PROPUESTA DE INVESTIGACIÓNDETERMINACIÓN DE LA ESTABILIDAD DEL COLORANTE ACHIOTE (PIGMENTOS BIXINA Y NORBIXINA) OBTENIDO MEDIANTE EXTRACCIÓN VÍA ENZIMÁTICA EN

UN PRODUCTO DE GALLETERÍA

PRESENTADO A UNIVERSIDAD DEL VALLE

VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONESCONVOCATORIA INTERNA  PARA  LA CONFORMACION DEL BANCO DE

PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN – 2013 SEDES REGIONALES

ELABORADO POR

Ing. LIBARDO CASTAÑEDA FLÓREZ, Esp.Coordinador Programa Tecnología en Alimentos Univalle Tuluá

Investigador Principal – Docente Tiempo Completo Univalle Tuluá

MABEL ESQUIVIA MERCADO, MSc.Docente Programa Tecnología en Alimentos Univalle Tuluá

Co-Investigador Proyecto – Docente Hora Cátedra - Univalle Tuluá

UNIVERSIDAD DEL VALLE SEDE TULUAPROGRAMA ACADÉMICO DE TECNOLOGÍA EN ALIMENTOS

FACULTAD DE INGENIERÍATuluá, Febrero 13 de 2013

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TABLA DE CONTENIDO

1. RESUMEN DEL PROYECTO..............................................................................32. DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO.........................................................................32.1 PLANTEAMIENTO DE LA PREGUNTA O PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN Y SU JUSTIFICACIÓN EN TÉRMINOS DE NECESIDADES Y PERTINENCIA......32.2 MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE.........................................................62.2.1. ESTADO DEL ARTE.............................................................................................62.2.2. MARCO REFERENCIAL.....................................................................................232.2.3. MARCO CONCEPTUAL.....................................................................................322.3 OBJETIVOS........................................................................................................342.3.1. OBJETIVO GENERAL.........................................................................................342.3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................342.4 METODOLOGÍA PROPUESTA..........................................................................342.5 RESULTADOS/PROD. ESPERADOS Y POTENCIALES BENEFICIARIOS......462.6 IMPACTOS ESPERADOS A PARTIR DEL USO DE LOS RESULTADOS........502.7 IMPACTO AMBIENTAL DEL PROYECTO.........................................................502.8 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES...................................................................512.9 DISPOSICIONES VIGENTES.............................................................................523.0 PRESUPUESTO.................................................................................................534.0 BIBLIOGRAFÍA...................................................................................................56

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DETERMINACIÓN DE LA ESTABILIDAD DEL COLORANTE ACHIOTE (PIGMENTOS BIXINA Y NORBIXINA) OBTENIDO MEDIANTE

EXTRACCIÓN VÍA ENZIMÁTICA EN UN PRODUCTO DE GALLETERÍA

1. RESUMEN DEL PROYECTO

Este proyecto se encuentra enmarcado dentro de la línea de investigación Biotecnológica y está orientado a determinar la estabilidad del colorante natural en polvo de la semilla de achiote variando la acidez en la etapa de extracción por vía enzimática y temperatura y flujo de aire en la etapa de secado.

Como factor importante a tener en cuenta en la extracción del colorante a partir de la semilla de achiote (Bixa orellana) son los metabiltos secundarios presentes dentro de los cuales está el mayoritario que es la bixina y el minoritario que es la norbixina. Esto con el fin de emplear la biotecnología para extraer por vía enzimática el colorante natural sin residuos químicos.

En la extracción por vía enzimática se varia el pH en tres niveles y en el secado se varía igualmente en tres niveles la temperatura y el Flujo de aire. A cada una de las muestras de colorante obtenidas se les determina el contenido de bixina y norbixina, humedad, color, tono y el coeficiente de difusión con una frecuencia semanal durante un período de tres meses. Se propone también realizar estas determinaciones al colorante aplicado a un producto de galletería con la misma frecuencia y en el mismo período de tiempo.

2. DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO

2.1 PLANTEAMIENTO DE LA PREGUNTA O PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN Y SU JUSTIFICACIÓN EN TÉRMINOS DE NECESIDADES Y PERTINENCIA

En la actualidad a nivel mundial existe una demanda considerable de colorantes naturales como alternativa orientada a reemplazar colorantes sintético entre los cuales uno de los más empleados a nivel industrial es la tartrazina, por su amplia gama de

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tonalidades y estabilidad. Sin embargo, el uso de este colorante cada día es más restringido debido a los múltiples reportes científicos de sus efectos colaterales adversos a la salud humana. El consumo prolongado de colorantes sintéticos está directamente relacionado con indigestión, anemia, lesiones patológicas en el cerebro, bazo, riñón, hígado y tumores cancerígenos, parálisis, crecimiento retardado, afecciones visuales entre otros, razón por la cual ha surgido la tendencia a reemplazar la tartrazina por colorantes naturales dentro de los cuales se encuentra el colorante extraído de la semilla de Achiote (Bixa orellana).

Los colorantes extraídos de fuentes naturales, especialmente vegetales, son empleados para la coloración de productos alimenticios y no alimenticios; presentando por lo general problemas de estabilidad debido a sus características fisicoquímicas, ya que son susceptibles a la oxidación, degradación por la luz, el calor y humedad.

Temperaturas mayores a 70 °C influyen en la degradación del metábolito mayoritario bixina a norbixina, aplicado tanto en productos alimenticios secos como en productos hidratados.

Además, algunos de estos colorantes naturales empleados a nivel industrial, son insolubles en agua (carotenoides) mientras que son solubles en disoluciones acuosas ácidas (bixina, norbixina) por lo tanto los métodos aplicados en la extracción influyen en la solubilidad. Entre los que más se utilizan están los solventes orgánicos, el de vía alcalina (KOH y precipitación con HCl); la selección de los solventes depende de la estructura química y la polaridad de los pigmentos presentes. Estos métodos influyen en la estabilidad del colorante tanto antes como después de ser aplicados (Jaramillo, 1992).

Es por lo anterior que los colorantes naturales empleados en la industria alimenticia presentan problemas de estabilidad que afectan negativamente el color y las características organolépticas del producto final.

Por otro lado, los métodos de extracción que utilizan solventes como hexano, cloroformo, propilenglicol, entre otros, extraen un colorante que solamente tiene la bixina (carácter polar) y además pueden quedar trazas de solvente en el colorante. Si la extracción se realiza con aceite vegetal presenta el inconveniente de que no se estaría ofreciendo un colorante natural libre de aceite.

Actualmente en el mercado el colorante natural de achiote que se produce por vía alcalina y secado por atomización a temperaturas de aproximadamente 170 °C, por lo que el pigmento bixina se desnaturaliza a norbixina y por lo tanto el colorante está compuesto solo de pigmento norbixina el cual es solamente soluble en agua.

Todos los colorantes sintéticos debido a su mayor estabilidad, son empleados masivamente, a pesar de ocasionar efectos adversos para la salud, como es el caso de

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la tartrazina. Este tipo de colorantes azoicos son muy solubles en agua, facilitando su incorporación en productos de conservas vegetales, confitería, galletería, cárnicos, repostería, helados, bebidas refrescantes entre otros.

Con base en lo anterior, se expone la siguiente pregunta de investigación: ¿Es posible ofrecer al sector alimenticio nacional una alternativa viable de colorante natural derivado del Achiote, obtenido a partir de vía enzimática, presentando características de adecuada estabilidad y evaluado bajo diferentes condiciones (temperatura de secado, caudal de aire y pH) sin efectos nocivos para el consumidor, que pueda a mediano y largo plazo, reemplazar a la tartrazina?

JUSTIFICACIÓN

Hoy en día existe un interés creciente por parte de los fabricantes que utilizan colorantes en los diversos productos, tanto alimenticios como farmacéuticos, de reemplazar los colorantes sintéticos por colorantes naturales.

Como alternativa a lo anterior, el colorante natural en polvo del achiote el cual contiene bixina – norbixina, se constituye en un colorante natural de gran interés comercial, avalado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), como de nula toxicidad.

El método que se plantea para obtener el colorante natural de achiote en polvo controla durante la extracción una temperatura de 60 °C y en el secado temperaturas de 50, 55 y 60 °C, lo cual garantiza que no se presenta desnaturalización de la bixina en norbixina.

Para contribuir a subsanar lo anterior, han sido sugeridos varios métodos de extracción orientados a mejorar la estabilidad de los colorantes naturales utilizados en los productos alimenticios, la cual es influenciada por variables como pH, luz, temperatura, reacciones de oxidación y humedad.

Por tanto la presente propuesta de investigación está orientada a determinar la estabilidad del colorante extraído a partir de la semilla de achiote (Bixa orellana L) mediante vía enzimática, variando el pH en la extracción y la temperatura y el flujo de aire en la etapa de secado, para obtener el colorante natural en polvo y posteriormente evaluar su comportamiento con y sin aplicación en un producto de galletería.

La obtención del colorante natural de achiote en polvo por vía biotecnológica usando una enzima y controlando la temperatura en todo el proceso, evita los problemas antes mencionado lo cual, lo hace adecuado para uso a nivel industrial, puesto que se logra inocuidad del colorante acompañada de buenos rendimientos del proceso (alrededor del 10.3 %).

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Las enzimas degradan parte de la cubierta exterior de la semilla conformada por celulosa, carbohidratos, aceites esenciales y pigmentos presentes en el colorante permitiendo separar el extracto a temperatura de 60 °C, para luego ser secado a temperaturas moderadas (50 - 60 °C) y obtener el colorante en polvo. Este colorante contiene los dos pigmentos (bixina y norbixina) en una relación aproximada de 80% a 20 %. A esta temperatura, la bixina por ser un carotenoide carboxílico con estructura química similar a la del caroteno, no se degrada a norbixina.

Estos colorantes extraídos en condiciones moderadas de temperatura se caracterizan por presentar mayor estabilidad debido a su alto contenido de bixina (80%) lo que no ocurre con los extraídos por métodos químicos que utilizan condiciones de extracción y secado extremas.

Adicionalmente el colorante de la semilla de achiote presenta actividad antimicrobiana contra bacterias como Salmonella, Staphilococus aureus y E Coli.

En el método de extracción por vía enzimática se contempla el encapsulamiento del colorante utilizando malto dextrina, la cual influye en la estabilidad del colorante durante la etapa de secado, no permitiendo que el colorante se aglomere (Pedroza, 2002).

De obtenerse resultados positivos a partir de esta investigación, puede ofrecerse una alternativa de un colorante natural en polvo innocuo y compuesto con el pigmento tanto polar (norbixina) como el no polar (norbixina) a las industria alimentaria con el fin de que puedan reemplazar los colorantes sintéticos como la tartrazina.

Siendo Colombia un país con gran diversidad económica en la agricultura, esta investigación tendría incidencia positiva en los aspectos económico y social, mediante la generación de productos inocuos que involucran adición de colorantes naturales, con el objetivo de reemplazar el uso de los sintéticos con niveles similares en cuanto al porcentaje de aplicación, contribuyendo de esta manera al bienestar de la población y por tanto, en una acción articulada a una política de salud pública; además de fomentar el cultivo de especies promisorias nativas, como el achiote, constituyéndose en una alternativa adecuada para sustitución de cultivos tradicionales y/o ilícitos, impulsando el desarrollo rural en la región centro vallecaucana.

2.2 MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE

2.2.1. ESTADO DEL ARTE

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“Estudio de estabilidad y algunas propiedades tecnológicas de pigmentos sintetizados por Epicoccum nigrum”. (Bleoju, 2007). El objetivo principal de este trabajo fue estudiar la estabilidad de extractos acuosos y etanolicos del colorante amarillo-anaranjado sintetizado por Epicoccum nigrum, así como evaluar algunas propiedades tecnológicas, como la capacidad antioxidante y la antimicrobiana.

