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/&'OMBi?'E: E d i t h i l r o s z t e i n Rener TSILXFOlJL; PA XTICLJLBR: 553- 72-35 #A TRICULA : 80330725

J CAERZZA: I n y e n i r i a BioqrEfrilica I n d u s t r i a l T.QIhfISTi?Z: S y r e s a d a en J u l i o d e 1984. F i O R A Y :;.&#ANA: DE 13 a 1 5 h s . según l o : .equiri¿ e l proyecto. LUGA!? DCil3)E .'E R13:;I.IZC: L a b o r a t o r i o s Na c i ona l e s d e Fomento In-

d u s t r i a l (LAA'FI). 1i6CFiA Di? II;TICIO: 2O/C;ct. 183 PECiiA BE T.X8&IiVd$CION: 2O/Sept. / e 4

/,VO,Vi92E TL TUTOt? Z,,YT : W G : sir. Zdmundo ?lava . pU%';'íCj Y dDSC:'?I!:'CI(;li': Departamento d e i9iotecno.l o y f a

&?TULO: '>Ai s lamiento d e C epa s d e l Género P s eudomona s $ara 10

M o d u c c i d n d e V i t a m i n a 812''

b

U N I V E R S I D A D A U T O N O M A M E T R O P O L I T A N A

I 2 T A P A L A P A.

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL REALIZADO

EN

LABORATORIOS NACIONALES DE FOMENTO INDUSTRIAL

PROYECTO FINAL.

- Edith Brosztein Rener

Matricula: 80330725

Ingeniería Bioquimica

Industrial.

Octubre de 1984.

SELECCION DE CEPAS DEL GENERO

Psemiomonas PARA LA PRODUCCION DE VITAMINA

B l 2

INDICE . ". .

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, .

PAGIMA

OBJETIVO. ..................................................... a

INTRODUCCION ................................................... 1

CARACTERISTICAS GENERALES DE LA VITAMINA 012 .................. 7

CARACTERISTICAS DEL GENERO Pseudomonas ....................... 11

ANTECEDENTES E HISTORIA ...................................... 13

RUTA METABOLICA GENERAL PARA LA BIOSINTESIS DE COBALAMINAS ... 16

CARACTERISTICAS GENERALES DE LA PRODUCCION DE VITAMINA B12

POR VIAS FERMENTATIVAS ....................................... 17

I

i A

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIALES Y EQUIPOS ......................................... 2Q

REACTIVOS .................................................... 21

METODOS ANALITICOS ........................................... 23

PRUEBAS BIOQUIMICAS .......................................... 28

AISLAMIENTO DE CEPAS ......................................... 31

PRODUCCION DE VITAMINA B12 ................................... 34

RESULTADOS ................................................... 36

DISCUSION Y CONCLUSIONES ..................................... 40

SUGERENCIAS .................................................. 4~

RESUMEN ...................................................... 43

BIBLIOGRAFIA ................................................. 45

-

.~ .

. . . OBJETIVOS..

El objetivo pricipal del presente-trabajo fue encontrar ce-

pas del genero Pseudomonas para la producci6n de vitamania B12,

ya que la vitamina mencionada se importa en su totalidad al pals,

representarndo esto un gasto importante para la industria farmaceti -

tics nacional.

Debido a que lo básico par poder desarrollar un proceso fer - mentativo para producir en cantidades significativas la vitamina

B12, es encontrar una buena cepa productora de este metabolito; es .

necesario empezar a buscar cepas con esas características.

. .

1 ,

1

IMTRODUCCION.

El hombre ha utilizado las fermentaciones desde los albo-

res de la civilización, a pesar de que no conocía las causas -

del desarrollo de estos procesos.

AUn sin conocer la existencia de los microorganismos como

tales, el honbre aprendió a utilizarlos para s u bienestar, ya

sea en el antiguo arte de fabricación de quesos, en la fabrica -

c ción ¿e salsa de soya, en el horneo del pan, en la producción

de vinos, etc. (2) - - r

.- c

Actualmente el honbre utiliza los procesos fermentativos

para obtener productos de consumo animal y humano, tales como

antibióticos, proteina unicelular, producción de amino-acidos,

vitaminas, esteroides, energéticos como etanol y metanol, etc.

La posibilidad de utilizar desechos agrícolas y domésti--

cos, así como el bagazo de caña, residuos de destilerias, remo

lacha, licores sulfíticos, melazas, suero de leche, etc., como

sustrato para la composición de los medios de fermentación in-

crementa la importancia económica de los procesos fermentati--

-

vos, procesos que en la mayoría de los casos, no producen dese

chos contaminantes (1).

-

Actualmente sabemos que los procesos fermentativos que se

realizan a partir de cultivos puros de microorganismos, depen-

.

den de las características de la cepa con que se trabaja, de - - -

ahí que el aislamiento y la selección de las cepas adecuadas pa-

ra la realización de l o s procesos fermentativos deseados, son de

vital importancia para el desarrollo y la industrialización de -

un proceso fermentativo dado.

Las caracteristicas de las cepas aisladas y seleccionadas -

pueden ser posteriormente mejoradas por medio de inducción de FIE

taciones y por técnicas de Ingenieria Genética, para la optirniza

ción de un proceso establecido.

Entre los productos que pueden ser obtenidos por via fermen -

tativa se encuentra la vitamina B12 (cobalanina), que es un con-

puesto indispensable en la dieta animal y humana. En México este

compuesto se importa en su totalidad de Estados Unidos (571 Kg.)

y de Francia ( 5 Kg. ) (Datos tomados de l o s manuales de estadís-

tica nacionales del IMCE, de 1979).

La vitamina B12 se encuentra en casi todos los tejidos ani-

males, siendo l o s productores principales de este producto l o s -

microorganismos. Algunos animales adquieren la vitamina B12 que

requieren absorbiendo el colmpuesto a medida que se produce en

su propia flora intestinal. El hombre no puede hacerlo, ?or lo -

que requiere ingerir en su dieta toda la vitamina B12 que necesi

ta. ( 8 ) .

Recientemente se log& la sintesis química de la vitamina -

B12, pero este proceso es tan lento y dificil que por s i mismo -

3

el metodo no resulta una amenaza económica a la producción por - vía fermentativa del compuesto.

Muchos protistas pueden sintetitar la Vitamina B12. Este - -

producto aparece cono un subproducto importante en las fermenta-

ciones de Estreptomicina y Aureomicina, y también aparece en ca'

tidades significativas en el residuo lodoso sólido del tratamien

to de desechos biológicos (3).

