1GENERALIDADES SOBRE PURIFICACION DE PROTENAS.

El mtodo de purificacin debe disearse desde un principio teniendo en cuenta la cantidad de protena que se requiere. Hay etapas de purificacin que se puedenaumentar de escala fcilmente y otras en que no es posible hacerlo.

El grado de pureza necesario depender del uso que se va a dar a la protena. Para usos en investigacin, la escala es reducida y es mas importante la pureza que el rendimiento. Para usos teraputicos la escala es mayor y la pureza requerida esmxima. Para usos industriales, frecuentemente se requiere gran cantidad, bajocosto y pureza menor.

Si el inters est en la protena y no importa el organismo de origen, convienebuscar una fuente fcil de obtener, barata, que contenga esa protena en abundancia. Si existe la posibilidad de partir de organismos enteros o de clulas en cultivo, esto ltimo es en general preferible. Lo ptimo es producir la protena pormtodos de DNA recombinante.

Dependiendo de la finalidad, la protena debe ser obtenida en estado nativo o puedeestar desnaturalizada. Para actividad biolgica, debe estar nativa; para determinarestructura primaria, puede estar desnaturalizada.

2Se debe seleccionar un mtodo de determinacin especfico de la protenaen cuestin (p.ej.: actividad, si se trata de una enzima; unin de ligando a un receptor; unin de un anticuerpo especfico en un RIA) y un mtodo de determinacin de la protena total. Debe tenerse en cuenta que, salvo la determinacin de protena por anlisis de aminocidos o por peso seco, todos los dems mtodos son semicuantitativos, a menos que se los estandardice con la propia protena en estudio. Entre estos mtodos se pueden mencionar 1) espectrofotometra en el UV (280 nm, Trp; 210-215 nM, unin peptdica); Biuret(Cu2+ alcalino); Lowry (Cu2+ alcalino + reactivo de Folin-Ciocalteau); Bradford (Coomassie Blue); unin de Ag.

La actividad especfica (AE) es igual a la relacin entre la cantidad de protena que se purifica sobre la cantidad de protena total.

El grado de purificacin es el cociente de la AE en la etapa 2 sobre la AE en la etapa 1 (la purificacin global, AE final sobre AE inicial)

Se debe utilizar un mtodo adecuado para juzgar la pureza de la protenaobtenida; actualmente se utiliza SDS-PAGE, monodimensional o, preferentemente, bidimensional. En otras pocas, se utiliz la ultracentrifugacin analtica.

Se debe evitar la protelisis de la protena en estudio durante supurificacin, utilizando ccteles de inhibidores de proteasas, y trabajando tan rpido como sea posible y en fro, para minimizar su accin.

3Purificacion step TotalProtein

Totalactivity

SpecificActivity

Purificationfactor

Yield

Cell-free extractConA-SepharoseMono QMono P

mg

227.5 5.6

0.67 0.36

unitsa

56.0043.7525.9514.70

unitsa/mg

0.246 7.8138.7340.83

Fold

1 31.75 157.44 165.97

%

100 78.1

46.34 26.25

4ESQUEMA GENERAL DE UN METODO DE PURIFICACION1) Separacin de las clulas.

2) Si la protena es intracelular, ruptura celular y separacin de restos.

3) Concentracin.

4) Aislamiento primario.

5) Purificacin de alta resolucin.

6) Pulido del producto final.

Problemas a ser resueltos para disear el proceso:1) Elegir etapas basadas en diferentes principios fisicoqumicos.

2) Elegir entre operaciones alternativas, en base a la escala final buscada.

3) Disear una secuencia de etapas ptima, con el menor nmero de etapasposible, lo que aumentar el rendimiento final.

4) Minimizar la desnaturalizacin y efectos de superficie; evitar agregacin: minimizar la degradacin; cuidar la limpieza y desinfeccin del equipo usado.

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7METODOS PARA LA RUPTURA DEL MATERIAL

A menos que se trate de una protena extracelular, liberada al medio, lasclulas o tejidos deben romperse para extraer la protena de inters. Estaruptura debe ser slo la necesaria, no excesiva, para evitar la extraccinintil de protenas contaminantes.

Los distintos tipos de clulas tienen diferente susceptibilidad a la ruptura.

