RESOLUCIÓN OIV/OENO 390/2010 DIRECTRICES SOBRE … · Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de...

Certificado conforme

Tiblisi, 25 de junio de 2010

El Director General de la OIV

Secretario de la Asamblea general

Federico CASTELLUCCI

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RESOLUCIÓN OIV/OENO 390/2010

DIRECTRICES SOBRE LOS ANALIZADORES POR INFRARROJOS EN ENOLOGÍA

LA ASAMBLEA GENERAL

Visto el artículo 2 apartado2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 relativo a la

creación de la Organización Internacional de la Viña y el Vino,

A propuesta de la Subcomisión de Métodos de Análisis,

CONSIDERANDO la resolución Oeno 10/2005 «Guía práctica para la validación, el

control de calidad y la estimación de la incertidumbre de un método de análisis

enológico alternativo» que permite a los laboratorios llevar a cabo el trabajo de

conexión del método interno automatizado respecto al método de referencia OIV.

CONSIDERANDO que esta guía también incluye procedimientos de control de la

calidad de los resultados obtenidos por estos métodos automatizados, que permiten

garantizar la utilización segura.

CONSIDERANDO que sólo los métodos publicados en la Recopilación de los métodos

internacionales de análisis de vinos y mostos de la OIV o en la recopilación de los

métodos internacionales de análisis de bebidas espirituosas de origen vitivinícola de la

OIV tienen un carácter oficial de referencia y son aplicables para el control y

reglamento de discrepancias.

DECIDE adoptar y publicar independientemente las directrices sobre los analizadores

por infrarrojos en enología adjuntas.






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DIRECTRICES SOBRE LOS ANALIZADORES POR INFRARROJOS

EN ENOLOGÍA

Advertencia: Esta guía no constituye un documento de referencia sino sólo de

información. Los métodos que figuran en las líneas directrices no pueden ser

considerados como métodos de referencia de la misma manera que los que figuran en

la Recopilación de los métodos internacionales de análisis de vinos y mostos de la OIV

o en la recopilación de los métodos internacionales de análisis de bebidas espirituosas

de origen vitivinícola de la OIV. Sólo los métodos publicados en la Recopilación de los

métodos internacionales de análisis de vinos y mostos de la OIV o en la recopilación

de los métodos internacionales de análisis de bebidas espirituosas de origen

vitivinícola de la OIV tienen carácter oficial y son aplicables para el control y

reglamento de discrepancias.

Estos analizadores emplean las absorciones características de los compuestos

orgánicos de los vinos y de los mostos en el espectro infrarrojo para su cuantificación.

Existen dos grandes familias utilizadas en enología:

Los analizadores de infrarrojo cercano (NIR) ;

Los analizadores de infrarrojos por transformada de Fourrier (IRTF).

1. Los analizadores de infrarrojo cercano

1.1 Principio

Los compuestos cuya determinación desea conocerse se someten a una radiación de infrarrojo cercano en la que presentan bandas de absorción características. Los datos espectrales de la muestra analizada se comparan con los obtenidos en el caso de vinos patrón de referencia, empleados para el calibrado inicial del equipo, y la concentración del compuesto buscado se

calcula a partir de una regresión lineal múltiple. El equipo, informatizado, puede acoplarse a un extractor de muestras. El nivel de absorción debe ser elevado para que los resultados sean

válidos y el método sólo es aplicable a los macro-compuestos del vino o del mosto, esto es, básicamente el etanol y los azúcares. Las principales virtudes de este método son su simplicidad de aplicación, su alta cadencia analítica y el hecho de que no precisa preparación de la muestra más allá de una descarbonatación de los mostos en fermentación.

1.2 Material

Los equipos utilizados en enología trabajan por reflexión. El fondo de la célula de circulación que

contiene el vino o el mosto que se desea analizar dispone de un reflector que refleja el rayo infrarrojo incidente, que atraviesa así por segunda vez la muestra antes de ser analizado por el detector. Los equipos constan de los elementos siguientes.

Un sistema de bombeo de la muestra

En general se trata de una bomba peristáltica que permite llenar la célula de medición. El

sistema de bombeo suele completarse con un baño termostático que permiten ajustar la

temperatura de la muestra al valor deseado para la medición.






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Una fuente luminosa

Se trata de una lámpara de tungsteno que produce una luz policromática con un espectro de

320 a 2.500 nm. La alimentación debe estar perfectamente estabilizada para obtener una intensidad constante.

Un selector de longitud de onda

Los equipos utilizados en enología utilizan filtros interferenciales de longitudes de onda conocidas o monocromadores de red para poder seleccionar longitudes de onda características de los compuestos buscados.

Una célula de medición

La parte que atraviesan los rayos incidentes y reflejados es de cuarzo. El fondo de la célula puede ser de cerámica recubierta con una capa de oro que permite la reflexión. Esta célula se mantiene a una temperatura de medición constante, en general mediante un sistema de efecto Peltier.

Detectores

Dos células fotoeléctricas de sulfuro de plomo recogen la radiación reflejada.

