PROTEÍNAS

Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos

¿Qué es un aminoácido?

¿Cómo se llama el enlace que une dos aminoácidos?

El DNA tiene 2 funciones

REPLICARSE TRADUCIRSE

Figura tomada de “LehningerPrinciples of Biochemistry” D.L. Nelson & M.M. Cox. Third Edition Worth Publishers.

TRANSCRIPCIÓN

TRADUCCIÓN

TRANSCRIPCIÓN

Transferencia de la información contenida en el DNA hacia una

secuencia de proteínas

ARNmARN Polimerasa

TRADUCCIÓN Se traduce el mensaje genético del DNA-RNAm-RNAt-Aminoácidos-Enzimas La información del RNAm se organiza en tripletesCODÓN

GUC AAU UCG CUGcodón 1

aa1

codón 2

aa2

codón 3

aa3

codón 4

aa4

¿Quién aporta los aminoácidos?

aa1 aa2 aa3 aa4

CODIGO GENÉTICO

UniversalEspecíficoContinuo Redundante

AUG Codón de inicio

Frecuencia de substituciones Anemia Falciforme

Evolución y diversidad de secuencias

Diversidad actual 10 millones de especies x 5,000 genes/especie ≈ 5 x1010 secuencias de proteína diferentes. Conocemos una pequeña fracción(6.7 x 107 secuencias)

Las proteínas son cadenas lineales de aminoácidos

Estructura secundaria

Es el plegamiento entre residuos de aminoácidos cercanos en la cadena polipeptídica.

Puentes de hidrógeno entre los grupos carbonilo (-CO) y los amino (-NH-)

Hélices Alfa Beta Plegada

Estructura Terciaria

Se denomina estructura terciaria de una proteína a la distribución tridimensional de todos los átomos que constituyen la proteína.

Hélices, hebras y estructuras no repetitivas como asas y giros forman dominios compactos y globulares

DominiosRegión compacta con mayores contactos consigo misma que con el

resto de la proteína.

Unidad de plegamiento autónomo.

Unidad funcional.

Tamaño promedio 200 aa.

El 49% de los dominios identificados tienen entre 51 y 150 aa.

Domino mas grande 907 aa

Hasta 13 dominios diferentes por proteína

Dominios helicoidales

Manojos de cuatro hélices

Citocromo b652 Hormona de crecimiento humano

Mioglobina

Dominios beta

Compuestas principalmente por hojas antiparalelas

Conexión entre hebras adyacentes “sube y baja”

Proteína que une retinol (sube y baja)

Barriles Sandwiches

Proteína A Bacterioclorofila (Sube y baja)

Dominios alfa/beta

Hojas abiertas Barriles

Estructura Cuaternaria

STRUCTURE OF BETA-GLYCOSIDASE FROM SULFOLOBUS SOLFATARICUS

Hipertermófila

Cloroperoxidasa (CPO)

4,6 Dimetil dibenzotiofeno (DMDBT) Sulfoxido (DMDBT) Sulfona(DMDBT)

SH2O2 OH2

SO H2O2 OH2

SO O

CPO

NH

CPO

H2O2 KClNH

Cl

NH

Cl Cl+

Carbazol 3- Cloro carbazol 3,6 Dicloro carbazol

Capside Viral

BASES DE DATOS DE SECUENCIAS DE PROTEÍNAS

BASES DE DATOS DE ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS

Protein Data Bank

http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

Existen programas que nos permiten analizar las estructuras de proteínas

LAS PROTEÍNAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO CELULAR

FUNCIÓN EJEMPLOS Catálisis

Defensa

Transporte

Soporte

Movimiento

Regulación

Señalización

LAS PROTEÍNAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO CELULAR

FUNCIÓN EJEMPLOS Catálisis Enzimas : proteasas, polimerasas, cinasas

Defensa Inmunoglobulinas, anticuerpos, toxinas

Transporte Hemoglobina, mioglobina, canales membranales

Soporte Colágeno, queratina Movimiento Actina, miosina Regulación Factores de transcripción (proteínas de

unión al DNA)

Señalización Hormonas (insulina)

Propiedades de las proteínas

Å

Å

MASA

TAMAÑO

Carga

PI = pKa1+pKa2

2

Existe un pH para el cual la carga eléctrica media de las moléculas es cero. Este pH se llama punto isoeléctrico (pI). El pI es el pH en el que la molécula se disocia por igual en ambos sentidos, y como

Reconocimiento  molecular  

¿ PARA QUÉ NECESITAMOS PURIFICAR PROTEÍNAS?