Las clulas animales son muy fciles de romper, pues carecen de pared. Las vegetales tambien, pues, pese a tener pared celular, su gran tamaolas hace vulnerables a la ruptura mecnica. Las clulas bacterianas son ms resistentes, y esta propiedad depende de que sean Gram positivas o Gram negativas. El predominio del peptidoglicano en la pared de lasprimeras, las hace mucho mas sensibles a mtodos suaves, como la digestin con lisozima. Los hongos filamentosos y las levaduras son los ms resistentes a la ruptura. Tienen paredes celulares que contienenhasta 80 - 90 % de polisacrido (quitina y glicanos en hongos, manano y glucano en levaduras), adems de lpidos y protenas.

8ALGUNOS METODOS DE RUPTURA DE CELULAS

1) Mortereado con arena, almina, bolitas de vidrio, carburo de silicio.

2) Molinos de ruptura, por agitacin con abrasivos.

3) Uso de licuadoras u otros dispositivos con cuchillas rotativas.

4) Sonicacin.

5) Congelacin y descongelacin.

6) Extrusin de lquido o slido (material congelado)

7) Descompresin explosiva.

8) Enzimas lticas, seguido por shock osmtico o tratamiento mecnico.

9) Detergentes (Triton, digitonina) o solventes (tolueno).

10) Aislamiento previo de la organela en que se encuentra la protena.

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METODOS DE SEPARACION Y CONCENTRACION

Remocin de agua y molculas pequeas por

1) Agregado de un polmero seco on poros muy pequeos como paraque la protena penetre (Sephadex G-25).

2) Remocin a travs de una membrana semipermeable(ultrafiltracin). Celdas filtrantes. Dilisis contra polietilenglicol. Dilisis en vaco.

3) Remocin de agua en vaco: liofilizacin. Buffers voltiles, como el bicarbonato de amonio.

Cambios de buffer:

1) Dilisis. 2) Filtracin por gel; 3) Diafiltracin.

Purificacin por ultrafiltracin.

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PURIFICACIN Y CONCENTRACION POR PRECIPITACION

1) Precipitacion por aumento de la fuerza inica (salting-out):

Series de Hoffmeister. Sulfato de amonio.

2) Precipitacin por disminucin de la fuerza inica (salting-in)

3) Precipitacin por alteracin del pH (mnima solubilidad en el pI).

4) Precipitacin por solventes orgnicos (etanol, acetona), quedisminuyen la constante dielctrica de la solucin y por ello su poderde solvatacin.

5) Desnaturalizacin de impurezas por altas temperaturas, extremosde pH, solventes orgnicos.

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METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS.

1)Ruptura del material y obtencin de un extracto libre de clulas.

2)Precipitacin (sales, pH, alta temperatura, solventes orgnicos).

3)Dilisis o ultrafiltracin. Concentracin.

4)Fraccionamiento cromatogrfico.

Principio de separacin Tipo de cromatografaForma y tamao Filtracin por gelCarga neta Cromatografa de intercambio inico.Punto isoelctrico CromatoenfocadoHidrofobicidad Cromatografa de interaccin

hidrofbicaCromatografa en fase reversa

Funcin biolgica Cromatografa de afinidadAntigenicidad InmunoadsorcinContenido en carbohidrato Cromatografa con lectinas

inmobilizadasGrupos sulfhidrilos libres Cromatografa covalenteCapacidad de ligar metales Cromatografa de quelatos metlicos

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CROMATOGRAFIA

Separacin diferencial de los componentes de una muestra entre una fasemvil y una fase estacionaria.

La fase mvil es el solvente en que se introduce la muestra y con el que se eluyen las protenas (puede ser el mismo o variar durante la corrida).La fase estacionaria comprende las partculas, en general esfricas, con quese llena la columna. Estas partculas estn formadas por una matriz y, en la mayora de los casos, molculas de menor o mayor tamao con las que se la derivatiza, para adaptarla a los diferentes procedimientoscromatogrficos.

La matriz es el sustrato slido de la fase estacionaria. Las ms comunes son celulosa, dextrano, agarosa, poliacrilamida y silica.Deben tener buena estabilidad mecnica y qumica, alta capacidad, tamaoy forma adecuada de poros, superficie inerte para minimizar lasinteracciones no especficas, y tamao de partcula adecuado al flujo de solvente deseado y a la presin operativa.

