Reacciones Ag y Ac
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LA REACIÓNANTÍGENO - ANTICUERPO
Concepto de reacción Ag - Ac• Cuando un Ac entra en
contacto con un Ag contra el que está dirigido, ambos se unen formándose un complejo Ag-Ac.
• La unión Ag-Ac es reversible.• La permanencia de la unión
depende de:• Grado de adaptación entre
ambas moléculas.• Fuerza y estabilidad de los
enlaces que las unen.
Características de la Características de la Interacción Antígeno - Interacción Antígeno - AnticuerpoAnticuerpo
EspecíficaEspecífica ReversibleReversible Dependiente de pHDependiente de pH Sensible a la TemperaturaSensible a la Temperatura Sensible a la fuerza iónicaSensible a la fuerza iónica
Enlaces que intervienen en la unión Ac-Ag • No son covalentes. Son cuatro tipos:
1. Electrostáticos: Entre grupos iónicos (NH3+ y -COO-) de Prots. distintas.
2. Puentes de hidrógeno entre grupos polares hidrofílicos (-OH, -NH2, -COOH).
3. Hidrofóbicos: Gr. No polares hidrófobos en medio acuoso (cadenas laterales de algunos AA.)
4. De van der Waals: Fuerzas intermoleculares débiles de origen eléctrico que se ejercen a distancia entre moléculas.
• Las fuerzas de unión de cada uno de ellos son menores que en los covalentes, pero en conjunto consiguen una considerable energía de unión.
COMPLEMENTARIEDAD DE EPÍTOPE Y PARATOPE
• EPÍTOPE Y PARATOPE han de tener estructuras complementarias que encajan entre sí.
• Se forman varios enlaces no coovalentes simultáneamente.
• La distancia entre Ag y Ac es muy pequeña en el punto de unión, lo que incrementa la fuerza de esa unión.
AFINIDAD DEL ANTICUERPO• Es la fuerza de unión
entre el Ac con su Ag• Determina la
atracción entre ellos.• Esa fuerza es la suma
de las fuerzas de los enlaces que intervienen en la unión.
AVIDEZ DEL ANTICUERPO• Es una medida de la fuerza de unión y
estabilidad del complejo:Ag multivalente – Ac multivalente.• Ac multivalentes: Tienen más de un
punto de unión para Antígenos.• Ag multivalentes: Tienen varios
determinantes antigénicos (más de un punto de unión para los Ac).
• La fuerza de unión es mayor que la suma de las afinidades de cada uno de los puntos de unión
Cinética de la ReacciónCinética de la Reacción(ecuación válida solo para moléculas monovalentes)(ecuación válida solo para moléculas monovalentes)
k’
Hapteno + Ac ( Hapteno-Ac)
k
k’
Ka=k
=(Hapteno-Ac)
(Hapteno)(Ac)
[Ac] la concentración de sitios libres de Ac [Ac] la concentración de sitios libres de Ac [Ac-H] la concentración de sitios ocupados del Ac[Ac-H] la concentración de sitios ocupados del Ac
Equilibrio de diálisisPara calcular Ka
ESPECIFICIDAD DEL ANTICUERPO
• Si un anticuerpo reacciona solo con un Ag: Es muy específico.
• Si un Ac reacciona con varios Ag: Tiene una especificidad baja. Se habla de REACTIVIDAD CRUZADA.
• Esto ocurre porque varios antígenos tienen uno o más determinantes antigénicos iguales o similares, capaces por tanto de unirse al mismo Ac.
REACCIONES ANTIGENO ANTICUERPO
APLICACIÓN AL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Los anticuerpos como sondas para buscar antígenos de
interés
EspecificidadEspecificidad SensibilidadSensibilidad EstabilidadEstabilidad Versatilidad en el diseño: ELISA, IFI, Western blot, Versatilidad en el diseño: ELISA, IFI, Western blot,
etc.etc. Tiempo de ejecución razonable: minutos a Tiempo de ejecución razonable: minutos a ~ ~ hrshrs Costo convenienteCosto conveniente Infraestructura mínimaInfraestructura mínima
Ventajas
Inmunización conCarrier-hapteno
Antisuero
Análisis de los Ac. unidos a:
Hapteno libre
Hapteno en otra Proteína
Hapteno al mismo carrier
Los anticuerpos como sondas para buscar antígenos de interés
Ej. Haptenos (drogas, toxinas, hormonas, etc).
