo que comparando este valor con los resultantes
de nuestro experimento encontramos una diferencia de 30, 40.87 y 39.70 %
respectivamente para cada una de las tres siembras realizadas; por lo que podemos decir
que son aceptables.
37
Por posteriores experimentos pudimos darnos cuenta que la posible fuente de
or de médula de 0.7cm con 14.81% seguido por el grosor de 0.5cm
on un 15.22 % y por ultimo tenemos a los explantes con 0.2 cm. de grosor con un 38.1%,
crosis, por el
ontrario, si utilizamos un grosor y un tamaño mas grande el porcentaje de oxidación se
Figura 17. Relación del porcentaje de brotes con el grosor de médula
contaminación se encuentra en las areolas, debido a que en la base de éstas se produce
una pequeña cámara de aire al sumergirlas en las soluciones desinfestantes, por lo que
no se pueden eliminar los microorganismos presentes en estas estructuras.
Ahora bien, el menor porcentaje de oxidación encontrado de acuerdo a la Figura 16 nos
lo proporciono el gros
c
dichos resultados se pueden referir a los tamaños de los explantes utilizados que fueron
de 2.0, 1.5 y 1.0 cm2 respectivamente para cada una de las siembras. De modo que si
utilizamos un grosor de 0.2 cm. y un tamaño de 1.0 cm2 tendremos una alta oxidación
debido a que el tejido es muy pequeño y se encuentra muy expuesto a la ne
c
ve disminuido.
7.2. Formación de brotes en explantes
BASAL MEDIO APICAL
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0.2 0.5 0.7
GROSOR DE MÉDULA (cm)
% B
RO
TAC
IÓN
38
Figura 18. Brotes de acu
A) Basal, B) Medio, C) Apical y D) Formación de callo
médula de 0.2cm encontrados para la parte basal y la media fu
resultados se debieron a que éstas se contamin
el porcentaje de brotes fue de 4.8%, esto se atribuye al peq
y de grosor de médula.
a de 0.5cm se observaron los más altos valores en el porcentaje
de brotes para las partes basal, media y apical, con un 9.5, 4.8 y 14.3% respectivamente.
encontraron
media y apical de 2.4%, 4.8% y 4.8%
los explantes desarrolla o
aumentado y el porcentaje de brotes disminuido.
A) B)
C) D)
erdo al tipo de explante:
Como podemos observar en la Figura 17, el porcentaje de brotes para el grosor de
e de cero; dichos
aron por completo, pero en la parte apical
ueño tamaño de los explantes
Para el grosor de médul
En cuanto al grosor de 0.7cm se valores de brotación para la parte basal,
respectivamente, estos valores se debieron a que
ron demasiado callo y por ende el tiempo de brotacion se vi
39
De modo que la mejor respuesta en la formación de brotes se dio en la segunda siembra
n donde se obtuvo un valor de 28.6 % con respecto a los tres explantes sembrados,
abe recordar que este explante tenia un tamaño de 1.5 cm2 y un grosor de 0.5 cm.
horeño (2001), menciona que la activación aureolar y la formación de brotes se dio en
generaron de la siembra de semillas in
vitro, las cuales se uesta,
o así los explantes que procedían de las plantas de vivero.
Adenina en una concentración de 10 mg L-1 tiene efectos positivos
n la activación areolar en Opuntia polycanta y que es posible que ésta actúe
e
c
C
los fragmentos obtenidos de las plántulas que se
seccionaron y después de 28 días de sembradas mostraron resp
n
Por los anteriores resultados se pudo decir que la concentración de Bencil Adenina de
1.125 mg L-1 fue adecuada para la activación de las areolas en los explantes sembrados
in vitro provenientes de plantas de vivero. Mauseth (1976) y Mauseth y Halperin (1975)
señalaron que la Bencil
e
directamente en el meristemo de la areola.