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TIPOS DE CROMATOGRAFIA

1. Corridas a presin normal (LPLC, low-pressure liquid chromatography). Presin inferior a 5 bar. Pueden usarse matrices de escasa rigidez, como la agarosa o el dextrano.

2. Corridas a presin intermedia (MPLC, medium-pressure liquid chromatography, tambien llamada FPLC (Fast protein liquid chromatography). Presin entre 6 y 50 bar. Requiere matrices masrgidas. Permite flujos mayores.

3. Corridas a alta presin (HPLC, high-pressure - o high-performance -liquid chromatography). Presiones mayores de 50 bar. Requierematrices de rigidez alta, partculas pequeas y columnas y tuberas de material altamente resistente a la presin, como el acero inoxidable o el titanio.

Segn la presin a que se opera la corrida, se pueden considerar tres tipos:

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CARACTERISTICAS TIPICAS DE LPLC Y HPLC.

Caracterstica LPLC HPLC

Tamao de partcula () 100 10Flujo (ml.cm-2.h-1) 10 - 30 100 - 300

Presin de trabajo (bar) < 5 > 50

Tiempo de separacin (hs.) Hasta 24 1 - 3

Volumen de muestra ml - litro l - mlEtapa de purificacin Variable En general tarda

Resolucin Buena Excelente

Dificultades Largo tiempo, Alto costo de equipo,

cmara fra Posible desnaturalizacin

por presin.

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La aplicacin de la muestra a la columna se hace generalmente a travs de un loop, imprescindible para FPLC o HPLC. En LPLC puede hacerseaplicacin manual.

La elucin de las protenas introducidas en la columna puede hacerse sin cambiar la composicin de la fase mvil (elucin isocrtica) o cambiandola, por etapas o continuamente (gradientes).

El tamao de la columna a utilizar depender del procedimientocromatogrfico a seguir y de la cantidad de muestra a purificar.

Normalmente, luego de la corrida la columna debe ser regenerada, dejandola en condiciones de ser reutilizada. En general si las columnas no se utilizan continuamente deben ser guardadas conteniendo un agenteconservador, como el etanol al 20 % o la azida sdica, para evitar el crecimiento de microorganismos.

OTRAS CONSIDERACIONES GENERALES.

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METODOS CROMATOGRAFICOS BASADOS EN LA CARGADE LA PROTEINA.

Todas las protenas contienen residuos cargados, positiva o negativamente, y su balance a un determinado valor de pH dala carga neta de la molcula a ese pH. El valor de pH en el que las cargas se balancean, y en consecuencia la carga neta de la molcula es 0, es el punto isoelctrico de la protena.

Los mtodos cromatogrficos basados en la carga son dos:

1) La cromatografa de intercambio inico.

2) El cromatoenfocado.

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CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.La mayora de las protenas tienen su pI entre pH 5 y 9. Por encima de su pIla carga neta de la protena es negativa, y por debajo es positiva.

El material utilizado es una matriz derivatizada con grupos cargadospositivamente (que intercambian iones negativos, y se llaman por esointercambiadores aninicos, como DEAE-celulosa) o negativamente(intercambiadores catinicos, como CM-celulosa).

La adsorcin puede hacerse en batch o en columna. Las protenas migrarn(en condiciones isocrticas) en base a su carga neta a ese determinado pH. Sise trabaja a un valor de pH tal que muchas protenas se adsorben, la elucinse har cambiando el pH o aumentando la fuerza inica del buffer.

Los intercambiadores pueden ser dbiles (utilizables cuando la protena tienecarga elevada a ese pH) o fuertes (cuando la carga es baja). No conviene usarintercambiadores fuertes para protenas muy cargadas a ese pH, pues la interaccin ser muy fuerte y la elucin ms dificil.

La regeneracin de la columna se hace con alta fuerza inica (ClNa 1 M,p.ej.).

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GRUPOS INTERCAMBIADORES DE IONES USADOS EN PURIFICACION DE PROTEINAS.