Técnicas InmunoanalíticasTécnicas Inmunoanalíticas- Reacción de precipitación En medio líquido
Floculación
Nefelometría Precipitación de complejos Inmunes
En gel Inmunodifusión doble
Inmunodifusión radial Inmunoelectroforesis Rocket electroforesis Contrainmunoelectroforesis Inmunoelectroforesis cruzda bidimensional de Laurel
- Reacción de aglutinación
Aglutinación pasiva Aglutinación directa
- Fijación y actividad hemolítica del complemento
- Reacciones en fase sólida
o ELISA
o Western blot
REACCIONES DE INMUNOPRECIPITACIONCARACTERISTICAS:
Ag solublesAc de clase Ig GReacción poco sensibleReacción muy específicaIntervienen Ac policlonales frente a Ag polivalentes
•Modalidades:• Inmunoprecipitación simple en tubo• Inmunodifusión o Inmunoprecipitación en medio sólido:
Inmunodifusión simple: en tubo (Oudin)En placa o Radial (Mancini)
Inmunodifusión doble o radial (Ouchterlony)Inmunoelectroforesis (Grabar y Willians)ContrainmunoelectroforesisInmunoelectroforesis en cohete (Rocket y Laurel)Inmunoelectroforesis bidimensional.
Reacciones de Precipitación yReacciones de Precipitación yFloculación en soluciónFloculación en solución
Exce
so
AcExceso Ag
Equivalencia
Tiroglobulina agregada (mg)
Prec
ipita
do d
e pr
oteí
nas (
mg)
Reacciones de sueros humanos de pacientes con Tiroiditis de Hashimoto auotoinmune.
Inmunodifusión DobleInmunodifusión Doble (o de Ouchterloni)(o de Ouchterloni)
Ej: Mezcla de antígenos y suero polivalente
AS (pozo central) : Antisuero de conejo anti-suero humanoHSA: Albúmina humana purificadaHIg: Inmunoglobulina humana purificada
Suero humano
HSA
Suero humano
HIg
Ensayo Immunoturbidimétrico
Suero + Ag complejos insolubles
Aumenta turbidez de la solución
y puede ser medida ópticamente
Turbidez proporcional a la cantidad
de proteínas en la muestra
Sensibilidad de método se puede incrementar con los anticuerpos Unidos a látex: mayores agregados
Inmunodifusión RadialInmunodifusión Radial
Anticuerpo incorporado al gel
El tamaño de los halos es proporcional a la
concentración del antígeno
Ag
• REACCIONES DE AGLUTINACION• Características:• Ag particulados, generalmente poliantigénicos• Ac de clase Ig M e Ig G• Reacción con Ag superficiales.• Reacción bastante sensible• Reacción relativamente específica• Intervienen Ac policlonales frente a Ag polivalentes.
• Modalidades:Aglutinación directa:Cualatitativa/cuantitativaEn tubo/en portaAglutinación pasiva:Prueba de Coombs directa e indirectaHemaglutinación pasivaPrueba de LátexPruebas de coaglutinación
Reacciones de AglutinaciónReacciones de Aglutinación
Aglutinación Directa: Las partículas o células tienen un antígeno intrínseco.
Aglutinación Pasiva: partículas o células a las cuales se le agrega el antígeno
Se considera aglutinación cuando el antígeno esparticulado y tiene como tamaño mínimo el bacteriano
Reacciones mediadas Reacciones mediadas por Complementopor Complemento
Lisis celular
REACCIONES DE FIJACION DEL COMPLEMENTO
Reacción positiva (No hemolisis)
Reacción Negativa (Hemolisis)
Reacciones en fase sólidaReacciones en fase sólida
ELISA Western blots Inmunofluorescencia Cromatografía de Afinidad
ELISAELISA(Enzime linked (Enzime linked immunosorbent assay ) immunosorbent assay )
Detección de anticuerpos Detección de Antígeno
Determinación de antígenos Determinación de antígenos por ELISApor ELISA
Competencia Sándwich
[ Ag ]
Den
sida
d óp
tica
[ Ag ]
Den
sida
d óp
tica
Caso de Haptenos Caso de Proteínas
Método indirecto• También conocido como método Sándwich
(Antígeno-anticuerpos-anticuerpo), se basa en la fijación de un antígeno a la fase sólida, el cual atrapa los anticuerpos homólogos en la muestras que posteriormente son identificados con un anticuerpo específico marcado con una enzima. En estos casos la cantidad de antígeno es directamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado.
