PRUEBAS BIOQUÍMICAS

PRUEBA DE CATALASA

El peróxido de hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos, a esta vía metabólica recibe el nombre de metabolismo aerobio-oxidativo.

La acumulación del peróxido es muy toxico por lo que la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas exceptuando a Streptococcus sp. producen una enzima llamada catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno obteniendo agua y oxigeno gas.

Técnica e interpretación de la prueba.

El reactivo utilizado en la prueba es el peróxido de hidrogeno al 30%, Hay diferentes técnicas para realizar la prueba la mas común es poner una gota de peróxido en el portaobjetos y posteriormente con un palillo plano tomar un poco de bacteria a partir de una colonia aislada, si se observa el burbujeo generalmente intenso significa que hay producción de oxígeno por lo tanto se entiende que hay presencia de la enzima catalasa., hay bacterias que dan una reacción positiva debil aunque son las menos.

Reacción de la catalsa.

Control positivo: Stahylococcus aureus

Control negativo: Streptococcus pyogenes

PRUEBA DE OXIDASA:

La oxidasa, es una prueba que se usa para poner de manifiesto el sistema citocromoxidasa, que se encuentra en organismos aerobios, anaerobios facultativos y ocasionalmente en microaerófilos, careciendo los anaerobios estrictos de esta. El método más frecuento es el indirecto, se realiza en un trocito de papel de filtro, de forma que colocamos una gota del reactivo de Kovacs en el papel y posteriormente tomamos parte de nuestra colonia con el asa de siembra, que frotaremos sobre el papel. El resultado será positivo se se produce una reacción de color a los pocos segundos.

PRUEBA VOGUES PROSKEUR

Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa con producción de ácido por la vía ácido mixta o con producción de un producto final neutro (acetoína) por la vía butanodiólica.

La prueba rojo de metilo y Vogues-Proskauer son dos pruebas en una. Las bacterias que siguen principalmente la vía de fermentación ácidos mixtos a menudo producen suficiente ácido para mantener un ph menor de 4.4.

MEDIO OF

Es una prueba que indica del tipo de metabolismo energético: Respiratorio (O) o Fermentador (F). Se suele utilizar glucosa como sustrato. Se detecta la acumulación de ácidos con un indicador ácido-base (azul de bromotimol). La bacteria se inocula con el hilo recto (por picadura ) y se incuba en condiciones de aerobiosis (sin parafina) y de anaerobiosis (con parafina, tubo cerrado), simultáneamente.

Las bacterias que respiran aerobiamente crecen en la superficie del medio del tubo abierto. Transforman la glucosa en CO2, la superficie del medio se verá ligeramente amarilla (por la formación de ácido carbónico originado al reaccionar el CO2 con el agua del medio). En el tubo cerrado el cultivo se mantiene azul-verdoso. Las bacterias fermentadoras producen ácidos a partir de la glucosa. Viran el cultivo del tubo cerrado a amarillo; en el tubo abierto se inicia el viraje en el fondo, pero transcurridas 24 horas los ácidos pueden difundir por todo el medio virándolo a amarillo.

Producción de ácido en la parte alta del tubo de cultivoque contiene azúcar; el agar blando se utiliza paradisminuir la mezcla durantela incubación.

Esta prueba se basa en determinar el metabolismo osicativo o fermentativo de un hidrato de carbono.

CITRATO

Se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo para usar citrato como única fuente de carbono. Esta reacción es llevada a cabo por la encima citrasa.

Se siembra con asa recta en un tubo con Agar Citrato de Simmons, realizando una estría sobre la superficie inclinada y se incuban los tubos durante 24 horas. Transcurrido este tiempo se hace la lectura del test. Este agar contiene citrato sódico como única fuente de carbono e ión amonio como única fuente de nitrógeno. Además contiene azul de bromotimol como indicador de pH. El agar citrato de Simmons es inicialmente de color verde, si el microorganismo es capaz de crecer en este medio y utilizar el citrato se producirán productos alcalinos. El azul de bromotimol por encima de pH 7,6 produce un viraje del medio a azul.

PRUEBA DE INDOL

Se usa para identificar bacterias capaces de producir indol a partir del triptófano (son bacterias que producen la enzima triptofanasa) El aminoácido triptófano puede ser convertido por las bacterias que contienen la enzima triptofanasa, a indol, amonio y ácido pirúvico.