ESTUDIAR SU FUNCIÓN y regulación enzimática

REALIZAR ANÁLISIS ESTRUCTURALES: cristalografía de rayos X, espectroscopía NMR.

Estudiar sus interacciones con otras proteínas o con ácidos nucleícos

Para la producción de anticuerpos

Si no se conoce el gen que codifica a la proteína aislada: La proteína purificada se puede usar para determinar la secuencia de aminoácidos y por tanto la secuencia del gen que la codifica!!!!

1. Seleccionar la muestra biológica (fuente) 2. Definir objetivos: PUREZA Y CANTIDAD REQUERIDA

Algo que debemos saber….

Muy alta > 99% Usos terapeúticos , estudios in vivo

Alta > 95-99% Estudios estructurales, cristalografía de rayos X, Caracterización fisicoquímica

Moderada > 95% Obtención de antigeno(s) para la producción de anticuerpos

Secuenciación Espectrometría de masas

¿Y cómo comienzo la purificación?

Contar con un método adecuado para la detección de la proteína de interés.

Monitorear el progreso de la purificación

Cuantificación de proteína total

Detectar específicamente la proteína de interés

ROTURA CELULAR

MÉTODOS PARA REALIZAR LA ROTURA CELULAR Algunos ejemplos son:

1. Lisis celular válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias.

2. Destrucción mecánica Congelación-descongelación, prensa de French, sonicación, macerado con N2 líquido

3. Lisis con detergentes

Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a muchos agentes que pueden dañarla!!!!!!.

¿Cómo protegemos a la proteína de interés?

UTILIZAR: Soluciones amortiguadoras

Inhibidores de proteasas Bajas temperaturas (4°C)

EVITAR Altas temperaturas

Manipular demasiado la muestra

PROCURAR que el proceso sea lo más corto posible.

Algunos agentes estabilizadores son:

Métodos de purificación de proteínas

BAJA RESOLUCIÓN

Precipitación con sales, precipitación con temperatura y pH

ALTA RESOLUCIÓN

Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio iónico,

afinidad

Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante,

desnaturalizante, isoelectroenfoque

Precipitación con sales Sal más usada: Sulfato de Amonio

EXISTEN TABLAS QUE ESPECIFICAN LA CANTIDAD DE SULFATO DE AMONIO QUE SE DEBE AGREGAR PARA LLEGAR A UN % DE

SATURACIÓN ESPECÍFICO

ALTA RESOLUCIÓN

CromatografíaEs un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar dichos componentes

Volumen de columna

Muestra aplicada

Matriz

Tapón poroso

Eluyente

Eluyente Proteínas separadas

Cromatografía de intercambio iónico

Intercambio catiónico

Fase estacionaria cargada negativamente

Intercambio aniónico

Fase estacionaria cargada positivamente

GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN

Factores)que)afectan)a)la)retención)

1.  Fuerza)Iónica)

2.)pH)

3.)Modificadores)Orgánicos)

PRINCIPIO:(!  Tamaño(de(partícula(y(masa(molecular.(!  Mayor(masa(molecular(eluye(primero(!  El(gel(retiene(particuas(de(menor(masa(

molecular((

!APLICACIONES!!!!  Desalado!de!proteínas!!  Purificación!de!proteínas!!  !Determinación!del!peso!

molecular!de!las!proteínas!

TIPOS!DE!MATRIZ!GRANULOS!DE!UN!MATERIAL!

ESPONJOSO!E!HIDRATADO!

!  Dextranos!con!enlaces!cruzados!

!  Agarosa!!  Poliacridamida!

Cromatografía de Afinidad

Utiliza la alta especificidad entre las moléculas biológicas para separar componentes específicos de mezclas complejas.

VENTAJAS: No hay restricción por volumen. Especificidad Pureza del producto final

DESVENTAJAS: Precio (alto) Condiciones de elución drásticas Ligando específico no disponible o inadecuado

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA

Absorción en el ultravioleta. Es un método no destructivo. El intervalo de concentración que se puede determinar depende del contenido de los

aminoácidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml. La presencia de sustancias absorbentes a 280 nm conduce a interferencias.

Reacción del Biuret.

Las características más importantes de la reacción son:

La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas. Su intervalo de determinación es de 1 a 6 mg/ml. No depende de la composición de aminoácidos. Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción.

Método de Lowry. REACCIÓN DE BIURET + REACTIVO DE FOLIN-CIOCALTEU

Esta coloración se atribuye a la reducción del ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico a azul de heteropolimolibdeno de composición no definida, por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las proteínas que forman el complejo con el Cu2+.

Método de BRADFORD

El intervalo de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estándar).

La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos.