EXPERIMENTO #1: Medicin de la absorbancia

Una solucin produce Absorbancia (luz absorbida) y Transmitancia (luz que transmite). El espectrofotmetro es un instrumento que mide la Absorbancia (medida indirecta de la concentracin de una sustancia; por la Ley de Beer-Lambert ambos son directamente proporcionales).

Spectronic 20

Componentes de un espectrofotmetro:1- Fuente de luz: ilumina la muestra.2- Monocromador: permite que salga el haz de luz deseado segn la longitud de onda.3- Celda: compartimiento de la muestra. Puede estar hecha de cuarzo por lo que no se deben lavar con escobillas, ni rayar con el fin de garantizar el paso eficiente de la luz.4- Detector: detecta la radiacin, puede responder a fotones o a calor.

Dependiendo de la solucin, la fuente de luz puede ser: Ultravioleta si se trata de soluciones NO coloreadas. Visible (intervalo 390-780 nm) si se trata de soluciones coloreadas.

Regin visible400 nm AZUL500 nm VERDE 600 nm AMARILLO 700 nm ROJO

Si una solucin es azul, al colocarla en el espectrofotmetro a 600 nm (amarillo) su absorbancia ser significativamente mayor que a 400 o 500 nm. Lo mismo ocurre con una solucin amarilla, su absorbancia ser mayor a su complementario (azul), o sea, en 400 nm.

(nm)Absorbancia

Azul(soln. CoSO4)Amarillo(soln. K2CrO4)Rojo(soln. NiSO4)

4200,022,000,02

5000,020,110,05

5900,110,020,03

Pregunta: Qu relacin debe haber entre el color de la luz y el color de la solucin para que haya una absorcin mxima?Respuesta: Ambos colores deben ser complementarios.Laboratorio n2Tcnica para la extraccin de sangre en el humanoANLISIS DE SANGRELa determinacin cuantitativa de los constituyentes sanguneos representa uno de los datos ms valiosos con que cuenta el mdico para realizar diagnsticos, conocer la evolucin de los cuadros patolgicos y controlar drogas utilizadas en teraputica. Los mtodos analticos ms utilizados son de tres tipos principalmente: Fotomtricos Volumtricos GasomtricosLas determinaciones en sangre pueden realizarse utilizando sangre total, plasma o suero. Deben seguirse una serie de procedimientos de acuerdo a la sustancia a determinar:1. Extraccin de la sangre2. Preparacin3. Uso de anticoagulantes4. Desproteinizacin

1. EXTRACCIN: la mayor parte de los estudio se realizan en sangre venosa o en sangre capilar; muy raras veces se emplea sangre arterial para los anlisis ordinarios de laboratorio.

A. OBTENCIN DE SANGRE CAPILAR Se utiliza para realizar microanlisis Se acerca en su composicin a la sangre arterial. Se puede obtener de la parte lateral de la yema de los dedos y en el lbulo de la oreja (nios y adultos) y en la parte lateral del taln (nios)

B. OBTENCIN DE SANGRE VENOSA La sangre se obtiene en general de las venas de la flexura del codo, preferentemente de la mediana del codo, ceflica y baslica. Cuando se tiene poca experiencia es mejor no elegir la baslica ni la ceflica, porque estn muy prximas a inervaciones. Concluyendo, si no se ve o no se palpa ninguna vena, la preferente para la extraccin, es la vena mediana del codo.Factores que impiden una extraccin exitosa Hemos traspasado la vena No estamos en la vena El bisel est obstruido por la piel Estamos en la vlvula de la vena

Razones por las cuales obtenemos poca sangre Se forma un vaco en la jeringuilla por halar el mbolo antes de tiempo o se sale el bisel.Luego de una extraccin, es comn que el paciente tenga un edema en el rea donde se realiz la misma; un edema es la acumulacin de lquido en el espacio intersticial. En caso tal de que no se pueda efectuar una puncin en el brazo para extraer sangre, se recurre a punzar la vena femoral; esta puncin solamente es realizada por un mdico. Para esta extraccin es preciso localizar la arteria femoral en el tringulo femoral. Posteriormente se le solicita al paciente que coloque uno de sus malolos externos sobre la rodilla y as se aflora mejor esta zona. Finalmente se introduce el bisel con un ngulo de 90.Cmo saber si nos hallamos en una arteria o en una vena? Presin: las arterias son vasos de presin, mientras que las venas son vasos de capacitancia. Color de la sangre: en las arterias la sangre es brillante pero este no es un criterio muy confiable.La vena yugular externa es otro sitio para extraer sangre, principalmente en nios. A estos se les recuesta en el borde de una mesa y su reaccin ser llorar por lo que se sopla ms la vena y la sangre se acumula en la cabeza.C. OBTENCIN DE SANGRE ARTERIAL Se emplea para realizar estudios de gasometra (pCO2, pO2), conocer el porcentaje de saturacin de Hemoglobina, conocer las concentraciones de los iones, pH de la sangre, conocer la oxigenacin. En la sangre arterial la oxigenacin es de aproximadamente 95%. En la sangre venosa es de aproximadamente 70%. Sitios para extraer sangre arterial: arteria radial (se puede localizar en la tabaquera anatmica, en el dorso de la mano), arteria braquial y arteria femoral. De estas la preferente es la arteria radial. Luego de la extraccin se debe ejercer presin sobre la arteria hasta que la sangre se coagule.

