PCR reacción en cadena de la

polimerasa

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALALICENCIATURA EN OPTOMETRIA Correa Gallegos Jaime Moisés

• La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction) es, sin lugar a dudas, la técnica más importante y revolucionaria en biología molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de (ADN) a partir de una sola molécula.

• La PCR se basa en la replicación celular en la que actúan varias proteínas para sintetizar dos nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona como molde.

El inventor de esta interesante técnica fue Kary Mullis por la cual se le adjudicó el Premio Nobel de Química en 1993. Utilizó la PCR para la amplificación del gen de la b-globina humana y el diagnóstico prenatal de la anemia falciforme desde entonces la PCR ha revolucionado todos los campos que estudian y manipula los ácidos nucleicos.

Mullis se basó en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de DNA.

Partiendo de este principio, la reacción en Cadena de la Polimerasa se basa en la

repetición de un ciclo formado por tres etapas:1ª Desnaturalización del ADN doble cadena

*la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC). La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.

2ª Hibridación de los cebadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras

•los cebadores se unen a las zonas 3´ complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65ºC).

3ª Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa

• En la tercera etapa (elongación) se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los deoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde.

• El proceso se lleva a cabo en un termociclador. Un aparato que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta.

•

• Como se muestra en la siguiente imagen , observamos que una vez completado el primer ciclo, disponemos de 2 copias de la muestra original, al final del segundo ciclo tenemos 4, al final del tercero 8...Si los ciclos se producen un número "n" de veces y suponiendo que el número de copias de ADN se duplica en cada ciclo, obtenemos una cantidad de ADN de 2n, por lo que la amplificación se realiza en forma de progresión geométrica.

• La detección del producto de la Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza normalmente mediante corrido electroforético . Dependiendo del tamaño de la amplificación y de la resolución que deseemos usaremos diferentes geles (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones. La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radiactividad (radiografía).

• Gracias a esta técnica se han podido realizar estudios genéticos en cualquier campo de la ciencia. Por ejemplo, se utiliza diariamente para la identificación de cadáveres o en el estudio de escenas del crimen para buscar rastros del culpable. También se emplea en la biología, para identificar cadenas genéticas de plantas, animales o, sobre todo, microorganismos. En la medicina se reúne la experiencia de todos esos campos y se usa principalmente para identificar gérmenes agresores que se encuentran en nuestro organismo.