Revista Asebir junio 2009

Jun

io 2

009

Vol

.14

· N

º1

REVISTA

ASOCIACIÓN PARA EL ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN

ACTUALIDADLa importancia de una buena prácticaen “PGS”.

ARTÍCULOSEstudio Genético Preimplantacional en pacientes portadores de translocaciónRobertsoniana (13;14).

Las apariencias a veces engañan, laverdadera belleza está en el interior.

Fundamentos de criobiología espermáticapara bancos de semen.

DEBATE“Turismo reproductivo”, NO. “Flujo depacientes”, SI.

Reproductive Tourism.

Flujo de pacientes entre países. ¿quésabemos de ello?

V CONGRESO NACIONAL DE ASEBIRPROGRAMA CIENTIFICO

FORMACIÓN CONTINUADAPapel de los factores solubles enfoliculogénesis.

CALENDARIONOTICIASBOLETÍN DE INSCRIPCIÓN

af.cubierta:Maquetaci n 1 25/06/2009 14:09 PÆgina 3

SUMARIO

Í N D I C E

EDITAAsociación para el Estudio de la Biología

de la Reproducción (ASEBIR).

JUNTA DIRECTIVAPresidente: Mark Grossmann i Camps.

Vicepresidenta: Mª Victoria Hurtado

de Mendoza.

Secretaría: Nieves Cremades Fernández

Tesorero: Manuel Ardoy Vilches

Vocalía de Docencia y Formación: Jorge

Martín Cuadros Fernández, Montserrat

Boada Palá.

Vocalía del Sitio Web: Jorge Ten Morro,

Fernando Marina Rugero.

Vocalía de Publicaciones: María Bonada

Sanjaume, Antonio Urries López.

Vocalía de Congresos: Mª José de los

Santos Molina, Begoña Arán Corbella,

Nieves Cremades Fernández.

Vocalía de Relaciones Públicas: Fernando

Marina Rugero, Jorge Ten Morro.

COORDINACIÓNMaría Bonada Sanjaume,

Antonio Urries López.

PUBLICIDAD YCOLABORACIONESSecretaría ASEBIR

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Depósito legal: M-18873-1996

ISSN: 1136-4424

Soporte válido: 78-R-CM

EDITORIAL 3Mark Grossmann i Camps y M. Victoria Hurtado de Mendozay Acosta.

ACTUALIDAD 4La importancia de una buena práctica en “PGS”.Esther Fernández García

ARTÍCULOS 7Estudio Genético Preimplantacional en pacientes portadores detranslocación Robertsoniana (13;14).Hebles, M.; Dorado, M.; Migueles, B.; González, M; Aguilera, L.;Núñez, G.; Lara, J.; Rodríguez, A.; Sánchez, F. y Sánchez, P.

Las apariencias a veces engañan, la verdadera belleza está en elinterior.Olmedo Illueca, C.; Lozano Zamora, M.; Iñiguez Tornero, J.y Cuevas Sáiz, I.

Fundamentos de criobiología espermática para bancos de semen.Fernández,A.; Gonzalvo,C.; Clavero,A.; Ruiz de Assín,R.;Zamora,S.; Roldán,M.; Rabelo,B.; Ramírez,J.P.; Yoldi,A.;Castilla,J.A."

DEBATE 28“Turismo reproductivo”, NO. “Flujo de pacientes”, SI.Xavier Orriols y Montse Boada. Servicio de Medicina de laReproducción. Institut Universitari Dexeus.

Reproductive Tourism.Bonnie Collins. Laboratory Manager. Centre for ReproductiveMedicine, St Bart's Hospital. London.

Flujo de pacientes entre países. ¿qué sabemos de ello?Marta Tresanchez y Montserrat Boada. Servicio de Medicina de laReproducción. Institut Universitari Dexeus.

V CONGRESO NACIONAL DE ASEBIR. PROGRAMA CIENTIFICOPRELIMINAR 32

FORMACIÓN CONTINUADA 37Papel de los factores solubles en foliculogénesis.Paloma Sánchez-Aparicio, Sierra Muñoz-García, Jorge Cuadros

CALENDARIO 44NOTICIAS 46BOLETÍN DE INSCRIPCIÓN 49

Junio 2009 Vol. 14 · Nº1SUMARIO Pág.

af.interior:Maquetaci n 1 25/06/2009 14:11 PÆgina 1

E D I T O R I A L

Junio 2009 Vol. 14 · Nº 1

APUESTA POR LA FORMACIÓN CONTINUADA

QUERIDAS/OS COLEGAS:

Está escrito en los estatutos de nuestra asociación, está reflejado en las intervenciones de los socios durante las asambleasordinarias y está presente en nuestra mente como una prioridad de esta Junta Directiva: potenciar la formación.

Y ¿cómo lo hacemos? Bien, pues trabajando duro en cuatro frentes:Cuadernos ASEBIR de Embriología Clínica. Gracias al trabajo de los grupos de interés hemos revisado los dos cuadernos que yateníamos publicados, de manera que ahora están actualizados y disponibles en formato digital desde la zona restringida de nuestraWeb. Quedarnos aquí sería quedarse corto, a medias, y por ello nos proponemos exprimir más nuestras energías y publicar otros doscuadernos en los próximos meses, y conseguir que la colección de Cuadernos ASEBIR sea una herramienta de consulta imprescindiblepara los embriólogos.

Jornadas de Formación ASEBIR sobre Reproducción Asistida. Por primera vez nuestra asociación ha organizado una actividadformativa completamente desvinculada del congreso. En esta ocasión escogimos adrede dirigirnos a los embriólogos júnior y ofrecerconocimientos básicos en andrología, embriología y legislación, en una única jornada que se repitió en Barcelona, Madrid y Sevilla,con lleno “hasta la bandera”.

Para nosotros es un placer (y también un orgullo) comunicaros que esta actividad formativa fue un éxito en las tres sedes, y que comoefecto colateral nos proporcionó un considerable número de nuevos socios/as en el colectivo de estudiantes y recién licenciados.Asimismo, mediante las encuestas de satisfacción realizadas a los asistentes, hemos constatado el estado tan saludable de ASEBIRjoven ya que hay un gran interés porque las Jornadas se repitan, tengan una mayor duración y se han propuesto numerosos temasde interés a desarrollar en próximas ediciones.

A parte de estas Jornadas propias, ASEBIR y SEF han auspiciado e intervenido en una Jornada de controversias sobre DGP celebradaen Málaga, el pasado 8 de Mayo, ya que la formación no es una exclusiva nuestra, obviamente.

Artículos de Formación Continuada en la Revista. Igualmente satisfechos estamos de la calidad de los artículos que se publican enla sección FC. La actividad decana en formación dentro de ASEBIR cumple con creces su función y nos aporta novísimos conocimientosen cada entrega gracias a la selección de autores que realiza la vocalía de Formación. Por ello queremos crear un espacio en nuestraweb para agrupar los últimos artículos de Formación Continuada publicados en la revista.

Congreso. El propio congreso es, por definición, una actividad formativa de primer orden. Y en el entorno del próximo congresoASEBIR (¿tenéis ya la inscripción hecha, verdad?) esperamos que el grupo de interés en Diagnóstico Genético Preimplantacionaldesarrolle el primer taller formativo sobre técnicas de biopsia y fijación. De hecho, los grupos de interés son el alma mater de laactividad asociativa y por lo que al DGP se refiere, en la sección Actualidad de este mismo número de la revista podréis leer suopinión sobre el recientemente instaurado debate a favor/en contra del screening de aneuploidías (PGS).

Todo este trabajo no sería posible, antes lo hemos dicho y ahora lo repetimos, sin el esfuerzo desinteresado de los miembros de losgrupos de interés, también los autores que nos han brindado su tiempo y sus conocimientos, de los ponentes que se prepararon lascharlas y la participación de nuestros patrocinadores que, a pesar de estar inmersos en un año de crisis, nos han mantenido suapoyo. A todos ellos muchas gracias.

¿Y qué más? Consideramos que nuestra formación ha de ser integral, no limitarse a lo puramente técnico, hemos de conocer el porqué, cómo, cuándo, de qué forma y qué trascendencia tienen nuestros actos. Si os fijáis, buena parte de esta actividad formativaque estamos desarrollando está centrada en la embriología clínica. Eso es bueno, pero no debemos olvidar nuestro alter ego ysomos conscientes que la formación básica en biología de la reproducción y en bioética son áreas en las que deberíamos adentrarnosen proyectos futuros.

La revista y los boletines digitales ofrecerán información del desarrollo de todos estos proyectos, pero es en la página web dóndeencontraréis todos los detalles actualizados. Estamos reformando este espacio digital: esperamos que os sea agradable y útil, y osanimamos a usar el foro como lugar virtual de consulta y debate.

Atentamente,Mark Grossmann i Camps M. Victoria Hurtado de Mendoza y AcostaPresidente Vice-presidenta

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A C T U A L I D A D

Esther Fernández García et al. La importancia de una buena práctica en “PGS”

GRUPO DE INTERÉS DE DGP-ASEBIR

En estos últimos meses, todos hemosasistido a la crítica feroz a que ha sidosometida la técnica de DGP para eldespistaje de aneuploidías quefrecuentemente vemos referenciadocomo PGS (del inglés, preimplantationgenetic screening). Han sido varios losartículos que han querido poner demanifiesto la “no utilidad” de estatécnica en el campo de la reproducciónhumana. Lo más llamativo no ha sido lapublicación casi al unísono de estosartículos, sino la buena aceptación quehan tenido por parte de losprofesionales de la Reproducción, sinprofundizar en el diseño, la metodologíao los resultados clínicos de los mismos.Estas técnicas, asociadas a la FIV, quellevan practicándose durante más de 15años, en unos meses han sidodesechadas sin contemplaciones.

Como no podía ser de otro modo, desdeel Grupo de Interés en DGP de ASEBIRhemos revisado estos estudios en los quese concluía que la selección deembriones cromosómicamente normales,para un numero cromosomas, nomejoraba las tasas de embarazo por ciclopara las indicaciones de edad maternaavanzada, fallo repetido deimplantación o en pacientes de buenpronóstico de FIV.

Debido a la trascendencia que hantenido estas afirmaciones para aquellos que practicamos la medicina reproductiva, nuestro primerplanteamiento fue responder de unamanera constructiva mediante una cartaal editor, que en estos momentos estáaceptada para su publicación (HUMANREPRODUCTION, 2009), en la quehacemos hincapié en la importancia que“una buena práctica” puede tener en losresultados finales del PGS.

Dentro de la metodología utilizada enlos estudios prospectivos randomizadospublicados encontramos tres aspectosbásicos que merecen una revisión crítica:

- el análisis genético realizado: enalgunos de los trabajos publicadosencontramos una elevada incidencia deembriones no-informativos o sindiagnóstico, en concreto en el trabajo deMastenbroek y colaboradores (2007)este porcentaje se eleva al 20% y sólo enun 50% de las pacientes del grupo de“PGS” se transfieren únicamenteembriones informativos para loscromosoma analizados, por lo que elposible beneficio de la técnica se veenmascarado por la transferencia deembriones sin diagnóstico. Por otrolado, en estos trabajos también seobserva la ausencia de cromosomas muyrelevantes como el cromosoma 15 y 22,que aparecen frecuentemente implicadosen las aneuploidías observadas enabortos espontáneos. La ausencia deanálisis de estos cromosomas disminuyela detección de aneuploidías del 85% al27%. Además, para obtener undiagnóstico lo más preciso posible, losgrupos con mayor experienciarecomiendan rehibridar con sondassubteloméricas, que marcan otra regióndel cromosoma, aquellos blastómeroscon monosomías o señales dudosas,permitiendo diferenciar una monosomíareal de un solapamiento de doscromosomas homólogos, consiguiendoun diagnóstico de aquellas señalesdudosas. Mediante estas rehibridacionesse aumenta la eficiencia y la precisión dela técnica.

