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Certificado conforme Mainz, 10 de julio de 2015

El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general

Jean-Marie AURAND

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RESOLUCIÓN OIV-OENO 419C-2015 MÉTODOS ESPECÍFICOS PARA EL ANÁLISIS DEL AZÚCAR DE UVA (MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS RECTIFICADOS) – DETERMINACIÓN DEL MESOINOSITOL, DEL ESCILOINOSITOL Y DE LA SACAROSA

La ASAMBLEA GENERAL, VISTO el articulo 2 párrafo 2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el que se crea la Organización Internacional de la Viña y el Vino, CONSIDERANDO los trabajos de la Subcomisión “Métodos de Análisis” en la actualización del Compendio con los métodos específicos para el análisis del azúcar de uva (mostos de uva concentrados rectificados), CONSIDERANDO la Resolución OENO 47/2000 sobre las especificaciones de los mostos concentrados rectificados y los métodos correspondientes y la necesidad de actualizar dichos métodos, DADO que los métodos siguientes han sido reconocidos por autoridades internacionales, DECIDE crear un Anexo F titulado “Métodos específicos para el análisis del mosto de uva concentrado rectificado”, DECIDE introducir, en el Anexo F del Compendio de los Métodos Internacionales de Análisis de los Vinos y de los Mostos, los métodos descritos a continuación, DECIDE, por lo tanto, adaptar la Resolución OENO 47/2000, incluida en el Codex Enológico Internacional.



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MÉTODOS ESPECÍFICOS PARA EL ANÁLISIS DEL AZÚCAR DE UVA (MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS RECTIFICADOS) – DETERMINACIÓN DEL MESOINOSITOL, DEL ESCILOINOSITOL Y DE LA SACAROSA

ANEXO F: MESOINOSITOL, ESCILOINOSITOL Y SACAROSA

1. FUNDAMENTO DEL MÉTODO

El mosto de uva concentrado rectificado (MCR) está compuesto principalmente por los azúcares, los polialcoholes y el agua de las uvas. El resto de compuestos, orgánicos y minerales, se eliminan en el proceso de rectificación.

El mesoinositol, el esciloinositol y la sacarosa se determinan mediante cromatografía de gases tras la silanización.

La sacarosa, potencialmente presente en pequeñas cantidades en el MCR, se mantiene estable durante varios meses, ya que la hidrólisis se ralentiza considerablemente por la ausencia de acidez debida a la eliminación de ácidos orgánicos o minerales en el proceso de rectificación, al bajo contenido de agua y al alto de nivel de glucosa y fructosa.

2. REACTIVOS

2.1. Xilitol (núm. CAS 87-99-0)

Patrón interno: (solución acuosa a una concentración exactamente conocida de aproximadamente 10 g/L preparada en el momento).

2.2. Mesoinositol (C6H12O6) (núm. CAS 87-89-8)

2.3. Esciloinositol (C6H12O6) (núm. CAS 488-59-5)

2.4. Glucosa (C6H12O6), fructosa (C6H12O6), sacarosa (C12H22O11)

2.5 Bistrimetilsililtrifluoroacetamida - BSTFA - (C8H18F3NOSi2) (núm. CAS 25561-30-2)

Atención: Producto peligroso e inflamable. Líquido y vapores inflamables. Podría provocar quemaduras cutáneas graves y lesiones oculares graves. Utilice guantes/prendas de protección. Protéjase los ojos/cara.

2.6 Trimetilclorosilano (C3H9ClSi) – (TMCS) – (núm. CAS 75-77-4)

Atención: Producto peligroso e inflamable. Nocivo en caso de contacto con la piel. Podría provocar quemaduras cutáneas graves y lesiones oculares graves. Es tóxico si se inhala. Podría irritar las vías respiratorias. Manténgase alejado de fuentes de calor/chispas/llamas libres/superficies calientes. No fume. Evite inhalar sus vapores. Utilice guantes/prendas de protección. Protéjase los ojos/cara.