2. PREPARACIN A. Para obtener suero: se vierte la sangre extrada en un tubo de ensayo sin anticoagulante y se deja coagular a temperatura ambiente. Luego se separa el cogulo de las paredes del tubo, se centrifuga inmediatamente y se separa el suero que queda sobrenadante.B. Para obtener plasma: la muestra obtenida debe tratarse con anticoagulante y se mezcla haciendo girar el tubo suavemente. Luego de esto la muestra se centrifuga.

En la electroforesis se utiliza el suero, debido a que este no posee las protenas de la coagulacin de la sangre (fibringeno, que lleva a fibrina). En un electroforetograma el fibringeno puede aparecer como una banda adicional y podra pensarse que se trata de una patologa.

3. ANTICOAGULANTE: Es de gran importancia utilizar la cantidad apropiada de anticoagulante; un exceso podra dar lugar a la hemlisis de los eritrocitos, dificultar algunas determinaciones o alterar la distribucin de agua y ciertos electrolitos entre las clulas y el plasma. Los anticoagulantes ms utilizados son la heparina y el EDTA (cido etilendiaminotetracetico). Heparina: Contiene sales de sodio y potasio que se deben evitar si en la muestra se van a realizar anlisis de dichos iones. Suele utilizarse 0,2 mg por mL de sangre. Suele utilizarse como tratamiento para pacientes con trombosis debido a que previene la formacin de cogulos de sangre, evitando que la protrombina se convierta en trombina y por lo tanto se bloquee el paso fibringeno a fibrina. cido etilendiaminotetracetico (EDTA): Es un agente quelante y preservativo de los componentes celulares sanguneos. Es efectivo en concentraciones de 1- 2 mg/mL de sangre.

Unquelante, o antagonista demetales pesados, es una sustancia que forma complejos conionesde metales pesados.

Uso del EDTA: Determinacin de elementos formes de la sangre, por ser un agente quelante del calcio (recordar que el Ca2+ cuarto factor de la cascada de la coagulacin), formando un enlace coordinado con el mismo para impedir que se complete la formacin del cogulo. Hematcrito Hemograma o biometra hemticaOtros anticoagulantes utilizados son: Precipitan el calcioOxalacetato de sodio Oxalato de potasio Fluoruro de sodio: es un anticoagulante conservativo. El flor inhibe las enzimas de la gluclisis, lo que permite determinar bien los niveles de glucosa y de esta manera esta no se metabolice y por lo tanto se preserve. Citrato de sodio: para realizar estudios de la coagulacin. Factores que pueden producir hemlisis Demorar mucho para extraer la sangre Dejar puesto el torniquete por ms de 2 minutos Si se dobla la aguja y se contina con la extraccinUn indicativo de que hay hemlisis es la coloracin rojiza /anaranjado rojiza del sobrenadante (normalmente es amarillo).Se altera la concentracin de potasio, un catin que se encuentra en todas las clulas y que mantiene el potencial de reposo de las clulas, el potencial de umbral y el potencial de accin. Una concentracin elevada de este catin puede ser indicativo de problemas cardiacos.** ** No estoy muy segura de por qu menciono eso.Hematoma: cmulo de sangre en el tejido celular subcutneo

PLASMA: con protenas de la coagulacin *CON fibringenoSUERO: plasma sin las protenas de coagulacin *SIN fibringenoLaboratorio # 3Electroforesis en protenas

La ELECTROFORESIS es la separacin de las molculas bioqumicas en suero o plasma de acuerdo a su carga neta en el medio amortiguado utilizando un campo elctrico.

Las molculas pequeas que difunden con rapidez requieren de una gradiente ALTO voltaje (20 V/cm) con el objeto de que la velocidad de la electroforesis sea mayor que la velocidad de difusin del soporte.

