PulseNet América Latina 4ta Reunión Internacional Buenos Aires, 22 y 23 de junio 2006 Mariana...

PulseNet América LatinaPulseNet América Latina4ta Reunión Internacional4ta Reunión InternacionalBuenos Aires, 22 y 23 de junio 2006Buenos Aires, 22 y 23 de junio 2006

Mariana PichelServicio Enterobacterias – Departamento Bacteriología

INEI – ANLIS “Carlos G. Malbrán”22 de junio de 2006

“Subtipificación de Enterobacter sakazakii por PFGE”

Red de Subtipificación Molecular para Vigilancia de Enfermedades Transmitidas por los Alimentos

Enterobacter sakazakiiEnterobacter sakazakii• Asociado a infecciones infantiles graves, Asociado a infecciones infantiles graves,

especialmente en lactantes: sepsis, especialmente en lactantes: sepsis, meningitis y enterocolitis necrotizante meningitis y enterocolitis necrotizante (NEC). Alta tasa de mortalidad.(NEC). Alta tasa de mortalidad.

• Reservorio desconocido. Muy resistente a Reservorio desconocido. Muy resistente a la falta de humedad y a altas temperaturasla falta de humedad y a altas temperaturas

• Preparados en polvo para lactantes han Preparados en polvo para lactantes han sido asociados como fuente de infección sido asociados como fuente de infección en los casos de infección en neonatos.en los casos de infección en neonatos.

Antecedentes Antecedentes epidemiológicosepidemiológicos

•USA, Tennesse,USA, Tennesse, 4 lactantes afectados. (Simmons et al. 4 lactantes afectados. (Simmons et al. Infect. Control Hosp Epid 1989;10: 398-40).Infect. Control Hosp Epid 1989;10: 398-40).

•Islandia,Islandia, 3 neonatos, 2 con secuelas neurológicas, 1 3 neonatos, 2 con secuelas neurológicas, 1 fallecido. (Biering el al, JCM 1989; 27 (9): 2054-56.fallecido. (Biering el al, JCM 1989; 27 (9): 2054-56.

•Holanda,Holanda, 8 casos de meningitis en neonatos en 6 años, 8 casos de meningitis en neonatos en 6 años, dos con NEC, mortalidad:75%. (Muytjens et al , JCM 2001; dos con NEC, mortalidad:75%. (Muytjens et al , JCM 2001; 39:293-297)39:293-297)

En todos estos casos se recuperó el microorganismo en En todos estos casos se recuperó el microorganismo en las fórmulas utilizadas para alimentar a los afectados.las fórmulas utilizadas para alimentar a los afectados.

•Bélgica,Bélgica, 12 lactantes con NEC, 2 fatales. (Van Acker et 12 lactantes con NEC, 2 fatales. (Van Acker et al., JCM 2001;39:293-97). Se recuperó al., JCM 2001;39:293-97). Se recuperó E. sakazakiiE. sakazakii en en muestras clínicas, a partir de la fórmula infantil en polvo muestras clínicas, a partir de la fórmula infantil en polvo consumida y en envases cerrados del mismo lote. Se consumida y en envases cerrados del mismo lote. Se estableció similitud entre los aislamientos por AP-PCR.estableció similitud entre los aislamientos por AP-PCR.

E. sakazakiiE. sakazakii

Incluido desde febrero del 2004 en la Incluido desde febrero del 2004 en la categoría A categoría A (Pruebas clara de (Pruebas clara de

causalidad) de la lista de patógenos causalidad) de la lista de patógenos de riesgo de la FAO/OMS, para de riesgo de la FAO/OMS, para

microorganismos relacionados con microorganismos relacionados con preparados en polvo para lactantes preparados en polvo para lactantes

junto con junto con Salmonella Salmonella spp.spp.