2.7 Piridina p. a. (C5H5N) (núm. CAS 110-86-1)

Atención: Producto peligroso e inflamable. Nocivo en caso de inhalación, contacto con la piel e ingesta.



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2.8 Etanol absoluto (C2H6O) (núm. CAS 64-17-5)

Atención: Producto inflamable. Líquidos y vapores fácilmente inflamables. Manténgase alejado de fuentes de calor/chispas/llamas libres/superficies calientes. No fume.

2.9 Agua de tipo 1 de conformidad con la norma ISO 3696 o agua desionizada de una

resistividad ≥ 18M cm

2.10 El reactivo de silanización también puede encontrarse listo para ser utilizado en forma de kit (p. ej. HMDS+TMCS+Pyridine 3:1:9 Supelco cod. 33038)

2.11 Gases técnicos: nitrógeno, hidrógeno, helio y aire para el cromatógrafo de gases y para las fases de deshidratación

3. EQUIPO

3.1. Cromatógrafo de gases:

3.2. Columna capilar capaz de garantizar una eficiencia mínima de N=250.000 platos/columna para la sacarosa a 1 g/L.

Por ejemplo, OV-1 (25 m x 0,30 mm x 0,15 µm) o DB-5 (60 m x 0,25 mm x 0,10 µm).

Condiciones operativas (a título de ejemplo):

– gas portador: hidrógeno o helio puro para cromatografía de gases,

Hidrógeno – Atención: Gas extremadamente inflamable. Conserve el recipiente en un lugar bien ventilado y lejos de llamas y chispas. No fume. Evite los cúmulos de carga electrostática.

– caudal del gas portador: 2 mL/min aproximadamente,

– temperatura del inyector: 250 °C,

– temperatura del detector de ionización de llama (FID): 300 °C,

– programación de temperatura: 1 minuto a 160 °C, 4 °C/minuto hasta 260 °C, isoterma a 260 °C durante 15 minutos,

– relación de división de flujo (split): 1 a 20 aproximadamente,

– gases auxiliares: hidrógeno y aire puros para cromatografía de gases.

3.3. Integrador

3.4. Microjeringa de 10 µL

3.5. Micropipetas de 10, 100, 400 y 1 000 µL

3.6. Viales de 2 mL con tapón de teflón

3.7. Estufa

3.8. Balanza técnica, balanza analítica capaz de garantizar una exactitud de ± 0,1 mg

3.9 Matraces de 50 y de 100 mL



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3.10 Desecador

4. PROCEDIMIENTO

4.1. Preparación de la muestra

En un matraz de 50 mL, pesar una cantidad “p” de mosto concentrado rectificado, de entre 4,9 y 5,1 g, y anotar el peso con una precisión de ±0,1 mg.

A continuación, añadir 1 mL de la solución patrón de xilitol (2.1) y enrasar con agua (2.9).

4.2. Deshidratación de la muestra

Después de homogeneizar la muestra, tomar 100 µL de solución, introducir en un vial (3.6) y secar con una ligera corriente de nitrógeno.

Es posible añadir 100 µL de etanol absoluto (2.8) para facilitar la evaporación.

Nota 1: En caso de que interese una dosis precisa de sacarosa, la solución diluida deberá prepararse justo antes de la silanización a fin de limitar la hidrólisis de la sacarosa en la solución acuosa diluida.

Nota 2: Las mediciones repetidas del contenido de sacarosa deberán llevarse a cabo en soluciones diluidas preparadas desde cero antes de cada silanización.

4.3. Derivatización

Disolver cuidadosamente el residuo en 100 µL de piridina (2.7), añadir 100 µL de bistrimetilsililtrifluoroacetamida (2.5) y 10 µL de trimetilclorosilano (2.6), cerrar el vial con el tapón de teflón y meter en la estufa a 70 °C durante 70 minutos.

Sacar los viales cerrados de la estufa y dejarlos enfriar en el desecador, a oscuras y a temperatura ambiente durante una hora antes de inyectarlos en el cromatógrafo de gases.