Frmula Nombre Abreviatura

Aninico fuerte

- CH2N+(CH3)3 Trimetilaminometil TAM -

- C2H4N+(C2H5)3 Trietilaminoetil TEAE -

Aninico dbil

- C2H4N+H3 Aminoetil AE -

- C2H4N+(C2H5)2 Dietilaminoetil DEAE -

Catinico fuerte

- SO3- Sulfo S -

- CH2 SO3- Sulfometil SM -

Catinico dbil

- CH2 - COO- Carboximetil CM -

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PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI POR FPLC EN COLUMNA DE MONO Q (INTERCAMBIADOR ANINICO)

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CROMATOENFOCADOEl cromatoenfocado puede ser considerado como una extensin del isoelectroenfocado (IEF) y la cromatografa de intercambio inico.

En IEF las protenas se separan por electroforesis en un gradiente de pH; se aplica en electroforesis bidimensional.

En cromatografa de intercambio inico se puede eluir con un gradiente de pH, que se forma fuera de la columna.

En cromatoenfocado, el gradiente se forma dentro de la columna, mezclandouna matriz de intercambio aninico pre-ajustada a un valor de pH, con un buffer de pH ms bajo.

La protena al descender en la columna encontrar valores crecientes de pH; cuando llegue a su pI se volver electronegativa, y se unir a la matrizpositivamente cargada. Como el buffer sigue corriendo, la protena se separar y unir sucesivamente, hasta eluirse en una banda muy definida(enfocada) al pH correspondiente a su pI.

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PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI POR FPLC EN COLUMNA DE MONO P (CROMATOENFOCADO)

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PURIFICACION BASADA EN LA HIDROFOBICIDADLa llamada originalmente cromatografa de particin utilizaba una faseestacionaria polar y una fase mvil orgnica.

La cromatografa en fase reversa se denomina de ese modo porque utilizauna fase estacionaria no polar y una fase mvil polar. La fase estacionariaest en general formada por cadenas alifticas de hasta C18 unidas a unamatriz de silica. La fase mvil es un solvente polar como metanol, propanol, etanol o acetonitrilo. Estas condiciones pueden causar la desnaturalizacin de muchas protenas . Por ello se las utiliza en general en HPLC en fase reversa (RP-HPLC), para purificar protenas y pptidospara su secuenciacin. Se usan contraiones como el cido trifluoroactico para asociarse con grupos cargados en la protena y aumentar su hidrofobicidad.

Para purificar protenas en estado nativo se utilizan condiciones mas suaves, en la llamada cromatografa de interaccin hidrofbica. Se utiliza en general octil-Sepharosa o fenil-Sepharosa; la adsorcin de las protenas se hace en general a alta fuerza inica, y la elucin disminuyndola, y, si esnecesario, agregando un solvente como propanol o butanol.

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CROMATOGRAFIA COVALENTEA pH 8, reaccionan la mayor parte de las protenas que contienen Cys-SH; a pH 4,

slo las que tienen Cys residuos con un pKa muy bajo, como la papana.La columna se regenera con 2,2-dipiridildisulfuro. La piridin-2-tiona absorbe a 343 nm

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CROMATOGRAFIA DE QUELATOS METALICOS (IMAC)

La matriz tiene unido covalentemente un quelante, como el cidoiminodiactico.

Se carga la columna con un in adecuado, que puede ser Zn2+, Ni2+, Cu2+, Co2+. La protena se adsorbe a la columna si tiene residuos agrupados de His, Cys o Trp. Se puede eluir con quelantes, o bajando el pH a 4 - 6, o compitiendo con imidazol.

Esta tcnica es muy usada actualmente para purificar protenasrecombinantes, expresandolas como fusiones con un tag de poly-His (en general 6 residuos), que pueden agregarse en el N o en el C-terminal. Se eluyen con imidazol.

Si todo funciona bien, se puede tener protena recombinante pura en un solo paso de purificacin. Debe tenerse en cuenta que iones como el Co2+ puedencatalizar la oxidacin de grupos en la protena, en especial de -SH.

Luego de la purificacin la columna se regenera con un quelante comoEDTA, y para reutilizarla se la debe volver a cargar con metal.

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CROMATOGRAFIA DE AFINIDADSe basa en que todas las protenas tienen sitios de unin para algn ligando, ya sea una molcula pequea (p.ej.: un anlogo del sustrato de una enzima, una hormona para un receptor) u otra protena (p-ej.: la Concanavalina A para unir glicoprotenas de alta manosa, o anticuerpos especficos para ligar sus antgenos). El ligando elegido para la protena que se desea purificar debe inmovilizarse sobre una matriz adecuada.