Las protenas no difunden tan rpido como los aminocidos y se pueden separar en gradientes de voltaje menores. As, si una solucin de una mezcla proteica (diferentes puntos isoelctricos) se colocan entre dos electrodos: nodo (+) y ctodo (-), las protenas se cargan negativamente debido al amortiguador (Tris-barbital, pH= 8.8) y migran hacia el nodo a una velocidad que depende de: su carga neta medio de soporte usado peso molecular tamao de la protena

Las protenas son molculas anfteras: su carga neta depende del pH del medio, en este caso del amortiguador alcalino dndole una carga NEGATIVA a las protenas

MATERIALES

Cmara electrofortica: lleva a cabo la electroforesis. Consta de dos electrodos que se enchufan a una fuente de poder. Fuente de poder: se le enchufan los 2 electrodos. Proporciona el voltaje (250V 300V) o el amperaje para llevar a cabo la separacin o corrida electrofortica. Soporte slido: en l se siembran las muestras. Utilizaremos el acetato de celulosa como soporte slido.

*** El amortiguador debe estar ATEMPERADO para evitar el aumento de temperatura provoque la desnaturalizacin de las protenas de la muestra en el tiempo de corrida.

** La corrida demora 40 minutos.

DESPUS DE LA CORRIDA

Una vez realizada la separacin electrofortica, se hace un relevado que consiste en TEIR el soporte slido con un colorante: ROJO PONCEAU S que se une a las protenas, lo que permite la deteccin de las bandas correspondientes a las protenas sricas***Cuando el componente slido (acetato de celulosa) es teido cambia de nombre a ELECTROFORETOGRAMA.

Se detectan 5 fracciones: La albmina es la fraccin ms intensa del electroforetograma Globulinas gamma, beta, alfa1, alfa 2

Desintmetro: convierte el electroforetograma en CURVAS es decir, en un proteinograma que se define como la grfica de separacin electrofortica de las proteinas del plasma o del suero.

Gamma Beta Alfa2 Alfa1 Albmina

** htp://www.uv.es/jcastell/Proteinas_plasmaticas.pdf

Cuestionario: 1. Cules son las principales protenas plasmticas?

Requisitos para ser considerada una protena plasmtica Ser secretada activamente en la sangre ejercer una funcin en el sistema vascular Presentar mayor concentracin en plasma que otros tejidos No derivar de lesiones. AlbminaGlobulinas (alfa, beta, gamma)

2. Si se usa suero en lugar de plasma, cul ser la diferencia en el electroforetograma?

El plasma conserva el fibringeno, protena de la coagulacin. Al ser una protena queda separada en la electroforesis y correr en 2, esto quiere decir que en una muestra de plasma la fraccin de 2 es ms intensa por la presencia de fibringeno. En el suero el fibringeno es parte del cogulo, por lo tanto la fraccin de 2 es tenue y prcticamente ni se ve.

3. Considerando que los pI de las protenas son:Albmina (4,7) Alfa1 Glob (2,7) Alfa2 Glob (4,4) Beta Glob (2,7) Glob /6,2 7,3) de fracciones de protenas sricas.Explique por qu se utiliza el amortiguador Tris-Barbital pH 8,8 para realizar la separacin

Es importante saber que las protenas son ANFOTERAS, es decir que cambian su pH conforme al pH del medio. Utilizamos un amortiguador de pH alcalino para cargar negativamente las protenas y darle una direccionalidad a la corrida, de manera que esta se realice desde el ctodo (polo negativo) hacia el nodo (polo negativo).

4. Los porcentajes de fracciones de protenas sricas determinados luego de la desintometra son los siguientes

Alb52,6%Alfa1 Glob 3,2%Alfa2 Glob 12,4%Beta Glob 11,2%Gamma Glob17,1%

El suero tiene una concentracin de 7 g/dL. Calcule los g/dL correspondientes a cada fraccin Protenas sricas% en sangreg /dL

Alb52,6%3,682

Alfa1 Glob 3,2%0,224

Alfa2 Glob 12,4%0,868

Beta Glob 11,2%0,784

Gamma Glob17,1%1,197

Cuantificacin de protenas

Las sustancias que poseen enlaces peptdicos dan color azul violeta al reaccionar con una solucin de cobre en medio alcalino (biuret). El color depende del medio de coordinacin formado por el in cprico y los tomos del nitrgeno peptdico.

Por qu azul violeta? PROT + BIURET = AZUL VIOLETAEsto es responsabilidad del COBRE quue forma un complejo de coordinacin con los electrones desapareados del enlace peptdico)

Utilizando el espectofotmetro se puede medir la concentracin del complejo de coordinacin que es directamente proporcional a la concentracin de protenas totales en el plasma o suero.

BIURET CUANTIFICAR PROTENASComponentes del reactivo de Biuret: CuSO4.5H2O: reacciona con los componentes del enlace peptdico para formar el complejo de coordinacin. NaOH: proporciona el medio alcalino para que se forme el complejo de coordinacin. Ioduro de potasio y sodio: evita la oxidacin del complejo de coordinacin. Tartrato de sodio y potasio: estabiliza el complejo de coordinacin, permitiendo que este se conserve en el tiempo de la lectura, para que se mantenga el color de la solucin.