La vitamina B12 también puede ser obtenida por procesos ex-

tractivos a partir del hígado y del riñon de res, sin embargo, -

estos porcesos resultan nuy caros en comparación con los proce--

sos fermentativos, debido que en estos últimos se obtienen rend2

mientos muy superiores (1,13,14,15)

Las fuentes naturales de vitamina B12 son muy variadas, aun

que su origen parece ser exclusivamente microbiano. A continua--

ción se presenta un cuadro con l o s contenidos de vitamina B12 en

algunos productos naturales (1). -

PRODUCTO CONTENIDO DE VITAMINA

B12 (O. 0001g/Kg seco) - Leche fresaca 3 - 5

Leche completa en polvo 10 - 26

Queso . 25

Yema de huevo 28

Verduras y hortalizas verdes indicios

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PRODUCTO

Algas

Filete de Lenguado

Ostras

Alme j as

Harina de pescado

Riñon de salmon

Res vacuna:

Mus 1 o

Hígado

Riñon

Corazón

Carnero

Carne de caballo

Carne de pollo

4

CONTENIDO DE VITAMINA

6 0 - 2 8 0

13

1 5 0 - 2 8 0 0

2 5 0 0

1 7 0 - 1 5 0 0

1 8 0 0 0

5 5 - 7 9

5 0 0

5 0 0

2 5 0

8 8

7 0 - 7 5

5 2

El hombre requiere alrededor de 1 micrograno de vitamina - -

B12 diario ( 1 2 ) .

Por otra parte, a continuación se presenta una tabla con las

características de la producción de vitamina B 1 2 para algunos pro

cesos microbianos: -

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7 i

CARACTERISTICAS GENERALES DE LA

VITAMINA B12

La vitamina B12 es un conpuesto otgánico complejo, indis-

pensable para el metabolismo animal y humano. Su deficiencia - -

en el organismo es responsable de una enfermedad l?amada ane--

mia perniciosa, la cual en su estado completamente desarrolla-

do se caracteríza por síntomas tales cono: cambios neurológi-

cons y mentales, disfunciones endócrinas, macrocitosis, médu-

la osea megaloblástica, leucopenia, disturbios en el metabo- -

lismo de las grasas, gastritis atrófica, desordenes en mernbra-

nas mucosas y ocacionalmente otros disturbios (10, 13)

I

I I !

. I !

ficiencia de vitamina B1Z en la dieta humana, sino por una fa- ¡ lfa en la absorción de la vitanina mencionada de la alimenta-- I

cion ingerida, debido a la ausencia de una giicoproteína espe-

cífica conocida- como factor intrínseco. Esta glicoproteína se

une a una molécula de vitamina Bl?. y la traiisporta he-ia dentro

La anemia - perniciosa no se produce únicamente por una de-

-

de las celulas intestinales, de las cuales es transportada uni-

da a otras proteinas llamadas transcobalaminas, a l o s tejidos

periféricos (9). -

La vitamina B12 tiene 2 componentes característicos. El -

más grande es un sistema de anillos, que se asemeja a un siste

ma de anillos porfirínicos, como en la hemoglobina, que contie

ne 4 anillos de tipo pirrólico, pero en el cual un par de es-

tos anillos de 5 miembros, esta unido directamente, en vez de

a

unirse por un puente de metano. Coordinando a l o s 4 atomos de

nitrógeno internos del sistemade anillos 3e encuentra un átomo

de cobalto, esencial para el crecimiento. El segundo componen-

te de la vitamina B12 es un ribonucleótido, que contiene como

base un 5,6-dimetilbenzimidazol en la union inusual alfa-N-glL

cosil con D-ribosa, en vez de una unión beta,firesente en la ma

yoría de los nucieótidos. Este ribonucleótido esta unido al ng

Cleo de anillos por un enlace coordinado, entre el otro átomo

de nitrógeno del nucleótido, y e1"átomo de cobalto, y por una

union ester entre el grupo 3-fosfato del ribonucleótido y la -

cadena lateral de los anillos. *

El grupo Cianuro ocupa una de las posiciones de coordina-

ción del átomo de cobalto, y de ahí se obtiene la cianocobala-

mina. Sin embargo, el grupo cianuro esta presente como un me-'

dio de aislamiento, ya que se conocen complejos similares con

nitritos, suifitos e hidróxidos (9).

La estructura química de la vitamina B12 se presenta en - la figura 1. Los derivados de la cobalamina en los que el gr:

PO Y varia reciben diversos nombres, de acuerdo al grupo sustl

tuyente, pero todos son fisiológicanente activos. Unicamente -

cuando el grupo X es diferente al 5,6benzimidazol la presudovi -

tamina así formada es fisiológicamente inactiva (14).

-

9

ESTRUCTURA QUIMICA DE LA VITAMINA B12

y\ CH.

X CH ..

i

- X Y Nombre Trivial

-CN Cianocobalamina(B12) -OH Hidroxocobaiamina -CH3 - Metilcobalamina

-

5,6-dimetilbenzi- CH2 midazoi

dH2

5-desoxiadenosilo . .

10

La vitamina B12 forma cristales rojos, l o s cuales funden

a 300 "C., pero se.obscurecen a alrededor de 210 - 220 'C. - -

Estos cristales son solubles en agua hasta una concentración a

de 1.25% a 25'C., también es soluble en alcohol y fenol, pero

es insoluble en acetona, eter y cloroformo. Su estabilidad a -

temperatura ambiente es relativamente grande, ya que no se a- -

precia pérdida notoria de actividad en períodos de 2 años o - -

más, y además en su forma ciano es de las vitaninas más resis-

tentes a la temperatura.

11

CARACTER.lSTICAS DEL GENERO

i PSEUDOMONAS

i I

Son bacilos rectos o encorvados, Gram negativos, con movi - lidad por flagelo polar, niden de 0.5 a 1 micra. Pueden ser mo -

notricos o multitricos.

Son quimeorganot6trofes, de metabolismo respiratorio, nun -

ca fermentativo. Algunas especies son quimeorganotótrofas fa--

cultativas, capaces de utilizar hidrógeno o mon6xido de carbo;

no como fuente de energía. El oxigeno es su aceptro final de -

el.ectrones, qunque algunas especies son capaces de desniírifi-

car, utilizando nitratos como aceptores alternativos.

Por l o general habitan suelos, aguas frescas y marinas, =

en las cuales es importante su actividad ei.1 la mineralización

de materia orgánica.

Algunas especies causan enfermedades en plantas-y exhiben

distintos grados de especificidad de hnesped.

. La mayoría de la especies de este género pueden crecer en

medios minerales, sin factores de creciniento, con un solo com -

ponente orgánico como única fuente de carbono y energla. Algu-

nas especies requieren la presencia de aminoácidos o vitaminas

en el medio de cultivo.

-

Crecen entre 4 y 43eC. siendo la temperatura óptima de _ -

12

crecimiento, para la mayoría de las especie5 30"C., y el pH

más adecuado de 7 a 8 . 5 . En la mayoría de las especies el - crecimeinto se inhibe a pH menor de 6.

Las especies marinas requieren por l o menos 1% de NXC1

en el medio de cultivo para desarrollarse, las de suelos o a

gua dulce no requieren situaciones iónicas u osmóticas parti

culares.

- -

Algunas son huespedes de Bacteriofagos. ( 4 )

En cuanto a sus características bioquímicas, l a mayoría

son Oxidasa +, Catalasa +, metaboiismo oxidativo, presentan -

reducción de nitratos variables, y algunas colonias presentan

fluorescencia. No forman esporas, presentan movilidad positi-

va (a excepción de - P. mallet) Crecimiento en agar de cetrimi-

da + (11).