Para ello, la bacteria se inocula en el medio líquido caldo de tristona que contiene triptófano y se incuba durante 24 horas. Transcurrido el tiempo de incubación, la presencia de indol se detecta añadiendo unas gotas del reactivo de Kovacs que queda sobre la superficie del caldo, ya que es menos denso, formando una especie de anillo. Se considera que la reacción es positiva si el anillo que forma es rojo-morado y negativa si es amarillo, quedando del mismo color que el reactivo.

PRUEBA AGAR HIERRO LISINA (LIA)

Este medio pone de manifiesto:

- Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa (LDC). el medio contiene como indicador Purpura de Bromocresol, cuando la lisina se descarboxila, el medio se acidifica y el indicador vira amarillo en el fondo.

MEDIO MIO ( MOVILIDAD, INDOL, ORNITINA)

Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a la descarboxilación de la ornitina.

Son tres pruebas, en esta prueba se evaluó la producción de indol, la descarboxilación de la lisina por la enzima ornitina descarboxilasa y la movilidad del microorganismo.

La presencia de indol, degradación del tripotofano para la enzima triptofanasa libera indol, acido pirúvico, amoniaco y energía.

Procedimiento:

Inocular en picada las cepas de microorganismos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37ºC.

PRUEBA DE SULFURO INDOL MOVILIDAD (SIM)

Determinar si un organismo es móvil o inmóvil, si es capaz deliberar ácido sulfhídrico por acción enzimática de losaminoácidos que contienen azufre produciendo una reacciónvisible de color negro y por último la capacidad dedesdoblar el indol de la molécula triptófano, además que laconsistencia del medio permite la observación de lamovilidad de algunas bacterias: Producción de ácido sulfhídrico, Producción de indol, Movilidad.

PRUEBA DE COAGULASA

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus.

Procedimiento:

Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazón) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo con algodón hidrofílico y lo llevamos a baño María a 37° C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.

Resultados:

Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles:

1: pequeños coágulos no organizados

2: pequeños coágulos organizados

3: gran coágulo organizado

4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.

Se consideran positivos los niveles 3 y 4.

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Staphylococcus epidermis.

PRUEBA DE UREASA

Determina la capacidad de un organismo de desdoblar laurea formando dos moléculas de amoniaco por la acción de la enzima ureasa produciendo un cambio de color rojo en el medio. La hidrólisis de la urea es catalizada por la ureasa, para dardos moléculas de amoniaco. La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposición de los compuestos orgánicos.

PRUEBA TAXO A (SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA)

Prueba utilizada para la diferenciación de estreptococos beta hemolíticos del grupo A de otros estreptococos beta hemolíticos..

Fundamento

La bacitracina es un antibiótico que inhibe la síntesis de pared celular bacteriana, y a la concentración que se encuentra en los discos (0.04 U) inhibe el crecimiento de los estreptococos beta hemolíticos del grupo A de Lancefield pero no inhibe el desarrollo de otros estreptococos beta hemolíticos.

Los micrococcus y los estomatococcus también son inhibidos, mientras que los estafilococos coagulasa negativo son resistentes.

Un resultado sensible, es presuntivo de la presencia de estreptococo grupo A, y se puede incrementar además el valor diagnóstico mediante la realización de la prueba del PYR (PYR-A-Enterococos, código B12-406-24)

Siembra

1-Realizar una suspensión densa del microorganismo en estudio (de turbidez igual a la del estandard 0.5 de la escala de Mac Farland).

2-Utilizando un hisopo estéril, hisopar una placa de agar sangre.

3-Aplicar un disco de Bacitracina de 0.04 U sobre la superficie de la placa.

Incubación

Incubar durante 24 horas, a 35-37 ºC, en atmósfera5-10% de CO2.

Resultados

Examinar la placa para observar cualquier zona de inhibición del desarrollo alrededor del disco de bacitracina.

Sensible: presencia de halo de inhibición del desarrollo alrededor del disco.

Informar: estreptococos beta hemolíticos presuntivamente del grupo A por la prueba de bacitracina.

Resistente: ausencia de halo de inhibición del desarrollo alrededor del disco.