Con respecto a la metodología utilizada:

Se realizó la extracción de los pigmentos producidos por el hongo La extracción se realizó siguiendo el protocolo establecido por (Bahrim y Soptica,

2004) usándose como extractantes agua Milli-Q y etanol 96%, para obtenerse así un extracto etanolicos y otro acuoso.

0.05 g polvo tipo Koji se maceraron con 10 ml., del solvente en agitación continua durante una hora. La extracción se realizó en oscuridad y a temperatura ambiente.

Transcurrido el tiempo de maceración las mezclas se centrifugaron a 11000 gess durante 10 minutos a 20ºC. Los sobrenadantes constituyeron los extractos objeto de estudio.

La decisión de usar estos extractantes se basó en la solubilidad de los pigmentos, comprobada en un estudio previo, y en la compatibilidad de ambos con las posibles aplicaciones alimentarías. (Mihaela Bleoju, 2007. p. 7).

Para la evaluación de la estabilidad de los extractos:

Se evaluó la estabilidad de los extractos a diversos pH: 3,0 / 6,0 / 9,0, que se alcanzaron por adición de pequeñas cantidades de disoluciones de hidróxido sódico y de ácido clorhídrico 1M. Además, se estudió el efecto de la temperatura, manteniéndose los extractos a 5ºC, 20ºC y 60ºC. También se hizo un estudio parcial de la estabilidad ante la luz, ensayándose la estabilidad en exposición a la luz solar, a la luz UV de 256 nm., y a la oscuridad.

Por impedimentos logísticos no fue posible estudiar todas las combinaciones posibles de los tres factores bajo estudio. Así se optó por las siguientes combinaciones: Estabilidad a temperatura ambiente: se ensayan los tres pHs, y el efecto de la

oscuridad la luz solar natural y la UV. Estabilidad a temperatura de refrigeración (cámaras a 5ºC): los tres pHs y el efecto

oscuridad y luz solar de lámpara Philips L565 (24h). Estabilidad a 60ºC: los tres pHs en oscuridad (estufa) y luz solar natural (baño arena

termostatizado).

Los ensayos se realizaron por triplicado, es decir existían tres extractos y tres replicas de cada extracto en cada una de las condiciones indicadas. Para las representaciones gráficas se consideraron valores medios y la desviación estándar. En su caso, se aplicó el test LSD para detectar diferencias significativas.

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La estabilidad se monitorizó durante 21 días, registrándose el espectro de absorción UV-VIS (200-600 nm.) de cada extracto, y anotándose la longitud de onda de máxima absorción en cada momento y la absorción a 430nm, longitud de máxima absorción de los extractos recién obtenidos (Mihaela Bleoju, 2007. p. 7-8)

Con respecto a los resultados de estabilidad se obtuvo: En primer lugar se quiere indicar que los espectros de absorción de los extractos acuosos y etanolicos fueron muy parecidos presentando esencialmente diferencias cuantitativas y no cualitativas.

Los extractos recién obtenidos presentaron máximo de absorción entorno a 430 nm., correspondiente al color amarillo-ligeramente anaranjado que presentan.

Se detectó cierto efecto del pH sobre el color de los extractos, sobre todo sobre la intensidad de color (absorbancia máxima alcanzada por cada extracto), que disminuyó al hacerlo el pH.

Inicialmente se pensó que estas variaciones podrían ser asociadas al uso de ácido clorhídrico como agente acidulante. Este, al ser un ácido fuerte, podría haber inducido ciertos daños en los pigmentos. Este hecho se descartó por dos motivos: 1º) el efecto fue dispar en extractos acuosos y etanolicos; 2º) el uso de otros ácidos como fosfórico y fórmico produjo efectos similares.

Se evaluó y se comparó la evolución de los extractos entre sí considerando los cambios de la absorbancia a 430nm durante el almacenamiento, usando una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso de luz. En general los resultados mostraron que la estabilidad de los extractos fue dependiente del extractante, del pH, de la temperatura y de la luz.

El efecto del pH en la estabilidad de los extractos En general se obtuvo una mejor estabilidad de los extractos cuando estos fueron ajustados a pH alcalinos (figura 4), observándose descensos bruscos de la intensidad colorante de muchos de los extractos ajustados a pH ácidos. Las mayores pérdidas de color a pH ácido sorprendieron ya que lo más habitual y lo más citado en la bibliografía es que los pH ácidos estabilizan los pigmentos, generalmente porque reducen la posibilidad de desarrollo de reacciones degradativas. (Mihaela Bleoju, 2007. P. 14).

Los resultados del efecto de la temperatura sobre la estabilidad de los extractos fueron bastante razonables, con la salvedad de la poca estabilidad detectada de los extractos acuosos almacenados en refrigeración, que es muy reducida a pH ácidos y sobre todo en presencia de luz. En general las pérdidas de color se produjeron más lentamente en los extractos refrigerados, siendo rápidas y en muchos casos muy bruscas cuando el almacenamiento fue a 60ºC. Estos datos indican que los pigmentos aislados son

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termodegradables lo que podría significar cierta limitación en sus aplicaciones tecnológicas. Por otra parte su estabilidad a baja temperatura los hace adecuados para su uso en productos que se manipulen, conserven y consuman en frío (Mihaela Bleoju, 2007. P. 11 - 12

Otra investigación relacionada con la estabilidad de los colorantes es la realizada en la Universidad de Guatemala, Eextracción, cuantificación y estabilidad de colorantes naturales presentes en los frutos de prunus capuli cav. (cereza), rubus urticaefolius poir. (mora) y sambucus canadensis l. (saúco) como alternativas naturales de consumo de los colorantes artificiales rojo no.40, rojo no.3 y rojo no.2, en bebidas en el rango de ph: 3, 4 y 5 (Fuentes 2005).

En la presente investigación se realizó la extracción de los pigmentos antociánicos que se encuentran en los frutos de Prunus capuli Cav. (Cereza), Rubus urtícaqfolius Poir. (Mora) y Sambucus canadensis L. (Saúco) utilizando la técnica de maceración en frío (extracción sólido-líquido), se cuantificaron dichos pigmentos y se evaluó la estabilidad a diferentes valores de temperatura (30'C y 50T) y pH (4 y 5) utilizando espectrofotometría ultravioleta-visible. Esto se realizó para determinar si poseían las características para ser utilizados como alternativas naturales de consumo de los colorantes artificiales Rojo No.40, Rojo No.3 y Rojo No.2 en bebidas comprendidas en el rango de pH 3, 4 y 5.

Se determinó que únicamente los pigmentos presentes en los frutos de Cereza pH 4 y 5, Mora pH 5 y Saúco pH 5, presentan las características para ser utilizados como alternativas naturales del colorante artificial Rojo No.2 en bebidas comprendidas en el rango de pH 4 y 5.

Se recomienda realizar otros estudios para determinar si los citados colorantes naturales satisfacen todas las exigencias que se demandan para hacer dicha sustitución (Fuentes 2005).

La evolución continua de las tecnologías mejora la calidad de los procesos de extracción y obtención de colorantes naturales. El interés en conocer y evaluar la estabilidad de los mismos aplicándolos a productos alimenticios, ha aumentado su propósito al direccionar la utilización de colorantes naturales para ofrecer un producto más inocuo al consumidor y con un valor agregado.

Las investigaciones realizadas tendientes a evaluar el Incremento de la estabilidad del colorante extraído a partir de la semilla de achiote (bixina – norbixina), han demostrado que el encapsulamiento de los colorantes con dextrinas brinda una protección contra los factores ambientales como la luz, el oxigeno y exceso de calor, evitando la degradación del colorante. (Benítez, Lenis, & Paz, 2010).

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Importancia de los colorantes adicionados a los alimentos

Como beneficios de la inclusión de colorantes en la formulación de productos alimenticios, se encuentran:

Mejora de las características organolépticas, resaltando el color inicial o final del producto.

Homogeneidad y uniformidad en tonos, evitando variaciones naturales en la intensidad de los mismos.

Realce de los colores que se disminuyen por el proceso. Apariencia original cuando el color natural ha sido destruido por el procesamiento. Conservación de la identidad y el carácter de los alimentos.

Clasificación de los colorantes

Se puede clasificar según su origen sintético y natural. También por su naturaleza química, ya sea orgánico e inorgánico y por su tipo de solubilidad, siendo colorantes hidrosolubles, liposolubles y colorantes lacas o pigmentos. En la figura 1, se presenta una clasificación general de los colorantes existentes, haciendo énfasis en los colorantes naturales orgánicos de tipo vegetal, los carotenoides (bixina y norbixina) y sintéticos orgánicos de tipo azo compuestos (tartrazina), siendo los colorantes involucrados a estudiar y evaluar.

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COLORANTESCOLORANTES

SintéticosSintéticos

Orgánicos

Azo CompuestosTartazinaAntraquinonasOtros

NaturalesNaturales

Orgánicos Inorgánicos

VegetalesAntocianinasBetalainasCarotenoides*Bixina *NorbixinaFlavonoidesClorofilaTaninosMioglobinaHemoglobina

AnimalesAc. CarmínicoAc. KermésicoOtros

MineralesAzul ultravioletaDióxido de titanioNegro Carbón

Figura 1. Clasificación de los colorantes (Badui, 1999)

Colorantes naturales. Están compuestos por pigmentos tanto liposolubles como insolubles y se encuentran en diferentes fuentes naturales ya sea de carácter vegetal o animal que pueden ser extraídos por diversos métodos. Son considerados como inocuos.

Sus principales características son:

Menor poder de tinción que los sintéticos. Innocuidad Estructura química definida Inestabilidad ante factores como pH extremos (ácidos- alcalinos), temperatura,

agentes oxidantes, humedad.

En términos generales, los colorantes relacionados con los alimentos se pueden clasificar en ocho categorías: carotenoides, clorofilas, antocianinas, flavonoides, betalaínas, taninos, mioglobina y hemoglobina (Badui, 1999). De estas ocho categorías los carotenoides representan los más utilizados para el sector alimentario.

Carotenoides. Los carotenoides o tetraterpenoides son pigmentos con 40 átomos de carbono, por lo que su estructura facilita la solubilidad en la mayoría de solventes apolares y brinda coloraciones que oscilan entre el amarillo (ß-caroteno) y el rojo (licopeno). Los carotenoides son una familia de colorantes liposolubles que se encuentran principalmente en plantas, algas y bacterias fotosintéticas. Por lo tanto son solubles en otros lípidos o en solventes no polares.

La coloración ofrecida por los carotenoides es impartida gracias a los dobles enlaces trans conjugados presentes en sus la estructuras moleculares lineales y rígidas (en su forma natural).

Las propiedades de los carotenoides tipo cis, presentan diferencia con respecto a los trans; pues ellos son más solubles y por lo tanto son mejor absorbidos y difundidos en un medio acuoso. La isomerización cis-trans puede ser causada por la presencia de halógenos libres, ácidos, luz excesiva y altas temperaturas (Badui, Dergal, 1999

Clasificación de los carotenoides. Los carotenoides se clasifican en dos grupos; los carotenos que están formados por carbono e hidrógeno, poseen una coloración rojiza y anaranjada, como el β-caroteno, α-caroteno, licopeno y criptoxantina; por otra parte se

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encuentran las xantofilas que contienen carbono, hidrógeno y oxígeno, poseen una coloración verdosa amarillenta y parda contra la radiación solar, como la luteína, zeaxantina y capsantina. (Martínez, 2003).

Los carotenos que poseen una coloración rojiza, de donde se obtienen pigmentos liposolubles e hidrosolubles como: bixina y norbixina.