TUBO BLANCOTUBO PATRNTUBO MUESTRA

5 mL Biuret5 mL Biuret5 mL Biuret

100 uL de muestra100 uL de patrn100 uL de muestra

Longitud de onda en el espectofotmetro = 500 nm

Solucin blanco: (Biuret + H2O) se utiliza para calibrar el espectrofotmetro.Solucin Patrn: es de concentracin conocida. Se determina su absorbancia y conociendo la misma se pude calcular las concentraciones de las muestras usando:

[Proteinas en plasma]= (Abs de la muestra / Abs del patrn) x [Patrn] g/dL[Patrn]= 7g/dL

Resultados:Patrn0.271

Muestra 10.3218.292

Muestra 20.3198.240

Muestra 30.3258.395

Muestra 40.3128.059

Muestra 50.3318.550

Muestra 60.2917.517

EXPERIMENTO #4: Protenas plasmticas

Suero: Sangre sin elementos formes y protenas de la coagulacin (fibrina y fibringeno). Es el lquido amarillento transparente que est en la sangre coagulada.Plasma: Es el lquido sobrenadante, ligeramente amarillo y transparente que est en la sangre no coagulada. Para evitar la coagulacin se usan anticoagulantes como heparina y EDTA.Electroforetograma: Soporte slido de acetato de celulosa teido con un colorante (rojo Ponceau S) en la cual aparecen las bandas proteicas.Proteinograma: Representacin grfica de las protenas del plasma que se obtiene luego de la densitometra del Electroforetograma.

Requisitos para ser una protena plasmtica: 1- Ser secretadas activamente hacia la sangre.2- No derivar de lesiones, ni alteraciones de tejidos o clulas.3- Ejercer una funcin en el sistema vascular.4- Presentar mayor concentracin en el plasma que en otros tejidos.Las protenas plasmticas se sintetizan en el hgado, excepto las inmunoglobulinas que las producen las clulas plasmticas derivadas de los linfocitos B de la mdula sea.

Concentraciones de las protenas sanguneas: Normal Normoproteinemia o Euproteinemia: 6-8 g/dL. Bajo Hipoproteinemia: < 3 g/dL (hipoalbuminemia). Alto Hiperproteinemia: > 10 g/dL (hiperglobulinemia).Proteinuria: Presencia de protenas en la orina. La proteinuria normal es hasta 150 mg en orina de 24 hrs.Sndrome: Conjunto de signos y sntomas que tienen un sustrato anatomo-patolgico comn.

En CLNICA se observa tanto la hiper- como la hipoproteinemia pero sta es ms frecuente. No existe ninguna patologa que produzca hiperalbuminemia. Pero s hay un aumento relativo de las protenas totales debido a hemoconcentracin.La hiperglobulinemia se presenta en enfermedades como el mieloma mltiple.Mieloma: Tumor compuesto por clulas del tipo que se encuentran normalmente en la mdula sea.

Mecanismos que producen hipoalbuminemia: Falta de aporte produce malnutricin proteico-calrica. Biosntesis defectuosa como en hepatopatas, cirrosis avanzada, hepatitis severas, cncer, etc. Prdidas por: La piel (en quemaduras extensas y ciertas enfermedades de la piel) Los riones (en el sndrome nefrsico donde ocurre un dao renal en la membrana basal que deja pasar las protenas) El intestino (en el sndrome de malabsorcin)Los criterios para hacer el diagnstico de sndrome nefrsico son:1- Albmina srica: 3 g/dL2- Proteinuria: 3 g en orina de 24 hrs.

Protena PlasmticaFuncin

1) PrealbminaTransporte: Tiroxina, Retinol

2) AlbminaRegula presin onctica. Transporte: cidos grasos, bilirrubina, frmacos, Ca2+ y Cu2+

3) 1 Globulinas- Antitripsina- Orosomucoide(Glucoprotena cida)- Fetoprotena Inhibe enzimas proteolticas Asociada con la inflamacin

Presente en el feto

4) 2 Globulinas- Ceruloplasmina- Haptoglobina- Macroglobulina Transporte de cobre Enlaza la Hb Inhibidor de endopeptidasas

5) 1 Globulinas- Transferrina- Hemopexina- C4 Transporte de hierro Fija grupo hemo libre Complemento

6) 2 Globulinas- Fibringeno- C3 Factor de coagulacin Complemento

7) Globulinas- IgG- IgA- IgM- IgD e IgE- Protena C-reactiva

Defensa inmunitaria

Defensa no adaptativa

Estudio cintico de la catalasaLa catalasa es una protena oligomrica formada por cuatro subunidades proteicas y cuatro grupos prostticos: ferriproto porfirina. Est presente en los eritrocitos. Su peso molecular es de 240 kDa. Se trata de una enzima altamente especfica y cataliza la descomposicin del H2O2 en agua y oxgeno, segn la siguiente reaccin: 2 H2O2 2 H2O + O2El perxido (H2O2) es un producto txico del metabolismo celular; se le clasifica como una especie reactiva de oxgeno (ROS).