La sustancia silanizada de los viales cerrados y conservados en el desecador, a oscuras y a temperatura ambiente estará estable durante tres días.

Nota 3: En el caso de que se esté trabajando con el kit de silanización, se deberá utilizar 400 µL de reactivo por cada 100 µL de muestra diluida y deshidratada, según se describe en el punto 4.1.

Nota 4: La silanización se considerará correcta si la solución, tras una sola fase, tiene una apariencia limpia o con un ligero depósito blanco. No deberá haber ningún depósito oscuro, ya que esto indicaría un exceso de azúcares no derivatizados o una sustancia silanizante envejecida.

Nota 5: En caso de suspensión blanca, esperar hasta que la materia sólida se deposite en el fondo sin centrifugar.

4.4. Análisis mediante cromatografía de gases

Tomar 1 µL con la jeringa (3.4) e inyectar en el cromatógrafo según la relación de división de flujo (split) anterior.

El cromatograma no deberá mostrar una confluencia de picos (señal de silanización incorrecta), sino que deberá mostrar los picos característicos, como los que aparecen en las figuras adjuntas (fig. 9-fig. 12).



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4.5. Criterios de integración de los picos

Integrar los picos del cromatograma con respecto a la línea de base horizontal. En el caso de los picos que no se hayan resuelto a la perfección, trazar la línea de base horizontal a partir de los valles más profundos que delimiten el pico en cuestión. Trazar una línea vertical hacia abajo a partir de los valles de los picos hasta la línea de base para identificar el área del pico.

No utilizar el método de integración de valle a valle.

La figura 10 recoge un ejemplo de la aplicación de estos criterios al patrón interno; la figura 11, a los inositoles y la figura 12, a la sacarosa.

Nota 6: En caso de que interese una dosis precisa de sacarosa, es importante respetar los criterios de integración expuestos en el punto 4.4. y representados en la figura 12.

5. CÁLCULOS

5.1. Cálculo de los factores de respuesta

Nota: Como alternativa al cálculo de factor de respuesta se puede utilizar una curva de calibración.

5.1.1. Preparar una solución que contenga:

- 60 g/L de glucosa,

- 60 g/L de fructosa,

- 1 g/L de mesoinositol,

- 1 g/L de sacarosa

pesar 60 g de glucosa y 60 g de fructosa con una precisión de ± 1 g; a continuación, 1 g de mesoinositol y 1 g de sacarosa con una precisión de ± 0,1 g y por último, añadir agua hasta alcanzar 1 litro.

5.1.2. Silanización de la solución de referencia

Seguir las instrucciones que figuran en el punto 4.1; se debe tomar como base 5 mL de esta solución en lugar de los 5 g de MCR.

Tomar 5 mL de esta solución y proceder de conformidad con el punto 4.

5.1.3. Factores de respuesta derivados de la cromatografía de gases

A partir del cromatograma obtenido, calcular los factores de respuesta del mesoinositol y de la sacarosa en relación al xilitol.

Para el esciloinositol, cuyo tiempo de retención está comprendido entre el último pico de las formas anoméricas de la glucosa y el del mesoinositol (véase figura11), utilizar el mismo factor de respuesta que el del mesoinositol.



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Donde: Amesoinositol = área del pico de mesoinositol; Asacarosa = área del pico de sacarosa; Api = área del pico de patrón interno; Cmesoinositol = concentración del mesoinositol en mg/L; Csacarosa = concentración de la sacarosa en mg/L; Cpi = concentración del patrón interno en mg/L, resulta:

La solución para el cálculo de los factores de respuesta deberá elaborarse y analizarse el mismo día (véase la nota 1, en el punto 4.1).

5.2. Expresión de los resultados

El mesoinositol, el esciloinositol y la sacarosa se expresan en miligramos por kilogramos de azúcares totales (mg/kgAT) sin cifras decimales.