- la biopsia, la fijación y cultivoembrionario posterior: un aspectoimprescindible para la aplicación del“PGS” es disponer de un laboratorio deFIV en que esté optimizado el cultivoprolongado de embriones, ya que en el

DGP de forma frecuente la transferenciase realiza en estadio de blastocisto, trasobtener los resultados del análisisgenético. Recientemente se hapublicado un trabajo (Beyer et al., 2009)en el que se describe la notable mejoraen los resultados de “PGS” en mujeres deedad avanzada, con el cambio de lascondiciones de cultivo en el laboratorio.Por otro lado, la técnica de biopsiaembrionaria debe aplicarse por manosexpertas para que la manipulación delembrión tenga un efecto mínimo en suviabilidad y posterior capacidad deimplantación. Como ejemplo de lo queno puede ocurrir, tenemos el trabajopublicado por Mastenbroek ycolaboradores en 2007, donde se puedeobservar una disminución en la tasa deimplantación de los embrionesbiopsiados respecto a los controles del50%. La fijación del núcleo de la célulabiopsiada también es crucial para el PGSmediante FISH, pues una fijacióndeficiente puede dar lugar a unincremento de fallos de hibridación(quedando así núcleos, y por tantoembriones, sin diagnóstico) y a unmayor solapamiento de señales,incrementando así el número de falsasmonosomías, e introduciendo posibleserrores diagnósticos.

- y por último consideramos muyimportantes los criterios de inclusión depacientes en los diferentes estudios:este aspecto llama sobre todo laatención en los trabajos de edadmaterna avanzada donde hay autoresque ya engloban bajo esta etiqueta amujeres ≥ 35 años (Mastenbroek et al.,2007; Schoolcraft et al., 2008).Consideramos que este límite habría queestablecerlo a partir de los 40 años,edad a partir de la cual una FIVconvencional ofrece tasas de embarazomás bajas con mayor riesgo de aborto yde descendencia aneuploide. Sobre este

LA IMPORTANCIA DE UNA BUENA PRÁCTICA EN “PGS”4

“El diagnóstico genético preimplantacional no hace que el embrión sea mejor”(Don Leigh, 9th Internacional Conference on Preimplantation Genetics, Miami 2009)

Esther Fernández García, Carles Gimenez i Sevilla, Mónica Parriego i Beltran, Carmen Rubio Lluesa, Lorena Rodrigo Vivo, Xavier Vendrell Montón,Esther Velilla i Garcia. Grupo de Interés de DGP-ASEBIR


A C T U A L I D A D


último aspecto, se pasan por alto enestos trabajos las interrupcionesvoluntarias de embarazo que serealizaron en pacientes con gestacionesaneuploides en las que no se habíarealizado “PGS” así como la actitud de laspacientes ante una gestación anormal.En dos trabajos recientes se hapublicado que el 84% de las pacientes deriesgo encuestadas se inclinaban haciael “PGS” para prevenir futurasgenstaciones con Síndrome de Down(Twisk et al., 2007; Shahine el al., 2007).). Finalmente, si el DGP no es necesario,¿por qué llevarlo a cabo en pacientes conbuen pronóstico de FIV? (Staessen et al.2008, Jansen et al. 2008).

Con todo ello nos gustaría invitaros areleer los estudios prospectivosrandomizados publicados sobre “PGS”con una visión crítica del diseño y de lametodología empleada y animaros avalorar la importancia de la experiencia

y de la buena práctica en el éxito de esta técnica.

REFERENCIAS - Blockeel C, Schutyser V, De Vos A, VerpoestW, De Vos M, Staessen C, Haentjens P, Van derElst J, Devroey P. Prospectively randomizedcontrolled trial of PGS in IVF/ICSI patientswith poor implantation. Reprod BiomedOnline 2008; 17: 848-54.

- Beyer CE, Osianlis T, Boekel K, Osborne E,Rombauts L, Catt J, Kralevski V, Aali BS, GrasL. Preimplantation genetic screeningoutcomes are associated with cultureconditions. Hum Reprod. 2009, Jan 30.[Epub ahead of print].

- Debrock S, Melotte C, Spiessens C, PeeraerK, Vanneste E, Meeuwis L, Meuleman C,Frijns JP, Vermeesch JR, D’Hooghe TM.Preimplantation genetic screening foraneuploidy of embryos after in vitrofertilization in women aged at least 35years:

a prospective randomized trial. Fertil Steril.2009 Feb 25. [Epub ahead ofprint] PubMed PMID: 19249029.

- Hardarson T, Hanson C, Lundin K, HillensjöT, Nilsson L, Stevic J, Reismer E, Borg K,Wikland M, Bergh C. Preimplantationgenetic screening in women of advancedmaternal age caused a decrease in clinicalpregnancy rate: a randomized controlledtrial. Hum Reprod 2008; 23: 2806-12.

- Jansen RP, Bowman MC, de Boer KA, LeighDA, Lieberman DB, McArthur SJ. What nextfor preimplantation genetic screening(PGS)? Experience with blastocyst biopsyand testing for aneuploidy. Hum Reprod2008; 23: 1476-8.

- Mastenbroek S, Twisk M, van Echten-Arends J, Sikkema-Raddatz B, Korevaar JC,Verhoeve HR, Vogel NE, Arts EG, de Vries JW,Bossuyt PM, Buys CH, Heineman MJ, ReppingS, van der Veen F. In vitro fertilization with

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A C T U A L I D A D

Esther Fernández García et al. La importancia de una buena práctica en “PGS”

preimplantation genetic screening. N Engl JMed 2007; 357: 9-17.

- Mersereau JE, Pergament E, Zhang X, MiladMP. Preimplantation genetic screening toimprove in vitro fertilization pregnancyrates: a prospective randomized controlledtrial. Fertil Steril 2008; 90: 287-9.

- Meyer LR, Klipstein S, Hazlett WD, Nasta T,Mangan P, Karande VC. A prospectiverandomized controlled trial ofpreimplantation genetic screening in the “good prognosis” patient. Fertil Steril2008: Sep 17.

- Rubio C, Giménez C, Fernández E, VendrellX, Velilla E, Parriego M, Rodrigo L. Theimportance of good practice inpreimplantation genetic screening: criticalviewpoints. Hum Reprod 2009, In press.

- Schoolcraft WB, Katz-Jaffe MG, Stevens J,Rawlins M, Munne S. Preimplantation

aneuploidy testing for infertile patients ofadvanced maternal age: a randomizedprospective trial. Fertil Steril 2008; Aug 8.[Epub ahead of print]- Shahine LK, Kuppermann M, Davis G,Creasman J, Cedars MI. Patient willingnessto participate in a clinical trial withpreimplantation genetic diagnosis. FertilSteril 2008; 89: 879-84.

- Staessen C, Platteau P, Van Assche E,Michiels A, Tournaye H, Camus M, Devroey P,Liebaers I, Van Steirteghem A. Comparisonof blastocyst transfer with or withoutpreimplantation genetic diagnosis foraneuploidy screening in couples withadvanced maternal age: a prospectiverandomized controlled trial. Hum Reprod2004; 19: 2849-58.

- Staessen C, Verpoest W, Donoso P,Haentjens P, Van der Elst J, Liebaers I,Devroey P. Preimplantation geneticscreening does not improve delivery rate in

women under the age of 36 following single-embryo transfer. Hum Reprod 2008;23:2818-25.- Twisk M, Haadsma ML, van der Veen F,Repping S, Mastenbroek S, Heineman MJ,Bossuyt PM, Korevaar JC. Preimplantationgenetic screening as an alternative toprenatal testing for Down syndrome:preferences of women undergoing in vitro fertilization/intracytoplasmic sperminjection treatment. Fertil Steril 2007; 88:804-10. Fertil Steril 2008; 90:1287-9.

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INTRODUCCION

Las translocaciones estructuralescromosómicas son comunes en lapoblación humana (Nielsen and Wohlert,1991). Dentro de las translocacionesestructurales, las más frecuente son lastranslocaciones Robertsonianas, conuna frecuencia de 1 caso cada 1000nacidos (Gardner and Sutherland,1996).Esta proporción se ve aumentada en elcaso de los varones estériles estandoasociadas a casos de oligospermia(Chandley, 1998).

La translocación Robertsonianas fuedescrita en 1916 por W. Robertson yrepresenta la fusión pericéntrica entre 2cromosomas acrocéntricos , es decir,entre los cromosomas 13,14,15,21 y 22.El resultado es un único cromosomaanómalo, generalmente dicéntrico,

conteniendo el brazo largo de loscromosomas implicados con pérdida delos brazos cortos (R.J.M. Gardner, G. R.Sutherland. 2º ed. New Cork; 1996 ). Lascombinaciones más frecuentes son entrelos cromosomas 13 y 14 y entre loscromosomas 14 y 21. La translocación(13;14) es la más frecuente, con unaincidencia de 0.7 cada 1000 nacidos(Nielsen and Wohlert, 1991).

Las translocaciones Robertsonianaspueden ocurrir de novo enaproximadamente el 50% de los casos, oser trasmitida por los progenitores.Como consecuencia de este tipo detranslocaciones se puede ver afectada la fertilidad, observándosedistintos grados de oligo-asteno-teratozoospermias, y/o el desarrollo delembarazo, debido a una posiblealteración de la gametogénesis y/o a la

producción de gametos con unacombinación no balanceada. Un zigotono balanceado puede presentarmonosomía o trisomía.

El uso combinado del análisisespermático por técnica de fluorescenciain situ (FISH) junto al diagnósticogenético preimplantacional (DGP), es degran utilidad en parejas portadoras dedicha translocación.

El análisis espermático por FISH puedeser de gran utilidad para describir laproporción de gametos anormales enhombres portadores de unatranslocación Robertsoniana, así comopara prever la segregación espermática(Estop et al., 1996; Blanco et al., 1998).

El PGD, desarrollado para el tratamientode parejas con riesgo de trasmitir

ESTUDIO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL EN PACIENTESPORTADORES DE TRANSLOCACIÓN ROBERTSONIANA (13;14)PREIMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS OF ROBERTSONIAN TRASLOCATION CARRIERS

Hebles, M.; Dorado, M.; Migueles, B.; González, M; Aguilera, L.; Núñez, G.; Lara, J.; Rodríguez, A.; Sánchez, F. y Sánchez, P.Clínica Ginemed. C/ Farmacéutico Murillo Herrera, nº 3. 41010 . Sevilla .Correo electrónico: mhebles@ ginemed.es

Junio 2009 Vol. 14 · Nº 17

A R T Í C U L O I

RESUMEN

En pacientes portadores de translocaciones Robertsonianas (13;14) se observa una mayor tasa de abortos. El análisiscromosómico de los espermatozoides por FISH en estos pacientes, describe la proporción de espermatozoides normales quenos podemos encontrar en el eyaculado de los mismos. Esta proporción se ajusta al número de pre-embriones normales quese obtienen en estas parejas tras someterlas a un ciclo de Fecundación in Vitro y posterior diagnóstico genéticopreimplantacional.