1

13

‘ ANTECEDENTES E HISTORIA. -

En 1925, Wipple y Robbins, al estudiar e l efecto terapefi-

tic0 que poseía el hígado de res sobre la anemia perniciosa, - sospecharon la existencia de un factor específico responSable

de la reversi6n de l o s síntomas causados por esta enfermedad-

I

(141.

A pesar de los esfuerzos hechos para aislar este factor,

no fue sino hasta 1948 en que Rickes y colaboradores, y Smith I

independientemente, lograron aislar ese factor como cristales I ‘ I puros (14, 9)

En 1948, Castle sugirió que para que se efectuara la absor

ción de esta vitamina por el organismo humano también era nece-

saria la presencia de un factor presente en el jugo gástrico:

una mucoproteina de bajo peso molecular, conocida posteriormen-

te como factor intrínseco de Castle. En humanos carentes de es

te factor, la absorción puede ser provocada por medio de la ad-’

ministración de dosis superiores a las presentes en humanos nor -

males ( 15 mg./día) (1).

- Dohkin y colaboradores, e n 1955 revelaron la estructura de

la vitamina B12, por medio de cristalografía de Rayos X. Su s i n - tesi5 química tomó 10 años desde los primeros trabajos de Wood-

ward y Eschenmoser, hasta su culminación con l o s trabajos de - - -- Krieger (1973) y Maugh (1973), con un proceso de 70 pasos (14) . -

..

14 t I

Los priemros procesos fermentativos para la obtención dn

vitamina B12 fueron con Hacillus megatherium, y con Streptomy- - -- ces olivaceus. También se hizo un proceso no fermentativo de - extracción de aguas negras.

. Las concentraciones finales de vitanina obtenidas en estos

procesos varaiaban entre 4 y 20 Mg./lt. de peso seco de produc-

to fermentado.

Posteriormente se descubrió que Pseudomonas denitrificans

y ciertas especies del genero Propionibacterium, tenían una ma - yor capacidad de producción de' vitamina B12, incrementandose - los rendimientos aGn más después de utilizar métodos de muta-

ción y selección de cepas de estos microPorganismos, lográndose

concentraciones de cianoc:obalamina de 20 a 40 bIg/lt. de medio

de cultivo, o más (10,14,15).

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16

RUTA METABOLICA GENERAL PARA LA BIOSINTESIS DE

j COBALAMINAS.

Glicina x 2 Cuccinil COA )Por f obi1 inógeno

levuiínico.

Urogeno 111

Coprógeno 111

\1 Protoporfirina IX

-I

Hemoglobina Clorofilas

Citocromos

Unidades CHI A I

J

.L Acido cobirinico

Aminopropanol

Cobinamida

5~-desoxiadenosilcobinamida

Guanosina-difosfato I

5,6-dimetilbenzimidazoi

T

d-ribazol-S'fosfato -\

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I

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Sl-desoxiadenosilcoba- lamina fosfato

Riboflavina

Tomada del Peppler, H.J. Microbial Technology

5'-desoxiadenosilcoba- 4. 1 I

I lamina (Co.Bl2)

17

CARACTERISTICAC GENERALES DE LA PRODUCCION DE

VITAMINA B12, POR VIAS FEF'JIENTATIVAS.

En el cuadro No.1 se enlistan algunos de l o s trabajos rea -

lizados recientemente, sobre la producción de vitamina B12.

En base al cuadro mencionado, de forma general podríamos

decit que la concentración de vitamina obtenida en los distin-

tos medios de cultivo, con los distintos microorganismo~ es muy

variable, pero l o s microorganismos que presentaron mayor ?TO--

ducción fueron: Propionibacterium shermanii, - P. freudenreichii, - P. vannielli, Pseudomonas denitrificans, y bacterias metanogéni -

cas, en.cultivo mixto.

Las condiciones fermentativas dependen del microorganismo

que se utilice, pero en todos l o s casos se requiere de la adi-

ción de oligoelementos esenciales para la biosíntesis de las - cobalaminas, como l o son el cobalto, requerido a una concentra

ción que varia entre 5 y 100 mg./lt., y con frecuencia el 5,6-

dimetilbenzimidatol (BBI), a una concentración que varía entre

10 y 30 mg/lt, para incrementar la producción de vitamina. Los

precursores potenciales de los corrinoides también pueden ser

benéficos (entre ellos estan la glicina, treonina, acido delta

aminolevulínico y aminopropanol) (14).

Entre l o s sustratos más utilizados estan la glucosa, saca - 1

rosa, melazas de remolacha y caña, harina de pescado, levadura I

I

18

de cerveza, agua de cocimiento de maíz, harina de soya, suero

de leche, metano1 y parafinas-(13,14).

I..

I-

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L

c

Daniels (1970), estudio la fermentación para obtención - de vitamina B12 con Pseudomonas denitrificans, realizando el .

. proceso en condiciones aerobias y con agitación. El encontró que se requieren para este proceso componentes tradicionales

como sacarosa, extracto de levadura, sal'es metálicas, de 10 a

25 mg/lt. de medio de DBI, y de 40 a 200 mg/lt. de &dio de - sales de cobalto, principalemnte en forma de nitrato, para es -

timular la producción de la vitamina B12. Así mismo, la beta-

- ína y la colina tenían efectos favorables para activar algu-

nos pasos biosintéticos, o para alterar la permeabilidad de -

la membrana en la producción de la vitamina. La temperatura '

óptima a la cual se realizó el proceso fueron 28"C, y el pH se

mantuvo en 7 . Q

En estudios a nivel laboratorio, trabajando con uh medio

químicamente definido, Daniels (1970), encontró que la metio-

nina, el 6-aminoievuiinato, ei succinato y el 1 -aninoz-propa-

nolno tenian efecto marcado sobre la producción de vitamina - -

BlZ, con P. denitrificans, también encontró que la glicina in-

hibe el crecimiento de la cepa, y que la colina s o l o sustituye

-

- -

parcialmEnte a-la betaina, en e l medio de producción. Como - - fuentes de carbono se puede utilizar D-glucosa, D-galactosa, - \

1 i

I D-manitol, D-sorbitol, sacarosa (aunque al hidrolizarla no se

ataca a la fructuosa), maltosa, lactosa, nelobiosa y rafinosa.

19

I-

-

La manosa y la sorbosa inhibian el crecimiento.

Daniels encontró que el nivel óptimo de sacarosa para la

producción de vitamina B12 es de 3% . Si se utiliza hasta un -

5% se incrementa e l crecimiento del microorganismo, pero no - la producción de la vitamina.

P i

20 ~

!

! MATERIALES Y EQUIPOS. \

EQUIPO :

Agitadores de matraces con baño de agua (hot pack Shaker)

Autoclave

Balanza analítica (Sartorius)

Balanza granataria

Centrífuga Sorval

Espectrofotómetro (Bausch 6 Lomb)

Estufa para incubación de cultivos.

Horno (O-300°C.)

Microscópio óptico

Refrigerador

Tanque de COZ con regulador de flujo y rotámetro.

MATERIAL DE VIDRIO:

Matraces Erlenmeyer de 250 y 500 ml.

Matraces volumétricos de 100 y SO ml.

Pipetas graduadas de 1, 5 y 1 0 ml.