Programa informático

Realiza el tratamiento matemático y estadístico que permite realizar las comparaciones con el

calibrado del equipo y la determinación de la concentración buscada.

1.3 Método de trabajo

La utilización de un analizador de infrarrojo cercano consta de varias etapas.

El calibrado inicial

Esta etapa permite realizar un calibrado permanente del equipo, que servirá de referencia.

Consiste en utilizar el máximo número posible (como mínimo 50) de vinos o mostos de concentraciones conocidas del analito buscado. Los valores de estas concentraciones deben distribuirse uniformemente en toda el rango de medición deseada. Las matrices deberán ser lo más próximas posible a las de los vinos o los mostos que se analizarán a continuación. Para cada muestra de calibrado, se efectúa una medición para un máximo de longitudes de onda que cubren el espectro infrarrojo cercano. Se efectúa una regresión multilineal a partir de los

resultados registrados, que permiten establecer la relación siguiente:

C = K0 + K1R1 + K2R2 + K3R3 + … + KiRi Donde:

C es el valor de concentración buscado K0 es una constante característica del equipo para un compuesto buscado, independiente de la longitud de onda.

Ki es una constante para un equipo, un compuesto buscado y una longitud de onda determinada.

Ri es la expresión de la medición espectral para la longitud de onda Li

Para cada analito buscado se seleccionan de 2 a 10 longitudes de onda características.

La calidad del calibrado se pone a prueba mediante la presentación de una nueva serie de muestras de vinos o mostos de referencia con concentraciones conocidas.

Calibrados periódicos

Resultan necesarios cuando los controles rutinarios revelan una desviación de los resultados ligada al equipo (envejecimiento de los componentes electrónicos, reparación, cambio de piezas,






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etc.). Este procedimiento no cuestiona la selección de las longitudes de onda, sino que permite realizar un nuevo cálculo de las constantes K0 y Ki.

Correcciones rutinarias del sesgo

Antes de cada utilización del material, se analiza(n) una(varias) muestra(s) de control de

concentración conocida de analito buscado. Si aparece un sesgo respecto al valor esperado, puede efectuarse una corrección.

2. Los analizadores de infrarrojos por Transformada de Fourrier (IRTF)

2.1 Material y principio del método

El material empleado es un interferómetro que utiliza la espectrofotometría de infrarrojos por Transformada de Fourrier, que permite escanear la totalidad del espectro infrarrojo en una

banda espectral de 2.000 a 10.000 nm, que cubre una parte del infrarrojo cercano y medio. Tras el calibrado del equipo para diferentes compuestos orgánicos, el análisis de un espectro permite dosificar simultáneamente estos últimos en el vino o el mosto analizado.

2.2 Interferometría y Transformada de Fourrier

La interferometría es un método alternativo a las técnicas clásicas de adquisición de un espectro en una escala de longitud de onda determinada. Estas técnicas son farragosas y requieren

mucho tiempo si se desea obtener una resolución fina. La interferometría permite tratar todas las longitudes de onda emitidas por una única fuente de infrarrojos al mismo tiempo, sin selección previa, lo que permite obtener un espectro completo en menos de un segundo.

La primera etapa consiste en realizar un interferograma en la muestra que se desea analizar. El interferómetro se basa en la separación en una lámina de una luz infrarroja policromática (procedente en este caso de un filamento incandescente). Antes de llegar al detector, las dos partes de la señal siguen un camino diferente: una primera parte atraviesa directamente la

muestra y una segunda parte se refleja en un espejo móvil antes de regresar hacia la muestra.

Para cada longitud de onda elemental de esta emisión infrarroja, al llegar al detector se obtendrá una diferencia de fase p. Gracias al espejo móvil, esta diferencia de fase p varía continuamente durante la medición.

Así, la señal final obtenida es una interferencia de dos señales luminosas de misma longitud de onda y de diferencia de fase p.

En función de la diferencia de fase, la recombinación será constructiva o destructiva, esto es, en función de p, la intensidad de la señal de interferencia será variable. La variación de la intensidad en función del desfase se llama un "interferograma". Su modelo matemático es una integral.

La Transformada de Fourrier es un procedimiento matemático que permite hallar a partir del interferograma la intensidad de la señal en función de la longitud de onda y reconstituir el espectro infrarrojo. Este farragoso cálculo sólo puede realizarse utilizando un sistema

informático potente. Este cálculo importante, no puede ser realizado sino por la utilización de una informática potente.






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Figura 1: Esquema simplificado de un interferómetro de Michelson

Una vez obtenido de este modo el espectro calculado, encontramos las aplicaciones clásicas de la espectrofotometría, que permite utilizar las longitudes de onda específicas de absorción de los diferentes compuestos orgánicos cuya concentración estamos buscando.

2.3 Ejecución de la obtención del espectro infrarrojo

La muestra que se desea analizar no precisa ninguna preparación particular. Sin embargo, en el caso de los mostos o vinos en rama, se realiza una clarificación por centrifugación o por

filtración para evitar colmataciones. Para contenidos de gas carbónico superiores a 750 mg/l, es preciso llevar a cabo una eliminación parcial previa para evitar problemas de desgasificación en el circuito de análisis.