El objetivo del presente trabajo es establecer la relación entre el análisis cromosómico de los espermatozoides por FISH y latasa de pre-embriones genéticamente normales en pacientes portadores de una traslocación Robertsoniana (13;14).

SUMMARY

There is a higher miscarriage rate in patients with robertsonian translocations. The chromosomal analysis by FISH in thespermatozoa of these patients describes the percentage of normal spermatozoa that we can find in the ejaculate. From therelevant literature it has been shown that this proportion is comparable to the rate of normal embryos that can be found in apreimplantation genetic diagnosis IVF cycle.

The aim of this study is to determine the correlation between the chromosomal analysis of spermatozoa by FISH and thepercentage of chromosomically normal embryos analysed by PGD in an IVF cycle in patients with Robertsonian translocations.


alteraciones genéticas a susdescendientes, nos permite la selecciónde embriones no afectos, siendo unaalternativa al diagnóstico prenatal.

En el presente trabajo, exponemos laexperiencia en dos ciclo de PGD porvarón portador de una translocaciónRobertsoniana entre los cromosomas 13y 14. La segregación meiótica de loscromosomas 13 y 14 fue analizada en los embriones, y comparada con las anomalías observadas en losespermatozoides.

MATERIAL Y METODOS

El estudio fue realizado a dos parejas queacudieron a la Unidad de Reproducciónde la clínica Ginemed, tras varios añosde esterilidad y abortos repetidos enambos casos.

Tras la anamnesis inicial de la pareja,fueron solicitadas pruebas hormonales,serológicas así como cariotipo a ambosmiembros de la pareja y estudio seminalal varón.

El cariotipo en sangre periférica se realizóen la Unidad de Genética de la ClínicaGinemed mediante cultivo de linfocitos enmedio PB-Max y tinción de bandas G.

El estudio seminal se realizó en laUnidad de Andrología según protocolode la Organización Mundial de la Salud(OMS-99).

La paciente 1 tenía 36 años de edad. Supareja, con 38 años, presentaba uncariotipo con una translocación entre loscromosomas 13 y 14: 45 XY, t (13,14)(q10;q10) . Tras el análisis espermático fuediagnosticado de oligo- teratozoospermiasevera y astenozoospermia moderada.

La paciente 2 presentaba 38 años deedad, y su pareja, con 37 años eraportador de una translocación entre loscromosomas 13 y 14: 45 XY, t(13;14)(q10;q10). En este caso, el varón presentaba un recuento y una motilidad espermática normal con unateratozoospermia severa.

En ambos casos, las mujerespresentaban un cariotipo 46 XX, y era elprimer ciclo de Fecundación in Vitro alque se sometían tras haber sufrido 2

abortos en el primer caso y 3 en lasegunda pareja.

ANALISIS DE FISH EN ESPERMATOZOIDES

El FISH en espermatozoides se realizósegún protocolo estándar (Munné et al,1998), empleando una mezcla dehibridación que contiene un IndicadorLocus Específico (LSI) para elcromosoma 13, visualizándose a la luznaranja, y teloméricas para 14q en elespectro verde.

Las muestras seminales fueron fijadascon la mezcla metanol: acético 3:1.Posteriormente, los portas con lasmuestras fijadas fueron incubados en lasolución dithiothreitol (DDT)/ Triton X-100 al 1%. A continuación se realizó unahibridación con mezcla de sonda paralos cromosomas 13 y 14.

Los portas con las muestras fueronobservados en un microscopio defluorescencia (Nikon E-400) con losfiltros apropiados para la visualizaciónde los cromosomas.

ESTIMULACIÓN OVÁRICA

En ambos casos se realizó unaestimulación ovárica utilizando unprotocolo largo tras un mes de reposoovárico con anticonceptivos. Para lasupresión se ha utilizado análogos de laGnRH (Synarel diario ®) desde la mitadde la fase lútea previa a dosis de 1pulverización cada 12 horas intranasal.Según los niveles séricos de FSH, LH yestradiol y en función de la edad de lapaciente se fijan las dosis deestimulación ovárica con hormonafolículo estimulante (FSH) (Gonal-F ®) YMenotropina (HMG Lepori ®). Laadministración de estos se individualizade acuerdo al control ecográfico delciclo. El criterio para la administraciónde la hormona gonadotrófica humana(1000 UI HCG) (HCG Lepori ®) es lapresencia de al menos dos folículos de 16mm. De diámetro. La administración deaGnRH y FSH se suspende el día de laadministración de la HCG.

Las punciones se realizaron a las 36horas de la administración de la HCG porvía vaginal ecoguiada.

Las muestras usadas para ICSI se

prepararon mediante combinación dedos procedimientos: gradientes dedensidad en capas de 0.3 a 1 ml de 40%y de 0.3 a 1 ml de 80% de Sperm Grad(Vitrolife ®) y Ham F-10 (Gibco) congentamicina, seguido por un swim-upusando como medio final Gamete(Vitrolife ®).

La microinyección se realizó entre las 3 y6 de la captación oocitaria descrita endetalla por Svalander et al. Previamenteel cúmulo fue eliminado con HYASE 10 enG-Mops en microgotas de 25 μL durantesegundos y finalmente pasando repetidasveces por micropipetas de distintodiámetro en G-Mops. La fecundación deevaluó a las 16-20 horas. Alos tres días dela punción se evaluaron los pre-embriones, realizándose la biopsia enaquellos donde estaba indicado.

DIAGNOSTICO GENETICO PREIMPLANTACIONAL

Pareja 1: Se procedió a la biopsia de 4pre-embriones que en día +3 estaban enestadío de ocho células.

Pareja 2: Se biopsiaron un total de 12pre-embriones que en día +3 tenían unnúmero de células mayor de 6.

Una célula por embrión fue biopsiadas yporteriomente fijada según la técnica deTarkoswky(1996) : metanol:acético (3:1).Una vez fijadas las blastómeras, fueronanalizadas por FISH, estudiándose loscromosomas 13, 16, 18, 21, X e Y.

RESULTADOS

Tras la realización del FISH en lasmuestras seminales de ambos pacientesse obtuvieron los siguientes resultados:en la pareja 1 se observó que un 5.62%de los espermatozoides estudiadospresentaban disomía para el cromosoma13 y un 6.78% de los espermatozoideseran disómicos para el cromosoma 14.Para la pareja 2 se observó que un 6.52%de los espermatozoides eran disómicospara el cromosoma 13 y un 7.82% deellos presentaban disomías para elcromosoma 14 (Tabla 1).

Respecto a los pre-embrionesbiopsiados, a la pareja 1 se lebiopsiaron un total de 4 pre-embrionessiendo 3 de ellos equilibrados y 1desequilibrado.

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A R T Í C U L O I

Hebles, M. et al. Estudio Genético Preimplantacional en pacientes portadores de translocación Robertsoniana (13;14)


A R T Í C U L O I

A la pareja 2 se le biopsiaron un total de12 pre-embriones, con 5 de ellosequilibrados y un pre-embriónequilibrado pero no informativo para elcromosoma 16. (Tabla 2).

Las aneploidías para los cromosomasimplicados fueron monosomías para elcromosoma 14 y monosomías/trisomíaspara el cromosoma 13.

Un 75% de los preembriones analizadosen el caso de la paciente 1 y un 66% en elcaso de la paciente 2 no presentabananomalías en los cromosomas implicadosen la translocación. Esto es similar a la anomalías detectadas en losespermatozoides en ambos casos (78.4%en la pareja 1 y 72% en la pareja 2).

En ambos casos se realizó unatransferencia de 2 pre-embriones,criopreservándose los restantes por latécnica de vitrificación , según protocolode Kuwayama M.( Kuwayama M., 2007).

DISCUSIÓN

El análisis espermático por FISH nos dainformación acerca de la proporción deespermatozoides normales en pacientesportadores de anomalías cromosómicas.Mediante este análisis también podemospredecir la proporción de gametos conanomalías que nos vamos a encontrartras la realización de un ciclo defecundación in Vitro y posteriordiagnóstico preimplantacional.

Los pre-embriones resultantes de lafecundación de espermatozoidesportadores de una translocaciónrobertsoniana entre los cromosomas 13y 14 pueden ser portadores decromosomas derivados dicéntricos quese han formados como consecuencia deroturas en los brazos cortos de amboscromosomas ( Han JY, et al). Estos pre-embriones, si no son analizados, puedendar lugar a abortos repetidos.

Mediante la combinación de un ciclo deFecundación in Vitro seguido de undiagnóstico Genético Preimplantacional,se realiza una selección de aquellos pre-embriones “normales” o equilibrados,pudiendo evitar así el aborto que sufrenestas parejas.

En nuestro estudio tras el análisis delPGD se observa que aunque el número degametos equilibrados en ambos casos(75% y 66%) es comparable con laproporción de espermatozoidesnormales en el eyaculado (78.4% y71.66). Otras anomalías de los pre-embriones pueden ser debidas a factoresoocitarios y/o efectos post-meióticos.

Este trabajo muestra que la proporciónde pre-embriones anormales debido a la

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Tabla 1. – Análisis espermático.

Tabla 2. Resultados del PGD


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Hebles, M. et al. Estudio Genético Preimplantacional en pacientes portadores de translocación Robertsoniana (13;14)

translocación Robertsoniana (13;14) es similar a la proporción deespermatozoides anormales encontradosen los varones portadores de latranslocación. Así, el análisis espermáticomediante la técnica de FISH sería de granutilidad para predecir el número depre-embriones normales que nosencontraríamos tras la realización de unciclo de Fecundación in Vitro en parejasportadoras de la translocación. Esto nospermite que mediante una prueba sencillay barata, orientar a las parejas sobre elnúmero de pre-embriones sin anomalíasque se podrían esperar tras un tratamientode reproducción asistida. En aquellos casosen los que el número de espermatozoidescon anomalías sea muy alto, se puedeindicar el uso de un semen de donante.

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A R T Í C U L O I I

INTRODUCCIÓN

La reproducción asistida se haconvertido en la única esperanza paramuchas parejas con problemas deinfertilidad. Sin embargo, esta técnicaresulta ineficiente, ya que tan solo entreun 10-30% de todos los embriones quese transfieren al útero maternoimplantarán y acabarán en embarazoevolutivo (Lieberman et al., 2001).

Muchos son los factores involucrados enla llegada a término del embarazo, perosin duda el protagonista de esta historiaes el embrión. El embrión humanodebido a su gran plasticidad es capaz deevolucionar incluso en condicionessubóptimas. Sin embargo esto podríatener ciertos costes, siendo una de lasprincipales causas de los fallos deimplantación en las técnicas de FIV.