Informar: estreptococos beta hemolíticos que presuntivamente no pertenecen al grupo A por la prueba de bacitracina.

TAXO P (OPTOQUINA)

PRUEBA DEL DISCO DE OPTOQUINA

Bioquímica: la optoquina es una sustancia química, clorhidrato de etilhidrocupreína. La etilhidrocupreína, la base del disco de optoquina, es insoluble en agua. Sin embargo, el clorhidrato de etilhidrocuprína es completamente hidrosoluble. La optoquina es un derivado del alcaloide hidroquinina, que se prepara por hidrogenación, demitilación, demetilación y etilación de la quinina. Cada disco de papel de filtro está impregnado con alrededor de 0.02 mL de una dilución acuosa 1:4000 de la sustancia química secada a 37° C. La optoquina tiene alrededor de 95% de sensibilidad específica para S pneumoniae y es bacteriostática a una concentración 1:500,00 a 1:100,000.

Determinar la sensibilidad de un microorganismo a la sustancia química optoquina. La sensibilidad a la optoquina prueba la fragilidad de la membrana celular bacteriana. El disco de optoquina se utiliza de manera específica para diferenciar entre Streptococcus pneumoniae (sensible, S. sens) y otras especies de Streptococcs a_ hemolíticos (viridans) (resistente, R); un método fenotípico.

Procedimiento:

A. Inoculación del microorganismo a ser probado1. Colonia pura2. Medio: placa de agar con sangre al 5%

Alternativa: sangre humana antigua (banco de sangre). Deben utilizarse placas de agar con sangre para la comprobación de la optoquina, ya que todas las especies de Streptococcus son microorganismos exigentes y requieren el agregado de elementos de enriquecimiento para el desarrollo.

3. Método de inoculación para obtener el máximo crecimiento; dos opcionesSubcultivo en caldo con tripticasa y soja; una única colonia

B. Inoculación directa

Colonia única

Estriar toda la placa de agar con sangre con una ansa de inoculación

Siembra en estrías en las cuatro direcciones.

No intentar usar más de cuatro discos por placa

C. IncubaciónPlaca invertidaJarra con vela35° C18-24 h.

FERMENTACIÓN DE ALGUNOS CARBOHIDRATOS

La mayor parte de las pruebas usadas para evaluar la actividad bioquímica o metabólica de

bacterias (por medio de la cual puede hacerse una identificación final de especie), se lleva a

acabo mediante el sub cultivo del aislamiento primario en una serie de medios

diferenciales, cuyos resultados pueden interpretarse después de uno odos días de

incubación.

La fermentación es un proceso metabólico de oxido-reducción que ocurre en un medio

ambiente anaerobio y, en lugar de oxígeno, un sustrato orgánico sirve como el aceptor final

de hidrógeno (electrones). En los sistemas de prueba bacteriológicos, este proceso se

detecta observando cambios de color en indicadores de pH a medida que se forman

productos ácidos. Las bacterias que fermentan un hidrato de carbono son por lo general

anaerobios facultativos. Por medio del proceso de fermentación un hidrato de carbono es

degradado y descompuesto en dos moléculas de carbono (triosas) que son nuevamente

degradadas en un número de compuestos de 1,2, 3 y 4 carbonos. Los productos finales

varían con cada especie bacteriana y depende del sistema enzimático existente en la especie

y las condiciones del medio ambiente .El más importante ciclo fermentativo de la

degradación dela glucosa es el ciclo de Embden - Meyerhof aun cuando éste también puede

producirse por la derivación de pentosa o el ciclo de Entner - Duodoroff. Pueden utilizarse

diversos hidratos de carbono. La bacteria usada depende de las dificultades que se

presenten para identificar un organismo determinado.

Utilizando un indicador de pH con un determinado hidrato de carbono puede determinarse

si una bacteria ha degradado el mismo en varios productos terminales, observando un

cambio de color visible.

MEDIOS DE CULTIVOS

MEDIOS ENRIQUECIDOS

Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de

factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este

enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero,

leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible añadir

suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej.

Polivitex, Isovitalex, etc) El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cisteína para su

crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de

cultivo (agar chocolate).