Se evaluaron dos protocolos para la Se evaluaron dos protocolos para la subtipificación de subtipificación de E. sakazakiiE. sakazakii::

A)A) Protocolo estandarizado de la Red PulseNet Protocolo estandarizado de la Red PulseNet para para Shigella sonneiShigella sonnei

B)B) Protocolo desarrollado en el laboratorio del Protocolo desarrollado en el laboratorio del Dr. Dr. Matthew J. Arduino,Matthew J. Arduino, Epidemiology and Epidemiology and Laboratory Branch Laboratory Branch Division of Healthcare Quality Promotion, Division of Healthcare Quality Promotion, Centers for Disease Control and Prevention, USA Centers for Disease Control and Prevention, USA

PFGE para la PFGE para la subtipificación de subtipificación de

Enterobacter sakazakiiEnterobacter sakazakii

Protocolo AProtocolo A Protocolo BProtocolo BPreparación de plugs de Preparación de plugs de agarosaagarosa cc. bacteriana cc. bacteriana ajustada por turbidimetríaajustada por turbidimetría

Preparación de plugs de Preparación de plugs de agarosaagarosa

cc. bacteriana estimada cc. bacteriana estimada

(200 a 250 ul de cultivo O.N.)(200 a 250 ul de cultivo O.N.)

LisisLisis

2 hs2 hs. a 55ºC en buffer . a 55ºC en buffer +Proteinasa K (PK) +Proteinasa K (PK)

(Sarcosyl/Tris/EDTA/PK)(Sarcosyl/Tris/EDTA/PK)

Lisis en dos pasosLisis en dos pasos::

- - 4 hs. a O.N4 hs. a O.N. a 37ºC en . a 37ºC en buffer+lisozima buffer+lisozima (Sarcosyl/EDTA/Desoxicolato (Sarcosyl/EDTA/Desoxicolato de sodio/Lisozima)de sodio/Lisozima)

- - O.N.O.N. a 55ºC en buffer+PK a 55ºC en buffer+PK

(Laurilsarcosina/EDTA/PK) (Laurilsarcosina/EDTA/PK)

LavadosLavados 2 con agua y 4 con 2 con agua y 4 con TETE

LavadosLavados al menos 3 con TE al menos 3 con TE

DigestiónDigestión con enzima con enzima XbaXbaII (30 U, 18hs)(30 U, 18hs)

DigestiónDigestión con enzima con enzima SpeSpeI I (20 U, 18hs)(20 U, 18hs)

ElectroforesisElectroforesis::

2.2 a 54.2 seg, 6 volts/cm, 18 2.2 a 54.2 seg, 6 volts/cm, 18 hs.hs.

ElectroforesisElectroforesis::

5.3 a 38.6 seg, 6 volts/cm, 16 5.3 a 38.6 seg, 6 volts/cm, 16 hs.hs.

PFGE para aislamientos de PFGE para aislamientos de E. E. sakazakiisakazakii

Protocolo AProtocolo AEnzima de restricción: XbaI

1: PulseNet Std Strain CDC # H9812

2: E. sak cepa #1

3: E. sak cepa # 2

4: E. sak cepa # 3


6: E. sak cepa # 4

7: E. sak cepa # 5

8: E. sak cepa # 6

9: E. sak cepa # 7


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Dendograma de relación genética de aislamientos de E. sakazakii realizado con el programa BioNumerics versión 4.0 con los parámetros de PulseNet (Coeficiente de Dice, optimización 1.5%, tolerancia en la posición de las bandas 1.5%).


Protocolo AProtocolo ADice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-98.3%]

PFGE-XbaI

100

8060

PFGE-XbaI

Esak1898/05/#1

Esak1900/05/#1

Esak1904/05/#1

Esak1923/05/#1

Esak1746/05A.

Esak1914/05/#1

Esak1918/05/#1

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

Argentina

Argentina

Argentina

Argentina

Argentina

Argentina

Argentina

E. sak 2

E. sak 3

E. sak 4

E. sak 1

E. sak 7

E. sak 5

E. sak 6

Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-98.3%]

PFGE-XbaI

100

8060

PFGE-XbaI

Esak1898/05/#1

Esak1900/05/#1

Esak1904/05/#1

Esak1923/05/#1

Esak1746/05A.

