UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

PROYECTO DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

TEMA: AISLAMIENTO SELECCIÓN Y

CARACTERIZACIÓN DE CEPAS SACHAROMYCCES CEREVISIAE DEL VINO DE

MIEL

INTEGRANTES:

BUSTOS MARÍA FERNANDA PARRA MERCEDES VACA RODRIGO VELASCO ALEXANDRA

1. TEMA: Aislamiento selección y caracterización de cepas sacharomycces cerevisiae obtenidas de un vino de miel.

2. OBJETIVOS:2.1 OBJETIVO GENERAL:

Aislar y seleccionar las mejores cepas, más resistentes (sacharomyces cervisiae) que se desarrolla durante la fermentación para la producción de vino a base de miel o Hidromiel.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Fermentar la miel de abeja para obtener vino de miel o hidromiel. Elaborar vino de miel, mediante la corrección de la fuente de nitrógeno y de

acidez Obtener vino de miel con los grados brix y alcoholico deseado, cuerpo y aroma

agradables Aislar la levadura saccharomyces cervisiae a partir del vino obtenido

3. ANTECEDENTES

El origen de las bebidas fermentadas se encuentra unido a la evolución de los seres humanos, siendo probablemente la miel diluida de abejas silvestres la primera de estas bebidas, también conocida como “hidromiel”, apareciendo posteriormente los derivados de los cereales “cerveza”, así como también de la uva “vino”. Hidromiel, por el hecho de ser una bebida alcohólica. Lograda mediante un proceso de fermentación, semejante a la del vino, se presenta como otra alternativa de utilización de los productos apícolas.

Durante varios miles de años de desarrollo en la apicultura, la comprensión de la biología y la ecología de abejas fueron muy limitadas y, además, el conocimiento quedaba oscurecido por el enigma, la superstición y el folklore.

El “Hidromiel” o “Mead” (nombre original en inglés) es un vino elaborado utilizando miel de abejas como fuente de carbohidratos para la levadura. Conlleva diluir miel para fermentar una cantidad de alcohol suficiente para preservar el líquido y que genere un producto que sea agradable al paladar. Se añaden nutrientes para que la levadura pueda crecer y reproducirse en una forma efectiva, se balancea la acidez para que haga un contraste agradable al paladar, se eliminan los microorganismos que se encuentran en el mosto y se añade levadura desarrollada específicamente para la elaboración de vinos. La miel de abejas armoniza en forma muy atractiva con especias y frutas que se añaden al momento de preparar el mosto.

El vino elaborado de miel de abejas es posiblemente la primera bebida alcohólica que el ser humano elaboró en forma consistente y se remonta unos 6,000 años antes de nuestra era. Esta bebida y sus derivados fueron consumidos por varios miles de años.

Re-surge el interés en los vinos hechos de o con miel de abejas ya que la capacidad de hacer Hidromiel de alta calidad aumenta y en algunos casos, supera la de un vino de uva.

4. JUSTIFICACIÓN

En el Ecuador existe la Asociación de Productores Apícolas (Asoproac) la cual ha consolidado la venta a diversos clientes locales de 10 mil litros de miel por año, 50 kilos de polen y 100 kilos de propóleo producidos a nivel nacional. Esta Asociación en el Ecuador ofrecen reinas para reemplazarlas y tienen el proyecto de darle valor agregado a la miel de diferentes sabores y colores mezclándola, como el vino miel, según el diario El Universo la demanda interna es tan grande que duplicando su producción se abastecería.En la temporada de lluvias, en la Costa las colmenas producen poca miel, el mejor periodo es de octubre a diciembre, en el Ecuador la miel tradicional que se consume es la creada a base de la flor de eucalipto, esta le otorga propiedades organolépticas diferentes.En el Ecuador empresas como alimenticia Apizum o The Ecuador Honey Company trabajan con miel envasada ya que la producción es baja debido las lluvias intensas en la costa y la ausencia de flores en el eucalipto pero su demanda es alta en el mercado, tratando de implementar productos como la obtención de miel a base de la flor de aguacate ofreciendo un sabor distinto y la fabricación de vino de miel

5. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El vino es la más sana e higiénica de las bebidas según Pasteur. Además provocar una sensación de placer en los sentidos, el vino calma la sed, estimula el apetito, relaja las tensiones, favorece la digestión, alimenta el espíritu y aviva el ingenio.Sin embargo el vino de miel es poco conocido debido a que no se produce y comercializa tanto como otras bebidas alcohólicas mejor conocidas.