CHOCOLATE AGAR SUPLEMENTADO

Uso

Este medio permite el crecimiento de microorganismos exigentes en sus requerimientos

nutricionales, por ejemplo especies de

Streptococcus, Haemophilus y Neisserias patógenas.

Fundamento

El medio de cultivo es ampliamente nutritivo por la presencia de peptona, tripteína, extracto

de levadura, extracto de corazón y almidón.

El agregado de sangre y suplemento Britalex con solvente aporta nutrientes, vitaminas y

minerales adicionales.

El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante.

instrucciones

Placas listas para usar.

Características del producto

Medio de cultivo color marrón.

Almacenamiento

A 2-8 ºC.

Procedimiento

Siembra

En superficie, estriar directamente el material en estudio.

Incubación

El tiempo, la temperatura, y la atmósfera de incubación, dependerán

del microorganismo que se quiera recuperar.

En general se recomienda:

Bacterias de fácil crecimiento: en aerobiosis, a 35-37 º C durante

18 a 24 horas.

Bacterias exigentes en sus requerimientos nutricionales: en atmósfera

con 5 % de CO2, a 35-37 ºC durante 18-48 horas.

Interpretación de los resultados

Observar las características de las colonias.

Agar sangre

Es un medio enriquecido que se utiliza además para la investigación de los diversos tipos

de hemólisis(α, ß ó gamma ). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la

preparación del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro

sódico o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el tripticase de

soja. La adición de sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que están en

el interior de los hematíes, pero sí puede añadir factores inhibidores del crecimiento

bacteriano presentes en el suero. Este es un inconveniente que puede solucionarse

calentando la sangre para romper los eritrocitos y para que se destruyan las sustancias

inhibidoras, que son termolábiles.La sangre utilizada como aditivo a estos medios suele ser

sangre de carnero diluida al 5%, pero en algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de

otras especies (caballo, conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolíticas o

contienen determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias inhibidoras del

crecimiento de determinados gérmenes. Agar chocolate: El agar chocolate se obtiene

calentando la sangre antes de adicionarla al medio base. Por esta razón el agar chocolate

contiene hemoglobina, que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el

factor X o hemina termoestable. El agar chocolate es un medio destinado principalmente al

aislamiento de Neisserias (gonococos ymeningococos) y Haemophilus, pero en él pueden

crecer muchos otros microorganismos exigentes. El agar chocolate puede convertirse

quizás en uno de los medios más enriquecidos si añadimos una mezcla de factores de

crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas, denominadas de forma diferente

según las casas comerciales (Polivitex, Isovitalex, etc.) contienen más de una docena de

compuestos que confieren a este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias. Por

adición de uno o varios antibióticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el

crecimiento de determinados microorganismos. Un ejemplo clásico es el Thayer-Martin,

utilizado para el aislamiento del gonococo y que no es otra cosa que un agar chocolate

enriquecido al cual se ha añadido unamezcla de tres antibióticos específicos que impedirán

el crecimiento del resto de la flora acompañante. Agar MacConkey: Es un medio utilizado

para el aislamiento e identificación de enterobacterias. Es un medio inhibidor de los

gérmenes Gram positivos por su contenido en cristal violeta y selectivo para enterobacterias

por su contenido en sales biliares. En su composición lleva un azúcar (lactosa) y un

indicador (rojo de metilo) que lo convierten en un medio diferencial. Los gérmenes que

fermenten la lactosa producen una acidificación del medio que hacen aparecer de color rojo

fuerte a las colonias resultantes. Las colonias lactosa negativas serán incoloras, apareciendo

del mismo color que el medio subyacente (naranja).

Agar Tripticase de soja

Es un medio utilizado para el crecimiento de gérmenes exigentes, como Brucella, Neisseria

o Streptococcus. Es un medio muy enriquecido, pero no es diferencial. Caldo tioglicolato

con resazurina: Es un medio recomendado para controles de esterilidad. Permite el cultivo

de aerobios, anaerobiosy microaerófilos. Tiene un bajo potencial redox que, al aumentar, se

manifiesta por un color rosa del medio.

MEDIOS SELECTIVOS

Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una

población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar

nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo de

medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de

salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias.