El circuito comienza con una aguja de toma que puede maniobrarse manualmente o bien controlarse mediante un muestreador. Una bomba peristáltica permite bombear la muestra hasta una cámara de calentamiento, donde se lleva a una temperatura de 40 °C. Tras pasar por

un filtro, atraviesa la cubeta de medición. Esta última constituye una pieza esencial del equipo. Está hecha de fluorosilicatos ya que el vidrio o el cuarzo presentan una absorción importante en el infrarrojo medio. A continuación, la muestra se desecha por el desagüe.

Espejo

Señal 100%

Señal 50%

Señal de

interferencia

Espejo

Fuente IR Lámina separadora

Espejo

Interferómetro de

Michelson

Cubeta

Detector IR






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Figura 2: Esquema simplificado del circuito analítico

El ciclo completo para una muestra dura 30 segundos. La versión automatizada permite una cadencia efectiva del orden de 120 muestras por hora.

2.4 La quimiometría

En general, el espectro medio infrarrojo de un vino o un mosto contiene datos que presentan un interés analítico cuya extracción no es inmediata. En la mayoría de casos, ésta requiere un tratamiento matemático que puede ser muy complejo. El conjunto de los medios que pueden emplearse para obtener estos datos analíticos forma parte de una ciencia reciente: la quimiometría. Ésta fue definida en 1996 por GELADI como «la ciencia del uso de los métodos matemáticos, estadísticos e informáticos que tiene como objetivo extraer la información útil

presente en datos de mediciones químicas». La quimiometría incluye así los métodos estadísticos adaptados al tratamiento de los datos espectrales.

Los analistas pueden perseguir dos objetivos principales:

La descripción global del producto analizado (método exploratorio). Se trata de clasificar los espectros por familias previamente definidas. Una aplicación en enología puede ser definir la matriz de un producto objeto de la medición. Este tipo de herramienta puede permitir

determinar si el producto es un mosto, un mosto en fermentación, un vino seco, un vino licoroso o un vino dulce natural. Un enfoque predictivo permite, a partir de datos de referencia previamente obtenidos (calibrado), hallar valores analíticos de compuestos o índices relativos a la composición de un vino o un mosto desconocido. Actualmente, los laboratorios utilizan sobre todo este segundo procedimiento en la medición, donde es posible sustituir las herramientas analíticas clásicas por la IRTF.

Los métodos quimiométricos aplicables para llegar a los resultados antes descritos son extremadamente numerosos y su aplicación sólo está al alcance de los especialistas. Pueden clasificarse en dos grandes grupos según se basen en un modelo lineal o no lineal. Van de las herramientas estadísticas simples, como el análisis de componentes principales (ACP), a herramientas de gran complejidad matemática y de utilización, como las redes neuronales.

Mientras que todos los fabricantes ofrecen herramientas de medición óptica con prestaciones

satisfactorias, los medios de normalización de las mediciones, las herramientas de tratamiento de los datos del espectro y la calidad de las herramientas de quimiometría que se ofrecen a los

usuarios son mucho más variables. Las dificultades halladas por los laboratorios están a menudo relacionadas con este punto. Asimismo, una parte de las polémicas surgidas en torno al método tiene su origen en este hecho. La calidad del tratamiento quimiométrico utilizado para la lectura de los datos espectrales de un vino o un mosto reviste una importancia crucial para la obtención

de resultados analíticos fiables y precisos.

Aguja de toma

Bomba peristáltica

Unidad de

calentamiento

Filtro Cubeta

Desagüe






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2.5 Análisis del espectro de infrarrojo medio

Es interesante conocer la enorme complejidad de los datos que contiene el espectro de infrarrojo medio de un vino o un mosto. Ésta se debe a varios elementos:

1/ La composición orgánica y mineral de estos productos es una de las más ricas del ámbito

agroalimentario. 2/ Las zonas de absorción de cada molécula orgánica en el infrarrojo medio son múltiples debido, en particular, a importantes fenómenos de resonancia. 3/ Entre los diferentes compuestos orgánicos existen interacciones que generan importantes efectos matriz imposibles de modelizar. Así, contrariamente a otros análisis espectrofotométricos, casi siempre es imposible aplicar al

análisis IRTF de los mostos y los vinos conocimientos teóricos sobre la absorción de un compuesto determinado. Únicamente cabe recurrir a la práctica experimental. Este punto se convierte en una característica fundamental del método, que se basa así en un enfoque estrictamente matemático, cuyo rendimiento será determinante para la calidad final del resultado. El procedimiento de este enfoque experimental de calibrado consiste en multiplicar la adquisición de espectros por un máximo de variedades de muestras de valores conocidos con

precisión para el compuesto o el índice que se desea analizar, antes de aplicar los métodos

estadísticos matemáticos. Es indispensable comprender que esta etapa es fundamental para obtener una buena herramienta de análisis. El operario debe disponer no sólo de un número lo más elevado posible de muestras representativas, sino que debe aplicar los métodos quimiométricos mejor adaptados y, si es posible, realizar un análisis comparativo crítico de los resultados obtenidos con varias de ellas. Este procedimiento debe completarse siempre con una comparación estadística muy amplia de los resultados ofrecidos por el modelo elegido y por los métodos analíticos de referencia. Pueden precisarse miles de determinaciones para esta última

etapa. El calibrado es, pues, un procedimiento largo y delicado que requiere tiempo y medios importantes. Para comprender mejor la dificultad del enfoque, se deben precisar los puntos críticos siguientes:

Comportamiento del analito

Todos los compuestos orgánicos del vino no tienen el mismo comportamiento analítico, por

varios motivos:

En premier lugar, es evidente que los compuestos con una concentración elevada (por encima de 1 g/L, por ejemplo) tienen muchas probabilidades de ser más fáciles de determinar, ya que generan fenómenos de absorción más consecuentes.

En segundo lugar, las capacidades de absorción características de un compuesto dependen de su constitución molecular. Algunas moléculas, como el dióxido de carbono, por ejemplo, tienen una alta capacidad de absorción en el infrarrojo medio, mientras que otras moléculas, aunque más complejas, tienen absorciones mucho más modestas.

Por último, la influencia de los demás compuestos del vino (efecto matriz) es un dato esencial. Resulta sencillo entender que si las longitudes de onda de absorción características de un compuesto se superponen en el espectro a las del agua o el etanol,

presentes en muy alta proporción, la sensibilidad de medición para este compuesto se verá muy mermada. Asimismo, existen fenómenos de interacción entre los constituyentes que pueden desplazar las bandas de absorción.

Cabe admitir que, de nuevo, los conocimientos teóricos no resultan de excesiva utilidad y que

sólo la práctica experimental puede permitir determinar si un compuesto dado puede analizarse

fácilmente por IRTF o no. A modo de ejemplo, la determinación de los azúcares resulta delicada para valores inferiores a 1 g.l-1, mientras que la del nitrógeno amoniacal (NH3) es accesible a partir de 10 mg.l-1.






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Estos datos sobre el comportamiento de los analitos permiten comprender que es más fácil analizar un compuesto con una alta concentración que presenta en el infrarrojo medio absorciones muy características, fuera de las zonas de absorción del agua y el etanol, y poco

sensibles a los efectos matriz, que un compuesto que presenta las características opuestas. De este modo, el etanol será mucho más fácil de analizar que el etanal. Asimismo, es evidente que,

cuanto más difícil es acceder a un compuesto, más complejo resulta y más deberá cuidarse el trabajo de calibrado. En particular, el muestreo inicial deberá ser suficientemente amplio y perfectamente seleccionado, las herramientas quimiométricas deberán ser más potentes y pertinentes, y el trabajo de comparación con los métodos de referencia deberá realizarse sobre un mayor número de muestras.

Extrapolación

Se trata de un punto esencial. En el trabajo de calibrado no es posible contar con una capacidad de extrapolación del sistema. Así, si el muestreo inicial no cubre la totalidad del ámbito de análisis deseado de forma equitativa, los resultados obtenidos en las zonas menos ricas en datos iniciales mostrarán deficiencias. Asimismo, si existe un efecto matriz significativo, como el que a menudo ofrecen los compuestos fenólicos, se hace indispensable la presencia de vinos de todas las concentraciones en compuestos fenólicos a todos los niveles de la gama. De lo

contrario, la parte de rango no cubierta por todos los valores posibles de compuestos fenólicos

será más sensible a los efectos matriz y no será fiable.

Los efectos matriz

Hemos visto antes que el efecto matriz se debe a los otros compuestos presentes en el medio que se desea analizar y absorbentes en el infrarrojo medio. No obstante, el efecto matriz no es

un problema insoslayable. Todo calibrado puede tener en cuenta numerosos efectos matriz. Para ello, como en los sistemas expertos, conviene ofrecer la información necesaria para que la herramienta pueda, por aprendizaje, medir el impacto del efecto matriz sobre la determinación del compuesto buscado. De este modo será posible eliminar el efecto matriz por referencia al valor de calibrado cuando se detecte en una muestra desconocida. En esta fase, es fácil comprender que cuantas más matrices diferentes presentemos durante un calibrado, más robusto será éste y con más facilidad podrá evitar los efectos matriz. Éste es uno de los puntos

más interesantes del método IRTF. Sin embargo, existe un límite en su utilización: cuanta más capacidad de gestión del efecto matriz se introduce en un calibrado, más sensibilidad y precisión pierde éste. Por tanto, el operario deberá tomar una decisión al desarrollar un calibrado para hallar el equilibrio óptimo entre robustez, sensibilidad y precisión. De nuevo, el procedimiento

puede hacerse muy complejo y no puede ponerse en práctica sin el uso de medios importantes.