Esak1914/05/#1

Esak1918/05/#1

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

Argentina

Argentina

Argentina

Argentina

Argentina

Argentina

Argentina

E. sak 2

E. sak 3

E. sak 4

E. sak 1

E. sak 7

E. sak 5

E. sak 6


2: E. sak cepa #1

3: E. sak cepa # 2

4: E. sak cepa # 3


6: E. sak cepa # 4

7: E. sak cepa # 5

8: E. sak cepa # 6

9: E. sak cepa # 7



Protocolo BProtocolo BEnzima de restricción: SpeI

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Dendograma de relación genética de aislamientos de E. sakazakii realizado con el programa BioNumerics versión 4.0 con los parámetros de PulseNet (Coeficiente de Dice, optimización 1.5%, tolerancia en la posición de las bandas 1.5%).


Protocolo BProtocolo B

Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

PFGE-SpeI

100

90807060

PFGE-SpeI

Esak1746A1/05/#1

Esak1914/05/#1

Esak1918/05/#1

Esak1898/05/#1

Esak1900/05/#1

Esak1904/05/#1

Esak1923/05/#1

E. sak 2

E. sak 3

E. sak 4

E. sak 1

E. sak 7

E. sak 5

E. sak 6

Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

PFGE-SpeI

100

90807060

PFGE-SpeI

Esak1746A1/05/#1

Esak1914/05/#1

Esak1918/05/#1

Esak1898/05/#1

Esak1900/05/#1

Esak1904/05/#1

Esak1923/05/#1

E. sak 2

E. sak 3

E. sak 4

E. sak 1

E. sak 7

E. sak 5

E. sak 6

ConclusionesConclusiones Ambos protocolos permiten obtener geles Ambos protocolos permiten obtener geles

de PFGE de alta calidad, con un número de PFGE de alta calidad, con un número adecuado de bandas bien distribuidas en adecuado de bandas bien distribuidas en cada perfilcada perfil

El protocolo A presenta las siguientes El protocolo A presenta las siguientes ventajas:ventajas:

- Es más rápido (una sola incubación en Es más rápido (una sola incubación en buffer de lisis) buffer de lisis)

- Es más económico (no requiere lisozima y la Es más económico (no requiere lisozima y la enzima enzima XbaXbaI es más económica que I es más económica que SpeSpeI)I)

- Hay menor probabilidad de contaminación Hay menor probabilidad de contaminación al partir de un cultivo en placa y no de al partir de un cultivo en placa y no de caldocaldo

Estudio de aislamientos de Estudio de aislamientos de E. E. sakazakiisakazakii de fórmulas lácteas en polvo de fórmulas lácteas en polvo

Se analizaron 21 aislamientos deSe analizaron 21 aislamientos de E. E. sakazakiisakazakii recuperados de fórmulas lácteas recuperados de fórmulas lácteas infantiles en polvo, correspondientes a dos infantiles en polvo, correspondientes a dos marcas diferentes, ambas importadas y marcas diferentes, ambas importadas y comercializadas en la ciudad de Buenos comercializadas en la ciudad de Buenos Aires:Aires:

Marca AMarca A: 20 aislamientos: 20 aislamientoslote 1 (n=16), lote 2 (n=1), lote 3 (n=1), lote 1 (n=16), lote 2 (n=1), lote 3 (n=1), lote 4 (n=1), lote 5 (n=1) lote 4 (n=1), lote 5 (n=1)

Marca BMarca B: 1 aislamiento: 1 aislamiento

Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-98.3%]

PFGE-XbaI

100

8060

PFGE-XbaI

Esak1746/05A1/#1

Esak1914/05/#1

Esak1674B/05

Esak1747/05B1

Esak1834/05

Esak1926/05

Esak1803/05

Esak1905/05

Esak1923/05/#1

Esak1114/06 A1

Esak1674A05

Esak1745/05C1

Esak1746/05B1

Esak1792MC/05

Esak1839/05

Esak1898/05/#1

Esak1900/05

Esak1901/05

Esak1904/05/#1

Esak1906/05

Esak1831/05

Esak1918/05/#1

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

INAL

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

Municipalidad de Córdoba

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GOD79Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63NAN1, NestléEnfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GGD09Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GHD60

Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-98.3%]