MAC CONKEY AGAR

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo,

aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa

en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia

Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 17.0 Pluripeptona 3.0 Lactosa 10.0

Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y Mezcla de sales

biliares 1.5 mezclar hasta uniformar. Calentar Cloruro de sodio 5.0 suavemente y hervir 1 a

2 minutos hasta disolver. Esterilizar en autoclave Agar 13.5 a 121 C durante 15 minutos.

Rojo neutro 0.03 Cristal violeta 0.001 pH final: 7.1 0.2

Fundamento En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el

desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales

biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte

de la flora Gram positiva. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la

colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en

las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores

de lactosa producen colonias incoloras. Resultados Microorganismos Colonias Escherichia

coli Rojas con halo turbio Klebsiella pneumoniae Rosadas mucosas Salmonella

typhimurium Incoloras, transparentes Shigella flexneri Incoloras, transparentes Proteus

mirabilis Incoloras, transparentes Enterococcus faecalis Diminutas, incoloras, opacas.

USO PREVISTO

BD CLED Agar (Agar cistina-lactosa deficiente en electrolitos) es un medio de cultivo

diferencial para aislar y contar las bacterias presentes en la orina. Favorece el crecimiento

de los patógenos y contaminantes urinarios aunque, debido a la ausencia de electrolitos,

impide la indebida proliferación de especies de Proteus.

PRINCIPIOS Y EXPLICACION DEL PROCEDIMIENTO

Método microbiológico.

En 1960, Sandys publicó el desarrollo de un nuevo método para prevenir la proliferación de

Proteus en medios sólidos mediante la restricción de electrolitos en un medio de cultivo que

posteriormente se modificó en varias ocasiones para utilizarlo en los cultivos de orina1-3.

Se designó como medio Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient (CLED) y se proclamó que

resultaba ideal para las técnicas de sumersión del inóculo y para la bacteriología urinaria en

general.

La gelatina, las peptonas de caseína y el extracto de carne bovina constituyen los nutrientes

del

BD CLED Agar. Se incluye lactosa en el medio con el objeto de proporcionar una fuente de

energía para los microorganismos capaces de utilizarla a través de un mecanismo de

fermentación. Como indicador del pH se utiliza azul de bromotimol, para diferenciar los

microorganismos fermentantes de lactosa y los no fermentantes. Los primeros reducen el

pH y modifican el color del medio, pasando éste de verde a amarillo. La cistina permite el

crecimiento de "colonias enanas" de coliformes. Se reducen las fuentes de electrolitos con

objeto de minimizar la proliferación de las especies de Proteus. De este modo, el medio

permite la determinación cuantitativa de los patógenos urinarios, incluido el Proteus, si se

emplean asas calibradas para la inoculación.

AGAR CHROMOCULT

Medio selectivo para Enterobacterias. Permite diferenciar entre coliformes totales y E. coli

MEDIO DE CULTIVO DIFERENCIAL

Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar

géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un sustrato metabolizable se

utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite

distinguir los gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. También lo

son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es

doblemente diferencial), etc.

Agar C.L.E.D.

El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrólito Deficiente) está recomendado para el

recuento e identificación presuntiva de los microorganismos de las vías urinarias. Su bajo

contenido en electrolitos evita la invasión de los cultivos por Proteus.La presencia de

lactosa en su composición le confiere el carácter de medio diferencial, aunque la

interpretación sea diferente al anterior medio por la incorporación de otro indicador: el azul

de bromotimol. Las colonias lactosa positivas aparecerán de color amarillo y las lactosa

negativas lo harán con un color verdoso, blanco o azulado.

Agar S.S.

El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a

partir demuestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante para impedir el

crecimiento de coliformes y gérmenes Gram positivos. La presencia de lactosa y rojo de

metilo nos permiten diferenciar las colonias que fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las

que no lo hacen (incoloras).Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la

lactosa por lo que este medio es excelente para descartar todas las colonias que no cumplan

este requisito. El agar SS es doblemente diferencial, porque además de indicarnos el

comportamiento de los gérmenes con relación a la lactosa, nos muestra los gérmenes que

son capaces de producir ácido sulfhídrico, que se manifiesta como un precipitado de color

negro en el centro de la colonia. Así, una colonia incolora y con un punto negro central es

sospechosa de Salmonella, y será exclusivamente a estas colonias a quienes se hagan las

pruebas bioquímicas confirmatorias de esta especie. El agar SS es un medio muy inhibidor

que a veces impide incluso el crecimiento de ciertas especies de Salmonella y sobre todo de

Shigella. Por esta razón debe utilizarse siempre junto con otro medio menos inhibidor como

el Hektoen.