40
7.3. Velocidad de formación de brotes
na vez sembrados los explantes en el medio de cultivo se evaluó cual de ellos brindaría
una respuesta mas rápida a la formación de brotes, por lo que se hicieron observaciones
periódicas para ver la respuesta de los explantes. Dando como resultado la siguiente
grafica:
Figura 19. Porcentaje de aparición de brotes de acuerdo al grosor de médula
Como se puede observar en la Figura 19, el explante que tiene un grosor de médula de
0.2 cm es el que tuvo el tiempo más largo de aparición de formación de brotes, a los 53
días después de haber sido sembrados in vitro , esto se debe a que el tamaño en general
del explante es muy pequeño y estos deben primero gastar energía en mantenerse con
vida antes de comenzar con la formación de brotes, en comparación con el grosor de
médula de 0.5 cm en donde el inicio de la formación de brotes se dió a partir del día 28
después de su fecha de siembra; podemos decir que el resultado se debió a que el
tamaño de este explante fue mayor que el primero por lo que no tuvo mayor dificultad en
U
0.2 cm 0.5cm 0.7cm
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
DIAS
% D
E B
RO
TES
41
comenzar la formación de brotes ya que no gastó energía en mantenerse vivo y tampoco
asi tuvo formación de callo, por el contrario el grosor de médula de 0.7 cm inició la
onde se obtuvieron los valores más altos en cuanto a la formación de brotes y el valor
más p
c
formación de brotes en el día 40 a partir de su fecha de siembra, este retraso se debió a
que éste explante por su gran tamaño y grosor, gasto energía en la formación excesiva de
callo y no en la formación de los brotes.
Choreño (2001), menciona que la formación de brotes se dió en el día 28 a partir de la
fecha de siembra de los explantes, estos eran originarios de plántulas obtenidas de
semillas y no obtuvo resultados en la formación de brotes con los explantes provenientes
de plantas de vivero.
Podemos observar que al día 77 que fue el fin de la evaluación tenemos porcentajes de
aparición de brotes de 7.1, 30.25 y de 12.45 % respectivamente para el grosor de médula
de 0.2, 0.5 y 0.7 cm., por lo que es evidente que el mayor valor encontrado es el que
corresponde al grosor de médula de 0.5 cm. y un tamaño de 1.5 cm2, por lo que además
de iniciar antes la formación de brotes es en este mismo en donde tenemos el mayor
porcentaje de formación.
7.4. Utilización de un nuevo método de desinfestación
Debido a los altos porcentajes de contaminación y oxidación en la siembra in vitro fue
necesario desarrollar un nuevo tratamiento de desinfestación (descrito en el apartado 6.9).
Para realizar la comparación de los dos protocolos tomamos como tamaño de explante
1.5 cm2 y un grosor de médula 0.5 cm., debido a que con estas características fue en
d
equeño en cuanto a la oxidación de los explantes.
42
30
35
% HONGOS % BACTERIAS % OXIDACION
15
20
POR
CEN
TAJE
0
5
10
PROTOCOLO 1 PROTOCOLO 2
25
SIEMBRA
Figura 20. Relación de porcentajes de contaminación por hongos, bacterias y oxidación
tación.
o afecta en la contaminación por este agente. En la contaminación por
ales en el ámbito agrícola son
considerados Bactericida y Biocida respectivamente.
El porcentaje de oxidación total de los explantes se vio disminuido de 15.22 % en el
protocolo 1 a 2.1 % en el protocolo 2, esto se lo pudimos atribuir a que alguno o algunos
de los componentes funcionaron como antioxidantes, además, el protocolo 2 nos
representó una disminución de 24.65% en el porcentaje de perdidas, por lo que no se
tendrán tantas mermas por los problemas de contaminación y oxidación total utilizando
este nuevo protocolo.
de acuerdo al protocolo de desinfes
Como podemos ver en la Figura 20 el porcentaje de contaminación por hongos fue de 8.7
y 8.5 respectivamente para el protocolo 1 y el protocolo 2, por lo que el cambio de
protocolo n
bacterias existió una marcada disminución en el porcentaje de incidencia teniendo para el
protocolo 1 un valor de 30.43 % y para el protocolo 2 un valor de 19.1 %; dicho resultado
se lo pudimos atribuir al uso de antibióticos presentes en el protocolo 2, específicamente
al contenido en el Fungymicin y en el Timsen, los cu
43
7.5. Efecto del ácido giberélico Debido a que no todas las areolas existentes en los explantes brotarían al mismo tiempo,
es evidente que tendríamos brotes de mayor tamaño y otros de menor tamaño en un
mismo explante, por lo que fue necesario homogeneizar el tamaño de los mismos, para
esto se desarrollaron los experimentos descritos en el Cuadro 11. Para el desarrollo de
esta fase se utilizaron brotes de 0.7 a 1.0 cm de altura indistintamente si provenían de la
parte apical, media o basal.
lico en el crecimiento de los brotes
de Cephalocereus senilis
mento de 0.09 cm., como pudimos observar ésta concentración de
Control 1 mg 2 mg 3 mg
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
50
CR
ECIM
IEN
TO (c
m)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
DIAS
Figura 21. Efecto de la concentración de ácido giberé
Como podemos observar en la Figura 21, es la concentración de 3 mg L-1 de AG3 la que
proporcionó el mayor valor en el incremento de la altura con 0.32 cm al final del periodo
de evaluación, en seguida tuvimos a la concentración de 1 mg L-1 de AG3 en donde
encontramos un incremento en la altura de 0.28 cm y finalmente la concentración de 2 mg
L-1 de AG3 con un incre
44
ácido giberélico no tuvo influencia marcada en el desarrollo de los brotes in vitro al
rmino de la evaluación.