Pipetas volumétricas de 1, 5, 10 y 20 mi.

Tubos de ensaye para cultivos.

Cajas de Petri.

-

MATERIALES:

1) Gradillas

2) Mecheros

3) Asas.

21

REACTIVOS.

Acetona

Acido acético

Acido clorhídrico

Acido sulfanílico

Agar Bacteriológico.

Agar de Cetrimida (DIFCO)

Agar nutitivo (DIFCO)

Agua destilada-

Alcohol amílico.

Azul de Bromotimol

Bacto B12 Assay Medium, USP (DIFCO)

Bacto Microassay Culture Agar (DIFCO)

Bacto Microinuculun Broth (DIFCO)

Caldo MR-VP (DIFCO)

Caldo de Nitratos (DIFCO)

Caldo Nutritivo (DIFCO)

Caldo de Triptona (DIFCO)

Cianocobalanina alta pureza.

Cianuro de potasio.

Cloruro de potasio

Cloruro de sodio

Cristal violeta

Dimetil-alfa-naftilamina

Etanol

Extracto de Levadura

Fostatidilcolina.

Fosfato monoácido de amonio

Fosfato monoácido de potasio

D-glucosa

Granalla de zinc.

Molibdato de sodio dihidratado

Nitrato de cobalto hexahidratado

P-dimetilbenzaldehido.

Peptona

Sacarosa

Safranina

Sulfato ferríco heptahidratado

38) - S u l f a to de magnes io heptahidra tad0

39) Sulfato de manganeso tetrahidratado

40) Sulfato de zinc haptahidratado.

22 1

MICROORGANISMO:

Lactobacillus leichmanii (del cepario de LANFI)

.-

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I_

23

METODOS ANALITICOS.

DETERMINACION DE VITAMINA B12:

Los métodos de análisis de vitamina B12 pueden ser espec-

trofotométricos o microbiológicos; l o s primeros por l o general

son muy laboriosos y se recomiendan para la evaluación de pro-

ductos de uso farmaceútico. Los segundos representan una herra-

mienta más acsesible para análisis rutinarios, ya que no necesi -

tan pasos previos de purificación como l o s anteriores (14).

Los microorganismos 'que se han utilizado para el análisis

microbiológico de vitamina B12 son: Lactobacillus leichmanii, - Escherichia coli, Euglena gracilis y QChromonas~malhamensis. - Estos microorganismos tienen la capacidad de responder al efec-

to estimulatorio de pequeñas cantidades de vitamina B12, por l o

que es posible hacer diluciones muy altas del medio de cultivo,

de forma tal que l o s componentes que pudieran interferir, como

los son l o s desoxinucleótidos, purinas, antibióticos y sales, -

se diluyan a-una concentración mínima que no afecte ai análisis

aunque existe la posibilidad de respuesta a compuestos análoeos

a la vitamina B12 (6, 14)

El método más especifico es el método con Ochromonas malha-

mensis, sin embargo tiene el inconveniente de que el tiempo de -

duración de la prueba es muy largo (Sdias para la preparación - -

del inóculo y de 5 a 7 días de incubación para la prueba).

i I

El método

e l anterior, y

la realización

leichmanii.

i ?

24

con Euglena--~racilises'menos específico aún que -

es más tardado,.por l o que se seleccionó, para - l

!

del presente trabajo, e l método con LactobacilSns

El microorganismo seleccionado responde a adenina-cobalami-

nas, hipoxantina-cobalaminas y desoxirribosidos, como contaminan -

tes.

La cuantificación de la cianocobalimina en el presente tra-

bajo se realizó en base al método presentado por Strohecker y - -

Heinz ( 1 4 ) , con ligeras modificaciones basadas en e l método des-

crito por la AOAC (Association of Official Analytical Chemists,

de 1980), utilizando Lactobacillus leichnanii del cepario de :-'

LANFI, como microorganismo de prueba.

Los medios de cultivo que se emplearon para la realización

de este análisis fueron: -

No. 1. - Bacto Microassay Culture Agar (DIFCO)

14b.Z.- Bacto Microinoculum Broth (DIFCO)

ke , 3. - Bacto Bl2 Assay Medium USP (DIFCO).

'\

E l mantenimiento de la cepa de Lactobacillus leichmanii se -

efectuo por medio de resiembras mensuales en medio Bacto Microas

say Culture Agar, incubandose el cultivo por picadura a 37OC., -

por 24 hs. Des pués el cultivo se almacenaba a 4°C.

. 25

Soluci'ón Estandar de Cianocobalamina:

~

Para realizar la determinación se preparó una solución es-

tandar de cianocobalamina, con un contenido de 10000000' picogfa -

mos de cianocobalamina por mililítro de solución, en solución al- I

l cohólica, conteniendo 5 ml. de tolueno para estabilizar la solu-

ción, que se almacenó en la obscuridad, a 4°C.

De esta solución se tomóun mililitro y se llevo a 1 It, te- i

1, I

niendose así una solución stock de cianocobalamina con 10 OOOpg.

de cianocobalamina por mililitro de solución, que se almacenó de

igual manera. i

I

La solu-ción fue preparada con Cyanocobalamine Reference Std.

USP? que contiene 6 .5 microgramos de cianocobalamina por cada mi-

ligramo de estandar seco.

Extracción de la Cianocobalamina de las Células Microbianas:

Esta extracción se hizo adicionando 2ml. de solución de KCN

(Cianuro de Potasio) al 5%, por cada muestra de medio, contenien

do aproximadamente 250 microgramos de cianocobalamina, sometien'

dose las muestras a un baño de agua a 85OC. por 60 minutos, para

convertir todas l as formas de cobalamina a cianocobalamina, la -

cual es más resistente a la temperatura.

-

,

Posteriormente estas nuestras fueron centrifugadas y lava; I das para eliminar los resídiios celulares, y trabajar únicamente I

I I

con el medio que contenía a la cianocobalamina, para evitar in--

terferencias en la lectura de las pruebas.

2 6

Preparación del Inóculo:

La cepa que fue sembrada en el medio No. 1 por picadura se

inoculó en un tubo-con 10 ml. del medio No. 2, previamente este-

rilizado, y se incubó de 20 a 24 hs. a 36-37°C. Posteriormente - las cé lu las crecidas se lavaron 4 veces con solución salina iso-

tónica estéril, centrifugandose a 2000 r.p.m. durante 15 minutos

cada lavado.

Después del Gltimo lavado las células fueron resuspendida3

en 10 ml. de medio -*de prueba (No. 3) diluido y estéril. De es-

tos 10 ml. se'transfirió nuevamente lml. a 99 ml. de medio No. 3

diluido y estéril.

El cultivo preparado de &Sta forma fue utilizado para inocu - lar los tubos de ensaye tanto de la curva tipo, como de las muez

tras problema.

Preparación de la Curva Tipo y de las Muestras Problema:

Los tubos en l o s cuales se realizó la prueba se metieron a

un horno a 250e, por 4 a 6 hs, para eliminar cualquier residuo - contaminante presente que pudiera interferir en la prueba.