POZO DE LA PLACA DE ELISAPOZO DE LA PLACA DE ELISA
MUESTRA DEL PACIENTEMUESTRA DEL PACIENTE
TMBTMB
STOPSTOP
Antígeno en Antígeno en PlacaPlaca
PP
Anticuerpos anti-IgG Anticuerpos anti-IgG Humana marcados con Humana marcados con
PeroxidasaPeroxidasa
TÉCNICA DE SANDWICH
Anticuerpos IgG en la Anticuerpos IgG en la Muestra del pacienteMuestra del paciente
Directo
• Detecta al antígeno y se basa habitualmente en la captura de este por anticuerpos específicos unidos a una fase sólida
• El antígeno presente en la muestra se combina con el anticuerpo fijado.
• El antígeno se detecta con otro anticuerpo específico conjugado a una enzima, se adiciona un sustrato para la enzima y se mide la intensidad de color.
POZO DE LA PLACA DE ELISAPOZO DE LA PLACA DE ELISA
MUESTRA DEL PACIENTEMUESTRA DEL PACIENTE
TMBTMB
STOPSTOP
Antígeno en Antígeno en La muestraLa muestra
PP
Anticuerpos IgG Anticuerpos IgG marcados con marcados con
PeroxidasaPeroxidasa
TÉCNICA DIRECTA
Placa con AnticuerposPlaca con AnticuerposIgG contra el AgIgG contra el Ag
POZO DE LA PLACA DE ELISAPOZO DE LA PLACA DE ELISA
MUESTRA DEL PACIENTEMUESTRA DEL PACIENTE
TMBTMB
STOPSTOP
Placa con AnticuerposPlaca con AnticuerposDe Captura De Captura
contra IgM Humanacontra IgM Humana
Anticuerpos IgM en la Anticuerpos IgM en la Muestra del Muestra del
pacientepaciente
Antígeno en Antígeno en soluciónsolución
PPAnticuerpos Anticuerpos anti-antígeno anti-antígeno marcados con marcados con
PeroxidasaPeroxidasa
TÉCNICA DE INMUNOCAPTURA
Método competitivo• Se basa en la competencia que se establece entre
un antígeno marcado enzimáticamente y el mismo antígeno sin marcar (muestra objetivo) al ser colocados frente a una cantidad limitada del anticuerpo homólogo fijado a la fase sólida. En estos casos la cantidad de antígeno es indirectamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado.
Western blotWestern blot
Anticuerpo específico
Anti-anticuerpo-Enzima
Sustrato
Precipitado producto enzimático
Quimioluminiscencia
Inmunofluorescencia indirectaInmunofluorescencia indirecta
Anticuerpo anti-Acrosina
Anticuerpo anti-Ag de embrión de ratón
Se puede hacer con células vivas o fijadas,
con o sin permeabilizar.
Cromatografía de AfinidadCromatografía de Afinidad
Anticuerpo
Anticuerpo no unido
Buffer de elusión
Elución de Anticuerpo
Ej: Purificación de un anticuerpo uniendo el antígeno a una resina (sp). Sin embrago, también se puede hacer lo contrario.
Quimioluminiscencia• Es el fenómeno que ocurre en las luciérnagas:
• una reacción química con un muy alto rendimiento energético produce una molécula potencialmente fluorescente.
• (No hay excitación luminosa como en la fluorescencia)
• Usualmente son reacciones redox catalizadas por enzimas que involucran O2 o H2O2 y un sustrato orgánico oxidable. La energía se libera como luz visible.
Quimioluminiscencia
Oxidante(H2O2,, perborato Na)
Luminol
PON2
Intermediarioelectrónicamente excitado
Luz, 425 nm
(3-aminoftalhidrazida)
aminoftalato
Quimioluminiscencia• Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de moléculas, menor límite de detección que en los otros métodos enzimáticos.
• Se marcan Ag o Ac con sustancias que participan en la reacción quimioluminiscente (luminol, peroxidasa).
• Se detecta la señal quimioluminiscente Se hacen en fase sólida, o en técnicas homogéneas
Electroquimioluminiscencia• Ej.: determinación de TSH
• Incubación a 37º
Muestra con TSH
Partícula magn
Streptavidina
Anti-TSH-biotina
•anti-TSH-Ru(bipy)3
Electroquimioluminiscencia
• Ejemplo: TSH
IMÁN
ELECTRODO
Anal Chim Acta, 378, 1(1999)
Electroquimioluminiscencia• Marca: Ru(bipy)2+
3
• Ru 2+Ru 3+
En presencia de N(Pr)3, en un ánodo, el pasaje de la forma +3 a +2 va acompañado de quimioluminiscencia.,
Con partículas magnéticas y un imán asociado al electrodo, se realiza la reacción allí.