5.2.1. Concentraciones expresadas en mg/L para la solución de MCR al 10 % (m/v) (4.1):

5.2.2. Concentraciones expresadas en mg/kg de azúcares totales (mg/kg AT) para el mesoinositol y el esciloinositol y para la sacarosa en el MCR. Con la “i” se indica cualquiera de los tres compuestos:

Donde “p” es el peso el g del MCR y “G” es el porcentaje de azúcares en el MCR expresado en °Brix [o % (m/m) de sacarosa]. El porcentaje de azúcares de la muestra de MCR deberá determinarse según el método OIV-MA-AS2-02.



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6. CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

6.1. Puntos críticos

Este método incluye el análisis de los azúcares y polialcoholes presentes en cantidades mínimas en una matriz de glucosa y fructosa en concentraciones muy elevadas. De este modo, resulta necesario verificar la capacidad del método para aportar respuestas lineales en el intervalo de concentraciones propuesto y que sean suficientemente exactas con respecto a los valores conocidos.

Además, el método incluye el análisis por cromatografía de gases de los compuestos silanizados obtenidos por derivatización de los azúcares. Estos compuestos son sensibles a la humedad y tienden a degradarse en el tiempo. Por lo tanto, es importante verificar que las indicaciones respecto a la conservación y manipulación de dichos compuestos sean adecuadas.

Por último, la sacarosa está sujeta a la hidrólisis, dada la cantidad de agua residual del MCR (del 30 al 45 %). No obstante, la baja acidez de la matriz y la alta concentración de glucosa y fructosa ralentizan el proceso de hidrólisis y permiten que se lleve a cabo una medición exacta. Es importante verificar que los tiempos de los análisis sean rápidos con respecto a la hidrólisis para que se puedan hacer las repeticiones de las mediciones de los azúcares.

6.2. Linealidad

Se preparó una serie de seis muestras sintéticas (incluido el blanco), que contenía una matriz de glucosa y fructosa obtenida al pesar cantidades similares de los dos azúcares con respecto a un contenido de azúcares totales del 60 % (m/m) en el MCR inicial.

A cinco de las muestras sintéticas se les añadió una cantidad precisa, cada vez mayor, de mesoinositol y sacarosa para obtener las concentraciones que recoge el siguiente cuadro:

Concentración añadida

N. Mesoinositol Sacarosa

(mg/kg AT) (mg/kg AT)

1 0 (blanco) 0 (blanco)

2 214,7 427,3

3 420,0 857,7

4 840,2 1.675,8

5 1.727,0 3.338,0

6 2.514,0 6.719,0

Seguidamente, las muestras se diluyeron (4.1.) y la solución diluida se deshidrató (4.2.), se silanizó (4.3.) y se analizó por CG (4.4.-4.5.).



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A continuación, las muestras se silanizaron y analizaron por CG. Los resultados se verificaron en orden de linealidad. En el gráfico se muestra la proporción entre las áreas de los picos del mesoinositol y las del patrón interno (Ameso/Api) y la proporción entre la concentración del mesoinositol y la del patrón interno (en mg/L), indicada como Cmeso/Cpi. El análisis por CG se llevó a cabo por duplicado; los datos siguientes son la media de ambos valores.

A la sacarosa se le aplicó el mismo tratamiento, según sigue.

Fig. 1. Linealidad del mesoinositol * Cmeso/Cpi

La linealidad del mesoinositol fue muy satisfactoria (R>0,998) para todo el intervalo de concentraciones estudiado.

Linealidad del mesoinositol

*

Ameso/Api



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Fig. 2. Linealidad de la sacarosa. * Csac/Cpi

En lo que atañe a la sacarosa, la relación lineal supuesta para todo el intervalo de concentraciones estudiado no tuvo una correlación satisfactoria (R=0,967). No obstante, al restringir el campo de linealidad a la muestra sintética núm. 5, la correlación fue comparable a la del mesoinositol (R>0,997).