- Para la elaboración de la curva tipo se elaboraron dilucio-

nes del estandar de cianocobalamina en solución, a que tuvieran

una concentración de 10, 20, 50, 100, 200 y 1000 pg/Ml, además - de un blanco. Un mililitro de cada una de estas diluciones fue -

27 I

adicionado a un tubo de prueba correspondiente, al que se le adi - cionaron posteriormente 2ml. del medio No. 3 concentrado.

I Para la determinación de las muestras problema se efectua--

ron diluciones de éstas de 1:lOO y 1:lOOO. Un mililitro de cada

una de estas soluciones se adición6 a l o s tubos de prueba, y se 1 i procedió de igual manera que con l o s tubos de la curva tipo.

Todos l o s tubos así preparados se esterilizaron a 121OC. por

5 minutos, y se dejaron enfriar. Posteriormente se inovuiaron, ca - da uno con una gotita de intitulo, utilizando una pipeta Pasteur - esterilizada en el horno previamente.

Cada concentración, tanto de la curva tipo como de las mues-

tras problema se realizó por triplicado. i

Los tubos ya inoculados se incubaron de-16 a 24 hs. a 36°C.

(hasta que no se observó un cambio significativo en la turbidez - en 2 h s . )

‘ I Para efectuar la lectura del crecimiento máximo en cada tu-

bo, el medio de cada tubo fue diluido a 5ml con agua destilada, - 1

efectuandose las lecturas a 546 nm. en un Espectrofotómetro Ba-- -

usch $ Lomb, ajustando a 100% de transmitancia con el tubo blan-

co que no contenia cianocobalamina estandar. I

I

I / I

PRUEBAS BIOQUIMICAS

1 ..

1

I

CATALASA:

Para realizar esta prueba, en condiciones estériles se to-

1 mó una asada de cada colonia a probar y se colocó en un porta-

objetos., adicionandose ahí una gota de peróxido de hidrógeno - ¡ .diluido. I

La presencia de‘efervescencia indicaba prueba positiva.

CRECIMIENTO EN AGAR DE CETRIMIDA:

I Cajas de Petri con un medio comercial de Cetrimida (DIFCO)

se semabraban con una asada de la colonia a probar; se incubaba

por 48hs a 30°C., observandose el comportamiento de las colonias

El género Pseudomonas crece en agar de cetrimida.

O-F GLUCOSA OXIDATIVA FERMENTATIVA:

Se prepará e l siguiente medio:

Peptona 2g

NaCl 5g 5

K2HP04 0.3g.

Agar 2-3g.

Azul de Bromotimol 0.03 a 0.08g - Glucosa log.

Agua destilada C.B.P. llt.

Tffbos conteniendo 5 m l . de este medio, previamente esteriliza

dos-se sembraban por picadura con las cepas a probar. De cada co

lonia a probar se sembraban 2 tubos, uno de los cuales se incuba -

r I

29

~. .. ba en' condiciones aerobias, y el otro en condiciones anaerobias,

r -

- .a 35'C. por 48 hs, corriendose además un tubo"b1anco por cada - - ! ! prueba. Después de 48 hs. de incubación se observaba la colora - .- h -< ción del tubo. : (

r_ ~

1 .- I Una coloración amarilla en la parte 3uperior del tubo culti - ii

i!

.-- I vado en condiciones aerobias, simultanea a una coloración verde .-

.- en el tubo cultivado en condiciones anaerobias, inociilados por - I l I una misma colonia, indicaba metabolismo oxidativo.

P-

- Una coloración amarilla en ambos tubos, inoculados por una .- misma colonia indicaba metabolismo fermentativo. -

En ambos casos el tubo blanco permanecia verde.

REDUCCION DE NITRATOS A NITRITOS:

El cultivo a probar se incubaba hasta tener un buen creci-

miento, en caldo nutritfeo con 0.1% de KN03, O en caldo de prue-

ba para reducción de nitratos (DIFCO), en tubes de ensaye, con 5

ml. de medio en cada uno. Cuando -se tenía un buen crecimiento de

la cepa se agragaban 0.5ml. de ácido sulfanílico al 1 % en ácido

acético SN, seguido por 0.5ml de d i m e t i l - a l f a - n a t a l e n a m i n a al - -

0 . 6 % en ácido acético 5N. - I

El desarrollo de un color r o j o obsucro indicaba un resulta- I I

do positivo.

NOTA: Esta prueba se realizó porque Pseudomonas denitrificans da

resultado positivo

I

30

.. . OX IDAQA: .. A 5ml. de bacterias cultivadas en caldo de triptona se le 5

gregaban 0.2-0.3 ml. de Reactivo preparado con 5g de P-dimetila-

minobenzaldehido y 75 nl. de aicohol aníiico, más 25 ml. de áci-

do clorhídrico.

._- ~ «.

..I

."I

L.

I

i r-

Un color r o j o oscuro en la cara jnperficial del tubo indica- ._ I- ba una prueba positiva. (3, 1 1 )

~

L-

r-

- .- - c

L-

7

L

31 _.

AISLAMIENTO DE LAS CEPAS.

Se siguieron l o s siguientes métodos de aislamiento:

Inicialmente se preparó un medio de cultivo con la siguien-

te formulación:

Glucosa 1 og.

Extracto de Levadura 1 5 g .

FeC13 0.03% Zm1/100ml.de medio

Agua destilada C.B.P. 1 It.

Este medio fue ditribuido en matracez Erlenmeyer de 2 5 0 ml.

conteniendo 7 5 ml. de medio por riatraz, y se esterilizó a 121'C.

por 1 5 minutos. A l enfriar cada matraz fue incubado con 7 % del

Volumen del medio con tierra de distinta procedencia, e icubado

por 2 4 hs. a 37'C. con una agitación rotatoria de 150rpm.

De estos matraces se tomaba una asada y se transferia a o -

tro matraz, que contenía el mismo medio previamente esterilizado

incubandose en las mismas condiciones, y repitiendose nuevamente

la transferencia.

- Del Gltimo matraz se tomaba una asada en condiciones estéri -

les, y se sembrababan cajas de Petri con agar nutrit+vo, para ais

lar distintas colonias. A las colonias aisfadas se ?es hizo una

tinción de Gram y se observaron al microscopio, encontrandose una

gran cantidad de levaduras presentes, por l o que se modifico el

i

1 i ' 1

i i

a 32

medio de cultivo utilizado para el aislamiento.

El nuevo medio seleccionado fue un medio más selectivo, que

en este caso fue el medio para la prueba de reducción de nitraw-

tos de DIFCO.

Los matraces de 250 ml. se prepararon con 75 ml. de medio y

se esterilizaron de igual manera que en el procedimiento anterior

Se inocularon con 5% de tierra, se incubaron, realizandose nueva

mente dos transferencia por cada matraz original. En este caso se

incubaron a 37'C. pero sin agitacibn. -

Del último matraz de cada transferencia se tomaron 2 asadas

y se sembraron en Cajas de Petri con agar nutritivo, aislandose

así una gran variedad de colonias.