Manitol Salado Agar.

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de

estafilococos.

Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir de muestras

clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria.

También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas de Vibrio, si no

se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas

especies pueden no desarrollar.

Fundamento

Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los

estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias

aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos,

presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se

repicarán en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la

prueba de la coagulasa.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de

carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable,

el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que

inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol es el indicador de pH.

Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol,

producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color

rojo al amarillo.

Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el

manitol.

Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias

amarillas rodeadas de una zona del mismo color.

Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas

de una zona del mismo color o púrpura.

MEDIOS DE TRANSPORTE

Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden sembrarse inmediatamente.

Su utilización debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el

interior de lmedio (generalmente en un tubo). Son ejemplos típicos de este grupo los

medios de Stuart -Amies, Cary-Blair, etc.

Stuart Medio de Transporte

Medio destinado a la recolección, transporte y preservación de muestras clínicas aptas para

exámenes bacteriológicos. Es útil para mantener la viabilidad de gonococos y de otros

microorganismos de difícil desarrollo.

Fundamento

Medio semisólido, no nutritivo. Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente

reducido y es útil para suprimir cambios oxidativos en el medio de transporte, y azul de

metileno, que es el indicador de oxido reducción. De esta manera se favorece la viabilidad

de los microorganismos durante su envío al laboratorio. Cooper encontró que usando

hisopos impregnados con carbón bacteriológico se recuperan en forma exitosa numerosos

patógenos entéricos y respiratorios.

Medio de Transporte AMIES sin/con carbón activado

Este medio se obtuvo de una modificación del medio Stuart al cual se le reemplazó el

glicerofosfato por un buffer inorgánico superior, la adición de carbón permitió el

crecimiento de patógenos tratados con antibioterapia y mejorar el desarrollo de fastidiosos

en comparación con el Stuart. Se le omitió el azul de metileno. Este medio así modificado

permitió recuperar un número mayor de patógenos que en el Medio de Stuart. Básicamente,

cambia el glicerofosfato por un fosfato inorgánico y el azul de metileno por carbón vegetal

neutro farmacéutico. Además, añade iones Calcio y

Magnesio, que ayudan a conservar la permeabilidad de la célula bacteriana.

El Medio Amies es recomendado para secreciones de garganta, vagina, heridas y urogenital

causadas por flora fastidiosa

o difícil de mantener viable como son: Neisserias, Streptococcus, Haemophilus, Listerias ;

manteniéndolos en óptimas condiciones para el cultivo hasta después de 48 hrs , y Medio

Amies con carbón activado se utiliza para secreciones de heridas y urogenital , para el

cultivo y aislamiento de gérmenes fastidiosos , tratados o en tratamiento con

antimicrobianos y/o expuestos a metabolitos tóxicos para su desarrollo, la presencia del

carbón tiene afinidad por compuestos orgánicos , descompone las formas reducidas de

oxigeno y secuestra los radicales libres .V.cholerae permanece viable y cultivable durante

sesenta días en el medio de transporte Amies con carbón.

Cary Blair Medio De Transporte.

Medio recomendado para la recolección, transporte y conservación de muestras aptas para

estudios microbiológicos.

Es especialmente útil para la búsqueda de Vibrio spp. a partir de muestras fecales y

rectales.

Fundamento

El primer medio utilizado para el transporte de muestras para estudios microbiológicos fue

el medio de Stuart. En 1964 Cary y Blair describieron un nuevo medio para el transporte de

muestras fecales. Tenía un bajo contenido de nutrientes, un bajo potencial de

oxidoreducción y un alto pH. En los estudios de Cary y cols., Salmonella y Shigella fueron

recuperadas luego de 45 días de inoculación. Otros autores han demostrado la eficacia de

ese medio de transporte para estudios microbiológicos en gastroenteritis. El medio de

transporte Cary-Blair, es semisólido debido a la baja concentración de agar. Tiene un

mínimo aporte de nutrientes que permite la recuperación de los microorganismos sin que

haya replicación. El tioglicolato de sodio se incluye para proveer un bajo potencial redox; y

el pH relativamente alto minimiza la destrucción bacteriana por acidificación.