Hasta hace relativamente poco tiempo laselección del embrión/es a transferir

estaba basada únicamente en criteriosmorfológicos. Estos parámetros, a pesarde tener la ventaja de ser no invasivos,tienen el inconveniente de ser a vecesinexactos y subjetivos. En los últimosaños, técnicas como la metabolómica y laproteómica son capaces de aportarinformación clínica importante acerca delos cambios que acontecen en elambiente del embrión. Con la creación delas ``ómicas´´ podremos identificarnuevos marcadores de viabilidadembrionaria no invasivos. Sin embargo,a día de hoy, se hace necesarioacompañar estas nuevas herramientascon criterios morfológicos paraseleccionar un embrión. Pero en un futurono muy lejano quizá podamos elegir unsolo embrión sin tener que fijarnosúnicamente en su aspecto. Porque lasapariencias a veces engañan….

METABOLÓMICA

La morfología de un embrión tiene un

valor predictivo limitado para determinarsu viabilidad y posibilidad de darembarazo, por lo que se necesitan nuevasherramientas que nos conduzcan a latransferencia embrionaria única (SET).

Una aproximación hacia el problema dela evaluación de la viabilidadembrionaria sería la valoración del perfilmetabólico del medio de cultivoconsumido por el embrión. Es lógicopensar que el metabolismo de unembrión sano podría alterar el medioque le rodea de forma distinta que unomenos sano y por lo tanto con menorpotencial implantatorio. El perfilmetabólico debería ofrecer la ventaja deevaluar de forma simultánea un grannúmero de analitos en el medio, yproducir un perfil que podría estarasociado con la viabilidad embrionaria.Se ha obtenido recientemente el perfilmetabólico del cultivo de embrioneshumanos mediante espectroscopíaRaman o NIR (Near-infrared

LAS APARIENCIAS A VECES ENGAÑAN, LA VERDADERA BELLEZAESTÁ EN EL INTERIOR.YOU CAN´T JUDGE A BOOK BY ITS COVER, TRUE BEAUTY IS WITHIN.

Olmedo Illueca, C.; Lozano Zamora, M.; Iñiguez Tornero, J. y Cuevas Sáiz, I. Consorcio Hospital General Universitario de Valencia (Unidad de Reproducción Humana). Avda / Tres Cruces s/n ValenciaCorreo electrónico: [email protected]

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RESUMEN

La evaluación de embriones mediante criterios morfológicos ha sido hasta ahora la única herramienta fiable de selección. Sinembargo, los avances en técnicas de biología molecular como la proteómica o la metabolómica nos permiten descubrir nuevosmétodos que, acompañados de los criterios morfológicos, nos permitan escoger los embriones con mayor potencial deimplantación. Con ello, no sólo conseguiremos aumentar las tasas de embarazo, sino que además evitaremos la necesidad detransferir más de un embrión y el posible riesgo de embarazo múltiple.

Palabras clave: marcadores no-invasivos, Viabilidad embrionaria, proteómica, metabolómica.

SUMMARY

Embryo evaluation using morphological criteria has been the unique trustworthy method of embryo selection. However, newadvances in molecular biology techniques like metabolomics and proteomics can permit to choose the embryo with the bestimplantation potential. Therefore, we will be able to increase pregnancy rates but furthermore avoid the need to trasnfer morethan one embryo and his multiple pregnancy risk.

Keywords: Non-invasive biomarkers, Embryo viability, proteomics, metabolomics



Olmedo Illueca, C. et al. Las apariencias a veces engañan, la verdadera belleza está en el interior.

spectroscopy). Existe un método paradetectar el perfil metabólico en mediosde cultivo de embriones de FIV/ICSI quemuestra la habilidad para valorar elpotencial reproductivo de un embrión(Seli et al., 2007). Esa información seobtiene midiendo biológicamente lasconcentraciones de grupos funcionalesclave como R-OH, -SH, C-C, -CH, -OH y -NH mediante el uso de espectroscopiainfrarroja cercana (NIR). Estos sonsensibles a especies reactivas deloxigeno, y la variación entre embrionesviables y no viables puede ser resultadode una modificación oxidativa. Elespectro obtenido por NIR mostró unaumento en los grupos –OH y descensode los grupos –CH y –NH.

El modelo de estimación de la viabilidadenfatiza en las diferencias existentesentre –CH y –NH. Estos resultados sonconsistentes con el concepto de que unembrión, cuando madura, consume elmedio de cultivo modificando su pool. Esnotable que –SH,-CH,-NH y –OH sonbiomarcadores del estrés oxidativo y seha demostrado que afectan a laviabilidad embrionaria. Mediante unalgoritmo genético se discriminan losembriones que dan embarazo positivo ynegativo según su perfil metabólico.

Esto da como resultado un score deviabilidad embrionaria para medir elpotencial del embrión para desarrollarsede forma correcta, implantar y dar lugara una gestación evolutiva.

De forma retrospectiva se ha intentadocomprobar si el perfil metabólico de losconstituyentes se correlaciona con elembarazo cuando los embrionestransferidos se seleccionaron porcriterios morfológicos porque no todoslos embriones con buena calidadmorfológica implantan. Para ello lospacientes se dividieron en grupos.Aquellos con una tasa de implantacióndel 100% representaron el grupo cuyosembriones tenían potencial reproductivoprobado, y aquellos con una tasa del 0%se seleccionaron para representar a losembriones sin potencial deimplantación. Las muestras que seanalizan son aquellas obtenidas de día 3y día 5 de desarrollo post-inseminación.Se comparan ambas muestras mediantesus índices de viabilidad usando análisisestadístico de la t-Student y se

obtuvieron mejores resultados para lasmuestras en día 3. Los índices deviabilidad de las muestras conimplantación fueron mayores (0.94) quelos que no implantaron (0.56). Secrearon curvas ROC (Receiver operadorcharacteristic) para identificar el valorumbral con mejor mezcla de sensibilidady especificidad. Este valor umbral fuedespués aplicado a los datos paracalcular valores predictivos positivos ynegativos. La curva ROC indica quemediante el índice de viabilidad de 0.76podemos ser capaces de discriminarentre embriones con alto potencial conuna sensibilidad y especificidad del82.4% y 69% respectivamente. Y unaexactitud del 75.8%.

Las muestras obtenidas de blastocistosen día 5 fueron evaluadas de igualforma. Las muestras asociadas a laimplantación tuvieron unos índices devariabilidad más altos (-0.40) queaquellas con fallo de implantación (-0.81). Se completó una curva ROC queidentificó el mejor valor umbral de -0.43. Usando este valor, la sensibilidad yespecificidad fue del 100%.

Los resultados sugieren que losembriones que implantan y acaban enembarazo modifican su ambiente deforma distinta que los que no implantan.Si se compara la exactitud de loscriterios morfológicos y losmetabolomicos, estos últimos tienen un15% más de acierto que los morfológicosdespués de la transferencia única (SET)en día 3 post-inseminación y un 40% endía 2, cuando la transferencia se lleva acabo independientemente de loscriterios morfológicos

Por tanto los cambios en el medio decultivo por oxidación pueden ser unindicador del potencial y sonindependientes de los criteriosmorfológicos.

En la práctica estos datos sugieren quela metabolómica podría usarse junto conla morfología para seleccionar unembrión.

La GM-CSF (Granulocite Macrophage-colony stimulating factor) es unacitokina perteneciente a la familia defactores de crecimiento hematopoyéticossecretada por el tracto femenino de

humanos y mamíferos al comienzo delembarazo. Su función es regular elnúmero y viabilidad de los blastocistos ysu presencia en el ambiente constituye unelemento clave en la implantación,crecimiento y desarrollo fetal.

Esta citokina varía su concentración enfunción de la edad de la paciente. Enaquellas menores de 30 años laconcentración es significativamentemayor que en aquellas con 37 años omás. También se ha visto que existerelación entre la G-CSF y los niveles deEstradiol. A medida que aumenta laconcentración de citokina en suerodisminuye el nivel de Estradiol. Existecorrelación entre los niveles de G-CSF yestradiol en suero el día de la punción.En cambio no había diferencias entrefolículos de ovocitos fecundados y nofecundados. El hecho de que los nivelesfueran superiores en líquido folicularnos indica la producción intrafolicular deesta citokina y el papel auto/paracrinoque ejerce en el ambiente folicular.

Mediante Western-Blot y técnicasinmunohistoquímicas se han localizadossus receptores en el ovario,principalmente en las células de lagranulosa y células luteales.

Se realizó un estudio comparativo de losembriones procedentes de líquidofolicular con concentraciones porencima y por debajo de 20 pg/ml, queconstituye el ratio del embrión peor y elmejor. Para decidir el valor límite de G-CSF que determina que concentración decitokina marca el potencial deimplantación de cada ovocito y sucorrespondiente embrión se realizó unacurva ROC. El valor límite por debajo delcual no ocurre la implantación es 20pg/ml. Sin embargo, cuando laconcentración supera 24 pg/ml el valorpredictivo positivo alcanza un 40%.

Los resultados muestran claramenteque pacientes embarazadas revelabanun aumento constante de citokinadesde la transferencia a laimplantación. Sin embargo aquellas que no resultaron embarazadasmostraban un ligero aumento seguidode un descenso los dias 6-8 deestimulación, marcando con ello elcomienzo de un nuevo ciclo.

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Otros autores pretenden identificar lasdiferencias en el perfil proteico entreblastocistos humanos usando Arrays. Seanalizan un total de 120 proteínas delmedio de cultivo (CCM, Vitrolife) deblastocistos. Si se compara el perfilproteico de aquellos blastocistos queimplantaron respecto a los que noimplantaron se encuentran diferenciasúnicamente en dos proteínas, que sonCXCL13 (B-cell attracting homingchemokine) y GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor).Estas dos proteínas disminuían su nivel enel medio de cultivo de embriones viables.La GM-CSF es un factor que previene laapoptosis (Sjoblom et al., 2002) ypromueve el desarrollo in vitro (Sjoblomet al., 1999). Y no sólo es esencial para eldesarrollo, sino también para laimplantación (Robertson et al., 2007).Podría por tanto ser considerado unbiomarcador de viabilidad embrionaria.

La CXCL13 no tiene funcionesrelacionadas con la implantación o eldesarrollo, pero si para el sistemainmune aunque no se conoce demasiadoacerca de ella.

Por tanto, la G-CSF tiene un papelprimordial en el desarrollo folicular, laimplantación, la ovulación y elmantenimiento del embarazo.Constituye un biomarcador no invasivoque promueve la transferencia únicaporque evalúa al ovocito de formaindividual y nos ayuda a identificar elmejor protocolo de estimulación. Pero eluso de estas proteínas como criterio deselección embrionaria necesita aún demás estudios.

Las células de la granulosa son las únicasencargadas de producir la hormona anti-mÜlleriana (AMH) desde el nacimiento.Esta hormona alcanza su máximo nivelen la pubertad y continúa presente enedad adulta a nivel basal.

Hasta ahora sólo se conocía su funcióncomo factor pronóstico de la reservaovárica. Se ha visto que los niveles dehormona son más bajos en mujeres conbaja respuesta que en aquellas conrespuesta normal (Elgindy et al,2008).Sin embargo esta hormonaademás de predecir la edad ováricaconstituye un marcador de calidadembrionaria.

Parece que la cantidad de oocitos y lacalidad de los embriones soninversamente proporcionales a la edadde la mujer, cuya respuesta ovárica,como hemos citado anteriormente, sepredice con la concentración de dichahormona en suero. Cuando laconcentración de hormona es elevada enlíquido folicular el día de laadministración de hCG, la calidadembrionaria, la tasa de implantación y,por tanto, la de embarazo aumentan.