A todas l a s colonias aisladas se les hi20 tinción de Gram,-

y las colonias que resultaron ser bacilos Gram ( - ) , se Teaisla--

ron en tubos que contenian agar nutitivo (inclinados); y se l ~ s

realizaron las sigueintes-pruebas bioquímicas:

1.- Crecimiento en agar de cetrimida

2.- Catalasa

3.- Oxidasa

4 . - O - F Metabolismo en glucosa

5.- Reducción de Nitratos. '

Posteriormente se seleccionaron todas las cepas probables de

Pseudomonas, y se l e s cuantificó la producción de vitamina B12, __ - I_

33

. .

en un medio no optimizado (similar a l que u t i l i z ó Daniels en 1970)

para encontsar a aquel las cepas que fueran productoras de l a v i t a -

mina deseada.

1 I

34

PRODUCCION DE VITAMINA B12

Las cepas del género Pseudomonas aisladas fueron inoculadas h -

en el siguiente medio de producción (similar ai utilizado por Da

niels en 1970, pero sin betaina):

Sacar osa 3og

("41 2BPO4 4g

MgS04.7H20 1g

PlnS04. 7H20 0.2g

ZnS04.7H20 ~ 0.ozg

KC1 0.9g

FeS04.7H20 O. 03g

. Na2Mo04. 2H20 O. 005g

Acido glutámico 5l!

Co (NO3) 2. 6H20 0.4g

Fosfatidilcolina log

Agua destilada CBP llt.

-

E l medio ;e distribuyó en matraces Erlenmeyer de 500m1, - -

conteniendo 150 nl. de medio cada matraz, y se esterilizó a 121"

C . durante 1 5 minutos; ya frios los matraces fueron inoculados

con las Gistintas cepas y se incubaron durante 72 h s , a 3OoC, - -

con una agitación rotatoria de 150 r.p.m. -

Posteriormente, la cianocobalamina producida se extrajo de

las celulas microbianas con KCN al 5 % (2ml. por cada muestra con

teniendo aproximadamente 250 microgramos de cianocobalamina), so

c .. 35

-_ metiendo 1.0s matraces~ con l.as celulas nicrobianas y el medio a - calentamiento, como se indicó anteriormente.

-. I i

i I I

i I Una vez realizada la extracción de la cianocobalamina, l o s I<," cultivos fueron centrifugados a 2000 r.p.m. por 20 minutos para

clarificarlos, y cuantifiac:ar la cantidad de vitamina B12 produ-

cida por cada cepa por el siétodo anteriormente indicado.

- ! c

!

I -

i

C I

I

36

RESÚLTADOS

El procedimiento de aislamiento indicado se sigui0 con

35 muestras de tierra porcedente de distintos lugares. De estas

35 muestras se aislaron gran variedad de colonias, descartandose

inmediatamente aquellas que no eran bacilo eram ( - ) , quedando a-

si 17 colonias, que además de ser bacilos Gram (-), cumplían con

las caracteristicas bioquímicas del género Pseudomonas. Estas 1 7

colonias con sus características bioquímicas se enlistan a conti

nuación:

CEPA

Ps 1

Ps 2

Ps3

Ps4

Ps5

Ps6

Ps 7

Ps8

Ps9

PSlO

Psl1

Ps12

-

CATALASA

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

OX I DASA

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ +

REDUCC ION

DE NITRATOS A NITRITOS

- +

O-F

METABO - L I SMO

O

O

o

O

o

O

O

e

O

o

O

O

l I

I

I I

I

Ps13

Ps14

Psl5

Ps16

Ps17

37

. CEPA . , CATALASA OX1 DAS.4.~ REDUCCION O-F

D E NITRATOS . METADO,-

A NITRITOS LISMO.

+ O

O

O

+ ,O

O

+ - + - +

+ - +

A l inocular las cepas en el medio de producción y posterior-

mente. al extraer y cuantificar la producción de vitamina-B12 se

encontró que las únicas cepas productoras de vitamina B12 fueron

las siguientes:

Ps 9

PslO

Ps13

Ps15.

Por otra parte, en base a la curva tipoprese ida al fina

de este capítulo podenos observar que las cepas Ps9, PslO y Ps 13

presentaron en realidad una producción inciznificante de la vita-

mina mencionada.

La cepa Psi5 produjo una mayor cantidad de Vitamina B12, aun -

que en realidad tampoco producjo una cantidad importante.

La producción que se obtuvo por las cepas mencionadas, ya -

considerando el factor de dilución fue la siguiente:

38

CEPAS:

Ps 9 1300pg/ml. de medio de cultivo

, PclO . 1100pg/ml. de medio de cultivo

Ps13 1700pg/mi. de medio de cultivo

Ps15 20400pg/ml. de medio de cultivo ,

La producción obtenida en la cepa PslS equivale a u r a pro-

ducción de 0.0240 mg/& de medio de cultivo.

!

.

T U N

80

70

60

50

40

301

20

10

CURVA TIPO.

I TANC IA

L 200 >

Concentración de cianocobalamina

(PP /mi. I

4 0

DISCUSION Y CONCLUSIONES

En base a los resultados obtenidos, podemos observar que - las cepas encontradas producen una cantidad poco considerable

de vitamina B12.

Esto se puede deber pricipalmente, a que el medio de produc

ción utiliiado no está optimizado para la producción de la vita-

mina mencionada.

Como menciona Daniels (1970), la betaina es un compuesto e-

sencial pra una buena producción de vitamina B12 por Pseudomonas

denitrificans, y debido a la situcación económica que atravies

actualmente el país, fue imposible utilizarla en el medio de pro - duccibn, por lo que la producción obtenida no fue buena.

Se pretendía suplir a la betaina con fosfatidiicolina, sin

embargo, esto no di6 un resultado adecuado, y es muy probable, =

que estas mismas cepas, en un medio de producción con betaina, - serian mejores productoras de l o que resultaran ser en el presen

te trabajo.

En base a la investigación realizada, considero que sería - nás adecuado buscar la foram de obtener mutantes hiperproducto--

ras de vitamina B12, de una cepa que se concozca actualemnte s u

producción, ya que la probabilidad de aislay del suelo una muta-

te hiperproductora es muy poca. Probablemente se podria mutar a

alguna de las cepas encontradas en el presente trabajo, para obte -

4 1

4 2

" - ra e

SUGERENCIAS

Sería importante para estudios posteriores, tratar de encon

un medio de producción mag adecuado que el que se utilizó pa -

presente trabajo, y optimizar posteriormente el medio encon - trado, o como alternativa, por medio de agentes mutagénicos tra-

tar de encontrar una mutante hiperproductora, estable, para fa -

producción de vitamina B12.

43

RESUMEN.

La vitamina B12 se encuentra en casi todos los tejidos ani-

males, siendo l o s pricipales productores de ella los microorganis -

mos; algunso animales adquieren esta vitanina absorbiendolo a me-

dida que se produce en su propia flora intestinal; el hombre no -

puede hacerlo, por l o que necesita ingerir en s u dieta diaria to-

da la vitamina B12 que necesita.

Es posible obtener la vitamina B12 por procesos extractivos

a partir del hígado y del ri5osn de res, sin embargo estos metodos

resultan sumamente caros, por lo que seria aconsejable obtenerla

por medio de un proceso fernentativo.