La especificidad del ligando puede ser absoluta (p.ej.: avidina para carboxilasas con biotina) o relativa (p.ej.: Cibacron Blue para dehidrogenasas NAD o NADP-dependientes). La afinidad de la protena por el ligando debe ser moderada (KLentre 10-4 y 10-8 M) para permitir una buena unin y una disociacin ulterior del complejo en condiciones no desnaturalizantes.

Para desarrollar el material para cromatografa de afinidad, primero hay que activar la matriz (p.ej.: agarosa con BrCN) y luego fijarle el ligando. El material debera ser lo suficientemente estable como para permitir su reutilizacin.

Se pueden expresar protenas recombinantes como fusiones que permiten aplicar cromatografa de afinidad (glutation S-transferasa y GSH-Sepharosa; maltose-binding protein (MBP) y maltosa-agarosa).

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GLUTAMATO DEHIDROGENASA-NADP DEPENDIENTE

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CRUZIPAINA

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FILTRACION POR GEL (CROMATOGRAFIA DE EXCLUSIONMOLECULAR, O DE TAMIZADO MOLECULAR)

El material cromatogrfico es un gel en partculas esfricas, de porosidad controlada, sin derivatizaciones. La separacin de las protenas se hace en base a la forma y la masa de la protena. La elucin es isocrtica. Las protenas que no penetran en absoluto en los porosdel gel son las que salen primero (en el llamado volumen de exclusin o volumen vaco, Vo). Las dems molculas en la muestra se separan, saliendo ltimas las que penetran porcompleto en las particulas de gel. Se usa en general fuerza inica alta, para minimizar lasinteracciones de las protenas entre si, y de las protenas con la matriz (en este ltimo caso, no relacionadas con el tamao de poro).

Los materiales mas comunes son geles de dextrano (Sephadex), de agarosa (Sepharosa), de agarosa y poliacrilamida (Biogel A), de poliacrilamida (Biogel P). Puede usarse en LPLC, y tambien en FPLC (Superosa, Superdex) y HPLC (silica porosa, como Lichrosorb).

En la filtracin por gel es crtica la relacin entre el volumen de muestra y el volumen de la columna (1 a 5 % del volumen total (Vt) del gel), por lo cual es una tcnica que no se puedeaumentar en escala mas que hasta un cierto punto. Para desalado de protenas, se admite hasta un 25 - 30 % del Vt.

Aplicaciones: Purificacin de protenas - Desalado - Determinacin de pesos molecularesde protenas nativas - Determinacin de constantes de equilibrio de unin (binding).

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Purificacion step TotalProtein

Totalactivity

SpecificActivity

Purificationfactor

Yield

Cell-free extractConA-SepharoseMono QMono P

mg

227.5 5.6

0.67 0.36

unitsa

56.0043.7525.9514.70

unitsa/mg

0.246 7.8138.7340.83

Fold

1 31.75 157.44 165.97

%

100 78.1

46.34 26.25

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PURIFICACION DE PROTEINAS DE MEMBRANA.

Protenas integrales y Protenas perifricas

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PROTEINAS INTEGRALES

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Para purificar proteinas de membrana, lo mejor es empezar purificandola membrana. La solubilizacin de las protenas depender de que se trate de protenas integrales o perifricas.

Protenas perifricas: Buffer con EDTA 0.1 - 1 mM, o alta fuerza inica,hasta 1 M ClNa o ClK. En algunos casos se requieren condiciones ms drsticas(urea 8 M, clorhidrato de guanidina 6 M). Incluir inhibidoresde proteasas.

Proteinas integrales: Las que tienen una parte soluble sustancial, pueden ser solubilizadas cortando la parte que las ancla en la membrana con fosfolipasas o proteasas, segn de qu ancla se trate. Las de Clase I se extraen por delipidacin con solventes orgnicos, agentes caotrpicos o detergentes.

Detergentes: Molculas anfiflicas, relativamente pequeas. Por encimade la concentracin micelar crtica las molculas coalescen a travs de su parte hidrofbica para formar micelas, en equilibrio con el monmero.

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Cuando se agrega un detergente a una membrana, se particiona dentro de la bicapa hasta que esta se hace inestable y se desintegra. Los lpidos forman en general micelas mixtas con el detergente, en tanto que las protenas hidrofbicas se cubren con una monocapa del mismo.