Los pigmentos carotenoides presentes en la semilla de achiote son la bixina (C25H30O4), cuyo nombre científico es: ácido 9’–cis-6,6’-diapocaroteno-6,6’dioco, monometilester y la norbixina (C24H28O4), cuyo su nombre científico es: ácido 6’-metilhidrogen-9’-cis-6,6’ diapocaroteno-6,6’ dioico. En estado puro estos carotenoides son sensibles a la oxidación por su estructura fuertemente insaturada (dobles enlaces) y cuando esto ocurre se presenta una disminución en la propiedad de ofrecer el color rojo por efecto de la desaparición de dobles enlaces conjugados; con el inconveniente de que la oxidación es acelerada por la acción de la luz y el calor. (Scotter, 1998).

Las propiedades fisicoquímicas de un pigmento cambian según el método de extracción que se utilice.

Bixina. Es el pigmento natural mayoritario, liposoluble presente en la semilla de achiote y representa el 80% de los carotenoides presentes y están ubicados específicamente en la cubierta exterior de la semilla del fruto. (Jaramillo, 1992). Aparte de la bixina también está presente la norbixina hidrosoluble (Toledo de Oliveira et al, 2004).

La cantidad de bixina y norbixina presente en la semilla varía significativamente y depende fundamentalmente de la variedad, tipo de fertilizante utilizado durante el cultivo, altitud del terreno cultivado, los valores comunes de bixina se encuentran en el rango del 2-5%, pero el contenido podría alcanzar el 7% del peso seco de las semillas. (Morrison E. y col., 1991; Schneider W., 1965).

Norbixina. Es un carotenoide producido por la eliminación del grupo ester metílico de la bixina, se considera estable al oxígeno, sensible la Calor y a la radiación, es muy soluble en agua, se utiliza como colorante. A continuación se presenta la Figura 2, las estructuras de la bixina y norbixina. Ambos pigmentos están presentes en el colorante extraído por vía enzimática.

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Figura 2. Estructura química de la bixina y norbixina.Fuente: (FAO/WHO, 1996).

Los componentes básicos del colorante presente en la semilla de achiote, es utilizado como colorante natural en los alimentos tales como margarinas, quesos, salsas, embutidos, pastelería y cualquier otro producto en el que predomine la fase oleosa. Las tonalidades de los pigmentos, van desde amarillo mantequilla hasta a el color rojo marrón y esto depende de la concentración (NOONAN, 1980). Además está aprobado por la FDA.

A continuación se presentan las características fisicoquímicas del colorante extraído de la semilla de achiote.

Tabla 1. Composición del colorante de la semilla del achiote.

Componente Porcentajeg/100 g

Proteínas 12.3 – 13.2Pectina 0.23Carbohidratos 39.91 – 47.90Ceniza 5.44 – 6.92Taninos 0.33 – 0.91Pentosanos 11.35 – 14.97Carotenoides (bixina – norbixina)

1.21 – 2.30

Β – carotenos 6.8 – 11.30 mg

Fuente: (Deviam, & Saldarriaga, 2003)

Colorantes sintéticos. Son colorantes obtenidos por síntesis química.

Sus principales características son:

Homogeneidad. Estabilidad a los cambios del medio como luz, pH, humedad y altas temperaturas. Alta pureza (80% - 90 %) Cubrimiento de una amplia gama de colores.Entre los colorantes sintéticos se encuentran los llamados azoicos.

Colorantes azoicos. Los colorantes azoicos forman parte de una familia de sustancias químicas orgánicas caracterizadas por la presencia de un grupo que contiene nitrógeno

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unido a anillos. La estructura química de este tipo de colorantes, se caracteriza por la presencia de uno más grupos azo −N=N−.

Debido a su facilidad de síntesis se convierte en los más abundantes y son todos solubles en agua, debido a la presencia de grupos sulfónicos. Pertenecen a este grupo casi la mitad de los colorantes sintéticos.

Tipos de colorantes azoicos. Tiene una amplia gama de colores que van desde el amarillo hasta el negro a medida que aumenta el número de grupos azo; es decir, a medida que el sistema conjugado es más extenso.

Mono azo: Amarillo-naranja-rojoDis – azo: Rojo-verde-azulTris – azo: Azul-negro

El más común y más utilizado es la tartrazina, la cual se conoce como FD&C Amarillo 5, su tipo monoazo (pirazolona). Su nombre químico es sal tricosódica del ácido 4,5- dihidro-5-oxo-1-(4-sulfofenil)-4-[4-sulfofenil-azo]-1H-pirazolona-3-carboxilico. Su formula molecular es C16H9N4Na3O9S2, su masa molar es 534,4, se presenta en polvo o gránulos de color naranjo claro, es muy soluble en agua, su intensidad aumenta cuando se encuentra disuelta. (FAO/WHO, 1992; ROHA, 2003). A continuación se presenta la estructura química de la tartrazina:

Figura 3. Estructura química de la tartrazinaFuente: (FAO/WHO, 1992)

Estabilidad de los colorantes

La estabilidad de los colorantes no solamente depende de la composición sino también de las variables manipuladas durante su procesamiento, condiciones de almacenamiento, de la composición del alimento y finalmente de las condiciones de almacenamiento del alimento.

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Muchos de estos cambios son producidos por el contenido de agua, tanto en el colorante como en el alimento. Esto implica que la estabilidad de los colorantes incluidos en los alimentos y la actividad de agua están estrechamente relacionadas en muchas (aunque no todas) situaciones. En la figura 4, se observan las relaciones típicas de las velocidades de degradación según la actividad de agua. Las velocidades de degradación, las posiciones y formas de las curvas pueden ser alteradas por la composición, estado físico y estructura de la muestra, por la composición de la atmósfera y por la temperatura.

Figura 4. Relación entre actividad de agua Vs. EstabilidadFuente: (Labusa, 1970).

Factores que afectan la estabilidad de un colorante

Las principales causas que afectan la estabilidad de los colorantes naturales son aquellas de naturaleza física, química y biológica. Entendemos que la estabilidad de los pigmentos presentes en el colorante de achiote es restringida, debido a que son sensibles a la temperatura, pH, luz y humedad. Tiempos largos de exposición a todas estas condiciones causa degradación de estos componentes incidiendo en la estabilidad de estos pigmentos.

Existen los siguientes factores:

Efectos del oxígeno. La presencia de oxígeno aumenta los efectos que tiene sobre el desarrollo de los microorganismos, afectando a los colorantes naturales y disminuyendo el valor nutritivo, a través de las reacciones de oxidación (lípidos presentes), produciendo efectos variables como es la generación de hidroperóxidos y peróxidos que a su vez oxidan la vitamina A, esto se produce ya sea dependiendo de la naturaleza de los lípidos y de su estado de almacenamiento.

Efectos de la temperatura. La temperatura no controlada en el proceso de secado

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ocasiona deterioro en la composición del pigmento bixina, esta actúa como acelerador de la degradación convirtiéndose en norbixina. Su color se pierde a 70°C, siendo un poco más estable la bixina (SECCO, 1994).

Efectos de la humedad. Los colorantes naturales son muy sensibles a la presencia de un ambiente de humedad relativa elevada, debido a su capacidad higroscópica (capacidad de absorción de agua), provocando la oxidación del pigmento y pérdida de color y desarrollo de microorganismos y hongos.

Efectos de la luz. Es la responsable de la destrucción de la vitamina A, además. La acción intensa de la luz sobre los carotenos induce la ruptura de los dobles enlaces con la consiguiente pérdida de la capacidad de coloración (Rodríguez, 1999).

Determinación de la estabilidad del colorante

El conocimiento de los factores que afectan la estabilidad del colorante, permite determinar el medio y la forma de conservación de éste. Como se mencionó con anterioridad, los factores que más influyen en la estabilidad de un colorante son la temperatura, el pH del medio, la actividad del medio, la presencia de agentes oxidantes y antioxidantes, y la exposición a la luz, principalmente. Una manera de determinar la estabilidad de manera subjetiva es visualmente pero esta es una manera inadecuada.

De los métodos objetivos como el sistema CIELAB (estrictamente CIE 1976 L*a*b*), es el que más se aproxima a la apreciación visual humana, y ha sido recomendado por diversas sociedades científicas para su uso en las mediciones del color en los alimentos, siendo adoptado como Norma UNE (Unión Europea).

El CIE L*a*b* (CIELAB) es el modelo cromático usado normalmente para describir todos los colores que puede percibir el ojo humano. Fue desarrollado específicamente con este propósito por la Commission Internationale d'Eclairage (Comisión Internacional de la Iluminación), razón por la cual se abrevia CIE. Los asteriscos (*) que siguen a cada letra forman parte del nombre, ya que representan L*, a* y b*, de L, a y b.

La estabilidad del colorante se determina fundamentalmente estableciendo la capacidad de mantener la uniformidad del color en el tiempo a las condiciones de aplicación y almacenamiento (Altman & Cía 2010).

Fundamentos de colorimetría

La “Comission International ed’ Éclairage”, (Comisión Internacional de Iluminación - CIE), estableció la curva del observador como medio patrón para definir un observador

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estándar concreto, éste se denomina observador colorimétrico estándar. La CIE estableció un procedimiento oficial para las igualaciones o correspondencias de color a partir de tres curvas: ⎯x, ⎯y, ⎯z.

El CIE se define numéricamente a la iluminación y al observador estándar, así como a los colores primarios: rojo, verde y azul, como las funciones triestímulos x, y, z, respectivamente. Para describir un color se utilizan tres coordenadas que corresponden a los valores triestímulos, mismos que se relacionan con la forma en que el observador ve un color.

El espacio CIELAB, es una transformación matemática del espacio x y z en el cual se fija un blanco de referencia. Ese blanco de referencia puede ser, por ejemplo una fuente luminosa, el iluminante al que se haya adaptado el observador (Gonzales, 2008).

Sistema Hunter L, a, b triestímulos. Sistema de color que se deriva del Sistema CIE; de gran aceptación debido a que es fácil de entender e interpretar. En la figura 5, se muestra la representación de las coordenadas que se emplean en este sistema para designar los colores.

Figura 5. Representación tridimensional que designa los colores en el sistema Hunter L, a, bFuente: (Hunter L.a.b, Apliccations Note, 2001)

Los tres ejes del sistema CIELAB se indican con los nombres L*a*b*. Representan Luminosidad (L), tonalidad de rojo a verde (a) y tonalidad de amarillo a azul (b).

El valor L representa la aproximación matemática de la respuesta del ojo al color negro y blanco. Un blanco perfecto tiene un valor de 100 y un negro perfecto tiene un valor de cero en la escala L. Un valor positivo en la escala (a) indica lo rojo, un valor negativo en

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esa escala índica lo verde; el cero índica lo gris. Un valor positivo en la escala b, indica lo amarillo, un valor negativo lo azul; el cero es gris.

Para este estudio se empleará el método experimental el cual proporciona los parámetros: a, b y L. El color puede ser evaluado por el índice IC* obtenido de la siguiente expresión:

IC* = (a x 1000)/(L x b)

El IC* por sus características de variación puede utilizarse como variable de control de la calidad organoléptica de alimentos (Capilla, Artiga & Pujol, 2002).

Para especificar exactamente un color se necesita un mínimo de parámetros que los defina, éstos se conocen como trivarianza visual. Los tres atributos a los que hace referencia un color son, según la U.S. Food and Drug Administration (1992) los siguientes:

Tono: podría referirse del color en sí mismo, se trata de la longitud de onda dominante del color y la cualidad que lo distingue de los demás. Es decir, es la primera respuesta que se da cuando se pregunta por el color de un objeto.

Claridad: cada color tiene su claridad específica, se trata de si un color es muy luminoso o no, si el tipo de color es claro u oscuro.

Saturación: nos indica la cantidad de color presente, su pureza. Es la cantidad de blanco que tiene un color. Contra más saturado, el color es más intenso y puro, y contiene menos blanco.

Instrumentos para medir el color y su composición.