La vitamina B12 es un compuesto orgánico complejo, que cons-

ta de 2 componentes caracteristicos, el más grande se asemeja a -

un sistema de anillos porfirinicos, teneiendo l o s 4 atomos de ni-

trogeno internos un sistema unido a un átomo de cobalto. El se-

gundo componente es un ribonucleótido, unido al nucleo de anillos

por un enlace coordinado. Esta vitamina forma cristales rojos que

funden a 300C, solubles en agua a 25e hasta una concentración de

1.25%. La falta de este compuesto en el or: nisno humano produce

la enfermedad conocida como anemia perniciosa.

-

-

Para poder desarrollar an proceso fernentativo para producir

industrialmente la vitamina B12, es necesario contar con una bue-

na cepa de la vitanina deseada. Entre-los generos microbianos ne-

jores productores de vitamina B12, se encuentra el género h-e.uA=

44

monas, - qn.e son bacilos rectos o encorvados, Gran (-), eon movi-

lidad por flagelo polar, qeu habitan en sdelso, aguas dulces y - x =

gua marina.Crecen entre 4Oy 43e y a pH entre 6 y 8.5. En cuanto a

sus características bioquímicas, son oxidasa positiva, catalasa - positiva, metabolismo oxidativo, reducción de nitratos a nitritos

variable; y crecimiento en agar de cetrimida.

En el presente trabajo se aisalaron 17 cepas del genero Pseu

domonas, de 35 muestras de s u e l o procedentes de distintos lugares.

Estas cepas fueron aisladas al hacer crecer inoculos de tierra en

medio comercial para la prueba de Reducción de Nitratos a nitri-

tos; después se sembraba una asada del cultivo en agar nutritivo,

se hacian tinciones Ue las distintas colonias, y aquellas que re-

sultaban-ser bacilos Gram ( - ) > eran resembrados por piquete en tE

bos inclinados con agar nutritivo, y se les hacian las pruebas - -

bioquímicas indicadas.

A las cepas con características de Pseudomonas se les sembró

en tubos de agar nutritivo para su nantenimiento y se les inoculo

en un medio de producción (no optimizado), para cuantificar si e-

ran o no productoras de la vitamina buscada. ,

- Se encontraron 4 cepas productoras de vitanina B12, de las

cuales únicamente 1 puede ser de interes para utilizarla posterior -

mente, ya sea optinizando un medio de cultivo adecuado para mejo-

rar la productividad de la cepa, o sometiendofa anutaciones para

encontrar una mutante hiperproductora.

45

BIBLIOGRÁFIA.

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- chii. U. S. Patent 2 , 816,856 - - ;

"AJSLAIIIELVTO DE CEPA U DEL GENE30 PSEUDOBONAS PARA LA PRODUCCICiN DE VXTABINA 812"

JUSTIFICACIGN Y NATURALEZA DEL PROYZCTO: El p r o y e c t o a r e a l i a a r e s un p r o y e c t o de i n v e s t i g a c i ó n d e

n a t u r a l e a a a p l i c a d a , ya que s e u t i l i a a r d p a r a p o d u r i r v i t a m i n a 812 en Afkxico, s i s e o b t i e n e n l o s r e s u l t a d o s deseados.

n e s d e h ígado o r i ñ d n d e r e s o a p a r t i r de aguas negras , a i i g u a l d e d e p r o c e s o s f e r m e n t a t i v o s . Los p r o c e s o s d e e x t r a c c i ó n r e s u l t a n c a r o s y de b a j o r e n d i m i e n t o comparados con los proce- sos f e r m e n t a t i v o s , por l o que e s d e s e a b l e implementar un pro- c e s o f e r m e n t a t i v o a n i v e l i n d u s t r i a l p a r a l a p roducc ibn de d s t a . P a r a poder l o g r a r l a implementac idn d e l p r o c e s o , e s e s e n c i a l e l e n c o n t r a r una cepa produc tora o sobreproduc tora de V i t . B12, y en e s t u d i o s a n t e r i o r e s s e ha encon t rado que l a cepa Pseudomonas d e n i t r ' i f i c a n s s a t i s f a c e e s a t a s n e c e s i d a d e s , p o r l o que e s nece- s a r i o a i s l a r l a , y medi r l o s r e n d i m i e n t o s de producc idn de v i t a - mina B12 o b t e n i d o s de l a s d i s t i n t a s cepas .

La v i t a m i n a 812 s e puedo o b t e n e r p o r medio d e e x t r a c c i o -

INTRODUCCI OK: La v i t a m i n a BJ.2 e s un compuesta i n d i p e n s a b l e p a r a l a d ie -

t a humana y animal . LL.~ d e f i c i e n c i a de e s t a v i t a m i n a en e l horn4 b r e produce anamia p e r n i c i o s a , cambios n e u r o l d g i c o s y m e n t a l e s , d i s f u n s t o n e s e n d o c r i n a s , l e u c o p e n i a , d i s t u r b i o s en e l metabo- l i s m o d e l a s g r a s a s , y o t r o s d i s t u r b b a s .

p e r o oscurecen e n t r e 210 y 22O'C. Son s o l u b l e s en agua h a c t a u- na c o n c e n t r a c i ó n de 1.25.: a 25'C. Son s o l u b l e s en a l c o h o l e s [/

f e n o l e s pero son i n s o l u b l e s en ace tona , c loro formo y e t e r . La e s t a b i l i d a d d e la v i t a m i n a B l 2 a temperatura ambiente

e s r e l a t i v a m e n t e grande ya que en p e r i o d o s de 2 años no je a- p r e c i a p é r d i d a de a c t i v i d a d muy n o t a b l e . En su f o r m a c i a n o e s a l t a m e n t e r e s i s t e n t e s a ira t emperatura . 3z s o l u c i ó n acuosa SU p ü dpt imo para c o n s e g u i r su e s t a b i l i d a d e s e n t r e 4 . 5 u 5.

E s t a v i tamina f o r m a c r i s t a l e s r o j o s que f u n d e n a 300'(7,

L a s p u e n t e s de o b t e n c i d n de e s t a v i t a m i n a son v a r i a s , pe-

r o su o r i g e n e s e x c l u s i v a m e n t e microbiano. Los an imales l a ob- t i e n e n a p a r t i r de su f l b r a i n t e s t i n a l , o l a i n b i e r e n ( e s t a con- t e n i d a e>i: l a c a r n e ) . E1 hombre depende de su i n g e s t i ó n d i a r i a en sus a l i m e n t o s , p a r a s a t i s f a c e r los r e q u e r i m e n t o s de é s t a .

L a s b a c t e r i a ; e l e g i d a s p a r a l a o b t e n c i b n de l a v i tamina F son Pseudomonas d e n i t r i f i cans ,que son b a s t o n e s r e c t o s o encor- vados, t i e n e n m o v i l i d a d .;or f l a g e l o p o l a r , son Gram ( - I , miden d e 0.5 a 1 micra , son quirn iorganotó tro fos . aerob ios . pueden des- n i t r i f i c a , r usando n i t r i t o s : como a c e p t o r e s de e l e c t r o n e s f i n a l e s . Por l o genera l h a b i t a n sue los y aguas f r e s c a s y marinas.

que h a c e r en un medio a e r a b i o y con ' a g i t a c i ó n , en un medio com- p u e s t o , a .una temperatura aproximada de 28.C y pE 7.