Actualmente se usa mucho el Triton X-114, que tiene la propiedadde ser miscible con el agua a 0 - 4oC, pero se separa en dos fases a 20 - 25oC. Las protenas integrales, solubilizadas a baja temperatura, particionan en la fase de detergente al llevarlas a 20 -25oC.

Existe una variedad considerable de detergentes empleados en purificacin de protenas de membrana. Pueden ser detergentes inicos, como el SDS o el CTAB, o no inicos, como la digitonina, el octilglucsido, el Lubrol, el Triton, y otros.

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PURIFICACION DE LAS PROTEINAS SOLUBILIZADAS.Las protenas perifricas (o los fragmentos hidroflicos de protenas integrales) en general se purifican por los mismos mtodos que los usados para las solubles. Las protenas integrales presentan problemas especiales, debido a que requieren la presencia continua de detergentes o solventes orgnicos.

La filtracin por gel puede aplicarse; prcticamente todos los materiales para esta tcnica pueden usarse en presencia de detergentes o desnaturalizantes, y existen algunas resinas (politeres hidroxilados, dextranos hidroxipropilados) admiten solventes orgnicos. La cromatografa de intercambio inico y el cromatoenfocado pueden utilizarse, en presencia de detergentes no inicos. La cromatografaen fase reversa en algunos casos puede aplicarse, con la muestra solubilizada en cido frmico al 50 - 70 % en agua. La cromatografa de afinidad es aplicable en general, requiriendose a veces resinas de altas porosidad y brazos espaciadores largos.

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PURIFICACION DE PROTEINAS PARA USO TERAPEUTICO.

Lo que se requiere en este caso es la mxima pureza. Por lo dems, losmtodos usados son como para cualquier protena soluble. La fuente pueden ser tejidos o sueros animales, sistemas de expresin procariticos y eucariticos, o hibridomas.

El nivel aceptable de contaminantes se relaciona con la frecuencia de administracin de la protena, y est regulado por las autoridades sanitarias. La significacin clnica de los contaminantes es variable: 1) Antigenicidad: puede dar origen a reacciones de hipersensibilidad. 2)Transformacin por DNA. 3) Enfermedades transmisibles (virus, priones). 4) Pirogenicidad por lipopolisacridos de pared bacteriana.

Para insulina, se considera que el nivel de contaminantes por debajo del cual no se producen anticuerpos es de 10 ppm. Para DNA se pueden considerar aceptables valores de 10 pg por dosis. Para virus y priones, ausencia completa.

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Se requieren, por lo tanto, mtodos muy sensibles para la deteccin de contaminantes. Para contaminantes proteicos, lo mas usados son los mtodos inmunolgicos. Tambien puede usarse tincin con Ag. El lmite de sensibilidad es del orden de 5 ppm por inmunoensayo, 25 - 50 ppm por Western blot y de 200 - 400 ppm por tincin con plata.

Para DNA contaminante, se usan tcnicas de hibridizacin. Paradeteccin de virus, hibridizaciones y PCR con oligonucletidos adecuados. Para endotoxinas bacterianas, gelificacin de lisado de amebocitos de Limulus polyphemus.

OTRAS APLICACIONES ESPECIALES:

1) SECUENCIACION: Evitar el bloqueo del N-terminal (usar urealibre de cianato). Usar RP-HPLC o SDS-PAGE y electrotransferencia para la purificacin final.

2) CRISTALOGRAFIA: La pureza debe ser alta, pero sobre todo deben evitarse las microheterogeneidades de la propia protena a cristalizar (en especial la protena desnaturalizada). Es bueno terminar lapurificacion con cromatografa de afinidad.

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PURIFICACION DE PROTEINAS EN GRAN ESCALA.

La escala de produccin de protenas y pptidos por la industria biotecnolgica es de gramos a kilogramos, y utiliza columnas cromatogrficas en un rango de volumen de litros a miles de litros.

El aumento de escala es un problema de ingeniera e involucra consideraciones que no estn asociadas con ciencia pura, como se la considera en el laboratorio.