PFGE-XbaI

100

8060

PFGE-XbaI

Esak1746/05A1/#1

Esak1914/05/#1

Esak1674B/05

Esak1747/05B1

Esak1834/05

Esak1926/05

Esak1803/05

Esak1905/05

Esak1923/05/#1

Esak1114/06 A1

Esak1674A05

Esak1745/05C1

Esak1746/05B1

Esak1792MC/05

Esak1839/05

Esak1898/05/#1

Esak1900/05

Esak1901/05

Esak1904/05/#1

Esak1906/05

Esak1831/05

Esak1918/05/#1

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

INAL

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

Municipalidad de Córdoba

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

DGHYSA

Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GOD79Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63NAN1, NestléEnfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GGD09Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GLD63Enfamil, lote GHD60

Brand A, batch 1Brand A, batch 2Brand A, batch 1Brand A, batch 3Brand A, batch 1Brand A, batch 1Brand A, batch 1Brand A, batch 1Brand A, batch 1Brand BBrand A, batch 1Brand A, batch 1Brand A, batch 1Brand A, batch 1Brand A, batch 1Brand A, batch 1Brand A, batch 4Brand A, batch 1Brand A, batch 1Brand A, batch 1Brand A, batch 1Brand A, batch 5

Análisis por PFGE de Análisis por PFGE de E. E. sakazakiisakazakii

Se aplicó el protocolo A con la Se aplicó el protocolo A con la enzima enzima XbaXbaII

ConclusionesConclusiones Primeros aislamientos de Primeros aislamientos de E. sakazakiiE. sakazakii en fórmulas lácteas en fórmulas lácteas

en Argentina y primer estudio de diversidad genética por en Argentina y primer estudio de diversidad genética por PFGE.PFGE.

La relación genética entre los aislamientos de La relación genética entre los aislamientos de E. sakazakiiE. sakazakii de dos marcas diferentes de PIF evidencia la necesidad de de dos marcas diferentes de PIF evidencia la necesidad de realizar una investigación sobre estos productos, a fin de realizar una investigación sobre estos productos, a fin de identificar las fuentes de contaminación de los mismos.identificar las fuentes de contaminación de los mismos.

La presencia de diferentes subtipos genéticos en distintos La presencia de diferentes subtipos genéticos en distintos lotes y aún dentro de un mismo lote de PIF de una misma lotes y aún dentro de un mismo lote de PIF de una misma marca sugieren la existencia de diferentes fuentes de marca sugieren la existencia de diferentes fuentes de contaminación.contaminación.

Es necesario profundizar el estudio de Es necesario profundizar el estudio de E. sakazakiiE. sakazakii como como agente causal de ETA e implementar un protocolo agente causal de ETA e implementar un protocolo estandarizado de PFGE que permita crear una Base de estandarizado de PFGE que permita crear una Base de Datos, con el fin de conocer y comparar los subtipos Datos, con el fin de conocer y comparar los subtipos circulantes en distintas regiones.circulantes en distintas regiones.

Participantes del estudioParticipantes del estudio DIRECCION GENERAL DE HIGIENE Y SEGURIDAD DIRECCION GENERAL DE HIGIENE Y SEGURIDAD

ALIMENTARIA, GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES:ALIMENTARIA, GOBIERNO DE LA CIUDAD DE BUENOS AIRES:Sergio EpszteynSergio EpszteynCelia MelamedCelia MelamedEdith MareyEdith MareyMariana MotterMariana MotterMaría Eugenia FerrerMaría Eugenia FerrerSantiago MingoraceSantiago MingoraceSilvana SanchezSilvana Sanchez

INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”:INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”:Raquel TerragnoRaquel TerragnoNorma BinszteinNorma BinszteinAngela SalveAngela SalveMaría Inés CafferMaría Inés CafferSalomé Vilchez LarreaSalomé Vilchez LarreaAgradecemos la colaboración de Raquel Callejo y Mónica PrietoAgradecemos la colaboración de Raquel Callejo y Mónica Prieto

GRACIAS!!!!!!!!GRACIAS!!!!!!!!

PulseNet América Latina 4ta Reunión Internacional Buenos Aires, 22 y 23 de junio 2006 Mariana...

Documents

Transcript of PulseNet América Latina 4ta Reunión Internacional Buenos Aires, 22 y 23 de junio 2006 Mariana...