Otros autores demuestran que enaquellas pacientes cuyos oocitosfecundaron, la concentración de AMH enlíquido folicular fue más elevada que enaquellas a las que no les fecundaron.

Según S.L.Broer et al., 2008 la AMHtiene la misma capacidad de predecirbaja respuesta ovárica a la estimulacióny no embarazo en FIV que el recuento defolículos antrales.

Para determinar la concentración dehormona se puede utilizar un ELISA,concluyendo que un desarrolloembrionario mejor de lo normal y unastasas elevadas de embriones de buenacalidad se correlacionan con unincremento de AMH en el líquidofolicular. Por lo tanto, la determinaciónde AMH en líquido folicular resultaría útilen la predicción de calidad embrionaria.

La HLA-G es una molécula del complejomayor de histocompatibilidad (MHC)tipo I no clásica. Adopta siete isoformas,resultado del splicing alternativo de unmismo RNA inmaduro, cuatro seencuentran ligadas a la membrana(HLA-G1,-G2, -G3, -G4) y las otras tresformas son solubles (sHLA-G5, -G6, -G7), además presenta una limitadadistribución en los tejidos,expresándose de forma selectiva por lascélulas del citotrofoblasto velloso en lainterfase materno-fetal.

Desarrolla un papel importante en lainmunoprotección del embrión, por ellopodría jugar un papel esencial endiálogo madre-embrión protegiendo alfeto de ser rechazado por la madre.

Desde la primera vez que fueidentificado en medios de cultivoembrionario (HTF Irvine Scientific, CA,USA) o (KSOM Gibco BRL, Grand Island,

NY, USA) (Jurisicova et al., 1999)algunos artículos relacionan suconcentración con una mayor tasa dedivisión embrionaria o con unacondición imprescindible para lograrembarazo, pero todos la asocian con unmayor éxito en la tasa de implantaciónde dichos embriones (Noci et al., 2005;Sher et al., 2005).

Sin embargo no todos los trabajos estánde acuerdo con estos hallazgos. Algunosautores solo detectan s-HLA-G entrofoblasto y no en cultivos deembriones de 8 células ni tampoco enblastocistos. Todos estos desacuerdospodrían venir dados por la especificidady la sensibilidad de los medios dedetección utilizados y por el tipo demedio de cultivo utilizado. Además,parece que también se observavariabilidad entre diferentes lotes delmismo medio.

En cualquier caso, la detección de s-HLA-G podría ser un posible biomarcadorde la capacidad implantatoria delembrión, ya que seria un método noinvasivo que permitiría realizar laselección embrionaria sin atenderúnicamente a criterios morfológicos.

PROTEÓMICA

Se conoce poco sobre la producción deproteínas del embrión de humano, enparticular de las proteínas que produceel embrión y son secretadas al medio quele rodea (secretoma). Las proteínas sonresponsables de la mayoría de funcionesque dictan como un embrión reaccionaráa su ambiente.

Los avances en espectroscopia de masashan sido revolucionarios para laproteómica. Mediante el uso de perfilesde expresión se identifican proteínasimplicadas en procesos biológicos.

Surface-enhanced láser desorption andionization time-of-flight massspectroscopy (SELDI-TOF MS) es uno delos mas recientes desarrollos de laproteómica basado en capturarproteínas y péptidos por superficiesquímicamente modificadas y esaltamente sensible para el análisis demuestras biológicas complejas. Lasensibilidad del SELDI-TOF MS permite elanálisis de pequeñas concentraciones de



Olmedo Illueca, C. et al. Las apariencias a veces engañan, la verdadera belleza está en el interior.

proteínas secretadas por el embrión a lolargo de su desarrollo.

La novedad está en que utilizasuperficies químicas en chips quepermiten capturar subclases deproteínas. Una vez unidas al chip lasproteínas son ionizadas usando un láserque desorbe en un gas cargadopositivamente. El tubo del TOF crea unvacío que permite la separación einterpretación de iones de acuerdo a sumasa/carga.

Usando SELDI-TOF MS se ha desarrolladoun sistema capaz de analizar el proteomade un blastocisto humano, y la meta esidentificar las proteínas y los eventoscríticos que ocurren justo antes de laimplantación.

Se utilizan blastocistos de morfologíasimilar pero con diferencias en el tipo yla intensidad de algunas proteínas ypéptidos. Cuando los blastocistos secompararon por análisis estadístico conembriones degenerados se encontraronmuchas diferencias en proteínascargadas negativamente.

Los datos han identificado un potencialcandidato implicado en apoptosis einhibición del crecimiento, la Heparin-binding epidermal growth factor (EGF)-like growth factor precursor (HB-EGF)es un potencial candidato implicadocon la interacción entre eltrofoectodermo y el epitelio luminal del útero materno en la implantacióndel blastocisto. Es un estimulador delcrecimiento, relacionado con elhatching.

Otro de los candidatos es la cystatin-likeprecursor. Como se sabe que las cistatinasinhiben las cisteína proteinasas, el feed-back positivo de esta proteínacontribuiría al fallo de implantación deembriones degenerados.

Los estudios han demostrado que losembriones, cada 24 horas secretandistintas proteínas. Esos perfilesproteicos caracterizan el estadio dedesarrollo de ese embrión por susecretoma solo, independientemente dela morfología. Los análisis revelan laexpresión de varios biomarcadoresdiferentes solo en puntos específicoscada 24 horas.

El análisis del secretoma de blastocistoshumanos que se desarrollan revelódiferencias significativas en la expresiónde una proteína de 8.5-kDa. Losembriones que se desarrollaroncorrectamente mostraron fuerteexpresión de esa proteína mientras quelos degenerados mostraron ausencia.Esta proteína también se detectasignificativamente en estadio deblastocisto y es el biomarcador másabundante en el secretoma en día 5. Estaproteína ha sido identificada como laubiquitina y está implicada enimplantación.

En cuanto a biomarcadores de viabilidad,los blastocistos humanos de morfologíassimilares muestran perfiles proteicosdistintos. Los embriones degenerados ylos que se desarrollan también varían encuanto a las proteínas implicadas enapoptosis e inhibición de crecimiento.En blastocistos de una misma paciente ycon morfologías similares variaenormemente su huella dactilarmetabólica (Gardner et al., 2001).

Esto indica que existen diferenciassignificativas en la expresión deproteínas independientemente de lamorfología.

El recambio aminoacídico constituye unmétodo no-invasivo de selecciónembrionaria basado en eldepleción/aparición de aminoácidos enel medio de cultivo (Leese, 1994;Houghton, 2002; Brison, 2004). Pareceestar relacionado con la habilidad de unembrión para implantar y dar embarazo.Esto es independiente de otrosindicadores de embarazo como la edadmaterna, reserva ovárica y número decélulas embrionarias y grado.

El análisis mediante HPLC (Highperformance liquid cromatography)permite ver los cambios que se producenen la concentración de aminoácidos en elmedio de cultivo individual de embrioneshumanos cada 24 horas. Los datosobtenidos retrospectivamente llevan a laconclusión de que existen diferenciasclaras en el recambio aminoacídico entreembriones evolutivos y no evolutivos.

En la figura 1 se puede ver laconcentración relativa de 18aminoácidos en el medio de cultivo,

junto con la concentración en aquellospacientes con y sin consecución deembarazo.

Los análisis muestran que la Asparragina(Asn), Glicina (Gly) y leucina (Leu) estánrelacionadas con el embarazo clínico ynacimiento. Leu, Gly y Serina (Ser) sonlas menos abundantes en el medio deembriones de ciclos exitosos mientrasque Asn y Arginina( Arg) son los másabundantes.

El número de células y el Embryo Scoreparece que se correlacionan únicamentecon la Glu. No sabemos exactamente queaspectos de la viabilidad embrionaria sereflejan en el recambio amino acídico,pero lo que si se sabe es que losaminoácidos cuyo recambio predice laformación del blastocisto no son losmismos que predicen el embarazo(Houghton et al., 2002). Losblastocistos formados in vitro sepredicen mediante la Ala, Arg, Gln, Met yAsn entre los días 2 y 3 post-inseminación (Houghton et al., 2002)mientras que para el embarazo se midenla Asn, Gly y Leu entre los días 1 y 2 post-inseminación. Esto refleja el hecho deque no todos los blastocistos formadosin vitro son viables. A lo largo deldesarrollo los embriones pasan denecesitar Leu en día 2-3, Ser, Arg y Leuen 8 células y Ser, Leu, Arg, Met y Valinadurante el paso de mórula a blastocisto.En cambio los embriones que sedetienen usan 7 y 6 aminoácidos en día2-3 en 8 células.

Esto nos da una idea de las necesidadesnutricionales del embrión y su posiblerelación con la fisiología y desarrollo delmismo. Y nos indica que los embrionesque se detienen son metabólicamentemás activos que los embriones que sedesarrollan. Esto implica que la calidadoocitaria debe jugar un rol mayor en ladeterminación de la viabilidadembrionaria puesto que la activacióndel genoma no se detecta hasta estadiode 4-8 células.

CONCLUSIÓN

Actualmente, continuamos trabajando deforma rutinaria en la valoraciónmorfológica de gametos/embriones, perogracias a los estudios que se estánrealizando se confirma que los embriones

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no son entidades estáticas, sino queintercambian metabolitos con el medioque les rodea y a su vez lo modifican,pudiéndose utilizar las medidas de esamodificaciones como herramientas deselección adicionales a la morfología.

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Fig 1. Box plots of the 18 individual amino acids showing the medians (thicker lines), inter-quartile ranges(boxes), ranges (whiskers; excluding outliers) and outlying observations (open circles) for amino acidappearance in the culture medium. Open boxes are the cycles that did not achieve a pregnancy and shadedboxes those yielding a pregnancy. P-values are for a Mann–Whitney test comparing the two groups for eachamino acid.


A R T Í C U L O I I I

INTRODUCCIÓN

El objetivo principal de lacriopreservación de espermatozoides esmantener su viabilidad y funcionalidad abajas temperaturas durante largosperiodos de tiempo. Las célulascriopreservados se almacenan a -196ºCen nitrógeno líquido. A esta temperaturano existen fenómenos ni de difusión nienergía térmica suficiente para llevar a

cabo reacciones químicas. Por tanto, lasdificultades de la congelación noderivan de la permanencia a bajastemperaturas sino de los procesos deenfriamiento y calentamiento.