La operacin en escala pequea busca obtener cantidades limitadas de protena, con mucha atencin de personal altamente capacitado. En la operacin a gran escala, se debe minimizar el costo y aumentar al mximo el rendimiento. Esto implica minimizar la intervencin humana, sobre todo de cientficos calificados. El proceso debe ser tan sencillo como sea posible. Las etapas innecesarias son antieconmicas, bajan el rendimieto y multiplican los problemas. Si el proceso de laboratorio est destinado desde un comienzo a una aplicacin industrial, el mtodo de purificacin debe ser diseado desde el principio con miras a su aplicacin en gran escala. Hay etapas de purificacin que pueden llevarse a una escala industrial y otras que no.

La industria biotecnolgica es extremadamente competitiva, y el factor tiempo es crtico.

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El manejo de soluciones de protenas en gran escala implica una serie de problemas tcnicos, como evitar la formacin masiva de espuma (que causa desnaturalizacin) en el bombeo de las soluciones, necesario para transferirlas entre etapas, evitar la agregacin de las protenas al aumentar su concentracin, y evitar escrupulosamente la contaminacin microbiana, que lleva a degradacin.

Las operaciones a realizar son como en cualquier purificacin en escala normal, pero con caractersticas especiales.

Separacin de slidos: Se pueden utilizar centrfugas industriales o filtracin. Las centrfugas de alta velocidad requieren refrigeracin, y contencin adecuada para evitar la formacin de aerosoles contaminantes del medio ambiente. El costo aumenta a medida que disminuye el tamao de las partculas a separar. Los filtros pueden ser los llamados filtros profundos (tierra silcea, 5 a 10 cm de espesor) o membranas (microfiltracin). Los problemas ms importantes son la floculacin de las protenas, su unin a las membranas y la desnaturalizacin.

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Ruptura celular: las tcnicas ms aplicables a gran escala son el homogeneizador y el molino con bolitas de vidrio. Homogenizador: la suspensin (15 - 20 % de peso seco) es forzada a alta presin a travs de una vlvula estrecha; es el mtodo mas usado, pero no sirve paramicroorganismos filamentosos. Puede procesar hasta 6000 litros/hora. Los molinos usan como abrasivo bolitas de vidrio, de 0.3 - 0.4 mm de dimetro. Sirve para microorganismos filamentosos. Acepta 30 - 60 % de clulas, peso hmedo, en suspensin y procesa hasta 2000 litros/hora.

Tambien puede utilizarse en ciertos casos lisis enzimtica (lisozima, por ejemplo) o qumica (tolueno, detergentes como SDS o Triton X-100, agentes caotrpicos como guanidina o urea).

Operaciones primarias de separacin: Incluyen la concentracin, que se puede hacer por ultrafiltracin o por precipitacin, con sales o solventes orgnicos. La remocin de cidos nucleicos puede hacerse con nucleasas, oagentes precipitantes, como la polietilenimina, polmero catinico de peso molecular 24 kDa. Esta precipitacin remueve adems los restos celulares (cell debris).

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Operaciones de purificacin de protenas: Se debe buscar un mnimo de etapas, para disminuir los costos y aumentar el rendimiento. En general, una etapa preparativa (que debe dar un alto rendimiento, aunque no purifique mucho, y puede ser una precipitacin salina); una etapa de alta resolucin, que debe dar un producto altamente purificado, por ejemplo cromatografa de intercambio inico o de afinidad, o cromatoenfocado; yuna etapa final, de pulido del producto, para eliminar los ltimos contaminantes; a esta altura de la purificacin, puede emplearse filtracin por gel. Es lo ms frecuente que el aumento de escala en los mtodos cromatogrficos se obtenga aumentando el radio de la columna y manteniendo, o aumentando poco, su altura. Pero esto depender, naturalmente, del tipo de cromatografa que se use.

Existen columnas con volmenes totales de hasta 2500 litros, con dimetrode 2 metros y alturas ajustables, hasta alrededor de 80 cm. La elucin isocrtica es ms frecuente que el uso de gradientes, para simplificar la operacin.

Se pueden emplear columnas radiales, que constituyen un concepto nuevo en el campo de la cromatografa en columna.

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Cromatografia de flujo radial. La muestra se distribuye del encabezamientode la columna (6) al canal anular externo (1); de alli difunde a travs de la pared porosa (5), a travs del material cromatogrfico, pasa luego a travs de la pared porosa interna (4)y llega al canal interno (2) de donde pasa al colector.