uy cercano al de 3 mg L-1, facilitó la asimilación de nutrientes
d
medios que contenían ácido gib s de 2 y 3 mg L-1 no formaron
íces al término del periodo de evaluación.
té
Comparando los resultados con el control, pudimos decir que al final, la concentración que
proporcionó un mayor incremento es la de 3 mg L-1 con un valor de 0.28 cm más que el
control, seguido por lo encontrado en la concentración de 1 mg L-1 con un incremento de
0.24cm; cabe mencionar que la concentración de 1 mg L-1 además de resultar en un
incremento de crecimiento m
al promover el enraizamiento de los brotes a los 23 días de haberse transferido al medio
de cultivo.
Clayton et al. (1990) mencionaron que al trabajar con 11 especies de cactáceas sus
brotes generaron raíces en un medio sin hormonas, y como podemos ver la concentración
utilizada en donde se presento la formación de raíces fue de 1 mg L-1 de AG3;
concentración que podría considerarse nula en el medio de cultivo, debido a los efectos
de desnaturalización por calor al momento de esterilizar el medio.
Choreño (2001) menciona que la formación de raíces en el cultivo in vitro de viejito, se dió
en los brotes que fueron transferidos a un medio de cultivo sin hormonas y que dicha
formación se dió a los 30 días después de la siembra.
Se observó que existe una influencia positiva en la formación de raíz de los brotes al
incorporar al medio de cultivo una concentración de 1 mg L-1 de AG3, dando como
resultado que a los 23 días se diera la aparición de éstas, en comparación con lo
reportado por Choreño (2001) en donde la formación se dió a los 30 días.
Cabe mencionar que la formación de raíces en el medio de cultivo control se dio a los 28
ías de haber sido transferidos a éste medio y que los brotes que se encontraban en los
erélico en concentracione
ra
45
8. CONCLUSIONES
• El medio de cultivo Murashige y Skoog, adicionado con 1.125 mg L-1 de Bencil
• El explante apical da mejores resultados en la obtención de brotes con un 14.3 %
xidación de 15.22 a un
2.1 %.
de AG3, en donde tenemos un
incremento de 0.28 cm en altura con respecto al control.
miento de los
brotes a los 23 días a partir de la fecha de siembra.
Adenina es adecuado para la siembra de explantes y obtención de brotes in vitro
de Cephalocereus senilis.
• El tamaño del explante (1.5 cm2) y el grosor de la médula (0.5 cm.) son los más
adecuados para la siembra y determinantes para la disminución de la oxidación y
la formación de brotes en Cephalocereus senilis.
a partir de plantas provenientes de viveros.
• El protocolo 2 de desinfestación es el más adecuado para la obtención de los
explantes de Cephalocereus senilis, ya que se disminuyó la contaminación por
bacterias de un 30.43 a un 19.1 %, además de reducir la o
• El mayor efecto en el crecimiento de los brotes in vitro de Cephalocereus senilis se
da utilizando la concentración de 3 mg L-1
• La concentración de ácido giberélico que proporciona las mayores ventajas es la
de 1 mg L-1 , dado que se observo un efecto positivo en el incremento de 0.24 cm
en altura con respecto al control, además de propiciar el enraiza
• Existe la formación de raíz en los explantes que fueron transferidos al medio de
cultivo que no contenía hormonas.
46
9. RECOMENDACIONE PARA EL TRABAJO
Deb
Cephal
de nue dologías, especialmente para la micropropagación, el
ontrol de la contaminación con peróxido de hidrógeno como agente de desinfestación, la
obt
directa
el esta la aclimatación o adaptación a
condiciones de invernadero.
S Y PERSPECTIVAS
ido a que no existe información suficiente en cuanto a la propagación de
ocereus senilis (viejito), se tiene un amplio campo para la investigación y desarrollo
vos procedimientos y meto
c
ención de un mayor porcentaje de brotes por explante ya sea por organogénesis
o indirecta, inducir la formación de brotes a partir de plántulas obtenidas in vitro y
blecimiento de las condiciones adecuadas para
47
10. BIBLIOGRAFIA
ASPAC. 1988. Cell and tissue culture in field crop improvement. Shutter Printing co.