Durante estos procesos las células seencuentran en suspensión en unasolución acuosa. Dicha solución tendráunas propiedades coligativas quedependen fundamentalmente del

número de moléculas que hay en ella yno de la naturaleza de estas. Así, alañadir un soluto a una disolucióndisminuye el punto de congelación(punto crioscópico) y la presión de vapor,y aumenta la presión osmótica y el puntode ebullición. La ósmosis es elmovimiento del agua desde solucionescon baja concentración de soluto hastasoluciones con alta concentración desoluto y la presión osmótica es la presión

FUNDAMENTOS DE CRIOBIOLOGÍA ESPERMÁTICA PARA BANCOSDE SEMENBASES OF SPERM CRYOBIOLOGY APPLIED FOR SPERM BANKS

Ana Fernández1, Maria del Carmen Gonzalvo1 Ana Clavero1, Rafael Ruiz de Assín1, Sandra Zamora1, María Roldán1, Belén Rabelo1, Juan PabloRamírez2,3, Alberto Yoldi2, José Antonio Castilla1,2,3

1 Unidad de Reproducción Humana, Hospital Universitario “Virgen de las Nieves”, Granada.2 Banco de Semen CEIFER, Granada.3 Programa de Control de Calidad Externo para el Laboratorio de Reproducción de la Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción(ASEBIR), Madrid.Para contacto: José Antonio Castilla Alcalá: Unidad de Reproducción. C/ Dr. Azpitarte S/N Edificio de consultas externas Hospital Materno-Infantil CP.18014 josea.castilla.sspa@juntadeandalucia

Junio 2009 Vol. 14 · Nº 117

RESUMEN

Los espermatozoides tienen unas características especiales para la congelación, en este trabajo se analizan estas característicasy su influencia en la supervivencia espermática aplicada a los bancos de semen. Entre ellas se encuentran factores propios deltipo celular a congelar y factores dependientes del protocolo de congelación. Dentro de los primeros podemos hablar deltamaño y la permeabilidad celular y entre los segundos nos encontramos la curva de congelación y la adicción de loscrioprotectores.

La curva de congelación se refiere a la respuesta celular a la congelación (shock por frío, formación de hielo y descongelación)que puede provocar lesiones crioinducidas como la formación de hielo intracelular, estrés osmótico o recristalización. Paraevitar estos daños en todos los protocolos se describe como parte fundamental la adicción de agentes crioprotectoresbeneficiosos para la supervivencia celular aunque también recogen aspectos perjudiciales como su toxicidad. Por último seanalizarán las bases y el papel de la vitrificación de espermatozoides en los bancos de semen.

Palabras clave: banco de semen, criobiología, vitrificación

ABSTRACT

The spermatozoa have special freezing characteristics, these characteristics and influences on the spermatic survival appliedto the sperm banks are analyzed in this work. Among them we find particular freezing factors depending on cellular type andfreezing protocol. Among those we will begin with size and the cellular permeability and secondly we will look the freezing curveand the addition of the cryoprotectors.

The freezing curve refers to the cellular response to freezing (cold shock, ice formation, and thawing) which could provokecryoinjuries such as intracellular ice formation, osmotic stress or re-crystallization. In order to avoid these damages allprotocols as a basic measure describe the addition of cryoprotecting agents as beneficial to the survival of the cell althoughthey also inflict detrimental aspects due to their toxicity. Finally the bases and the role of the vitrification of the spermatozoain the sperm banks will be analyzed.

Key words: sperm bank, cryobiology, vitrification



Ana Fernández et al. Fundamentos de criobiología espermática para bancos de semen

hidrostática que se genera a través de unamembrana semipermeable con ungradiente de concentración. Estaspropiedades deberemos tenerlas presentescuando al disminuir la temperatura duranteel proceso de congelación empiece aformarse hielo en el medio extracelular,pues el agua que forma parte del hielo nocontiene los solutos que tenía disueltos,aumentando la concentración de estos enel medio extracelular (hiperosmótico) y modificando las propiedades coligativasde este.

Durante estos procesos las células se comportan como osmómetros,variando su volumen en respuesta a loscambios osmóticos extracelulares, asílas células pierden o captan agua según se expongan a mediosextracelulares híper o hipo osmóticos,respectivamente; los movimientos deagua y crioprotectores a través de lamembrana celular durante lacriopreservación se rigen por diversosparámetros biofísicos que deben serdefinidos para cada tipo celular adiferentes temperaturas, y en definitivaserán los responsables del daño celular.

CONCEPTOS GENERALES DEL TRASNPORTEA TRAVÉS DE LAS MEMBRANAS DURANTELA CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN

A modo de ejemplo, podemos consideraruna célula como una “bolsa” rellena de unasolución salina sumergida en un medio decongelación (medio extracelular). Elenvoltorio de la bolsa, es decir, lamembrana celular tendrá propiedades demembrana semipermeable.

Las dos características principales quevan a definir el comportamiento de lamembrana son: el tamaño y lapermeabilidad.

TAMAÑO

Es el área de membrana disponible paraintercambiar agua con el medio exterior.

PERMEABILIDAD.

Este parámetro define la facilidad con laque el agua puede atravesar lamembrana ante un gradiente deconcentraciones. La permeabilidad de lamembrana celular esta regulada por unaley que refleja el hecho empírico de que

cuanto menor es la temperatura delsistema, menor es la permeabilidad de lamembrana. De esta manera la membranacelular pierde su carácter semipermeablepara pasar a tener un carácterimpermeable, por debajo de una ciertatemperatura crítica. Cuando enfriamos elsistema por debajo de dicha temperaturacrítica, el proceso de deshidratación sedetiene, esto se traduce en un aumentode la probabilidad de formación de hielointracelular. Experimentos de laboratoriomuestran que la permeabilidad de lamembrana celular, además de variar conla temperatura del sistema, tambiéndepende de la concentración de soluto enel medio extracelular.

El contenido de la “bolsa”, es decir, elmedio intracelular estará constituidopor dos regiones:

VOLUMEN OSMÓTICAMENTE INACTIVO

En esta región incluimos orgánulosinternos de la célula, el núcleo celular,macromoléculas como por ejemploproteínas, etc. Son partes internas dela célula que no van a intervenir en elproceso del transporte del agua. Sedefine como el agua que nunca dejaráel interior celular en respuesta a unaumento de concentración de solutosen el espacio extracelular por estarasociado a las macromoléculas yestructuras intracelulares. Si una célulase deshidrata y reduce su tamaño más allá del volumen osmóticamenteinactivo puede comprometerse laviabilidad de esta (Hipótesis devolumen mínimo de Meryman paraexplicar el daño celular durante lacongelación) (Meryman, 1970).

VOLUMEN OSMÓTICAMENTE ACTIVO

En esta región incluimos la soluciónintracelular en la que están flotando losorgánulos internos, el núcleo, etc., y quesi puede abandonar la célula.

RESPUESTA CELULAR A LA CONGELACIÓN

SHOCK POR FRÍO Y DAÑO DE ENFRIAMIENTO(DESDE 37ºC A 0ºC)

El shock por frío (cold shock) es el dañocelular debido a la sensibilidad frente ala velocidad de enfriamiento, y escausada por efectos de transición en la

fase lipídica (Drobnis et al., 1993). Eldaño de enfriamiento (chilling injury) esel daño debido a la sensibilidad frente auna temperatura específica o un rangode temperaturas.

Los ácidos grasos pueden existir en unestado rígido ordenado (gel) o en uno más flexible y relativamentedesordenado (fluido). La transición deun estado al otro se da en un rango detemperaturas, la media de la cual seconoce como temperatura de transiciónde fase (“melting temperature”, Tm).Esta temperatura de transición serámayor o menor dependiendo de lacomposición de los ácidos grasos de lamembrana. La mayoría de lasmembranas de células eucariotas tienensu Tm entre los 0ºC y los 20ºC.

La transición de fase en una membranaplasmática no se da simultáneamente entodos sus fosfolípidos y por tanto seespera la coexistencia de dominios enestado fluido y dominios en estado geldurante la transición. Esta situaciónproduce defectos en el empaquetamientode las membranas y está asociado a unamayor permeabilidad de solutos a travésde esta. Así, se ha demostrado que alalcanzar la temperatura de transición enuna bicapa determinada, se produce lamayor pérdida de solutos a través de lamembrana.

Además esta alteración causaalteraciones físicas de la membranaplasmática por la inducción de fallos enel empaquetamiento de lípidos, lasalteraciones transitorias de la faselipídica causan respuestas cinéticas nolineales en algunas enzimas, incluidasalgunas ATPasas de membrana. Esprobable que tales efectos sean en parteresponsables del mal control de laconcentración del calcio celular lo que esevidente a temperaturas por debajo delos 17 ºC (Bailey et al., 1994).

El choque térmico puede ser mitigadopor agentes crioprotectores, lapresencia de ciertos fosfolípidos(fosfatidil serina), una congelaciónlenta y pre acondicionamiento en unmedio con un nivel elevado de sales. Elespermatozoide humano pareceafectarse poco por el shock por frió ydaño por enfriamiento, probablemente

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gracias a la composición de sumembrana (Holt, 2000)

FORMACIÓN DE HIELO (0ºC A <-132ºC)

La respuesta de las células alenfriamiento, depende del método deenfriamiento. En particular la velocidadde enfriamiento es el parámetro críticoque determina los resultados delprotocolo de criopreservación. Acontinuación vamos a describir losprocesos básicos que han sidoobservados, cuando se induce hielo enel medio extracelular, en función delperfil de enfriamiento aplicado.

La existencia de solutos en el aguaproduce un descenso del punto decongelación (punto crioscópico entre -5ºC y -10ºC) y en consecuencia lacristalización del agua se produce atemperaturas menores a la del punto decongelación del agua pura (0ºC). Estoproduce, al disminuir la temperatura, unsobreenfriamiento de la muestra (Mazur,1977). En esta situación el comienzo delproceso de formación de hielo es denaturaleza aleatoria, y depende de laprobabilidad de formación de un puntode nucleación, punto de inicio de unfrente de cristales de hielo que esinversamente proporcional a latemperatura. Cuanto mayor sea ladiferencia entre la temperatura a la quecomienza a formarse hielo y latemperatura de cambio de fase, mayorserá la velocidad de crecimiento de loscristales de hielo. En el peor de loscasos, puede ocurrir que la temperaturaa la que comienza a formarse hielo seatan baja, que la velocidad de crecimientode los cristales resulta explosiva. Enestas condiciones los cristales de hieloactúan como lanzas que atraviesan lascélulas, destruyéndolas por completo.

Para evitar este problema, en algunosprotocolos, se induce la formación dehielo extracelular (nucleación óseeding), mediante un descenso bruscode temperatura (fig.1) para garantizarque cuando la temperatura del sistemasea la de cambio de fase, tengamoshielo. Existen numerosas maneras deinducir la formación de hielo. En el casode muestras de células aisladas se tocala muestra con una aguja fría, a unatemperatura inferior a la de cambio defase. Además este descenso de

temperatura inducido pretende evitarfluctuaciones de temperatura sobre lasmembranas celulares. Esto es debido aque al congelarse el medio decongelación se libera calor por laformación de cristales (calor latente dela fusión) que provoca un fuerteaumento en la temperatura y comoconsecuencia la temperatura de lascélulas no disminuye en paralelo con lacaída de la temperatura del dispositivo decongelación. De hecho, la temperatura dela muestra puede permanecer estáticadurante 2-3 min antes de reanudarse elenfriamiento. Varios estudios handemostrado que este período entre laformación de hielo y la reanudación deenfriamiento, el punto de congelaciónmeseta, es perjudicial para lasupervivencia celular (Fuller et al., 2004).En los protocolos habituales decongelación de semen no se realiza el“seeding” o nucleación inducida pues nose ha visto que mejoren las tasas desupervivencia, lo cual puede ser debido aque el espermatozoide humano contieneuna matriz intracelular altamente viscosagracias a la abundancia de proteínas yazucares. Su pequeño tamaño, hace quesu contenido de agua sea bajo y suestructura compartimentalizada hace quela formación de pequeños cristalesintracelulares no afecte a toda la célulasino a zonas aisladas.