Todos los instrumentos para medir el color se ubican dentro de las dos siguientes clasificaciones: espectrofotómetros y colorímetros. El espectrofotómetro es el instrumento básico para medir el color que facilita la obtención de resultados completamente objetivos. Sus mediciones dependen sólo de las características de la luz reflejada por la muestra, independientemente de las características del observador o de la fuente de luz. En la figura 6, se muestra un esquema simplificado de un espectrofotómetro.

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Figura. 6. Diagrama simplificado de un espectrofotómetro UV visibleFuente: (Albella & Miranda 1993)

Espectrofotometría UV-visible

Es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.

La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una región de energía muy alta. Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos carbonilos y otros hetero-átomos tienen su máxima absorbancia en la región UV, por lo que ésta es muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos. En la región visible apreciamos el color visible de una solución que corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. (Capilla, Artiga, & Pujol, 2002)

Espectrofotometría infrarrojo

La espectrometría infrarroja se basa en los enlaces químicos de las sustancias que tienen frecuencias de vibración específica, correspondientes a los niveles de energía de la molécula. Estas frecuencias dependen de la forma de la superficie de energía potencial de la molécula, la geometría molecular, las masas atómicas y, posiblemente, el acoplamiento vibracional.

Para realizar medidas en una muestra, se transmite un rayo monocromo de luz infrarroja a través de la muestra, y se registra la cantidad de energía absorbida. Repitiendo esta operación en un rango de longitudes de onda de interés (por lo general, 4000-400 cm-1) se puede construir un gráfico. Al examinar el gráfico de una

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sustancia; sin embargo, la técnica se utiliza habitualmente para la identificación de mezclas complejas. Proporciona gran información sobre las propiedades internas (compuestos químicos, impurezas, entre otros) (Olsen, 1990).

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

La cromatografía de líquidos High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). Es una técnica donde hay separación de los distintos componentes de una mezcla de sustancias, basándose en los diferentes tiempos de retención que experimentan los componentes, al pasar a través de una fase estacionaria, cuando la muestra es diluida por una fase móvil líquida.

Estas son las fases que comprende la cromatografía líquida:

Fase móvil: un fluido (gas, líquido o fluido súper crítico) que arrastra la muestra a través de una fase estacionaria.

Fase estacionaria: puede ser un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distintas formas con la fase

estacionaría y con la fase móvil: Adsorción: el soluto de adsorbe en la superficie de las partículas sólidas de la fase

estacionaría, es un fenómeno superficial, aumentando con la formación de puentes de hidrogeno.

Partición o reparto: el soluto se equilibra entre el líquido de la fase estacionaria y la fase móvil, por diferencia de solubilidad, hasta llegar a un equilibrio.

Intercambio iónico: los aniones o cationes se separan en base a una columna rellena con un intercambiador de iones (resina).

Exclusión molecular, filtración en gel: no existe interacciones entre la fase estacionaria y el soluto. Se separa por un tamaño de partículas.

Etapas de procedimiento del (HPLC) son:

Inyección de la muestra Transporte de la muestra por el interior de la columna y separación de sus

componentes. Detención de los componentes Identificación y cuantificación de cada componente

Después de haber pasado los componentes por la fase estacionaria y de haber separado, pasan por un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de compuesto, como lo muestra la figura 7 (Waters Corpotation, 1995).

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Figura 7. Etapas de procedimiento del (HPLC)Fuente: (Waters Corpotation, 1995)

Cromatografía de capa fina

Esta técnica es un tipo de cromatografía líquida en la cual la fase estacionaria es una capa uniforme y homogénea aplicada sobre un soporte inerte (generalmente plástico). También se utiliza el término de “cromatografía plana” que engloba la cromatografía de capa fina y la cromatografía en papel. Normalmente se emplean adsorbentes como fases estacionarias, aunque también se pueden emplear fases químicamente ligadas. Actualmente, se suelen utilizar placas prefabricadas de dimensiones 20 cm x 20 cm. Son láminas relativamente rígidas que se recortan con tijeras a la medida requerida.

En caso necesario, se procede a la determinación del Rf de las sustancias separadas, parámetro que caracteriza la migración de un soluto (abreviación de “factor rate”) definido por:

Rf = (Distancia recorrida por el soluto) / (Distancia recorrida por el frente del disolvente)

El Rf de las sustancias separadas permite la identificación de las mismas por comparación con el Rf correspondiente a los patrones de los compuestos identificados (Gutiérrez, 2002).

Coeficiente de difusión D.E. de un colorante

Para determinar el D.E en el caso de un colorante en solución acuosa y utilizando lámina en medio viscoso la relación entre el coeficiente de difusión del baño y la materia utilizada es aproximadamente de 10000: 1, la absorción es prácticamente instantánea y la última fase regirá la velocidad de tintura por ser la más lenta (Ribé, 1970).

La velocidad de difusión viene dada por la expresión:

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ds/dt=-D.a.dc/dx (I)

Conocida con la primera ecuación de Fick, en la que ds/dt es la masa de colorante difundida en la unidad de tiempo, a es el área, dc/dt es el gradiente de la concentración en la fibra y D es el coeficiente de difusión, que en el sistema C.G.S. viene dado en cm2/s. De la ecuación (I) se deduce la segunda ley de Fick, que se expresa, en su forma más general, por:

dc/dt=D∇2 c (II)

El valor de D en las anteriores expresiones se considera independiente de la concentración, sin embargo, para los colorantes directos presenta una cierta dependencia con la concentración que puede considerarse de la forma D = Do x c 1/2

siendo Do una constante y c la concentración.

La solución de la ecuación (II) para la difusión unidireccional (caso de una Lámina), viene dada por:

C= M / (2(πD.t)(1/2) ) exp (x2 /4Dt)

En que M = masa de colorante total difundido en una sección unidad, durante el tiempo t y x el espesor considerado de substrato (Ribé, 1970).

A continuación se presentan fundamentos relacionados con la deshidratación de un colorante ya que las variables que se establezcan en este proceso influyen en la estabilidad de un colorante.

Fundamentos de deshidratación

Deshidratación con aire caliente. En este proceso se presenta una transferencia de calor por convección y un contacto directo de la sustancia con el aire caliente en el cual tiene lugar la evaporación.

Para que el proceso de secado se realice en forma eficiente se requiere establecer las condiciones básicas del proceso como son: temperatura, humedad relativa del aire de secado, flujo de aire, tamaño y forma del producto (Perry, & Green, 1997.

Temperatura del aire de secado. Constituye un parámetro básico en el proceso de deshidratación con aire caliente. El incremento de temperatura aumenta la difusibilidad del agua, dentro del producto, acelerando en esta forma el proceso. Pero no se debe tener un excesivo incremento de temperatura, porque esto provoca deterioro de la calidad del producto debido a que se pueden presentar reacciones de pardeamiento, gelatinización y pérdidas de compuestos volátiles.

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Flujo de aire. El tiempo de secado depende de la cantidad de aire que pase a través del producto. Con base en las propiedades sicométricas del aire de secado, se debe establecer el flujo de aire para relacionarlo con la cantidad de producto que se requiere secar por unidad de tiempo y dimensionar el flujo de aire que se requiere para tal fin (Perry, & Green, 1997). Es indispensable conocer la humedad inicial del producto a deshidratar y entre los equipos con los cuales se puede medir la humedad inicial, está:

Lámpara halógena. El analizador halógeno de humedad funciona según el principio termo gravimétrico, registra el peso inicial de la muestra y una lámpara halógena seca la muestra, mientras una balanza integrada mide continuamente su peso, la pérdida de peso total se interpreta como contenido de humedad.

La lámpara halógena utiliza un elemento calefactor que está compuesto por un tubo de vidrio lleno de gas halógeno, por la cual la masa de la lámpara halógena es muy pequeña comparada con la un proyector infrarrojo convencional. Esto permite alcanzar en poco tiempo la potencia calorífica máxima y favorece una capacidad de regulación extraordinaria (Pecsok, 1976).

Muestreo. Es aplicable a la mayoría de alimentos menos líquidos. Consiste en recoger material de diferentes puntos del alimento o de distintos grupos del alimento, en una cantidad superior a la necesaria para el ensayo.

El principio consiste en que la cuarta parte debe ser representativa del todo, este material se disminuye en cuatro cuadrantes, previa homogenización, y se recoge el correspondiente a dos cuadrantes puestos, que se vuelven a mezclar y se procede a realizar el mismo procedimiento de cuarteo, hasta conseguir la cantidad de la muestra. Esta a su vez se puede realizar como:

Procedimiento manual: se mezcla todo el material. Este procedimiento es válido para muestras menores de 100 kg.

Procedimiento con cuarteador: Se utiliza un mezclador para garantizar homogeneidad. Este equipo se utiliza para cantidades mayores a 100 kg. (Juran, Frank, & Lingham, 2005)

2.2.2. MARCO REFERENCIAL

En la presente investigación se propone realizar la extracción del colorante de achiote por vía enzimática, para incrementar y determinar su estabilidad, con objeto de fomentar su empleo como una alternativa industrial viable, que sustituya el uso de

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tartrazina.

En la extracción vía enzimática, se pone en contacto las semillas de achiote con un volumen de agua en una relación 1:3 y la enzima alfa-amilasa (7.5 g enzima/kg semilla), agitación continua a una temperatura 60 °C, durante un tiempo de 3 horas, en este proceso se presenta la lixiviación de los pigmentos bixina y norbixina presentes en la semilla de achiote, generando un extracto acuoso.

Una vez terminada la lixiviación se separa la semilla del extracto acuoso y luego el extracto se somete a un calentamiento a 70 °C por un tiempo de 10 minutos para inactivar la enzima. Después se filtra para separar el residuo de semilla del extracto.

Al extracto acuoso se le adiciona maltodextrina referencia 1910 (almidón modificado) a una concentración de 1 % p-v con relación al volumen de extracto con el fin de encapsular los pigmentos (Bixina y Norbixina) agitando continuamente. Después de precipitar la maltodextrina con el colorante, se filtra para ser secado a tres temperaturas diferentes: 50, 55 y 60 °C.

Finalmente se empaca y se etiqueta en bolsas laminadas Flex Ap para protegerlo de la luz y la humedad.

Este proceso presenta ventajas considerables. Un rendimiento entre 10-11 %, un procedimiento de extracción simple ya que después del contacto entre semillas, agua y enzimas, las operaciones que se realizan posteriormente se pueden llevar a cabo fácilmente ya que los equipos requeridos son de fácil acceso (Casanova, & Ortiz, 2010).

A continuación se presenta el diagrama de flujo de la extracción por vía enzimática y secado del colorante de achiote en polvo.

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Diagrama de flujo 1. Extracción vía enzimática y secado de colorante de achiote en polvo

Figura 8. Diagrama de flujo de elaboración del colorante de achiote por vía enzimáticaFuente: (Casanova, & Ortiz, 2010)

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Selección

Semilla de achiote

Impurezas

LixiviaciónAgitación

Filtración

Calentamiento

Encapsulamiento

Sedimentación

Separación

Masa de colorante húmeda

Secado

Empacado y Almacenado

1 Parte de semilla seleccionada

Agua 3 partes

Temperatura: 60 °C, Tiempo: 3 horas Mezcla semilla – Enzima - Agua

Residuo de semilla sin colorante

Extracto de colorante

Temperatura: 70 °C, Tiempo: 10 minutos

Maltodextrina 1910 % p-v

Solución de colorante

Agua - Vapor

Temperatura: 60 °C

Colorante en polvo

Empaques - Etiquetas

Agua - sobrenadante

Agua - sobrenadante

10 kg de semilla

1011 gramos de

Enzima α Amilasa 7.5 g/kg semilla 7.5g/kg

Galletas

Las galletas (del francés galette) son en realidad productos de bollería ó pastelería por su composición y elaboración, se considera en una categoría independiente por diferenciar los otros dos tipos por su bajo contenido en agua (Bardón R, 2010).