En la práctica enológica, no es posible trabajar con calibrados que cubran todas las matrices

susceptibles de ser halladas. El estado de los conocimientos permite, sin embargo, para las determinaciones más corrientes, agrupar los vinos y mostos en cinco matrices fundamentales:

los mostos no fermentados, los mostos en fermentación, los vinos secos o poco azucarados, los vinos licorosos, los vinos dulces naturales.

Por el contrario, cabe señalar que, en general, los calibrados correctamente realizados eliminan los efectos matriz generados por variedades de cepa diferentes, el color del vino o el origen geográfico.

La complejidad de los efectos matriz implica otra consecuencia importante: es imposible utilizar para el calibrado, al igual que para el control, muestras sintéticas o muestras recargadas. Sólo

los vinos naturales son pertinentes.

Valores de referencia

La calidad de un trabajo de calibrado depende también de la calidad de los valores de referencia de las muestras que se emplean. El ejemplo del ácido glucónico resulta revelador. El método






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enzimático de determinación del ácido glucónico clásicamente utilizado , no es fiable. Presenta una falta de robustez no señalada en la bibliografía correspondiente y que probablemente se debe a efectos matriz no identificados. Las primeras calibraciones IRTF se realizaron con

resultados obtenidos mediante este método y, aunque el ácido glucónico presenta características de absorción muy marcadas, los resultados obtenidos por IRTF resultaron

deficientes. Más adelante se realizaron nuevas calibraciones utilizando, para los valores de referencia, técnicas más fiables como la electroforesis capilar, y los resultados obtenidos por IRTF son actualmente de gran calidad.

2.6 Principales etapas del análisis espectral

La figura 3 ilustra un espectro infrarrojo del vino.

Figura 3: Ejemplo del espectro infrarrojo medio de un vino

A partir del banco de datos obtenido con las muestras de referencia de valor conocido para el analito buscado, las herramientas de quimiometría utilizadas permiten seleccionar las zonas espectrales más pertinentes para éste (en general, una decena) y, seguidamente, calcular un modelo de regresión, que se utilizará para realizar la predicción para cualquier muestra desconocida.

2.7 La importancia del control de la calidad de los resultados

Una vez asumidos los puntos anteriores, hay que ser consciente de que la utilización de la IRTF implica, para el laboratorio, la obligación de crear una herramienta de control de la calidad de los resultados, que debe basarse en una estrategia específica, original y adaptada. Una automatización muy potente del sistema unida a una utilización simple del equipo constituye una peligrosa trampa en términos de riesgo de desviación de los resultados o de existencia de resultados aberrantes no identificados. Sólo un sistema muy completo y estricto de

identificación de las matrices, de eliminación de los resultados relativos a muestras no conformes a definiciones precisas, de introducción en las series de muestras de controles

suficientemente numerosos y la perfecta gestión de los datos recabados puede garantizar la calidad de los resultados. Los laboratorios deben saber que el tiempo dedicado al control de la calidad de los resultados supone, con la IRTF, una parte mucho más importante del tiempo total dedicado al análisis en comparación con el que precisan los otros métodos habitualmente

utilizados en los laboratorios de enología.






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Una estrategia de control de la calidad de los resultados puede incluir los siguientes

elementos:

2.7.1.1 Rangos de trabajo

Los rangos de trabajo validados deben establecerse para cada parámetro analítico.

Todos los resultados fuera del rango de trabajo, deben ser confirmados por los

métodos validados que sirven de apoyo al resultado IRTF.

2.7.1.2 Divergencia máxima admitida para las dos repeticiones

Este procedimiento debe introducirse en la aplicación de una nueva herramienta IRTF.

El laboratorio puede a continuación suspender la aplicación si los resultados obtenidos

son satisfactorios. Para cada muestra se efectúan dos lecturas. Las lecturas se aceptan

si su divergencia es inferior a la divergencia modelo máxima establecida para cada

parámetro analítico. La determinación para cada parámetro se repite, si la divergencia

de las lecturas supera la divergencia modelo máxima establecida.

2.7.1.3 Materiales de referencia (MR)

Los materiales de referencia deben presentar matrices conformes a las de los vinos

analizados. Sirven para comprobar la estabilidad del sistema analítico a lo largo del

tiempo. Los valores de referencia del MR se establecen a partir del certificado de

análisis (materiales resultantes de ejercicios interlaboratorios) o a partir de los

resultados obtenidos con los métodos utilizados para la calibración del IRTF. Se

asocian algunas tolerancias a los valores de referencia para establecer “límites de

alerta” y “límites de acción”. La serie de trabajo debe integrar varios MR

representativos de las matrices analizadas y dentro del rango de trabajo. La secuencia

de trabajo se valida si se incluyen todos los resultados del conjunto del MR dentro de

los límites de alerta. Si los resultados del MR se encuentran entre el límite de alerta y

el límite de acción, la secuencia analítica es válida, no obstante, sería necesario

comprobar:

1) si el MR se alteró (por ejemplo por mala conservación)

2) la posible existencia de divergencias sistemáticas que requiere entonces un

ajuste de la calibración. En ese caso, conviene utilizar los resultados más

recientes (si es posible del día) obtenidos por cruce de métodos (2.2.7.4). La

situación debe valorarse en función de toda la información disponible.