Tsukuba, Japan.
Ault, J. R. y Blackmon, W. J. 1987. In vitro propagation of Ferocactus acanthodes
(cactaceae). HotScience 22(1):126-127.
Bravo H.H. 1978. Las cactáceas de México. Vol. 1. UNAM. México
Bravo, H. y Sánchez H. M. 1991. Las cactáceas de México. Vol. 3. UNAM. México.
Cárdenas, C. y Torres C. 1994. Micropropagación de cactáceas en la biotecnología de la
horticultura ornamental. México.
Choreño, T., J.M. 2001. Micropropagación de la cactácea Cephalocereus senilis (Haworth
Pfeiffer) mediante la activación de areolas. Tesis de Maestría. Colegio de Postgraduados.
México.
Corona, N. y Chávez, A. 1982. Cultivo de cactáceas en medio aséptico. Cact. Suc. Mex.
27:17-23.
Dabekaussen, M. A.; J. D. Pierick y Van der Laken. 1991. Factor afecting areole activation
in vitro in the cactus Sulcorebutia alba Rausch. Scientia Horticulturae (AMST). 46(3-
4):283-284.
Debergh, P y Maene, V. 1977. Rapid clonal propagation of pathogen-free Pelargonium
plants, starting from the shot tips and apical meristems. Symp. on Tissue Culture for
Horticultural Purposes. Acta Horticulturae. 14:335-345.
Debergh, P. y E. P. Read. 1991. Micropropagation. Kluwer Academic Publisher.
Netherlands.
Gratton, J y Fay, F. 1990. Vegetative propagation of cacti and other suculents in vitro. En J
Pollerd y J Walker. Methods in Molecular Biology &. Plant Cell and Tissue Culture. The
Humana Press.
Hughes, W. 1987. Ornamental sp Cloning agricultural plants via in
itro techniques. CRC Press. Florida USA
ino, E. 1979a. In vitro propagation of Mammillaria elongata. HortsCience
4(5):605-606
culture propagation in vitro in the cactaceae.
actus and Succulent Journal USA 51:275-277
olar, Z. Bartek, J. y Vyskot, B. 1976. Vegetative propagation of the cactus Mammillaria
vegetales en México. Compilacion CICY y CONACYT.
éxico. pp. 65-77.
igación, Departamento de Fitotecnia, Universidad Autónoma Chapingo.
a (Cactaceae). American Journal of Botanic 62:869-877
auseth, D. 1979. A new method for the propagation of cacti: sterile culture of axillary
morphogenetic investigations an
allus culture of Neomammillaria profilera Miller (Cactaceae). American Journal of botanic
ontaño, M., Vega, V. y Nolasco, H. 1993. Aspectos ecológicos y económicos de las
ecies. En B. Conger.
v
Johnson. L. y Em
1
Johnson. L. y Emino, E. 1979b. Tissue
C
K
woodsii. Craig, through tissue cultures. Experientia 32(5):668-669
Losoya, S. H. 1985. Micropropagación de especies herbáceas. En M. L. Robert; V. M.
Loyola (eds). El cultivo de tejidos
M
Manzo, A. 1995. “Micropropagación de viejito a partir de la activación aureolar”. Proyecto
de Invest
Mauseth, D. y Halperin, W. 1975. Hormonal control of organogenesis in Opuntia
polyacanth
Mauseth, D. 1977. Cactus tissue culture: a potencial method of propagation. Cactus and
Suculent Journal 49:80-81
M
bund. Cactus and Succulent Journal 51:186-187
Minocha, S. C. y Mehra, P. N. 1974. Nutritional and
c
61(2):168-173
M
cactáceas mexicanas. Cactus y Suculentas Mexicanas 37:89-92.
49
Murashige, T. 1974. Plant propagation through tissue culture. Annu, Rev. Plant Physiol.
25, 135-166.
Murashige, T. 1979. Plant tissue culture and its important to agricultura. En Maramorosch,
K., Hirumi, H. Practical tissue culture applications. Academic Press. E. U. A. 27-44 pp.
:473-497.
anas 40:41-46.
-92.
éxico. Compilacion CICY y CONACYT.
éxico. Pp. 21-26.
ico. 39 pp.
s. USA. 206 pp.
Murashige, T y Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid grownt and bioassay with
tobacco tissue culture. Physiology Plantarum, 15
Ortiz, M. y Vargas, M. 1995. Propagation in vitro de Heliocereus elegantissimusk (Britton y
Rose) var. elegantissimus (Cactaceae). Cactus y Suculentas Mexic
Ozawa, Y. 1979. Common problems in tissue culture work in developing countries. En
Maramorosch, K. e Hirumi, H. Practical tissue culture applications. Academic Press. USA.