La galleta se entiende por productos obtenidos por cocción de una masa no fermentada o con escasa fermentación, elaborados en forma mecánica y constituida por una mezcla de harina y agua, son productos de consistencia más o menos dura y crocante, obtenidas con harina, con o sin leudantes, leches, féculas, sal, huevos, agua potable, azúcar, mantequilla, grasas comestibles, saborizantes, colorantes, conservadores y otros ingredientes permitidos.

La variedad de trigo utilizada para la elaboración de este producto es el Triticumaestrum, que da como resultado una harina más débil, con un gluten incapaz de almacenar CO2 y aumentar el volumen. Las galletas con más cantidad de grasa deben ser protegidas de la luz debido a su fácil oxidación.

En cuanto a la clasificación de las galletas, existe una gran variedad de productos muy diferentes: saladas o dulces, simples o rellenas, o con diferentes agregados como frutos secos, chocolate, mermelada, entre otros. Se pueden clasificar en los siguientes grupos según la reglamentación técnico-sanitaria. Su clasificación depende de la forma de presentación (Bardón R, 2010):

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Marías, tostadas y troqueladas. Se elaboran a base de harinas, azúcares y grasas comestibles, se pueden añadir otros ingredientes para su enriquecimiento, formando una masa elástica a consecuencia del desarrollo del gluten. Se cortan por sistema de prensa o rodillo troquelado.

“Cracker” y de aperitivo. Se fabricarse de igual forma que las anteriores, pero sin azúcar y sus masas pueden someterse a fermentación para conseguir su ligereza.

Galletas tipo sándwiches. Son dos galletas, a las que se adiciona entre ambas un relleno consistente en una mezcla de azúcar, grasa y otros.

Bañadas con aceite vegetal. Se parte de galletas tradicionales que después de horneadas son sometidas a una dispersión o baño de aceite vegetal muy atomizado por su superficie e incluso por su parte inferior, según tipos.

Recubiertas de chocolate. cualquier clase de galletas puede presentarse recubiertas de chocolate, pasta de cacao o mezcla de azúcar, gelatina y agua.

Surtidas. Conjunto de galletas de diferentes especialidades agrupadas en un solo envase.

Las materias primas y características nutricionales de las galletas, son compuestas por los ingredientes básicos como: harina, grasa, azúcar y huevos; este determinan su valor energético y nutricional (Bardón R, 2010).

Harina. Se fabrican generalmente con harina de trigo, sin gran cantidad de salvado y pueden tener añadidas pequeñas cantidades de otras harinas o almidones, para conseguir sabores o propiedades estructurales especiales.

Agua. El agua permite que se produzcan cambios en otros ingredientes, tanto para formar una masa como luego para producir una textura rígida después de la cocción. Toda el agua añadida a la masa es eliminada en el horno.

Azúcar. Se puede conseguir en forma de cristales blancos o como azúcar líquido. Según el tipo de galleta a elaborar se va a optar por una u otra forma.

Jarabes. Se encuentran en el mercado los derivados de la sacarosa y los provenientes de la hidrólisis del almidón de maíz. Hay amplia variedad de ambos tipos de jarabes.

Miel. Es considerada un tipo de jarabe especial, es valorada por su sabor y se utiliza en formulaciones particulares.

Grasas y aceites. Las grasas, puede ser de fuente vegetal como animal. Se utilizan tanto en la masa que tiene la misión de anti-aglutinante y funciones de textura, como en forma de rociado superficial y en los rellenos de crema y en cubiertas.Emulsionantes. Sustancias cuya función es la de estabilizar las mezclas de dos líquidos inmiscibles como aceite y agua; como la lecitina es un emulsionante natural, se encuentra en la manteca, leche, yema de huevo, soja, entre otros.

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Leche. Suele utilizarse en forma deshidratada, entera o parcialmente descremada. Las características de sabor que imparte a las galletas son muy valoradas.

Huevos. Se adquiere en forma líquida o en polvo. La yema de huevo es rica en grasa y lecitina, estos componentes, junto con el sabor que proporcionan a las galletas han hecho del huevo un ingrediente tradicional de estos productos.

Saborizantes y potenciadores de sabor. A las galletas se les puede incorporar sabores en aceites esenciales vegetales, mezclas sintéticas aromáticas, especias, hierbas desecadas, molidas, frutos desecados y troceados. Los potenciadores del sabor son sustancias naturales o sintéticas que no tienen sabor marcado propio, pero que de alguna manera activan al paladar y nariz para hacerlos más sensibles a determinados sabores. La sal es el más importante y común de las sustancias de este tipo.

Colorantes. Sin aditivos colorantes, la mayoría de las galletas aparecerían del mismo color tostado claro. Los colorantes naturales suelen ser menos estables al calor, pH y a la luz, el poder colorante no es tan intenso como el de los artificiales.

Para la utilización de las diferentes materias primas existen unos requisitos que se deben cumplir con las normas correspondientes.

Requisitos generales que se deben considerar en la fabricación de productos de galletería:

Deben elaborarse a partir de materias sanas y limpias, exentas de impurezas de toda especie y en perfecto estado de conservación.

Será permitido el uso de colorantes naturales y artificiales, conforme a la norma de aditivos alimentarios.

A las galletas se les puede adicionar ingredientes tales como azúcares, edulcorantes, sal, productos lácteos y sus derivados, huevos, frutas, pasta o masa de cacao, grasad, aceites, levaduras y cualquier otro ingrediente apto para el consumo humano. (Téngase en cuenta las normas NTC para estos productos: NTC 1241, 2007).

En la formulación de galletas pueden emplearse aditivos tales como saborizantes, emulsificantes, acentuadores de sabor, leudantes, conservantes, humectantes, colorantes y antioxidantes autorizados, en las cantidades contemplados por la legislación nacional vigente o por la comisión del Codex Alimentarius NTC 1241, 2007)

Requisitos Fisicoquímicos para la fabricación de galletas

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Los siguientes valores son las cantidades máximas permisibles para este tipo de producto:

Tabla 2. Requisitos fisicoquímicos para la fabricación de galletas

Fuente: (NTC 1241, 2007)

Operaciones básicas para elaborar un producto de galletería:

Existen algunas operaciones básicas empleadas en la elaboración de galletas y están conformadas por:

Recepción. Se inicia con la recepción de materiales y su posterior análisis para verificar que cumplan con las especificaciones de calidad.

Pesaje y formulación. Los componentes requeridos para elaborar la masa son pesados en recipientes de acero inoxidable. El tipo de galleta a elaborar dependerá ampliamente de la formulación y sus componentes de la masa, como harina, sal, azúcar, bicarbonato de sodio, grasas, leche, saborizantes y agua.

Cremado. Los ingredientes son mezclados con la grasa a fin de obtener una crema, continuando con la adición de harina, siendo esta la primera etapa. Esta mezcla se puede realizar en dos o tres etapas.

Mezclado. Todos los ingredientes son mezclados en una sola etapa incluyendo el agua; una parte del agua se utiliza para disolver los agentes químicos, saborizantes, colorantes, prosiguiéndose con el mezclado hasta obtener una masa satisfactoria (Manley, D. J. R. 1989).

El orden y la forma como se adiciona y mezcla los ingredientes determinan la textura de la pasta. Se obtiene en un orden específico los ingredientes. La mezcla del agua y la harina y la continua agitación permiten que la proteína contenida en la harina absorba el agua y se desarrolle el gluten, que confiere a la masa una textura pegajosa y fibrosa. A través de la agitación se controlan las características del producto final en cualquier proceso de panificación y bizcochería ya que el gluten sigue creciendo va tomando una textura más suave y más elástica.

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Requisitos en 100 g de muestra Mínimo

Máximo

pH de solución acuosa al 10% 5.6 9.5Proteína, % en fracción en masa en base seca 3.0 -Humedad en % - 10.0Contenido de metales pesados, plomo, como Pb mg/kg

- 0.2

Generalmente el tiempo de mezclado es de 15 minutos, durante el cual el azúcar se disuelve en la mezcla y la harina se hidrata. Después de haber realizado la mezcla se coloca la masa en reposo por 30 minutos para permitir que la masa tome la textura adecuada.

Amasado. Consta de dos etapas: primero, la grasa, azúcar, jarabes, harinas y ácidos son mezclados hasta obtener una crema corta. Luego se añade agua (y/o leche) conteniendo los agentes alcalinos, sal, etc. mezclándose hasta alcanzar una masa homogénea. En la primera etapa, la harina es cubierta con la crema para actuar como una barrera contra el agua, formando el gluten con la proteína (Manley, D. J. R. 1989).

Laminado. Para dar a la masa un espesor adecuado, se pasa a través de una banda transportadora y con un sistema de rodillos se proporciona el grosor que requiere para el corte. Posteriormente la masa pasa a través de un detector de metales para determinar la presencia de algún objeto metálico extraño que haya caído en ella en las etapas previas.

Corte. El corte de la masa tiene lugar en una banda transportadora sobre la cual se ubica un rodillo provisto de un molde con las formas de las galleteas en bajorrelieve. La masa cortada en forma de galleta se separa de la masa sobrante, la cual es llevada nuevamente a la etapa de laminado por medio de una banda trasportadora, mientras que las galletas formadas continúan por una banda transportadora a la etapa de horneado.

Horneado. Las galletas se pasan a la etapa de horneado para eliminar la humedad y darles el volumen y la consistencia adecuada. La temperatura de horneado es de 250ºC, obteniendo un producto de color castaño debido a las reacciones de Maillard, que son un conjunto de reacciones químicas producidas entre las proteínas y los azúcares reductores a altas temperaturas; este proceso es una caramelización de los alimentos, donde en la galleta se producen el sabor, color y textura característicos.

Enfriado. El enfriado de las galletas se realiza a temperatura ambiente a través una serie de bandas transportadoras la cuales llevan las galletas desde la etapa de dosificado hasta el apilado de éstas. El enfriado es importante porque si se empacan en caliente es más fácil que se dañen y que formen capas de humedad dentro del empaque.

Empaque. Se empacan las galletas en bolsas que no permita el paso de la humedad para mantener su consistencia una vez empacadas es estiban o se disponen en canastas para su almacenamiento y distribución.

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En la siguiente página se presenta el diagrama de flujo del proceso de elaboración de un producto de galletería:

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Diagrama de flujo 2. Proceso de elaboración de galletas

Fuente: (Castañeda, 2013)

Formulación estándar de producto de galletería

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Pesaje / Formulación

Cremado

Mezclado

Laminado

Cortado

Horneado: T°: 250°C y Tiempo: 8

min.

Ingredientes Secos

Colorante

Ingredientes

Recepción yAlmacenamiento

Bicarbonato de Sodio

Enfriado

Empaque

A continuación se presenta en la tabla 3, la formula estándar del producto de galletería a elaborar.

Tabla 3. Formulación estándar de un producto de galletería

Fuente: Castañeda. 2013

2.2.3. MARCO CONCEPTUAL

Aditivos alimentarios. Según el Codex Alimentarius, los aditivos son sustancias o mezcla de sustancias independiente de su valor nutricional, añadido intencionalmente, para lograr ciertos beneficios en un producto, siendo estos inocuos.

Anova. Técnica fundamental que desarrolla un contraste de hipótesis estadísticas, que afecta simultáneamente a los valores medios de k poblaciones (variables aleatorias) con distribución normal y homoscedásticas, es decir, con idénticas varianzas.

Azoico. Colorante compuesto que Contiene nitrógeno y se emplea para la tinción.

Carotenoides. Colorantes presentes en fuentes vegetales y animales

Colorante. Que imparte color, obtenida de fuente animal, vegetal, mineral o por síntesis. Es añadida o aplicada a los productos alimenticios y no alimenticios, con capacidad de intensificar o restaurar el color.

Colorimetría. Técnica o método cuantitativo para la determinación la intensidad de un color.