La formación de hielo extracelularrompe el equilibrio isotónico por una

única razón: el agua que forma parte delhielo no contiene los solutos que teníadisuelta cuando formaba parte de ladisolución acuosa del medioextracelular. Por lo tanto, cuandocomienza a formarse hielo fuera de lascélulas, simultáneamente se estáproduciendo un aumento de laconcentración de los solutos disueltosen el medio extracelular.

Mientras tanto, en el interior de lascélulas no se ha producido cambioalguno. Debido a la naturalezasemipermeable de la membrana celular,este gradiente en la concentración desolutos entre el medio extra eintracelular origina una sobrepresión dellado de la disolución que tiene unaconcentración de solutos menor, quedesencadena un flujo de disolvente purodesde la región menos concentradahacia la región de mayor concentración.Esta sobrepresión se puede interpretarcomo la diferencia de presionesosmóticas que tienen las dosdisoluciones.

Vemos por tanto que la formación dehielo extracelular, tiene comoconsecuencia la evacuación de aguadesde el medio intracelular hacia elmedio extracelular, en un proceso quellamaremos Deshidratación Celular.

En el espacio intracelular no tiene lugarla formación de hielo en estos momentos

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Fig. 1 Curva de congelación.

(1)Nucleación: liberación de calor por formación de cristales, provocando ascenso de la temperatura.

(2) La Tª de la muestra no descienda en paralelo con la caída de la temperatura, pudiendo permanecerestática durante 2-3 min.




(<-10ºC) posiblemente por la barrerafísica que impone la membrana celular alproceso de nucleación y al crecimiento delos cristales de hielo. Además, laprobabilidad de iniciar la nucleación en elmedio intracelular es mucho menor queen el medio extracelular ya que lanucleación está directamente relacionadacon el tamaño del compartimiento acongelar (Mazur, 1963).

Paradójicamente la formación de hieloextracelular, en principio podría evitarque se formase hielo dentro de la célula,ya que al aumentar la concentración desolutos en la región intracelular, el puntocrioscópico disminuye. Por lo tantopodemos tener una solución intracelularlíquida a temperaturas muy inferiores alos cero grados centígrados, que esaproximadamente el punto crioscópico(temperatura en que se produce el cambiode fase liquida a sólida) del mediointracelular original, cuando existíaequilibrio isotónico natural. No obstante,esto no llega a ocurrir debido a que lavelocidad con que la célula es capaz deevacuar agua es muy pequeña comparadacon la velocidad con que disminuye latemperatura.

DESCONGELACIÓN

Durante la descongelación sereproducen los cambios osmóticosinversos a los descritos para lacongelación. Así, cuando el aguacongelada cambia de estado (sólido alíquido), la concentración de solutos enel medio extracelular se reduceprogresivamente y la célula vuelve ahidratarse para compensar estadiferencia de concentraciones entre elexterior y el interior celular.

Generalmente se considera que para larecuperación de las células son necesariastasas de recalentamiento rápidas. Esto seha atribuido a la posibilidad de quepequeños cristales de hielo intracelularformados en algunas células durante lacongelación podrían crecer durante unproceso lento de recalentamiento,produciéndose el concepto decongelación durante el calentamiento,también llamado recristalización. Sólo siel calentamiento es tan rápido como paraevitar el crecimiento de los cristales dehielo este fenómeno puede evitarse (Rallet al., 1980).

LESIONES CRIOINDUCIDAS

Cuando la temperatura del medio alcanzalos -132ºC, el agua no existe en estadolíquido y los canales donde se encuentranlas células se encuentran en un estadovítreo (con una alta viscosidad) y sincristalización, un estado en el que losfenómenos de difusión de las reaccionesbioquímicas no son posibles (Mazur,1984) (Tabla 1). Por tanto parece claro

que la formación de hielo extracelular noes la responsable del daño celular ya quelas células criopreservadas se mantienenen dichos canales de solución nocongelada mientras crecen los cristales

de hielo en la solución extracelularsuperenfriada (Nei ,1978).

Por otra parte, observacionesexperimentales muestran que cuandoenfriamos muestras a altas velocidades, lasupervivencia de las células al proceso decriopreservación disminuye conformeaumentamos la velocidad deenfriamiento. Y que cuando enfriamosmuestras a muy bajas velocidades,

la supervivencia de las células al procesode criopreservación disminuye conformedisminuimos la velocidad de enfriamiento(Fig. 2). Cuando la supervivencia celularse dibuja en función de la velocidad de

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Fig.2: porcentaje de daño celular en relación a la velocidad de enfriamiento por efecto osmótico (----) ó porformación de cristales (——).

Tabla 1. Daños espermáticos durante la crioconservación.




enfriamiento, el resultado produce unacurva característica “forma de Uinvertida”(Fig. 3).

Para tratar de explicar este doblecomportamiento de la supervivenciafrente a las velocidades de enfriamiento,se ha propuesto una teoría denominadaHipótesis de los Dos Factores (Leibo,1970). En ella se proponen dosmecanismos distintos como causa de losdaños en las células, durante el protocolode criopreservación (producción de hielo y deshidratación celular o estrésosmótico). Siendo clave para determinarla importancia de cada factor la velocidadde congelación (Fig.2).

FORMACIÓN DE HIELO INTRACELULAR

A partir de que se inicia la nucleaciónextracelular y la correspondientedeshidratación celular lo que suceda enel espacio intracelular dependebásicamente de la velocidad deenfriamiento (Mazur, 1963; Nei et al.,1970). Si ésta es demasiado rápida, lacélula puede no ser capaz dedeshidratarse suficientemente rápido yal llegar a la temperatura de nucleaciónintracelular, el agua remanente secongela formando hielo intracelular. Lamanera en la que este hielo daña a lacélula, no es del todo conocido, pero sepiensa que es debido a una disfunción deorigen mecánico de las propiedades dela membrana celular y de otrasestructuras celulares suspendidas en suinterior, como pueden ser orgánuloscelulares o grandes macromoléculas de

proteínas. Lo que si se sabe es quecuanto mayor sea la cantidad de hieloformado dentro de la célula, menor es laesperanza de que la célula sobreviva.

Podríamos pensar, llegados a este puntoque un buen protocolo decriopreservación sería aquel en el que lavelocidad de enfriamiento fuera tanlenta que apenas formásemos hielo,pues permitirá la salida de todo el aguaintracelular. Sin embargo existe otromecanismo que provoca daños celularesy que precisamente actúa cuando lasvelocidades de enfriamiento son muyreducidas, lo que hace inviable esteprotocolo que acabamos de proponer.

ESTRÉS OSMÓTICO

Este mecanismo, activo a bajasvelocidades de enfriamiento, estárelacionado con la deformaciónmecánica de la célula, debida a lareducción de tamaño originada por elproceso de deshidratación tan intenso,y a la prolongada exposición de la célulaa elevadas concentraciones deelectrolitos. Este mecanismo se conocecomo “Efecto de Solución” ( Mazur et al.,1970) Existen básicamente dos teoríascomplementarias para explicar elfenómeno de estrés osmótico durante lacriopreservación.

La primera (hipótesis de altasconcentraciones de iones) achaca a lasinteracciones de las altas concentracionesde iones alcanzadas en el medioextracelular con las proteínas demembrana, lo que provocaría la

desnaturalización de estas mediante laformación de puentes de disulfuro entreaminoácidos (Lovelock, 1953; Karow, 1965)

La segunda hipótesis (hipótesis delvolumen celular mínimo) relaciona elefecto de la deshidratación producidadurante la concentración de solutos y lamuerte celular con la vuelta a lascondiciones isotónicas después de lacongelación (choque osmótico)(Merryman, 1970). Se basa en que elvolumen se reduce en relación alaumento de la osmolaridad extracelular,a medida que la célula pierde volumenpor la pérdida de agua, la compresión delcontenido citoplasmático aumenta laresistencia de la célula a seguirperdiendo volumen, y al excederse laresistencia física de la membrana seproducirán lesiones irreversibles en supermeabilidad y pérdida de lípidos de lamembrana celular. Esta perdidaafectaría a la integridad de la membranaplasmática que perdería su capacidad deexpansión durante la rehidratación alvolver a condiciones isotónicas.

En resumen, a velocidades deenfriamiento lentas el daño celular seproduce por la elevada concentración desolutos en el medio extra celular y aelevadas velocidades de enfriamientopor la formación de hielo intracelular.Existe una velocidad de enfriamientopara cada célula en la cual estos dosdaños son bajos denominándose,velocidad optima de enfriamiento,alcanzándose un máximo en laprobabilidad de supervivencia de lascélulas a la criopreservación.

A pesar de que se ha comprobado lavalidez universal de la hipótesis de los Dos Factores en todas las células estudiadas, el protocolo decriopreservación que optimiza lasupervivencia no es universal, es decir,cada tipo de célula requiere su propioprotocolo optimizado, de acuerdo con suspropiedades biofísicas (Nijs et al., 2001).

RECRISTALIZACIÓN

El agua en estado líquido, al enfriarse vaformando cristales y como hemoscomentado esta formación no eshomogénea, existiendo al mismo tiempoen estado líquido y sólido. El agua enestado líquido se va haciendo cada vez

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Fig. 3: Relación entre el porcentaje de supervivencia y la velocidad de enfriamiento.




mas viscosa, hasta que alcanza los -132ºC, en donde es tan viscosa que no puedeconvertirse en cristal, llamándose a esafase estado vítreo.

Todos los materiales biológicos debenalmacenarse por debajo de la temperaturade transición de fase del agua de líquido aestado vítreo (aproximadamente-132ºC)para poner fin a toda actividad biológica.A temperaturas superiores a -132ºC sereduce la longevidad celular a cuestión desemanas o meses, pues aun puede existiragua líquida y por lo tanto actividadcelular.

La transición a estado vítreo de unasolución acuosa congelada no ocurrerepentinamente en -132ºC; sino que esun fenómeno progresivo entre estatemperatura y -90ºC. En una célulacongelada a -196ºC que pasa a -80ºC,algunas moléculas de agua vuelven aestado líquido que pueden convertirseen cristales que provocan pequeñosdaños de recristalización. El problema esque los pequeños daños sonacumulativos; y cada incidente decalentamiento que se produzca porencima de -132ºC (por Ej. El sacar uncanastier del nitrógeno líquido paraextraer otra pajuela) contribuirá adisminuir la supervivencia funcional delas células criopreservadas.

AGENTES CRIOPROTECTORES

Además de una adecuada velocidad deenfriamiento, para mejorar laviabilidad celular es necesario alterarel comportamiento físico-químico delas soluciones acuosas en las cualestiene lugar la criopreservación, paraello se añaden al medio de congelaciónlos agentes crioprotectores (CPA). LosCPA son sustancias muy hidrosolublesy de baja citotoxicidad que disminuyenel punto eutéctico de una solucióndeterminada (temperatura mínima a laque una solución se encuentra enestado líquido). El descenso del puntoeutéctico implica que se alcanzará unaconcentración dada de solutos a unatemperatura menor, de forma que en elmomento en el que se induce lanucleación en el espacio extracelular lacélula estará más hidratada y elgradiente osmótico al que estarásometida será menor en el momento enque el espacio extracelular se congela.

Los crioprotectores pueden clasificarseen agentes penetrantes y no penetrantes,de acuerdo a la permeabilidad a través dela membrana celular.