CLCULOS:Milimol de H2O2 inicial= (volumen de H2O2 en mL)(Molaridad de H2O2)Milimol de H2O2 sin transformar= (volumen de KMnO4) (Molaridad de KMnO4) 5/2Milimol H2O2 transformado= Milimol de H2O2 inicial - Milimol de H2O2 sin transformarMilimol H2O2 transformado por minuto= Milimol de H2O2 transformado por minuto/5La catalasa es una enzima anti-oxidante, ya que cataliza reacciones protectoras o de la desintoxicacin del H2O2.

En el estudio de la cintica de la catalasa, la determinacin del consumo de H2O2 se har por manganimetra. Esta consiste en titular con permanganato la solucin E+ S+ H2SO4, para determinar la cantidad de H2O2 que ha sido degradado por la catalasa. El permanganato reacciona con el H2O2 remanente que no se logr descomponer. La reaccin redox que se lleva a cabo es la siguiente:5 H2O2 + 3H2SO4+ 2KMnO4 2MnSO4 + 5 O2+ K2SO4 + 8 H2O

Efecto de la concentracin de la enzima [E] sobre la velocidad de reaccin Vara la cantidad de Enzima Se mantienen constantes los siguientes factores: Concentracin del sustrato, T, pH, tiempo de reaccin, presencia de un inhibidor.PROCEDIMIENTO1. Se agrega la solucin de enzima, luego el agua y por ltimo, el sustrato.2. Detener la reaccin, transcurridos 5 minutos con 2,5 mL de H2SO4REACTIVO1234567

Solucin de enzima (mL)0,10,20,40,81,63,26,4

Agua destilada (mL)6,36,26,05,64,83,20

H2O2 (mL)2,52,52,52,52,52,52,5

KMnO4 usado 7,25,0 3,00,50,20,10,1

mmol de H2O2 inicial0,21450,21450,21450,21450,21450,21450,2145

mmol de H2O2 sin transformar0,1980,13750,08250,013755,5x10-32,75x10-32,75x10-3

mmol de H2O2 transformado0,01650,0770,1320,200750,2090,211750,21175

mmol de H2O2 transformado/min3,3 x10-30,01540,02640,040150,04180,042350,04235

EjemploConcentracin de Perxido

Tubo 1Milimol de H2O2 inicialMilimol de H2O2 inicial= (volumen de H2O2 en mL) (Molaridad de H2O2)Milimol de H2O2 inicial=(2,5 mL) (0,0858 M)Milimol de H2O2 inicial= 0,2145 mmolMilimol de H2O2 sin transformarMilimol de H2O2 sin transformar= (volumen de KMnO4) (Molaridad de KMnO4) 5/2Milimol de H2O2 sin transformar= (7,2 mL) (0,011 mmol/mL) 5/2Milimol de H2O2 sin transformar=0,198 mmolMilimol H2O2 transformadoMilimol H2O2 transformado= Milimol de H2O2 inicial - Milimol de H2O2 sin transformarMilimol H2O2 transformado= 0,2145 mmol 0,198 mmolMilimol H2O2 transformado= 0,0165 mmolMilimol H2O2 transformado por minutoMilimol H2O2 transformado por minuto= Milimol de H2O2 transformado /5 minMilimol H2O2 transformado por minuto= 0,0165 mmol/5 minMilimol H2O2 transformado por minuto= 3,3 x10-3mmol/min

Grfica de Velocidad vs Volumen de solucin enzimtica

Velocidad de reaccinVolumen de enzimaCuestionario1. Cul es el orden de la reaccin en este experimento?R/. En ese experimento, la reaccin es de orden 1. La velocidad aumenta en la misma proporcin con la que aumenta la concentracin de la enzima.

2. Cul es la condicin experimental para mantener una lnea recta constante en la grfica de velocidad versus volumen de solucin de enzima? R/. La condicin experimental para mantener una lnea recta constante en la grfica de velocidad vs volumen de solucin de enzima es mantener el suministro de sustrato constante para que la enzima contine trabajando.

3. Si usted obtiene un cambio de inflexin en la curva de velocidad versus volumen de solucin de enzima, Cmo lo explicara? Cmo es la velocidad de este segmento?R/. En la curva se observa una inflexin, luego cambia para hacerse constante. Esto se debe a que el sustrato se acaba en corto tiempo en presencia de una mayor cantidad de enzima, por lo que la velocidad es igual a 0 (VRx= 0). La velocidad NO ES CONSTANTE, no se puede medir en ese tiempo porque se agot el sustrato.

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO

Se debe variar la concentracin del sustrato y mantener el volumen de la enzima constante (0,2mL) y la temperatura constante tambin.