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INSUMOS PORCENTAJEHarina de soya 6.30Harina de trigo 41.89Harina de quinua 3.96Leche en polvo 2.75Margarina 14.00Azúcar 30.00Sal 0.50Bicarbonato 0.40Saborizante 0.10Colorante 0.10Total 100.0

Colorantes alimentarios. Son sustancias que añaden color a un alimento incluyendo componentes naturales o artificiales extraídos por métodos físicos o químicos.

Cromatografía. Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil.

Espectrofotometría. Métodos cuantitativos de análisis químico que utilizan para medir la absorción o la transmisión de luz por las sustancias.

Enzimas. Sustancia proteínica que producen las células vivas y que actúa como catalizador de los procesos del metabolismo. Es específica para cada reacción o grupo de reacciones.

Estabilidad. Permanencia de las características de un elemento o de una situación a través del tiempo, de su condición de estable o constante.

Inocuidad. Producto que no representa riesgos de daño a la salud del consumidor.

Maltodextrina. Polímero de dextrosa obtenido a partir de la hidrólisis parcial del almidón, por procesos enzimáticos (a-amilasas).

Muestra. Cantidad de producto que se toma para realizarle un análisis de propiedades o características.

Nutriente. Sustancia procedente del exterior de la célula y que ésta necesita para realizar sus funciones vitales. El nutriente es tomado por la célula y transformado en constituyente celular a través de un proceso metabólico de biosíntesis llamado anabolismo o bien es degradado para la obtención de otras moléculas y de energía.

Producto de galletería. Producto de consistencia más o menos dura y crocante, de forma variable, obtenidas por el cocimiento de masa preparada con harina, con o sin leudantes, leches, féculas, sal, huevos, agua potable, azúcar, mantequilla, grasas comestibles, saborizantes, colorantes, conservadores y otros ingredientes permitidos debidamente autorizados.

Tono. Atributo asociado con la longitud de onda dominante en una mezcla de ondas de luz. Así, el tono representa el color percibido por el observador; cuando llamamos a un objeto rojo, naranja o amarillo estamos especificando el tono.

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2.3 OBJETIVOS

2.3.1. OBJETIVO GENERAL

Determinar la estabilidad del colorante de achiote obtenido por vía enzimática variando tres condiciones de proceso y evaluar el desempeño en un producto de galletería.

2.3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Establecer el factor y niveles de variación en la etapa de extracción enzimática (α –amilasa), del colorante a partir de la semilla de achiote.

Establecer los factores y niveles de variación en la etapa de secado para obtener el colorante de achiote en polvo.

Establecer el diseño experimental para determinar el efecto de las variables independientes (pH, flujo secado y temperatura de secado) sobre las variables dependientes relacionadas con las variables de respuesta.

Empacar las muestras de colorante de achiote en polvo en bolsas Flex – Ap laminadas.

Realizar análisis de calidad a las muestras de colorante de achiote obtenidas (color, tono, coeficiente de difusión, porcentaje de metabolitos secundarios y humedad)

Elaborar el producto de galletería aplicando las muestras de colorante de achiote obtenidas.

Realizar análisis de calidad (color, tono, coeficiente de difusión, % bixina, % norbixina, humedad)

Establecer tiempo y frecuencia para medir el desempeño de las muestras de colorante de achiote en polvo sin aplicar y aplicadas en un producto de galletería.

Realizar el procesamiento estadístico de los datos obtenidos utilizando el paquete estadístico ANOVA

Realizar el análisis estadístico de los resultados.

2.4 METODOLOGÍA PROPUESTA

Esta investigación es un estudio de tipo exploratorio y descriptivo ya que se debe explorar por medio de resultados analíticos el comportamiento del colorante y realizar luego un análisis del efecto de las diferentes variables dependientes de la estabilidad del colorante y luego realizar una correlación con las variables independientes.

Para esta metodología de investigación, se emplea como materia prima la semilla de achiote y el método diseñado en el proyecto de grado titulado “Extracción de bixina de

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la semilla de achiote con biocatalizadores” (Casanova, & Ortiz, 2010). Este método utiliza la enzima α –amilasa ya que en dicho método no se determinó la estabilidad del colorante obtenido.

Teniendo en cuenta los factores relevantes de la extracción del colorante por vía enzimática y las condiciones o requisitos buscados a nivel industrial para el uso de éste en formulaciones de alimentos, se establecen los niveles de variación para implementar esta metodología.

Se consideran como Factores y niveles de variación del proceso de extracción del colorante de achiote por vía enzimática (α –amilasa), los siguientes:

Temperatura de secado. Se trabajarán tres diferentes temperaturas de secado (50 °C, 55 °C y 60 °C). Estas temperaturas fueron establecidas teniendo en cuenta no superar la temperatura de 60 °C para evitar la degradación de la bixina a norbixina (UAC. 2008), ya que se pretende lograr un colorante que contenga tanto el pigmento bixina como la norbixina.

pH del extracto. El pH variará en tres niveles (3, 6 y 9), ya que se pretende valorar la influencia de esta variable en la estabilidad del colorante con respecto a la capacidad de colorear y su solubilidad al ser introducido en la formulación de un producto alimenticio (galletería). Para ajustar el pH del extracto, se utilizan soluciones de hidróxido de sodio 0.1N y ácido clorhídrico 0.1N.

Flujo del aire de secado. El secado del colorante se realizará en un horno de bandejas rotatorio con un extractor de aire y variador de velocidad, lo que permite variar el flujo de aire (m3/h). Los niveles de variación del flujo de aire se establecerán con base en las características de diseño del horno disponible como son (5, 10, y 15 m3/h).

Tabla 4. Variaciones para extraer colorante en polvo.

Temperatura de secado

(°C)

pHExtract

o

Flujo del aire de secado(m3/h)

50 3 555 6 1060 9 15

Fuente: (Castañeda, 20013)

Diseño experimental

Para el análisis de las variables de extracción y el secado del colorante el número de combinaciones de los factores y niveles de variación del proceso se determinan por

36

medio de un diseño de experimental de tipo factorial de tres factores los cuales tiene tres niveles cada uno de la forma 3x3x3 para un total de 27 tratamientos.

Las variables experimentales independientes (factores) seleccionados para realizar los ensayos correspondientes al diseño experimental son:

Temperatura de secado: T1 = 50 °C, T2 = 55°C, T3 = 60 °C Flujo del aire de secado: F1 = 5 m3/h F2 = 10 m3/h F3 = 15 m3/h pH del extracto: pH1= 3 pH2 = 6 pH3 = 9

El orden de los ensayos se establece de manera aleatoria con el fin de garantizar la validez de la inferencia estadística y así eliminar la presencia de sesgo en los análisis. Cada ensayo se realiza con dos réplicas al azar.

Variables de respuesta

Contenido de Bixina y norbixina (determinado mediante cromatografía HPLC)Contenido de humedad del colorante en polvoColor L, a, bTono (h)Coeficiente de difusión D.E.Procesamiento estadístico con el aplicativo ANOVA

Puede afirmarse que Yijkl, es cualquier dato u experimento, µ la media total del experimento, Ai el efecto de un determinado nivel de tratamiento, Bj. El efecto de un determinado bloque, (AB)ij el efecto cruzado o el efecto de la casilla y Ɛijkl el error experimental. Un diseño factorial de tres factores asociado con el modelo estadístico apropiado es:

Donde:

Este modelo se supone cuando el investigador se interesa únicamente en los a niveles del factor a, en los b niveles del factor b y en los c niveles del factor c presentes en el experimento. Estas suposiciones están sintetizadas en:

37

Tabla 5. ANOVA

Fuente de Variación Suma de cuadrados medios

Tratamientos

A a – 1

B b – 1

C c – 1

AB (a – 1) (b – 1)

AC (a – 1) (c – 1)

BC (b – 1) (c – 1) (b – 1) (c– 1)

ABC (a – 1) (b – 1) (c –1)

Error experimental adc (r – 1)

Total abcrFuente. (Castañeda, 2013)

El modelo estadístico

El modelo estadístico que se aplicará es el siguiente (indicado por Castañeda, 2013)

Yijkl = μ + Zi + ∝j + YK + (Zα)ij + (ZY)ik + (αYjk) + ZαY)ijk + εijkl

i=1,2,3………….a=3j=1,2…………….b=3k=1,2…………….r=3

38

Yijkl=Observación debida al i-ésimo nivel de factor A (Temperatura de secado), del j-ésimo nivel del factor B (Flujo aire secado), del k-ésimonivel del factor C (pH del extracto) y la i-ésimo réplica.

μ= Media general

Zi= Efecto debido al i-ésimo nivel del factor A (temperatura de secado)

αj= Efecto debido al j-ésimo nivel del factor B (flujo de aire de secado)yk= Efecto debido al k-ésimo nivel del factor C (pH del extracto)

(Zα)ij= Efecto debido a la interacción entre el i-ésimo nivel de factor A (temperatura de secado) y el j-ésimo nivel del factor B (flujo de aire de secado)

(Zy)ik= Efecto a la interacción entre el i-ésimonivel de factor A (temperatura de secado) y el k-ésimo nivel del factor C (pH del extracto)

(αy)jk= Efecto a la interacción entre el j-ésimonivel de factor B (flujo de aire de secado) y el k-ésimo nivel del factor C (pH del extracto)

(Zαy)ijk= Efecto a la interacción entre el i-ésimonivel de factor A (temperaturas de secado), el j-ésimo nivel del factor B (flujos de aire de secado) y el k-ésimonivel del factor C (pH del extracto).

εijkl= Error experimental debido ali-ésimonivel de factor A (temperatura de secado, del j-ésimo nivel del factor B (flujos de aire de secado), del k-ésimonivel del factor C (pH del extracto) y la i-ésimo réplica.

La Hipótesis a trabajar por tanto, es:

H0: (Zα)ij = 0 para todo i,j.H1: al menos un (Zα)ij ≠ 0

H0: (Zy)ik = 0 para todo i,k.H1: al menos un (Zy)ik ≠ 0H0: (αy)jk = 0 para todo j,k.H1: al menos un (αy)jk≠0

H0: (Zαy)ijk = 0 para todo i,j,k.H1: al menos un (Zαy)ijk≠0

z1 = z2 =⋯=0Al menos un zi ≠0

39

a1 = a2=⋯=0Al menos un ai ≠ 0

y1 = y2=⋯=0Al menos un yk ≠0

Cada ensayo se realiza con dos réplicas al azar; los análisis estadísticos serán realizados utilizando el software MINITAB mediante un ANOVA. Las diferencias existentes entre los tratamientos serán indicadas por una prueba de comparación de pares de medias El Procedimiento para elaboración de las muestras de colorante de achiote será con base en el diagrama de flujo 1, establecido en la pag.22.

Para obtener las muestras de colorante, se deben considerar las materias primas e insumos, equipos e instrumentos y el procedimiento a utilizar. La elaboración de las muestras de colorante se realizará en la planta de alimentos perteneciente al Programa Académico de Tecnología en Alimentos de la Universidad del Valle Sede Tuluá, con base en el siguiente procedimiento:

Selección. La selección se realiza para garantizar semillas libres de impurezas e infestaciones de insectos. Esta selección se realiza manualmente.

Selección mecánica. Empleando un tamiz con diámetro de malla > a 4 mm para separar las impurezas y objetos extraños.

Pesado materias primas. Se procede a pesar la semilla, la enzima y a medir el agua para mezclarlos en la marmita.

Lixiviación enzimática variando pH. Se mezclan 10 kg de semilla de achiote seleccionadas con un 30 litros de agua desmineralizada (relación 1:3) y 75 gramos de enzima alfa-amilasa (7.5 g enzima/kg semilla), con una agitación continua durante 3 horas a una temperatura de 60 °C. Este procedimiento se realiza por separado para los valores de pH = 3, pH = 6 y pH = 9. Estos valores de pH se logran aplicando la cantidad necesaria de solución de ácido clorhídrico (HCl) 0.1 N ó solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0.1 N.