Si uno o más resultados de los distintos parámetros analíticos del MR están sobre el

límite de acción, no se valida la secuencia analítica. Conviene:

1) confirmar el resultado (s) anormal (es) por los métodos que sirven de apoyo

al resultado IRTF

2) efectuar una normalización de las condiciones espectrales del aparato IRTF.

3) analizar otro MR disponible para comprobar si las lecturas respetan los

criterios establecidos.

4) confirmar si los antecedentes cruce de métodos (2.2.7.4) demuestran que

un ajuste de la calibración debe practicarse (divergencias sistemáticas) para el

parámetro anormal.

La situación debe valorarse en función de toda la información disponible. En particular,

nunca debe hacerse una corrección del sesgo a partir de la única información

establecida por el MR.

2.7.1.4 Cruce de métodos

Es muy importante hacer sistemáticamente el cruce de los resultados obtenidos por

IRTF y por los métodos de referencia que sirven de apoyo al resultado. Se recomienda






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efectuar el cruce de métodos diariamente para los parámetros más sensibles. Las

diferencias deben ser inferiores o iguales a los límites de acción (2.2.7.3). Si la

diferencia entre los resultados obtenidos para un parámetro analítico, supera el límite,

es necesario considerar los puntos siguientes:

1) encontrar una explicación probable (por ejemplo matriz no - cubierta por la

calibración);

2) efectuar un cruce de métodos con otras muestras de la serie de trabajo;

3) confirmar si los antecedentes del cruce de métodos demuestran que un

ajuste de la calibración debe practicarse (divergencias sistemáticas) para el parámetro

anormal.

Criterios de aceptabilidad de una nueva calibración

Es también muy importante tener criterios definidos para sustituir una calibración

validada y aplicada por una nueva calibración. Una de las estrategias posibles es

considerar los puntos siguientes:

1) la nueva calibración debe incluir un número de observaciones superior al de

la calibración utilizada;

2) el “cross validación error” (CVR) de la nueva calibración debe, idealmente,

ser inferior o igual al de la calibración anterior; un CVR superior puede sin

embargo aceptarse si hay un refuerzo de las zonas de calibración menos

potentes;

3) para un conjunto de al menos 15 vinos representativos dentro del rango de

trabajo, conviene comparar los resultados obtenidos con la nueva calibración y

los obtenidos con la calibración anterior y con los métodos que sirven de apoyo

al resultado IRTF.

4) Se recomienda efectuar la comparación de los resultados obtenidos con la

calibración anterior y los obtenidos con la nueva calibración introduciendo

materiales de referencia externa. Conviene sin embargo garantizar que estos

últimos son vinos o mostos naturales no dopados y no estabilizados con

compuestos que pueden modificar la matriz.






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ANEXO 1

EJEMPLOS DE MÉTODOS DE DETERMINACIÓN HABITUALES EN ENOLOGÍA MEDIANTE ANALIZADORES DE INFRARROJO CERCANO (IRC)

Los métodos aquí descritos sólo lo son a título de ejemplo.

1. Determinación del grado alcohólico de vinos y mostos en fermentación mediante infrarrojo cercano

1.1 Principio

Un rango de longitudes de onda de 1.150 nm a 1.200 nm presenta una absorción específica que

permite determinar el grado alcohólico de las bebidas alcohólicas. En este intervalo, ningún otro

compuesto interfiere en la determinación. Dos puntos en los extremos del rango permiten determinar la línea de calibrado. El cálculo de la concentración de alcohol se realiza utilizando un algoritmo simple. La medición puede efectuarse para una escala la cual tiene de 0 a 20 %vol.

1.2 Reactivos y materiales de referencia

1/ Agua destilada y descarbonatada. 2/ Soluciones hidroalcohólicas cuyo grado alcohólico se determina después de la destilación por la medida de la masa volumétrica.

1.3 Material

Se utiliza un espectrómetro de infrarrojo cercano con una calibración específica para la medición

del grado alcohólico en los vinos y los mostos en fermentación.

1.4 Muestreo

Las muestras deben estabilizarse previamente a una temperatura próxima a los 20°C. El análisis

debe realizarse rápidamente tras la apertura de las muestras. Conviene eliminar el gas carbónico excedente por filtración sobre papel de filtro de gran porosidad o por cualquier otro medio.

1.5 Procedimiento

Antes de realizar las mediciones, el espectrómetro debe ajustarse utilizando agua destilada y una solución hidroalcohólica de grado conocido.

1.6 Cálculos

Los equipos disponen de un programa de cálculo que ofrece directamente el resultado en %vol. con 2 decimales.