Clculos: mmol de perxido inicial = (volumen de perxido en mL)(molaridad de perxido)mmol de perxido sin transformar= (volumen de KMnO4)(molaridad de KMnO4) 5/2mmol de perxido transformado= mmol de perxido inicial - mmol de perxido sin transformarVelocidad= mmol de perxido transformado /5 min

REACTIVO23456

H2O2 (mL)0.20.40.81.63.2

Agua (mL)12.612.412.011.29.6

Enzima (mL)0.20.20.20.20.2

KMnO4 usado (mL)0.621.22.44.88.5

mmol de H2O2 inicial 0.01720.03430.06860.13730.2746

mmol de H2O2 sin transformar0.01710.03300.06600.13200.2338

mmol de H2O2 transformados0.00010.00130.00260.00530.0408

Velocidad 0.000020.0002640.0005280.0010560.008162

Milimol de H2O2 incialMilimol de H2O2 inicial= (volumen de H2O2) (Molaridad de H2O2) Milimol de H2O2 inicial= (0,2 mL) (0,0858 mmol/mL) 5/2Milimol de H2O2 inicial=0,0172 mmol

Milimol de H2O2 sin transformarMilimol de H2O2 sin transformar= (volumen de KMnO4) (Molaridad de KMnO4) 5/2Milimol de H2O2 sin transformar= (0,62 mL) (0,011 mmol/mL) 5/2Milimol de H2O2 sin transformar=0,0171 mmol

Milimol H2O2 transformadoMilimol H2O2 transformado= Milimol de H2O2 inicial - Milimol de H2O2 sin transformarMilimol H2O2 transformado= 0,0172 mmol 0,0171 mmolMilimol H2O2 transformado= 0,0001 mmol

Milimol H2O2 transformado por minutoMilimol H2O2 transformado por minuto= Milimol de H2O2 transformado por minuto/5Milimol H2O2 transformado por minuto= 0,0001 mmol/5Milimol H2O2 transformado por minuto= 2,0 x10-5mmol/min

Grfica de Velocidad vs Concentracin de sustrato

Obtenga Vmax y Km experimentalmente

Cuestionario:

1. Interprete la forma de la curva experimental obtenidaHiprbola rectangular

2. Cul es el orden de la Rx en los 3 segmentos obtenidos?

[S]Km orden cero (la velocidad es independiente de [s]3

2

1

3. Qu importancia tiene el momento en el cual la velocidad se hace constante e independiente de la concentracin del sustrato?Es el momento en que la enzima est saturada, es decir cuando alcanza su velocidad mxima.

4. Cuando V=Vmax/2, demuestre q Km= [S]V= [S]= Km

Km + [S] = 2 [S]Km= 2 [S] - [S]Km= [S]

5. Cul es la utilidad de la determinacin de Km?a. Defina conceptualmente Km La constante de Michaelis-Menten (smbolo Km) corresponde a la concentracin de sustrato que se alcanxa a la mitad de la velocidad mxima. Es una medida de afinidad de la enzima. El valor de Km es inversamente proporcional a la afinidad.Es UTIL para conocer la afinidad de la enzima.

b. De qu depende Vmax?Depende de la concentracin de la enzima.

c. Cules son los factores que afectan Km y Vmax?[Enzima], temperatura.

6. Utilizando la ecuacin de Michaelis-Menten, interprete dos situaciones:a. Cuando [S]> Km. Cmo es la velocidad de la reaccin enzimtica?

V es constante

EXPERIMENTO #7: Efecto de un inhibidor sobre la velocidad de reaccin

La Derivacin de Lineweaver-Burk es el inverso de la Ecuacin de Michaelis. Esta grfica sirve para saber con qu tipo de inhibidor se est trabajando.

Un inhibidor es una sustancia que afecta la actividad enzimtica de forma negativa. Importancia de los inhibidores: regulan las vas metablicas. Pueden ser:a) Inhibidor competitivo: evita que se forme E-S. Parmetros: > Km, Vmax no vara. Hay un aumento aparente de la Km porque se requiere una mayor cantidad de [S] para alcanzar la Vmax. Ejemplos de estos inhibidores: CN-, H2S, F-.b) Inhibidor no competitivo: cuando se forma el complejo E-I, la enzima cambia de forma, alterando el nmero de sitios catalticos disponibles para el sustrato; por lo que Vmax disminuye. Parmetros: Km no vara, < Vmax. Ejemplos de estos inhibidores: Hg, As, Pb.c) Inhibidor anticompetitivo: el inhibidor se une una vez formado el complejo E-S. Parmetros: < Km y Vmax.

Panel A: Enzima SIN inhibidor.Panel B: Enzima con inhibidor competitivo MAYOR Km, IGUAL Vmax.Panel C: Enzima con inhibidor no competitivo IGUAL Km, MENOR Vmax.Panel D: Enzima con inhibidor acompetitivo MENOR Km y Vmax. Vara la concentracin del inhibidor (KCN). Se mantienen constantes los siguientes parmetros: Sustrato, Enzima, Temperatura, Tiempo.