Filtración. Para cada condición de pH se separa la semilla del extracto acuoso, utilizando un tamiz con diámetro de malla 1 mm.Calentamiento. Para cada condición de pH, el extracto se calienta hasta una temperatura de 70 °C por un tiempo de 10 minutos para inactivar la enzima.

Encapsulamiento. En la marmita, con agitación continua por un tiempo de 30 minutos, para cada condición de pH, al extracto acuoso se le adiciona almidón modificado (Malto

40

dextrina referencia 1910), con el fin de encapsular los pigmentos (bixina y norbixina) a una concentración de 2.5 % p-v con relación al volumen de extracto.

Sedimentación del colorante. Cuando finalice la agitación se deja reposar la mezcla para cada condición de pH con el fin de que el almidón que contiene el colorante se sedimente, generando un sedimento y un líquido sobrenadante.

Separación de la masa de colorante del líquido sobrenadante. La marmita tiene un sistema de volco que facilita el vaciado del líquido sobrenadante. Una vez separado este líquido para cada condición de pH, se procede a recoger la masa de colorante y se protegen con papel aluminio para ser almacenadas en condiciones de refrigeración a 5°C.

Deshidratación. La deshidratación se realiza en un horno a gas rotatorio de bandejas que tiene medidor y controlador de flujo de aire de secado, medidor y controlador de temperatura, medidor de humedad relativa.

Materias primas e insumos

Las materias primas e insumos para elaborar las muestras del colorante derivado del achiote son:

Semilla de achiote Agua desmineralizada Enzima α-amilasa Malto dextrina 1910 Solución de HCl 0.1 N Solución NaOH 0.1 N Bolsas laminadas Flex - Ap capacidad 5 – 10 - 50 - 100 gramos Bolsas de polietileno con capacidades de 5 – 10 - 25 - 50 -100 gramos

La semilla de achiote se adquirirá en la planta de transformación de “productos de la Bixa orellana” ubicada en las instalaciones de la Universidad del Valle Sede Tuluá.

El agua a utilizar debe ser desmineralizada, la cual se obtiene del mercado como lo es la marca agua cristal.

La enzima será adquirida de la empresa Proenzimas Ltda., ubicada en la ciudad de Cali, la cual debe mantenerse refrigerada a 5 °C., condición que puede lograrse almacenándola en la nevera perteneciente a la planta de alimentos de la Universidad del Valle Sede Tuluá.

El empaque será adquirido a la Organización Alico de la ciudad de Cali. Este empaque denominado Bolsa FlexUp con cierre hermético tipo zipper, está construido con

41

materiales laminados los cuales se pueden usar en productos del sector alimenticio (cárnicos, quesos, lácteos, salsas, aderezos, arepas, tortillas, productos de panadería y repostería); cosmético, agroindustriales, farmacéuticos, textiles. La lámina está construida de materiales multicapas que permiten la combinación de materiales plásticos y no plásticos permitidos, donde se ofrecen estructuras con barrera a la luz, humedad, oxígeno, aromas, resistencia química, resistencia mecánica, resistencia al punzado y resistencia al calor.

Equipos e instrumentos

Para el desarrollo de esta propuesta de investigación, se emplearán equipos e instrumentos facilitados por el Laboratorio y la Planta de alimentos de la Universidad del Valle Sede Tuluá, los cuales se relacionan a continuación:

Tamiz con diámetro de orificio > 4 mm Tamiz con diámetro de orificio 1 mm Balanza digital capacidad 0 - 50 Kg Recipientes graduados con capacidades de: 1 – 5 - 10 litros Marmita con agitación Horno de bandejas rotatorio con quemador a gas pH - metro Material de vidriería de laboratorio (Beakers, erlenmeyer, probetas, pipetas, entre

otros)

Existen otros equipos que el Laboratorio y la planta de alimentos de la Universidad del Valle Sede Tuluá no poseen actualmente como son:

Balanza analítica Balanza digital 0 – 5 kg Colorímetro Tamices diámetro orificio 1 y 4 mm

Estos equipos serán adquiridos con los recursos financieros de aporte al proyecto por parte de la Vicerrectoría de investigaciones como son:

Relación de muestras de colorante con base en la combinación de los factores pH, Flujo de aire secado y Temperatura de secado

Los factores a variar en la obtención de las muestras de colorante por vía enzimática son pH extracto – Tsecado – Flujo del aire secado.

Se toman muestras de 60 gramos por duplicado de cada una de las muestras de masa de colorante con pH = 3, 6 y 9 aplicando el método de cuarteo para cada combinación

42

de Ts y Fs.

Las dos muestras para cada combinación se colocan separadas en una bandeja que tiene medidas de 65 cm x 44 x 2 cm.

Se precalienta el horno y se fijan las condiciones de operación para cada combinación hasta alcanzar condición estable.

Se introducen las muestras al horno y se empieza a medir el tiempo de secado (tiempo estimado 12 – 14 horas).

Una vez transcurrido el secado, se apaga el horno y se espera que se enfríe a condiciones ambientales. Se retiran las muestras de colorante, se pesan y empacan inmediatamente en las bolsas de aluminio para protegerlas de la humedad del ambiente. Las muestras a obtener según las diferentes combinaciones de factores, se presentan en la tabla 6.

43

Tabla 6. Combinaciones de los factores a variar en la elaboración de muestras de colorante de achiote.

Fuente:

Castañeda (2013)

Análisis de calidad de las muestras de colorante de achiote obtenidas

A continuación se describen los diferentes tipos de análisis de calidad que se deben realizar a cada una de las muestras de colorante obtenidas, teniendo en cuenta las variables de respuesta como son: Contenido de metabolitos secundarios bixina y norbixina, contenido de humedad del colorante en polvo, color L, a, b, tono (h) y coeficiente de difusión D.E.

44

pHTemperatura secado (Ts) – Flujo aire

secado (Fs)No.

Muestras

3.0

Ts1 – Fs1Ts1 – Fs2Ts1 – Fs3

222

Ts2 – Fs1Ts2 – Fs2Ts2 – Fs3

222

Ts3 – Fs1Ts3 – Fs2Ts3 – Fs3

222

6.0

Ts1 – Fs1Ts1 – Fs2Ts1 – Fs3

222

Ts2 – Fs1Ts2 – Fs2Ts2 – Fs3

222

Ts3 – Fs1Ts3 – Fs2Ts3 – Fs3

222

9.0

Ts1 – Fs1Ts1 – Fs2Ts1 – Fs3

222

Ts2 – Fs1Ts2 – Fs2Ts2 – Fs3

222

Ts3 – Fs1Ts3 – Fs2Ts3 – Fs3

222

Contenido de bixina y norbixina. Se toman 20 gramos de cada una de las muestras y se empacan en bolsas laminadas Flex-Ap y se envían al laboratorio de análisis industriales del Departamento de Química de la Universidad del Valle Cali, solicitando el análisis de la composición de los metabolitos secundarios bixina y norbixina por medio de la técnica cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC).

Contenido de humedad del colorante en polvo. Se toma 1 gramo de cada una de las muestras obtenidas y se colocan en la balanza determinadora de humedad marca Ohaus (+/- 0.1), con lámpara halógena, la cual permite mostrar, almacenar y registrar la humedad final, el tiempo y la curva de secado. Este análisis se realiza en el laboratorio de alimentos de la Universidad del Valle Sede Tuluá.

Color L, a, b del colorante en polvo. Se toma cada una de las muestras de colorante y se preparan las respectivas soluciones diluciones a las cuales se le mide la absorbancia en el espectrofotómetro de UV visible. Con estos datos se construye una curva patrón.

Tono (h). Se toma cada una de las muestras de colorante y se preparan las respectivas soluciones diluciones a las cuales se le mide el tono en el colorímetro, ubicado en el laboratorio de Química de la Facultad de ciencias de la Universidad del Valle.

Coeficiente de difusión (DE). Se toma cada una de las muestras de colorante para medir el coeficiente de difusión DE en un espectrofotómetro de UV visible.

Análisis comparativo de los resultados de calidad de las muestras de colorante de achiote con la tartrazina

Se contratarán los análisis de calidad de la tartrazina con la empresa Colorquimica S.A., ubicada en Medellín (Colombia). Estos análisis incluyen: Pureza, contenido de humedad, color, tono (h) y coeficiente de difusión D.E.

Comparar los resultados de los análisis de calidad de cada una de las muestras de colorante de achiote con los análisis de la tartrazina como patrón.

Identificar las muestras de colorante de achiote que cumplen con una desviación de +/- 10% en el color, tono y coeficiente de difusión con respecto a la tartrazina.

Si todas las muestras cumplen con la condición anterior, se selecciona por cada pH la muestra que presente la menor desviación.

Sí existen muestras que no cumplen, se toman las muestras restantes para realizar las aplicaciones. Se prosigue con la elaboración del producto de galletería aplicando

45

colorante.

En la Tabla 7 se presenta la formulación del producto de galletería a elaborar:

Tabla 7. Fórmula estándar de producto de galletería.

Fuente. (Organización Alico, 2013)

Con base en la formulación y procedimiento establecidos se elaboran las muestras del producto de galletería aplicando en cada una los diferentes tipos de colorantes de achiote obtenidos.

Se procede a empacar cada una de las muestras de producto en bolsas laminadas Flex – Ap. Se almacenan las muestras empacadas en una cámara que simula condiciones ambientales normales de Temperatura y humedad relativa.

Determinación de la estabilidad del colorante de achiote

Se toman tres réplicas de cada una de las muestras de galletas coloreadas con colorante de achiote, midiendo cada 2 días y durante un mes, el color, tono y coeficiente de difusividad en el laboratorio de alimentos de la Universidad del Valle Sede Tuluá y se registrarán en la Tabla 8, presentada en la siguiente página:

46

INSUMOS PORCENTAJE %Harina de soya 6.30Harina de trigo 45.85Leche en polvo 2.75Margarina 14.00Azúcar 30.00Sal 0.50Bicarbonato 0.40Saborizante 0.10Colorante 0.10Total 100.0

Tabla 8. Resultados de color, tono y (D.E) de las muestras de galletas con colorante de achiote

Muestra Día Replica 1 Replica 2 Replica 3Color Tono DE Color Tono DE Colo

rTono

DE

i

1357911131517192123252729

Fuente: (Castañeda, 2013)

2.5 RESULTADOS/PRODUCTOS ESPERADOS Y POTENCIALES BENEFICIARIOS

Se espera obtener una ruta óptima del proceso de extracción enzimática y secado del colorante de achiote en polvo que a su vez permita maximizar la estabilidad de dicho colorante. Asociada a la ruta óptima en la etapa de extracción enzimática el valor de pH óptimo y los valores óptimos de temperatura y flujo de aire en la etapa de secado.

La determinación de las condiciones óptimas de extracción y secado del colorante de achiote podrán ser aplicadas en un proceso de producción con el fin de ofrecer un colorante natural de achiote en polvo tal que presente igual o mayor estabilidad que el colorante sintético como la tartrazina.

La valoración de la calidad del colorante de achiote en polvo con y sin aplicación en un producto de galletería, permitirá establecer la velocidad de la perdida de estabilidad y poder asociarla con las condiciones de extracción.

47

1. RELACIONADOS CON LA GENERACIÓN DE CONOCIMIENTO Y/O NUEVOS DESARROLLOS TECNOLÓGICOS:

Tabla 9. Generación de nuevo conocimiento

Resultado/producto esperado Indicador BeneficiarioConocimiento de la ruta óptima del proceso de extracción enzimática y secado del colorante de achiote en polvo que a su vez permita maximizar la estabilidad de dicho colorante.

Publicación en revistaNacional e indexada.

Comunidad científica, académica y la

industria.

Conocimiento de la calidad (color, tono, coeficiente de difusión % bixina, % norbixina, humedad), del colorante de achiote en polvo extraído vía enzimática variando condiciones de pH, temperatura y flujo de aire de secado.