MEDIOS ESPECIALES

Son aquellos medios de cultivo que por su riqueza nutritiva, sirven para el cultivo de

bacterias muy exigentes. Contienen en su formulación sustancias inhibidoras para ciertas

bacterias, que permiten el aislamiento y diagnóstico precoz de aquellas bacterias que nos

interesan por ser los agentes etiológicos de las enfermedades infecciosas. También

pertenecen a este grupo aquellos medios que por adicción de sustancias químicas

determinadas, facilitan el diagnóstico por características bioquímicas de algunas especies

microbianas.

Los medios especiales se clasifican en:

Medios Mejorados: se obtienen añadiendo a los medios corrientes sustancias de mayor

valor nutritivo, que tienen el efecto de proporcionar condiciones favorables para el cultivo

de bacterias exigentes (Ej. Estreptococos, Corynebacterium).

Las sustancias añadidas pueden ser: sangre desfibrinada (conejo, cordero o caballo), suero

sanguíneo (equino), suero fetal bovino, huevo, cerebro, corazón, trozos o extracto de

hígado, carne o levadura, etc.

La mayoría de estas sustancias por ser proteicas coagulan con el calor, lo cual impide que

sean esterilizadas en autoclave. Deben por lo tanto ser esterilizadas por filtración o ser

agregadas a los medios previamente esterilizados, en condiciones de rigurosa asepsia.

Ejemplo: Agar Sangre, Agar Cerebro Corazón, etc.

Medios Selectivos: generalmente el microorganismo patógeno causante del cuadro

infeccioso que se desea aislar a partir de la muestra, no se encuentra puro sino que convive

con otras especies sin interés diagnóstico. Así por ejemplo es frecuente que las fecas, orina,

exudados, alimentos, agua, etc. estén altamente contaminadas con bacterias saprófitas que

por su desarrollo exuberante en los medios de cultivo corrientes, inhiben el crecimiento o

enmascaran la presencia del agente patógeno buscado.

Los medios selectivos se caracterizan por estimular el desarrollo de ciertas especies

bacterianas y a la vez inhibir el desarrollo de otras especies, lo que permite es aislamiento y

diagnóstico de las bacterias con facilidad y rapidez. Estas características se obtienen por la

adición de sustancias tales como colorantes de anilinas, sales biliares, antibióticos, etc.

Ejemplo: Agar Brucella, Caldo Selenito Cistina, etc.

Caldo selenito-F: Se utiliza exclusivamente para enriquecimiento de Salmonellas.

TCBS Medio

Medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus y otras especies de Vibrio a partir de heces, agua y alimentos contaminados.

También es conocido como Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa, o como Agar Selectivo para Vibrios.

Fundamento

En el medio de cultivo, el extracto de levadura, la peptona de carne y la tripteína aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. Es este, el medio selectivo más adecuado para el aislamiento de las especies de Vibrio, e inhibidor para la mayoría de las enterobacterias. Esta inhibición se basa en las altas concentraciones de tiosulfato y citrato, la presencia de bilis y un pH fuertemente alcalino. La degradación de la sacarosa es variable entre las especies de Vibrio y las colonias son verdes para las cepas que no la utilizan y amarillas para aquellas que producen ácido a partir de este azúcar. Esto es debido al viraje del color de los indicadores de pH azul de timol y azul de bromotimol, del color azul al amarillo en medio ácido. Es importante tener en cuenta, que la proporción de sacarosa en el medio está equilibrada de forma tal que no inhiba el crecimiento bacteriano por exceso de ácido.

El cloruro de sodio favorece el crecimiento de microorganismos. El tiosulfato de sodio aporta azufre y junto con el citrato férrico permiten la detección de producción de ácido sulfhídrico.

Aumentando la concentración de cloruro de sodio y disminuyendo la temperatura de incubación, pueden aislarse especies marinas sin importancia sanitaria.

Löwenstein-Jensen

Este medio se utiliza para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis. Contiene verde malaquita para inhibir parcialmente el crecimiento de otras bacterias. El huevo se utiliza como sustancia de enriquecimiento.