PROCEDIMIENTO:

1. Se mezclan sustrato e inhibidor, luego se agrega la enzima.2. Se detiene la reaccin a los 5 minutos con 2,5 ml de H2SO4 1,5 M.

ReactivoTUBOS

1234

H2O22,5 mL2,5 mL2,5 mL2,5 mL

ConcentracinDe KCN00,2 mL1x10-4 M0,2 mL1x10-3 M0,2 mL1x10-2 M

Solucin de enzima0,2 mL0,2 mL0,2 mL0,2 mL

mL de KMnO4 usado3,94,24,96,0

mmol de H2O2 inicial0,2310,2310,2310,231

mmol de H2O2 sin transformar0,1070,1160,1350,165

mmol de H2O2 transformados0,1240,1150,0960,066

mmol de H2O2 transformados/min0,02480,02300,01920,0132

% Inhibicin---7,2622,5846,77

Concentracin del Perxido [H2O2] = 8,4 mL KMnO4 x 0,011 mol KMnO4 x 5 mmol H2O2 = 0,0924 M 2,5 mL H2O2 1 mL KMnO4 2 mmol KMnO4

TUBO 1Milimol de H2O2 incialMilimol de H2O2 inicial= (volumen de H2O2) (Molaridad de H2O2) Milimol de H2O2 inicial= (2,5 mL) (0,0924 mmol/mL) 5/2Milimol de H2O2 inicial=0,231 mmol

Milimol de H2O2 sin transformarMilimol de H2O2 sin transformar= (volumen de KMnO4) (Molaridad de KMnO4) 5/2Milimol de H2O2 sin transformar= (3,9 mL) (0,011 mmol/mL) 5/2Milimol de H2O2 sin transformar=0,107 mmol

Milimol H2O2 transformadoMilimol H2O2 transformado= Milimol de H2O2 inicial - Milimol de H2O2 sin transformarMilimol H2O2 transformado= 0,231 mmol 0,107 mmolMilimol H2O2 transformado= 0,124 mmol

Milimol H2O2 transformado por minutoMilimol H2O2 transformado por minuto= Milimol de H2O2 transformado por minuto/5Milimol H2O2 transformado por minuto= 0,124 mmol/5Milimol H2O2 transformado por minuto= 0,0248mmol/min

TUBO 2% Inhibicin = velocidad sin [I] velocidad con [I] x 100Velocidad sin [I]% Inhibicin = 0,0248 0,0230 x 1000,0248%Inhibicin = 7,26

TUBO 3% Inhibicin = velocidad sin [I] velocidad con [I] x 100Velocidad sin [I]% Inhibicin = 0,0248 0,0192 x 1000,0248%Inhibicin = 22,58

TUBO 4% Inhibicin = velocidad sin [I] velocidad con [I] x 100Velocidad sin [I]% Inhibicin = 0,0248 0,0132 x 1000,0248%Inhibicin = 46,77

Cuestionario1. Qu es un inhibidor?Un inhibidor es una sustancia que afecta la actividad enzimtica de forma negativa.2. Interprete la grfica de velocidad versus concentracin del inhibidor.Es una grfica de tipo exponencial, donde a mayor concentracin del inhibidor, menor velocidad de reaccin, casi al punto de sta ser constante.3. Interprete la grfica de porcentaje de inhibicin versus concentracin del inhibidor.Es una grfica de tipo lineal, donde ambos parmetros son directamente proporcionales. Es decir, a mayor [I], mayor % I.4. Cmo har usted, experimentalmente, para demostrar si se trata de una inhibicin competitiva o de una no competitiva?Se realizaran dos experimentos: (1) Con [E] y [S], donde [E] es constante, y [S] vara. (2) Con [E], [S] e [I], donde [E] es constante y [S] e [I] varan. Luego de obtener los resultados se hace la linealizacin de Lineweaver-Burk.5. Cmo varan los parmetros enzimticos en una inhibicin competitiva?Aumenta Km, Vmax no vara.6. Cmo varan los parmetros enzimticos en una inhibicin no competitiva?Km no vara, disminuye Vmax.