Publicación en revistaNacional e indexada.

Comunidad científica, académica y la

industria.

Conocimiento de la velocidad de la pérdida de estabilidad del colorante de achiote en polvo con y sin aplicación en un producto de galletería.

Publicación en revistaNacional e indexada.

Comunidad científica, académica y la

industria.

2. CONDUCENTES AL FORTALECIMIENTO DE LA CAPACIDAD CIENTÍFICA NACIONAL

Tabla 10. Fortalecimiento de la capacidad científica.

Resultado/producto esperado

Indicador Beneficiario

Formación de recurso humano a nivel de pregrado

Formación de estudiantes de Tecnología en Alimentos.

2

Universidad del Valle Sede-Tuluá, Universidad del Valle Cali y la comunidad científica.

Fortalecimiento de la cooperacióncientífica

Fortalecimiento del semillero de investigación de alimentos SITECA de la Universidad del Valle Tuluá.

Comunidad científica.

48

3. DIRIGIDOS A LA APROPIACIÓN SOCIAL DEL CONOCIMIENTO

Tabla 11. Fortalecimiento de la capacidad científica

Resultado/producto esperado

Indicador Beneficiario

Transferencia del conocimiento sobre la ruta óptima de proceso para la extracción vía enzimática y secado del colorante de achiote en polvo con la mayor, a las Pymes del centro del Valle contribuyendo a la competitividad. .

Numero de Pymes que han apropiado el conocimiento

Comunidad local y regional.

Tabla 12. Productos esperados.Tipo de productos Cantidad

Productos de nuevos conocimientosArtículo completo publicado en revistas A1 o A2 Artículo completo publicados en revistas BArtículo completo publicados en revistas C

2

Libros de autor que publiquen resultados de investigaciónCapítulos en libros que publican resultados de investigaciónProductos o procesos tecnológicos patentados o registrados Prototipos y patentes Software Productos o procesos tecnológicos usualmente no patentables o protegidos por secreto industrial

1

Normas basadas en resultados de investigación

49

Formación de recursos humanos No. de estudiantes vinculados

No. de trabajos terminados1

Pregrado 3 1MaestríaDoctoradoEstudiantes vinculados al programa de semilleros de investigación (matriculados en pasantía I-II)

Productos de divulgación

Publicaciones en revistas no indexadas o sus equivalentes

Ponencias presentadas en eventos (congresos, seminarios, coloquios, foros)

No. de ponencias nacionales

No. de ponencias

internacionales

1

Propuesta de investigación

Propuestas para ser presentadas a convocatorias externas 2014-2015

1Evaluar como la velocidad de la

degradación de la estabilidad está relacionada con las propiedades antimicrobianas del colorante de

achiote

1 Trabajos de grado O Proyectos de investigación de maestría

50

2.6 IMPACTOS ESPERADOS A PARTIR DEL USO DE LOS RESULTADOS

Tabla 13. Impactos esperados:

Impacto esperado

Plazo (años) después de finalizado el proyecto: corto (1-4 ), mediano (5-9), largo

(10 o más)

Indicador verificable

Supuestos*

Social Largo plazo: Mejoramiento de la calidad de vida de losconsumidores de productos de galletería

Aplicación por parte de los productores de productos de galletería del colorante natural en polvo extraído aplicando las condiciones de la ruta óptima d.

Productividad ycompetitividad

Corto plazo: Colorante natural de achiote en polvo estable

Que el colorante presente alto nivel de estabilidad

2.7 IMPACTO AMBIENTAL DEL PROYECTO

En este proyecto tanto los materiales como las técnicas empleadas son seguros para el medio ambiente. Tanto el laboratorio de química como la planta de alimentos de la Universidad del Valle Sede Tuluá han sido adaptados con las exigencias y regulaciones específicas del Ministerio del Medio ambiente y de Protección Social del Gobierno de Colombia.

En la etapa de extracción solo se genera un residuo sólido como son las semillas de achiote de la especie B.orellana L., las cuales después de filtrar el extracto se serán recogidas y almacenados separadamente de cualquier otro residuo no vegetal con el fin de entregarlo a los cultivadores de achiote que hicieron parte del proyecto “Cultivo y cosecha de la Bixa orellana en el Centro del Valle del Cauca” para que sea utilizarlo como abono. El líquido correspondiente al extracto es luego sometido a un secado donde solo se produce vapor de agua y los gases de la combustión del gas propano en el horno de secado.

51

2.8 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Fases Actividad Tiempo (meses)1 2 3 4 5 6 7 8 9 1

011

12

1 Búsqueda de bibliografía2 Diseño experimental

3

Extracción colorante de la semilla de achiote Adquisición de semilla de

achiote Acondicionamiento de la

semilla Adquisición enzima Adquisición Maltodextrina Adquisición bolsas Flex-Ap

laminadas Acondicionamiento planta

piloto alimentos y equipos Lixiviación Filtración Encapsulamiento con

maltodextrina Secado del extracto de

colorante Empacado muestras de

colorante

4Análisis de calidad de las muestras de colorante de achiote en polvo

5Elaborar el artículo 2 y radicar en revista indexada tipo C

6Elaboración producto de galletería aplicando muestras de colorante de achiote en polvo

7 Medición de las variables de respuesta Realizar análisis de calidad

(color, tono. Coeficiente de difusividad, %bixina, %norbixina, humedad) con una frecuencia semanal a las muestras de colorante de achiote en polvo.

52

Realizar análisis de calidad (color, tono. Coeficiente de difusividad, %bixina, %norbixina, humedad) con una frecuencia semanal a las muestras de del producto de galletería con la aplicación del colorante de achiote en polvo.

7

Procesamiento y análisis estadístico Realizar el procesamiento

estadístico por medio del ANOVA

Realizar el análisis estadístico de los datos procesados

8 Conclusiones9 Elaborar el artículo 2 y radicar en

revista indexada tipo C

10

Elaborar el informe final con los resultados y conclusiones del proyecto y entregar a Vicerrectoría de Investigaciones

11 Presentación ponencia seminario

2.9 DISPOSICIONES VIGENTES

Decreto 3075 de 1997, Sector alimentos (fabricación y procesamiento de alimentos para consumo humano), reglamentado por el Ministerio de Protección Social. (INVIMA) por medio del cual se establecen Las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) que consisten en los principios básicos y prácticas generales de higiene en la manipulación, preparación, elaboración, envasado, almacenamiento, transporte y distribución, con el objeto de garantizar que los productos se fabriquen en óptimas condiciones sanitarias y se disminuyan los riesgos inherentes a la producción.

Decreto 60 de 2002 (enero 18) Diario Oficial No. 44.686, de 24 de enero de 2002 DEL MINISTERIO DE SALUD Por el cual se promueve la aplicación del Sistema de Análisis de Peligros y Puntos de Control Crítico - HACCP en las fábricas de alimentos y se reglamenta el proceso de certificación. El Sistema HACCP es utilizado y reconocido actualmente en el ámbito internacional para asegurar la inocuidad de los alimentos y que la Comisión Conjunta FAO/OMS del Codex Alimentarios, propuso a los países

53

miembros la adopción del Sistema de Análisis de Peligros y Puntos de Control Crítico HACCP, como estrategia de aseguramiento de la inocuidad de alimentos y entregó en el Anexo al CAC/RCO 1-1969, Rev.3 (1997) las directrices para su aplicación.

3.0 PRESUPUESTO

Presupuesto global (en miles de pesos)

RUBROS

FUENTES

CONTRAPARTIA EN

ESPECIE

SOLICITADO A LA

CONVOCATORIA

OTRAS FUENTES 2 TOTAL

PERSONAL 11.434,6 4.128,0 0,0 15.561,6

SALIDAS DE CAMPO 0,00,0

0,0 0,0

SERVICIOS TÉCNICOS 0,0 2.160,0 0,0 2.160,0PUBLICACIONES Y PATENTES

0,0 388,0 0,0 388,0

MATERIAL ESPECIALIZADO

0,0 3.000,0 0,0 3.000,0

EQUIPOS 0,0 10.324,0 0,0 10.324,0SOFTWARE 0,0 0,0 0,0 0,0MANTENIMIENTO 0,0 0,0 0,0 0,0CONSTRUCCIONES-ADECUACION DE INFRAESTRUCTURA

0,0 0,0 0,0 0,0

VIAJES 0,0 0,0 0,0 0,0USO DE EQUIPOS 0,0 0,0 0,0 0,0ADMINISTRACION 6.020,0 0,0 0,0 6.020,0MATERIAL GENERAL 800 0,0 0,0 800BIBLIOGRÁFIA 0,0 0,0 0,0 0,0TOTAL 18.254,6 20.000 0,0 38.254

2 Se debe anexar constancia de las otras fuentes de recursos aprobados.

54

Descripción de los gastos de personal (en miles de $).

NOMBRE DEL PARTICIPAN-

TES

FORMACACADÉM

FUNCIÓN EN EL PROY3

DEDICACIÓN (en h/s y meses de

vinculación)

RECURSOSEspecie Efectivo

Libardo Castañeda

Ing Químico, Esp

10/12 6.033,6

Mabel Esquivia 10/12 5.400Monitor 1 Apoyo a la

investigación15/8 2.064

Monitor 2 Apoyo a la investigación

15/8 2.064

TOTAL 11.434,6 4.128

Valoraciones salidas de campo (en miles de $)

Detalle Costo unitario# de

salidasRECURSOS

Especie EfectivoTraslado de muestras a laboratorio en Univalle Cali

0 0

TOTAL

Servicios Técnicos (en miles de $)

Descripción del servicio JustificaciónRECURSOS

Especie EfectivoAnálisis de laboratorio (27 muestras a $80,000 c/u)

Requeridos para determinar % de Bixina y Norbixina en las muestras de colorante obtenidas. Se realizarán en laboratorio de Análisis Industrial de Univalle Cali

2.160

TOTAL 2.160

Publicaciones y patentes (en miles de $)Descripción RECURSOS

Especie EfectivoArtículo científico en revista indexada tipo C 388TOTAL 388

3 Investigador principal, Coinvestigador, Asesor, Auxiliar de investigación, Est. de pregrado, Est. de posgrado

55

Material especializado (en miles de $)

Descripción del material JustificaciónRECURSOS

Especie EfectivoSemilla de achiote (200 kg), Enzima alfa amilasa (2 kg), Maltodextrina 1910 (50 kg)Tamices Taylor (2), Vidriería

Requeridas para la ejecución satisfactoria del proyecto (cumplimiento de objetivos)

3.000

TOTAL 3.000

Descripción de los equipos (en miles de $).

Descripción del equipo JustificaciónRECURSOS

Especie EfectivoColorímetro Espectofotómetro (rango longitud onda 325 a 1.100 nanómetros, precisión longitud +/- 2.0 nm, repetibilidad +/- 0,5 nm, ancho banda espectral -/= 8 nm, sistema óptico rejilla de difracción, lámpara tungsteno alógeno. Dimensiones 30 cm*33 cm*19 cm, peso 4,5 kg

Requerido para determinar las variables de respuesta (color, tono, coeficiente de difusión) en las muestras de colorante de achiote obtenidas y en los productos de galletería cuya formulación incluye el colorante

8.120

Balanza digital Ohaus Capacidad 6000 gr +/- 0.1 g

Requerida para pesar los insumos (semilla de achiote, maltodextrina, alfa-amilasa e insumos para producto de galletería)

2.204

TOTAL 10.324

Descripción de software (en miles de $).

Descripción del software Justificación RECURSOSEspecie Efectivo

TOTAL

56

Descripción del rubro de mantenimiento (en miles de $)

Descripción justificaciónRECURSOS

Especie Efectivo

TOTAL

Descripción del rubro construcciones-adecuación de infraestructura

Descripción justificaciónRECURSOS

Especie Efectivo

TOTAL

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