6. HIPÓTESIS

El control de la fermentación alcohólica en el vino de miel se realizara de la misma forma que en un vino ya que los dos contienen levaduras vínicas como el saccharomyces cerviseae, siguiendo como parámetros más elementales la elección de la materia prima, las mieles deben ser las más dulces, claras y las aromáticas ya que estas características nos darán un color más claro en el producto final, mas aroma y mayor rendimiento, corrigiéndose los valores tanto de acidez, fuente de nitrógeno, otros parámetros primordiales son: el descenso de la densidad del mosto, así como el nivel alcanzado por la temperatura de fermentación. Siendo especialmente importante en este tipo de elaboraciones, vigilar el final de la fermentación alcohólica, para asegurar la total desaparición de los azúcares, salvo los azucares residuales; alcanzándose valores tanto de alcohol en 11,5 GL y de azucares (8-10 BRIX) utilizando un buen método para su determinación. La razón de esta precaución es para evitar un solape de las fermentaciones alcohólicas y maloláctica, que a veces se producen en los vinos con valores de pH y de temperatura elevada, y a pesar del efecto antagónico

existente entre levaduras y bacterias; pero que pueden hacer subir en exceso la acidez volátil.

7. MARCO TEÓRICO

7.1 MIEL O HIDROMIEL

Miel: Es la sustancia natural dulce producida por la abeja Apis mellifera a partir del néctar de plantas (miel de flores o miel de néctar) o de secreciones de partes vivas de plantas o de excreciones de insectos chupadores presentes en las partes vivas de las plantas (miel de mielada), que las abejas recolectan, transforman combinándolas con sustancias específicas propias, depositan, deshidratan, almacenan y dejan en colmenas para que madure.

Las abejas combinan con la enzima invertasa que contiene la saliva de las abejas y lo almacenan en los panales donde madura. La técnica que involucra la extracción de miel de los panales de la colmena es conocida como apicultura.

7.1.1 COMPOSICIÓN DE LA MIEL

Contenido en agua: Suele oscilar entre 14-19%, aunque el porcentaje ideal de agua en la miel es de 17.5%. El contenido de agua es muy importante porque, un exceso de la misma, puede provocar la fermentación de la miel.Azúcares: Son los componentes principales de la miel, oscilan entre un 95-99% del total de los sólidos de la miel. Son los encargados de dar el sabor dulce a la miel y el aporte energético. Los principales son: Glucosa (40%) y Fructosa (30%). Proteínas: Como máximo 0.1%, en la miel se han identificado hasta 7 proteínas, de las cuales 5 proceden de las abejas y 2 de las plantas, de las cuales las principales son las enzimas, que juegan un papel muy importante en la conservación de la miel.Otros componentes menores: Ácidos orgánicos, vitaminas, sustancias aromáticas, minerales, cenizas etc. Aunque aparecen en menor cantidad también cumplen un papel importante dentro de la nutrición.

Minerales es muy pequeño. Los más frecuentes son calcio, cobre, hierro, magnesio, manganeso, zinc, fósforo y potasio.

Aminoácidos existen alrededor de la mitad de los aminoácidos existentes.

Ácidos orgánicos (ácido acético, ácido cítrico, entre otros) Vitaminas del complejo B, vitamina C, D y E. La miel posee también una

variedad considerable de antioxidantes (flavonoides y fenólicos).

TABLA1. Componentes en (%) de los componentes más usuales de la miel

COMPONENTE RANGO CONTENIDO TÍPICO

Agua 14-22% 18%

Fructosa 28-44% 38%

Glucosa 22-40% 31%

Sacarosa 0.2-7% 1%

Maltosa 2-16% 7.5%

Otros azúcares 0.1-8% 5%

Proteínas y aminoácidos 0.2-2%

Vitaminas, enzimas, hormonas,

0.5-1%

Minerales 0.5-1.5%

Cenizas 0.2-1.0%

7.2 MICROORGANISMOS DE LA MIEL

El vino de miel es elaborado por la fermentación espontánea de los azúcares de la miel de la abeja. El hidromiel es una de las bebidas fermentadas más antiguas que el hombre ha consumido. El hidromiel es un producto de la fermentación alcohólica de la miel de ulmo (Eucryphi cordifolia cav) diluida con agua que es fermentada por acción de levaduras pertenecientes al género Saccharomyces cervisiae.

7.3 SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Las levaduras son las responsables de la fermentación alcohólica de los mostos. Las especie Saccharomyces cerevisiae con elevado poder fermentativo, vigorosas y resistentes al etanol y dióxido de azufre. Son capaces de fermentar casi todos los azúcares, excepto los de cinco átomos de carbono, produciendo la enzima invertasa, capaz de desdoblar la sacarosa en glucosa y fructusa, no asimilan los nitritos.

Saccharomyces Cerevisiae es la levadura de color crema a ligeramente café lisas a rugosas, brillantes u opacas.

La temperatura óptima de crecimiento es de 25-30ºC. Las características importantes de las levaduras son la capacidad de flocular, capacidad de producir etanol, tolerancia al alcohol, tolerancia a la osmolaridad del medio, tolerancia a altas temperaturas, capacidad y vigor en la fermentación de azúcares y capacidad de producir congenéricos.