Siguiendo las instrucciones que figuran en el punto 5.1, se obtuvieron los siguientes factores de respuesta:

FR rel. mesoinositol/PI de xilitol FR rel. Sacarosa/PI xilitol

1,04 ± 0,03 (media ± σ; n=4) 0,36 ± 0,06 (media ± σ; n=4)

6.3. Especificidad

La relación entre el mesoinositol añadido y el determinado por CG es lineal para todo el intervalo de medidas estudiado; la pendiente de la recta es muy cercana al uno y la intersección es muy cercana al cero.

Linealidad de la sacarosa

*

Asac/Api



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Fig. 3. Especificidad del mesoinositol * Concentración del mesoinositol determinado por CG (mg/kg AT)

Además, la recuperación es satisfactoria, entre el 95 y el 105 %, tal y como recoge el siguiente cuadro:

Cmeso añadido (mg/kg AT)

Cmeso determinado por CG ±σ (n=2) (mg/kg AT)

Recuperación (%)

0 0 -

214,7 213 ± 2 99 %

420,0 419 ± 3 100 %

840,2 852 ± 20 102 %

1.727,0 1.668 ± 214 100 %

2.514,0 2.587 ± 36 99 %

En lo que atañe a la especificidad de la sacarosa, las concentraciones obtenidas a partir del cálculo de la sacarosa añadida y la determinada por CG concuerdan y presentan una relación lineal, con una pendiente de uno y una intersección de casi cero, siempre que se considere un intervalo de concentración más restringido que el estudiado.

El siguiente gráfico muestra que la relación lineal no se extiende hasta el último nivel de concentración de aproximadamente 6.700 mg/kg AT.

Especificidad del mesoinositol

*

Concentración del mesoinositol añadido (mg/kg AT)



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Fig. 4. Especificidad de la sacarosa. * Concentración de la sacarosa determinada por CG (mg/kg AT)

Además, la recuperación fue satisfactoria, entre el 90 y el 110 %, salvo en los niveles de concentración más altos, tal y como recoge el siguiente cuadro:

Csacarosa añadida (mg/kg AT)

Csacarosa determinada por CG ±σ (n=2)

(mg/kg AT) Recuperación (%)

0 0 -

427,3 423 ± 16 99 %

857,7 913 ± 37 107 %

1.675,8 1.852 ± 344 111 %

3.338,0 3.297 ± 284 99 %

6.719,0 9.220 ± 19 137 %

6.4. Estabilidad de la sacarosa en el mosto concentrado rectificado

Una muestra de MCR con sacarosa añadida se mantuvo a temperatura ambiente y se analizó en intervalos de tiempo regulares para conocer la incidencia del fenómeno de la hidrólisis de la sacarosa en el MCR.

Los resultados se recogen en el siguiente cuadro:

t=0 días t=9 días t=53 días

Mesoinositol (mg/kg AT) 2.227 2.100 2.052

Esciloinositol (mg/kg AT) 424 430 394

Sacarosa (mg/kg AT) 4.631 5.108 4.969

Especificidad de la sacarosa

*

Concentración de la sacarosa añadida (mg/kg AT)



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Ni el mesoinositol, ni el esciloinositol, ni la sacarosa mostraron variaciones significativas en la concentración respecto al valor inicial hasta 53 días después de la preparación.

Este hecho se hace evidente en el siguiente gráfico:

Fig. 5. Estabilidad en el tiempo.* Concentración

6.5. Estabilidad del silanizado

El producto de la silanización, obtenido según se describe en el punto 4.2., se conservó como se describe en ese mismo punto. La muestra silanizada se analizó, en intervalos de 24 horas, mediante cromatografía de gases y según el procedimiento que se indica en los puntos 4.3. y siguientes.