1.7 Validación del método

1.7.1 Comparación interlaboratorio entre la determinación del grado alcohólico por infrarrojo cercano y determinación por el método de referencia después de la destilación en los vinos

El objetivo principal de este estudio era comparar los resultados obtenidos por el método de

infrarrojo cercano y el método de referencia OIV por destilación. 14 laboratorios participaron en esta comparación. 10 vinos diferentes procedentes de 5 países europeos han sido sometidos al examen de los laboratorios. Su grado alcohólico cubría una escala de 9 a 14 %vol. Cada






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análisis, por el método de referencia o por infrarrojo cercano, se realizó 3 veces en cada uno de los laboratorios. El cuadro n.° 1 detalla los diferentes vinos, que incluían vinos blancos secos o dulces y vinos tintos secos.

Tabla 1: Lista de las muestras

1.7.2 Resultados de la validación y conclusiones

La búsqueda de los valores erráticos mediante el test de GRUBBS es negativa para los erráticos de tipo 1. Los resultados de la medición del grado alcohólico volumétrico a partir de un amplio muestreo

de vinos revelan que los valores obtenidos por el espectrómetro de infrarrojo cercano son idénticos a los obtenidos por el método de referencia por destilación. Las repetibilidades y reproducibilidades de los dos métodos son comparables. Los valores obtenidos se muestran en

la tabla n° 2. Tabla 2: Resumen de los parámetros de fidelidad

Todos los valores

Tras eliminación de los aberrantes

Parámetro NIR: Destilación: NIR Destilación:

r

0,0396

0,0638

0,0328

0,0639

sr

0,0142

0,0228

0,0117

0,0228

R

0,1705

0,1865

0,1136

0,1500

sR

0,0609

0,0666

0,0406

0,0536

País Color del

vino

Grado alcohólico

indicado en la etiqueta

Seco/dulce Número de muestreo

Portugal blanco 9%vol seco 1

Francia blanco 11,5%vol seco 2

Italia blanco 12,5%vol seco 3

Austria blanco 13,0%vol seco 4

Austria blanco 10,0%vol dulce 5

Hungría blanco 13,0%vol dulce 6

Italia tinto 11,5%vol seco 7

Austria tinto 12,0%vol seco 8

Francia tinto 13,0%vol seco 9

Austria tinto 14,0%vol seco 10






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1.8 Bibliografía

Amtsblatt der Europäischen Union; Bestimmung des Alkoholgehaltes von Wein mittels hydrostatischer Waage; VO (EG) Nr. 128/2004; OIV; ANNEX A – Methods of Analyses of wines and musts; Alcoholic strength by volume; Seite 1 – 52; Section 3.1.2; compendium of international methods of wine and must analysis; Volume 1; Edition 2010

Murer; G.; Benes,R.; Germann, K.; Imre, M.; Kotnik, P.; Sauseng,G.; Trinkel, M; Alcolyzer – Ein Alkoholmessgerät für Wein; Schweizerische Zeitschrift für Obst-und Weinbau, Wädenswill; Switzerland, 2000, 136(23)597-598 American Society of Brewing Chemists; Anton Paar Alcolyzer for Measurement of Alcohol and Original Extract Content in Flavored Alcohol Beverages; Journal – American Society of Brewing

Chemists; USA, 2006, VOL 64; Part 4, pages 242-243

W. Horwitz; Protocol fort he design, conduct and interpretation of collaborative studies; Pure & Appl. Chem.; Vol. 60; No 6; pp. 855-864; 1988; W. Horwitz; Protocol fort he design, Conduct and interpretation of method-performance studies; Pure & Appl. Chem.; Vol. 67; No 2; pp. 331-343; 1995;

OIV; Praktischer Leitfaden für die Validierung, Qualitätskontrolle und Bestimmung der Unsicherheit einer üblichen önologischen Analysenmethode; Resolution Oeno 10/2005; CABANIS M.T., CABANIS J.C., RAFFY J., PEYRONNENCHE M., VIOTTE O., LEBOEUF J.P. 1983 L’Infralyseur 400 : une détermination automatique du titre alcoométrique des vins. Rev. Fr.

Oenol., 89, 75-79. BOUVIER J.C., 1986 Influence du glycérol sur la mesure du degré alcoolique par infra-rouge. Rev. Fr. Oenol., 102, 21-22.

OIV, Recueil des méthodes d’analyse des boissons spiritueuses d’origine vitivinicole Edition 2010.






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ANEXO 2

EJEMPLOS DE MÉTODOS DE DETERMINACIÓN COMUNES EN ENOLOGÍA POR ANALIZADORES

INFRARROJOS MEDIOS (IRTF) Los métodos descritos a continuación sólo lo son a modo de ejemplo. Su número no deja de crecer debido a la realización constante de nuevas calibraciones. Los más importantes actualmente desarrollados pueden clasificarse en varias categorías distintas.

1. Los métodos “directos”

Se trata de la determinación de los compuestos orgánicos para los cuales la correlación entre la absorción molecular y la concentración puede considerarse directa. El cuadro siguiente resume los métodos habitualmente hallados.