52-55 pp.
Pierik, R. L. M. 1988. Handicaps for to the large scale commercial application of
micropropagation. Acta Horticulturae 230:63-71.
Pierik, R. L. M. 1990. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Mundi-Prensa. Madrid,
España. 326 pp.
Reyes, S. J. y Arias, M. 1995. Cactáceas de México: Conservación y Producción. Revista
Chapingo. Horticultura 3:85
Robert. M. L. 1985. Micropropagación de especies herbáceas. En M. L. Robert; V. M.
Loyola (eds). El cultivo de tejidos vegetales en M
M
Sánchez, M. E. 1993. Avances en la propagación in vitro de cactáceas. ITESM-Campus
Querétaro, Méx
Schaffner, P. C. 1979 Animal and plant tissue culture decontamination. En Maramorosch,
K. e Hirumi, H. Practical tissue culture applications. Academic Pres
50
Secretaria de Desarrollo Social (1994). Norma Oficial Mexicana (NOM-ECOL-059-94) que
determina las especies y subespecies de flora y fauna silvestres terrestres y acuáticas en
eligro de extinción, amenazadas, raras y las sujetas a protección especial y que
ico. Tezoyuca, Morelos. FIRA.
éxico. 29-33 pp.
cculent
ournal (US) 57:114-115.
Horticultural Science 59(3):449-452.
p
establece especificaciones para su protección. Diario Oficial de la Federación
CDLXXXVIII(10):2-25.
Solórzano, V. D. E. 1989. Micropropagación de Nopal. Memoria de la primera reunión
Nacional sobre Avances de la Micropropagación en Méx
M
Starling, R. 1985. In vitro propagation of Leuchteenbergia principis. Cactus and Su
J
Vyskot, B. y Jara, Z. 1984. Clonal propagation of cacto through axilary buds in vitro.
Journal of
51
11. ANEXOS Porcentaje de contaminación por hongos, bacterias y oxidación en relación con el grosor
del explante.
1° Siembra 2° Siembra 3° Siembra
GROSOR DE MÉDULA (cm.) PARÁMETROS
0.2 0.5 0.7
% Contaminación por hongos 23.8 8.70 16.67
% Contaminación por bacterias 26.2 30.43 23.63
% Oxidación total 38.1 15.22 14.81
% Perdida total 88.1 54.35 55.11
Relación del porcentaje de Brotes con el grosor de médula
1° Siembra 2° Siembra 3° Siembra
GROSOR DE MÉDULA (cm.) % DE BROTES
0.2 0.5 0.7
BASAL 0 9.5 2.4
MEDIA 0 4.8 4.8
APICAL 4.8 14.3 4.8
TOTAL 4.8 28.6 12.0
Porcentaje de aparición de brotes de acuerdo al grosor de médula
GROSOR DE MÉDULA (cm.) 0.2 0.5 0.7 DIAS
Porcentaje de aparición de brotes 0 0 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0 9 0 0 0
12 0 0 0 14 0 0 0 16 0 0 0 21 0 0 0 23 0 0 0 25 0 0 0 28 0 2.17 0 30 0 2.17 0
52
32 0 2.17 0 37 0 2.17 0 40 0 2.17 1.85 44 0 17.39 1.85 51 0 17.39 7.41 53 2.8 7421. 8.23 58 2.8 26.09 8.23 62 4.76 26.09 9.75 67 4.76 26.09 9.75 68 7.1 28.57 9.75 77 7.1 30.25 12.45
Relación de p inación por h , bacter idación erdo al
protocolo de de
Parámetro Protocolo 1 Protocolo 2
orcentaje de contam ongos ias y ox de acu
sinfestación.
% Contaminación por hongos 8.7 8.5
% Contaminación por bacte 30.43rias 19.1
% Oxidación total 1 15.22 2.
% Perdida total 54.35 29.7
Efecto de la concentración de Acido Giberélico en el crecimiento de los brotes de
Cephalocereus senilis.
CONCENTRACION DE ÁCIDO GIBERÉLICO
Control (0 mg L-1) 1 mg L-1 2 mg L-1 3 mg L-1DIAS
Altura (cm.) Altura (cm.) Altura (cm.) Altura (cm.)
0 0 0 0 0
9 0 0 0 0
16 0 0.17 0.02 15 0.
23 0.02 0.23 0.06 20 0.
31 0.02 0.24 0.07 23 0.
39 0.03 0.26 0.09 29 0.
46 0.04 0.28 0.09 32 0.
53