Efecto de la Temperatura sobre la velocidad de reaccin El parmetro que variar ser la temperatura Se mantienen constantes los siguientes factores: Concentracin del sustrato (2,5 mL), cantidad de enzima (0,2 mL), pH, tiempo de reaccin, presencia de un inhibidor.PROCEDIMIENTO3. Se agrega la solucin de enzima, luego el agua y por ltimo, el sustrato.4. Detener la reaccin, transcurridos 5 minutos con 2,5 mL de H2SO4REACTIVO12345

H2O2 (mL)2,52,52,52,52,5

Temperatura (C)0243760100

Solucin de enzima (mL)0,20,20,20,20,2

KMnO4 usado 6,83,9 3,65,56,0

mmol de H2O2 inicial0,21450,21450,21450,21450,2145

mmol de H2O2 sin transformar0,1870,10720,0990,15120,165

mmol de H2O2 transformado0,02750,10730,11550,06330.0495

mmol de H2O2 transformado/min0,00550,021460,02310,012660,0099

*Tericamente el consumo de permanganato debe dar 7.8mL (el valor que da el prof. para obtener la concentracin de perxido) y as las moles transformadas deben ser CERO.Concentracin de Perxido

Tubo 3Milimol de H2O2 inicialMilimol de H2O2 inicial= (volumen de H2O2 en mL) (Molaridad de H2O2)Milimol de H2O2 inicial=(2,5 mL) (0,0858 M)Milimol de H2O2 inicial= 0,2145 mmolMilimol de H2O2 sin transformarMilimol de H2O2 sin transformar= (volumen de KMnO4) (Molaridad de KMnO4) 5/2Milimol de H2O2 sin transformar= (3,6 mL) (0,011 M) 5/2 Milimol de H2O2 sin transformar= 0,099 mmolMilimol H2O2 transformadoMilimol H2O2 transformado= Milimol de H2O2 inicial - Milimol de H2O2 sin transformarMilimol H2O2 transformado= 0,2145 mmol - 0,099 mmolMilimol H2O2 transformado= 0,1155 mmolMilimol H2O2 transformado por minutoMilimol H2O2 transformado por minuto= Milimol de H2O2 transformado /5 minMilimol H2O2 transformado por minuto= 0,1155 mmol/ 5 minMilimol H2O2 transformado por minuto=0,0231 mmol/minGrfica de Velocidad vs TemperaturaVT ptima

T

T sub- ptimaT sobre- ptima

Tericamente el tubo que est a 100C debi gastar ms permanganato porque se desnaturaliza la enzima y no se descompone el sustrato. A 37 consumi menos permanganato.Cuestionario1. Interprete la forma de la curva experimental obtenidaR/. La temperatura ptima de la catalasa es 37 ya que se observa que a esta temperatura hay una mayor velocidad, y por lo tanto mayor actividad y efectividad cataltica. Mientras que en los extremos (0 C y 100 C) la actividad enzimtica es bajsima.2. Defina temperatura ptimaR/. La temperatura ptima es aquella en la cual se alcanza la mayor eficacia cataltica, se refleja en que hay mayor velocidad puesto que la enzima tiene una conformacin ptima y degradar al sustrato a la mayor velocidad posible.3. Existen temperaturas sub-ptimas y sobre- ptima, Qu ocurre con la estructura de las enzima en estas temperaturas?a) Temperaturas sub- ptimas (0, 24): Se mengua la actividad de la enzima Su conformacin es diferente a la ptima Falta energa cintica , no hay choques efectivos entre las molculas b) Temperaturas sobre- ptimas (60, 100): Se pierde la conformacin (se pierden las estructuras 2, 3 y 4; solo se conserva la 1) Se desnaturaliza la enzima4. Defina Q10. Calcule la Q10 de la catalasa utilizando sus datos experimentales.R/. La Q10 es la cantidad de veces que cambia la velocidad cuando la T vara en 10 C.

Q10= 1,08 veces

EFECTO DEL TIEMPO SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION

REACTIVO1234567

H2O2 (mL)2.52.52.52.52.52.52.5

Enzima (mL)0.20.20.20.20.20.20.2

Tiempo 3015105310

KMnO4 usado (mL)0.11.71.824.75.66.8*

mmol de H2O2 inicial 0.21450.21450.21450.21450.21450.21450.2145

mmol de H2O2 sin transformar0.00280.04680.04950.05500.12930.15400.1870

mmol de H2O2 transformados0.21180.16780.16500.15950.08530.06050.0275

Velocidad 7.06 x10-31.68 x10-21.10 x10-23.19 x10-22.84 x10-26.05 x10-20

Curva de progreso de la reaccin (mmol de H2O2 descompuesto vs tiempo de reaccin)

mmol de H2O2 descompuesto

0 15 30Tiempo de Rx (min)

VelocidadGrfica de velocidad vs tiempo

Tiempo de Rx (min)

CUESTIONARIO1. Qu significado tiene la pendiente de la grfica 1?R/. La pendiente representa la velocidad de reaccin

2. Calcule dos pendientes de la grfica 1

0,0124 mmol/ min

5, 6 x10-4 mmol/ min

3. Cmo vara la pendiente con el avance de la reaccin?R/. A medida que avanza la reaccin, la pendiente va disminuyendo al igual que la velocidad.

4. Interprete la grfica 2 y relacione con su respuesta a la pregunta 3