Analito Escala de medición Reproducibilidad intralaboratorio

Reproducibilidad interlaboratorio

Glucosa y fructosa 0 a 400 g.L-1 1,3 g.L-1

Ácido málico 0,3 a 6 g.L-1 0,15 g.L-1 0,6 g.L-1

Ácido láctico 0,3 a 6 g.L-1 0,15 g.L-1 0,6 g.L-1

Dióxido de carbono 60 a 1300 mg.L-1 95 mg.L-1 230 mg.L-1

Glicerol 0,2 a 10 g.L-1 10 %

Ácido tartárico 1 a 15 g.L-1 10 %

Ácido glucónico 0,1 a 15 g.L-1 10 %

2. Los métodos “indirectos”

En enología encontramos dos casos diferentes.

1/ La molécula buscada no tiene una absorción significativa en el infrarrojo cercano, ya sea por su naturaleza o debido a concentraciones demasiado débiles.

2/ La búsqueda no tiene que ver con una molécula específica sino con un índice que traduce un equilibrio resultante de un conjunto complejo de compuestos orgánicos.

Para el primer caso, pondremos el ejemplo de la determinación del potasio. El ión potasio no absorbe en el infrarrojo. Las absorciones que se detectan mediante los procedimientos quimiométricos y que se correlacionan con su concentración en el vino o el mosto analizados son, de hecho, las de compuestos orgánicos que están en equilibrio con ese ión.

Para el segundo caso, podemos citar como ejemplo las mediciones del pH o de la acidez total, muy bajos, y que son posibles por la lectura, en el espectro infrarrojo, de los equilibrios complejos de los compuestos orgánicos responsables de estos valores indicados






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El cuadro siguiente describe los métodos habitualmente aplicados.

Método Escala de medición Reproducibilidad intralaboratorio

Reproducibilidad interlaboratorio

Densidad 0,0012 a 1,4000 g.cm-

3 0,00015 g.cm-3 0,0010 g.cm-3

Grado alcohólico volumétrico

8 a 16 %.vol. 0,10 %.vol. 0,21 %.vol.

Acidez total 3 a 33 g.l-1 en ácido tartárico

0,11 g.l-1 en ácido tartárico

0,15 g.l-1 en ácido tartárico

Acidez volátil 0,30 a 0,96 g.l-1 en ácido acético

0,036 g.l-1 en ácido acético

0,12 g.l-1 en ácido acético

pH 2,6 a 4,7 0,06 0,12

Potasio 600 a 8000 mg.L-1 10 %

Índice de compuestos fenólicos totales

15 a 100 14

Nitrógeno amoniacal 5 a 250 mg.L-1 16 %

Nitrógeno -aminado 5 a 250 mg.L-1 10 %

3. Bibliografía

DUBERNET Marc, DUBERNET Matthieu y GRASSET Françoise, 1999, Utilisation de l’analyse infrarouge multiparamétrique à transformée de Fourier en œnologie, Feuillet vert OIV N°1089.

DUBERNET Marc et DUBERNET Matthieu, 2000, Utilisation de l’analyse infrarouge à transformée de Fourier pour l’analyse œnologique de routine, Revue Française d’œnologie, N°181, 10-13. Marc DUBERNET , Matthieu DUBERNET, Vincent DUBERNET, Sylvain COULOMB, Matthieu LERCH

e Isabelle TRAINEAU, 2000, Analyse objective de la qualité des vendanges par spectrométrie

infra-rouge à transformée de Fourrier (IRTF), Congrès OIV 2000, Paris.

DUBERNET Matthieu, DUBERNET Marc, GRASSET Françoise, GARCIA Augustin, 2001 Analyse de l’azote assimilable dans les moûts par Interférométrie Infrarouge à Transformée de Fourier, Revue Française d’Oenologie, N°187, 9-13.

DUBERNET Matthieu, DUBERNET Marc, SAGE Lucile, 2006, Modification de la composition des moûts et des vins issus de raisins parasités par Aspergillus carbonarius. Evaluation rapide de la contamination du raisin et de la teneur en Ochratoxine A dans les moûts et les vins par infrarouge à transformée de Fourier, Revue Française d’œnologie, N°216. BERTRAND D., DUFOUR E. et al. 2000, La spectroscopie infrarouge et ses applications analytiques. Technique et documentation Ed.

PATZ C-D, DAVID A., THENTE K., KURBEL P., DIETRICH H ; 1999. Wine analysis with FTIR spectrometry. Wein Wissenschaft, 54, 80-87. J.C. Boulet, P.Williams, T.Doco. A Fourier transform infrared spectroscopy study of wine polysaccharides, Carbohydrate Polymers, 69 (2007), 79-85.






© OIV 2010 17/17

J.C. Boulet, T.Doco, J.M. Roger, Improvement of calibration models using two successive orthogonal projection methods. Application to quantification of wine polysaccharides, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 87 (2007), 295-302.

FERREIRA M.L., COSTA A. M., RIBEIRO N., SIMÕES T., BARROS P., 2009. Quality control in FTIR

wine análisis. Acceptance of analytical results. Ciência Tec. Vitiv., 24(1), 47-53.”

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