En e l p r e s e n t e t r a b a j o s e tratar8 de a i s l a r a 2. d e n i t r i f i - - cans d e l s u e l o , con med ios de c u l t i v o s e l e c t i v o s p a r a és ta cepa.

P a r a p r o d u c i r v i t a m i n a B 1 2 con P. d e n i t r i f i c a n s se t i e n e

JNTECFDENTES:

d e l h í g a d o de res sobre l a anemia p e r n i c i o s a e n c o t r a r o q que e x i g t í a un f a c t o r e s p e c í f i c o re sponsab le de l a cura. En 1948 R i c k e r s y co laboradoras , y Smith i n d e p e n d i e n t e m e n t e , a i s l a r o n ese f a c t o r en forma de c r i s t a l e s . En e s e mismo azo C a s t l e s u g i r i ó que p a r a que s e e f e c t u a r a l a a b s o r c i ó n de l a v i t a m i n a R 1 2 en e l organis - mo s e r e q u e r i a un f a c t o r e s tomaca l , que e s una mucoprote ína de b a j o p e s o m o l e c u l a r , normalmente p r e s e n t e en e l j u g o g d s t r i c o , a l a que s e l lamó f a c t o r i n t r í n s e c o de C a s t l e .

v i t a m i n a B 12 p o r medio de c r f s t a l o g r a f f a de Rayos 1.

d e l o s primeros t r a b a j o s de Woodward y Eschenmoser, h a s t a l a cu l - m inac ión con los t r a b a j o s de K r i e g e r y Naugh en 1973, con un pro- c e s o d e 70 p a s o s r e q u e r i d o s , p o r l o que e s muy c o s t o s o .

L o s pr imeros p r o c e s o s i n d u s t r i a l e s de producc ión d e v i t a m i n a ü12 f u e r o n r e a l i z a d o s con B a c i l l u s meaa ther ius , con S t r e a t o m u c e s p l i v a c e n s , y p o r un proceso de e x t r a c c i ó n de a j u a s negras . En e s t e proceso s e o b t u b i e r o n c o n c e n t r a c i o n e s f i n a l e s de v i t a m i n a E 12 d s m t r e 4 y 20 m i l i g r a n o s / l b . de p e s o s e c o d e l p roduc to

En 1925 Wtpple y Robbtns a l e s t u d i a r e l e f e c t o t e r a p e d t i c o

En 1955Dohgkin y co laboeadores r e v e l a r o n l a e s t r u c t u r a de l a

La s í n t e s i s qu fmica de e s t a v i t a m i n a tomó 10 años, a p a r t i r

I

c . .. 2

f e rmen tado . P o s t e r i o r m e n t e s e d e s c u b r i o que Pseudomonag dent t r p f i c a n s y c i e r t a s e s p e c f e s de Prowton ibac te r ium t e n f a n una mayor capacidad de producc idn de' v i t a m i n a 812. Los r e n d i m i e n t o s s e au- mentaron aún mds después de u s a r mdtodos de s e l e c c i ó n y mutación de e s t s o microorganismos , l ograndose c o n c e n t r a c i o n e s de c i a n o c g balaminas de 20 a 4 0 Y g / l t . de medio de c u l t i v o .

e s t a s cepas , por l o que l a m e t o d o l o g f a p a r a a i s l a r l o no es ta re- por tada .

N o e x i s t e n a n t e c e d e n t e s e s p e c f f i c o s p a r a l a s e l e c c i ó n de

OBJ6TIVO: El o b j e t i v o d e e s t e p r o y e c t o es a i s l a r una cepa de && domonas d e n i t r i f i c ans,que sea buena produc tora de v i t a m i n a 812 a p a r t i r de l s u e l o .

P o s t e r i o r m e n t e , con l a cepa a i s l a d a s e r á p o s i b l e hacer un p r o c e s o j ' e r m e n t a t i v o , p a r a p r o d u c i r e s t a v i tamina a n i v e l inJus- t r i a l en México.

PROGRAMA I YETODOLOGIA BEL TRABJO:. En e l t r a b j d s e t r a t a r a d e a t s f a r l a cepa a n t e s mencionada

a p a r t i r de d i s t i n t o s sue lo , con med ios de c u l t i v o c o m e r c i a l e s , s e l e c t i v o s p a r a Pseudamonss. p o s t e r i o r m e n t e se de terminara l a c g pacidad de producc idn de e s t a i i tasn ina por l a s c e p a s o b t e n i d a s .

P a r a l a e t a p a de a i s l a m i e n t o s e incubara en c o n d i c i o n e s ae-

r o b i a s y con a g i t a c i ó n a l o s matraces , a una temperatura de aproximadagente 30'C, p o s t e i r o r m e n t e s e hardn~:#ha!iones d e l medio de c u l t i v o p a r a a i s l a r a l a s cepas. sembrandolas en med ios e s p e c L J i c o s , y observando l a s e a r a c t e r f s t i c a s de l a s c o l o n i a s f o r m a d a s h a s t a e n c o n t r a r l u cepa deseada. Una ve2 s n c o n t t a d z l a cepa de- seada se de te rminara 1u producc ión de v i tamina B12 por un md- tod 1 f o t o c o l o r f m e t r i c o , con incubac idn d e L a c t o b a c i l l u s Jeichma-

n2t. No s e puede e s t a b l e c e r un programa e x a c t o d e l p r o y e c t o , y a

que dependerd d e l t t e g p o r e q u e r i d o para e n c o n t r a r sl m i c r o o r g a n i s a o d e s e a d o . s i n embargo, como base r lc l p lan d e t r a b a j o s e ocupa- rdn l a s p r i m e r a s t r e s semanas d e l p r o y e c t o en e s t u d i a r l a b i b l i o - gra jYa encon trazia, p o s ter2 ormen t e durdn te o t r a s t r e s semanas s e e s t u d i a r a n y uno s e f a r i l i a r i z a r d con l o s m6todos de t r a b a j o

se detci-minarán l a s c u r v a s patrdn p a n : prodccc idn de vitomina 812, con e l método mencionado por i n o c u l a c i ó n d e L a c t o b a c i l l u s 1eichmaniL. Se esttma q u e e 1 a i s l a m i e n t o d e l a c e p a t a r d a r á apro- ximadamente tres meses, y d$spués de e s t o se detdrminard l a c a p a c L dad de producc ión d e cada una d e l a s c e p a s encontraslas .

31 medio de c u l t i v o i n i c i a l parc e l a i s l a m i e n t o se h a r d con lOgde g l u c o s a por l i t r o , 5 g. d e e x t r a c t o d e l evadura por l i t r o y 2 0 m l . de Cloruro pkrrico 0.038, a jus tando e l piir a 7. L a s pruebas d e i d e n t t j P i c a c t ó n p a r a e l & a r o serdn c a t a l a s e , o x i d a s a y se someteran l a s c e p a s seleccionad::^ a un medio e n a n a e r o b i o s i s con n i t r a t o s conto a c e p t o r e s d e e l e c t r o n e s .

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