8. MARCO METODOLÓGICO 8.1 PROCESO DE LA OBTENCIÓN DE LA MIEL

8.2 AISLAMIENTO , SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE LAS CEPAS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

8.2.1 AISLAMIENTO

FASE DE ENRIQUECIMIENTO

Tomar una alícuota de 10 ml del mosto de miel con agua al final de la fermentación colocarlo en un erlemneyer de 150ml de colocados en 90ml de caldo YEPD modificado (extracto de levaduras peptona dextrosa)

Incubar a 42ºC en Shaker Orbital durante 24 horas.

8.2.1.1 Tabla 2. Composición del medio YEPD

COMPOSICIÓN CANTIDAD

Glucosa 20g/l

Bacto-peptona 20g/l

Extracto de levadura 10/l

8.2.2 FASE DE SELECCIÓN

Luego de las 24 horas realizar diluciones en agua estéril hasta 10-6, añadir suero fisiológico 9g/l de NaCl.

De estas diluciones sembrar en agar extracto de levadura-extracto de malta YM por estriado.

Dejar encubar por 48 horas a una temperatura de 35ºC

8.2.2.1 Tabla 3. Composición del agar extracto de levadura-extracto de malta YM

COMPOSICIÓN CANTIDAD

Extracto de levadura 3g/l

Extracto de malta 3g/l

Peptona 5g/l

Glucosa 10g/l

Agar bacteriológico 20g/l

8.2.3 FASE DE PURIFICACIÓN

Pasar las cepas que se obtuvieron en la fase de selección a un caldo nutritivo y encubar 24 horas a 35ºC. Estas colonias son de la de color crema a café de borde irregulares.

Luego se realiza otra siembra en agar malta YM de igual manera por estriado. Colocar ampicilina al agar YM en una cantidad 300mg/l para inhibir la flora

competitiva, y de esta manera obtener cepas puras. Incubar las cajas durante 24 horas a una temperatura de 35ºC.

8.2.4 FASE DE CONSERVACIÓN

Luego de obtener cepas puras se debe seleccionar las mejores colonias, se aplica la técnica de conservación de perlas.

Los crioviales debe contener de 10-20 perlas, se debe utilizar sustancias crioprotectoras: Me2SO con una concentración de 10%, o glicerol de 5-50% de concentración. Con un tiempo de contacto de 10-60 min.

La temperatura óptima para la conservación es de 4ºC.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. José Hidalgo Togores, Tratado de Enología, Tomo I España-Barcelona, Acdos S.A Año 2002, pág. 445-487

2. http://books.google.com.ec/books?

id=lhDAXRKSfDUC&pg=PA477&lpg=PA477&dq=levaduras+en+el+hidromiel+(fermentativas)&source=bl&ots=7fpaGhMidL&sig=NkTSw66lJe59A6MyS_zr2ARzV1w&hl=es&ei=DFnZTK7oL4G88gaJ47S_CQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=10&ved=0CDsQ6AEwCQ#v=onepage&q&f=false

3. http://www.slideshare.net/johncito01/fermentacin-industrial-2900199

4. http://itzamna.bnct.ipn.mx:8080/dspace/bitstream/123456789/7538/1/ESTCAMBIOS.pdf

ANEXOS

FIGURA 1: FLUJOGRAMA DE LA ELABORACIÓN DEL BIORREACTOR (ELABORACIÓN DE VINO DE MIEL O HIDROMIEL)

Inicio

Preparación del mosto

Corrección del mosto

Homogenización

Fermentación

Clarificación

Hidromiel

Fin

500 ml de miel 2000 ml de agua

Levadura 0.2 g/l Fuente de nitrógeno 0.7g/l Ácido cítrico 8 g

º Brix iniciales 22-26Acidez 3.0-3.5T de fermentación 20ºC

ºGL 10.4-12.3A total 5.0-5.3 g7l ac tartáricoA Volátil 0.2-0.3g/l de ac acéticoºBrix finales 8-10

FIGURA 2. FLUJOGRAMA DE AISLAMIENTO, SELECCIÓN, CONSERVACIÓN DE CEPAS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Inicio

Inoculación en Caldo YEPD modificado (extracto de levaduras y peptona dextrosa) 42ºC por 24 horas

Agitación Shaker Orbital

Diluciones 10-6 en agua estéril

Sembrar en agar estracto de malta YM 35ºC por 48 horas

Colonias cremas a cafe con bordes irregulares

Incubar en caldo nutritivo por 24 horas a 35ºC

Resembrar en agar extracto de malta YM con ampicilina 300mg/l

Incubar 24 horas a una temperatura de 35ºC

Cultivo puro

Método de perlas

Selección de perlas de 10 a 20 por cada criovial

Conservación a 4ºC

Fin