Los resultados se recogen en el siguiente cuadro:

t=0

media ± DE (n=3)

t=24 h media ± DE

(n=3)

t=48 h media ± DE

(n=3)

t=72 h media ± DE

(n=3)

t=96 h media ± DE

(n=3)

Mesoinositol (mg/kg AT)

2.424 ± 109 2.347 ± 44 2.358 ± 17 2.453 ± 39 2.478 ± 15

Esciloinositol (mg/kg AT)

261 ± 7 254 ± 2 256 ± 4 257 ± 3 264 ± 1

Sacarosa (mg/kg AT)

6.233 ± 971 6.500 ± 200 6.633 ± 58 6.733 ± 321 6.600 ± 436

No se detectaron diferencias importantes entre los resultados obtenidos a partir de la misma muestra silanizada hasta cuatro días después de la silanización, al seguir el procedimiento de conservación del silanizado, que figura en el punto 4.2.

Estabilidad en el tiempo

Tiempo desde la preparación (días)

Meso mg/kg AT

Escilo mg/kg AT

Sac mg/kg AT

*



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Este hecho se hace evidente en los siguientes gráficos:

Fig. 6. Estabilidad del Mesoinositol.

Fig. 7. Estabilidad del Esciloinositol.

Mesoinositol

Esciloinositol

horas

horas

mg

/ k

g A

T

mg

/ k

g A

T



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Fig. 8. Estabilidad de la Sacarosa.

6.6. Precisión

Parámetros de precisión derivados de las pruebas interlaboratorios llevadas a cabo en abril de 2014 entre ocho laboratorios italianos. El programa de comparación entre laboratorios se llevó a cabo con una muestra añadida de sacarosa con una concentración de 1 g de sacarosa por 1 kg de MCR.

sacarosa mesoinositol esciloinositol

Número de laboratorios participantes 8 8 8

Número de resultados aceptados 23 23 23

Valores medios (mg/kg AT muestra) 1.665 954 145

Repetibilidad

Desviación estándar de la repetibilidad (Sr) 78 52 11

Desviación estándar relativa de la repetibilidad (%RSDr) 4,7 5,4 7,3

Límite de repetibilidad (r) 219 146 29

r HORRAT = RSDr / RSD(R) Horwitz 0,9 1,0 1,0

Reproducibilidad

Desviación estándar de la reproducibilidad (SR) 122 76 19

Desviación estándar relativa de la reproducibilidad (%RSDR) 7,4 8,0 13

Límite de reproducibilidad (R) 343 213 55

RSD(R) Horwitz % 5,2 5,7 7,6

R HORRAT = RSDR / RSD(R) Horwitz 1,4 1,4 1,8

Sr/SR 0,64 0,68 0,58

Sacarosa

horas

mg

/ k

g A

T



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7. BIBLIOGRAFÍA

7.1 Versini, G., Dalla Serra, A., & Margheri, G. (1984). Polialcooli e zuccheri minori nei mosti concentrati rettificati. Possibili parametri di genuinità? Vignevini, 11(3), 41-47

7.2 Monetti A., Versini G., Dalpiaz G. y Raniero F. (1996) Sugar adulterations control in concentrated rectified grape musts by finite mixture distribution analysis of the myo-inositol and scyllo-insitol content and the D/H methyl ratio of fermentative ethanol. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44-8: 2194-2210.



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8. FIGURAS

Fig. 9 – Cromatograma de la solución de referencia para el cálculo de los factores de respuesta

Fig. 10– Cromatograma de una muestra de MCR (ZONA patrón interno)

8,0

7 X

ilit

ol

()P

.I.)

15,5

1 m

eso

ino

sito

l

26,9

7 s

acar

osa

volt

aje

volt

aje

8,0

6 X

ilit

ol

()P

.I.)

Tiempo

Tiempo

volt

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15,5

1 m

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l

26,9

7 s

acar

osa

Tiempo

volt

aje

8,0

6 X

ilit

ol

()P

.I.)



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Fig. 11– Cromatograma de una muestra de MCR (ZONA inositol)

Fig. 12– Cromatograma de una muestra de MCR (con 0,5 g/kg de sacarosa añadida)

volt

aje

saca

rosa

Tiempo

volt

aje

Tiempo 1

4,2

6 e

scil

oin

osi

tol

15,5

0 m

eso

ino

sito

l

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