CPA PENETRANTES

Son sustancias de bajo peso molecular ypermeables a través de la membrana, queprotegen a la célula de las lesionesproducidas por las congelaciones avelocidad lenta. Los más utilizados son:1,2-Propanodiol (PROH), Dimetilsulfóxido(DMSO), Etilén-Glicol (EG), Glicerol.Todos estos compuestos tienen encomún que sus moléculas son pequeñas,es decir, tienen un peso molecularrelativamente bajo; así el glicerol tiene92.09 de peso molecular, lo que lepermite atravesar la membrana celular.Si bien la célula es permeable a estosagentes su permeabilidad nunca es de lamisma magnitud que la del agua. Dentrode este grupo el glicerol es el más usadoen la criopreservación espermática.

CPA NO PENETRANTES

Son sustancias de alto peso molecular,que son efectivas cuando se utilizanvelocidades altas de congelación. Eltamaño de estas moléculas es muysuperior a las del grupo anterior. Asípor ejemplo, el peso molecular de lasacarosa es 342. No son crioprotectorespropiamente dichos, ya que nopenetran en la célula sino que ejercensu acción crioprotectora promoviendola rápida deshidratación celular ysuelen usarse asociados a los agentespenetrantes. Los más utilizados son:Sacarosa, Glucosa, Dextrosa, Polivinil-pirrolidona (PVP), Dextrano yPolietilen-glicol (PEG), (en congelaciónde semen humano las más usados sonlos dos primeros).

Dependiendo de la permeabilidad delcrioprotector utilizado y de sucitotoxicidad, la adición se realiza adistintas temperaturas. Los agentescrioprotectores pueden añadirse yextraerse en pasos, es decir aumentandoo disminuyendo gradualmente laconcentración de crioprotector en elmedio, lo que reduce el stress osmóticosobre la célula a congelar; o bienañadirse (o extraerse) en un solo paso,lo que reduce el tiempo de exposicióncelular al crioprotector.

Existen dos formas diferentes deadicción o disminución gradual del CPAal medio. En la primera, la solución deCPA (en el caso de adición) o un mediode cultivo (en el caso de dilución) seañaden en distintos pasos pero con un“volumen fijo”. En la segunda, la adiciónde CPA o diluyente varían en volumenpara producir cambios equilibrados en lamolaridad del CPA. Esto ha sidodenominado como “fixed molar step”(Gao et al., 1995; Gilmore et al., 1997).

Aunque células pequeñas (comoespermatozoides) contienen muy pocaagua, su cantidad corresponde en granparte (45-75%) al volumenosmóticamente inactivo, y esto es lo quehace que se deshidrate muy poco encomparación con otras células. Losespermatozoides humanos se puedenhinchar sólo un 110% de su volumenisosmótico original mientras que puedendisminuir un 75% de su volumen yretener ≥90% de su motilidad original(Gao et al., 1995). Como vemos losespermatozoides toleran menos unfuerte hinchazón que un encogimiento,y es por eso que la eliminación del CPAtras la descongelación puede tener unefecto dramático sobre las tasas desupervivencia espermática.

Si la dilución del CPA se realiza en unsolo paso, se obtiene un incremento delvolumen espermático del 160 % y unapérdida de aproximadamente el 70% dela motilidad. Por el contrario, el máximoaumento del volumen de un célulautilizando una dilución “fixer molarstep” nunca supera el límite superior delvolumen celular y por consiguiente notienen ningún efecto adverso sobre lasupervivencia espermática. Además laadición de CPA también parece causarmenor daño cuando se realizagradualmente (Gilmore et al., 1997).Todo lo anterior obliga a cuidar almáximo el tiempo empleado en laadición de los medios de congelación alsemen y la dilución con medio de cultivotras descongelación, siendo necesarioinvertir varios minutos en ello segúncada protocolo.

BENEFICIOS DE LOS CPA

A pesar de que el uso de estas sustanciasen los protocolos de criopreservación esuna práctica habitual, los mecanismos

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de protección no son del todo conocidos.Los mecanismos que con certeza sesaben que actúan a favor de lasupervivencia celular son mecanismosfísicos:

-Dilución de los electrolitos: La altaconcentración de los electrolitos en lasúltimas etapas de la deshidratacióncelular, fue una de las hipótesis de losmecanismos causantes de la muertecelular. Los CPA protegen a la célula delos efectos de los solutos. Este objetivose logra porque las CPA diluyen la altaconcentración de electrolitos. Esteefecto es descrito por la “regla de fases”,que establece que en un sistema de dosfases, como agua líquida y hielo a en unapresión dada, la concentración total desoluto en la fase líquida es constante parauna determinada temperatura. Así, comoel agua se solidifica en hielo, la soluciónrestante contendrá progresivamentemayores concentraciones de CPA yelectrolitos. Como la concentración totalde CPA y electrolitos debe ser constante,mayor es la concentración de CPA ymenor es la concentración deelectrolitos. Así, la CPA efectivamentediluye la concentración de electrolitosen la solución limitando así su toxicidad.

-Disminución de la concentración deagua: El otro mecanismo que causabamuerte celular era la formación de hielointracelular. Al introducir en el mediomás moléculas (de crioprotector), loscristales de hielo en crecimiento tienenuna mayor dificultad para encontrarmoléculas de agua y seguir asícreciendo, reduciendo de esta manera elriesgo de muerte celular.

-Aumento de la viscosidad: Al añadirsustancias crioprotectoras al mediointracelular, la viscosidad de ésteaumenta. Esto reduce la movilidad de lasmoléculas en su seno, por lo que laformación de cristales de hielo se vemenguada, aumentando de esta manerala probabilidad de supervivencia.

-Efecto coligativo: Al añadir un soluto(CPA) a un disolvente (medio decongelación) el punto crioscópico de lasolución desciende, necesitándose unatemperatura más baja para el cambio defase. Por lo tanto, las célulasexperimentarían menos estrés salinoque si estuvieran bajo las mismas

condiciones sin CPA. Este efecto ‘saltbuffering’ podría impedir elestablecimiento crítico de altasconcentraciones de soluto en la fracciónresidual de congelación hasta que elsistema se enfría llegando atemperaturas muy bajas donde toda laactividad molecular es inhibida(Lovelock et al., 1954).

-Otros mecanismos de naturalezabioquímica, se sospecha que sontambién causantes de la elevada tasa desupervivencia que se alcanza al añadiragentes crioprotectores. Tan sólocomentaremos a modo de ejemplo queciertos agentes crioprotectores podríanestabilizar la membrana celularmediante interacciones electrostáticascon los fosfolípidos de ésta(Hammerstedt et al., 1990).

En resumen, los crioprotectores reducenla cantidad de hielo formado a unatemperatura determinada y por tanto laconcentración de soluto durante lacongelación y así la deshidratacióncelular. Esta reducción en ladeshidratación celular hará que la célulano llegue nunca al volumen celularmínimo durante el proceso decongelación.

ASPECTOS PERJUDICIALES DE LOS CPAS

A pesar de los bien conocidos efectosbeneficiosos de los agentescrioprotectores, éstos pueden ser muydañinos, especialmente cuando sonempleados en altas concentraciones. Losprincipales efectos dañinos son dos:

-Toxicidad: Los agentes crioprotectoresson sustancias químicas que encondiciones normales no se encuentranen el interior de las células. Por ello,cuando atraviesan la membrana celulary se difunden por el medio intracelular,lo que realmente estamos haciendo esenvenenar a la célula (Fuller et al. 2004).Sin embargo como el metabolismocelular está muy ralentizado, la accióntóxica de los crioprotectores se ve muydisminuida, salvo que empleemos muyaltas concentraciones a temperaturasrelativamente altas (en el entorno de los0ºC).

-Ósmosis: La adición de CPA ejerce per seun estrés osmótico sobre las células

porque aumentan la osmolaridad delmedio. Las células inicialmente sedeshidratan para compensar la fuerzaosmótica inducida por la presencia de losCPA y después se hidratan a la vez que elagua vuelve al interior celular junto conel CPA (permeable). Cuando el CPApermeable entra en la célula (lo hacemás lentamente que el agua, debido a unmayor coeficiente de permeabilidad dela membrana al agua que al CPA), lascélulas regresan a su volumen isotóniconormal. Tras la eliminación del CPApermeable por dilución de la muestratras la descongelación, el agua entra enlas células rápidamente, debido algradiente osmótico que se genera, yentonces el CPA sale de las células máslentamente; por lo tanto, las células sehinchan antes de alcanzar el equilibrio.Estos cambios en el volumen de la célula(contracción e hinchazón) pueden ser losuficientemente grandes como paracausar un daño celular irreversible. A lapresión osmótica a partir de la cual seproducen estos daños se le denomina “límite de tolerancia osmótica”. Estoslímites son únicos no sólo para cada tipode celular, sino también para cadaespecie celular.

-Cambios en la permeabilidad al agua dela membrana plasmática: diferentesCPAs reducen la permeabilidad al aguaen diversos grados, y así losespermatozoides se deshidratan máslentamente de lo esperado (Gilmore etal., 1995). El flujo de agua en lamembrana es realizado por dos vías, porcanales proteicos y a través de la bicapalipídica. Por lo tanto, un CPA podríaafectar la permeabilidad de la membrana en al menos tres maneras.Primero, el CPA podría modificar labicapa lipídica, causando un cambio ensu permeabilidad. Segundo, unamodificación de la bicapa lipídica podríaafectar indirectamente a la actividadtrasportadora de las proteínas demembrana. Tercera, el CPA podríainterferir directamente con la función delas proteínas transportadoras de agua (principalmente a los canalesespecíficos para el transporte de agua,o secundariamente a canales que sonpresumiblemente para transportaralguna otra molécula, como la glucosa,pero que además facilitan el trasporte deagua).

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OTROS COMPONENTES DE LOS MEDIOS DECRIOCONSERVACIÓN

AGENTES QUE INTERACTÚAN CON LAMEMBRANA PLASMÁTICA

El shock por frío esta probablementerelacionado con la transición de fase dela membrana lípidica, cuyos resultadosson separación de las fases y la pérdidade permeabilidad selectiva. Diferentessustancias han demostrado que puedencambiar la composición lipídica de lamembrana celular mejorando su fluidez.La adicción de lecitina (de aceite desoja) o yema de huevo (que contienefosfolípidos y lecitina) protege a lamembrana espermática del shock porfrío.

El mecanismo exacto por el cual estassustancias protegen a la célula del shockpor frío es desconocido. Parece que elresponsable del efecto de la yema dehuevo es una lipoproteína de bajadensidad (LDL). Esta LDL puede actuaruniéndose directamente a la membranay modificando su permeabilidad oactivando a enzimas de la membrana(adenilato ciclasa, bombas iónicas,..)que mejorarían el comportamientoosmótico de las célula y la respuesta acrioprotectores permeables como elglicerol.

Además, el posible efecto beneficiosode algún detergente durante lacongelación (SDS, etc.) se atribuye aque el detergente modifica laspartículas de la yema de huevo (LDL)solubilizando lípidos, lo que facilita lainteracción de éstos con la membranaplasmática.

Varios investigadores han proporcionadoevidencia directa de que la Albúmina,en el medio de congelación se adhiererápidamente a la membranaespermática en el momento de ladilución, modifica la composicioneslipídicas del espermatozoide medianteintercambio lípidico o hidrólisis,promueve la hidrólisis de las proteínasde membrana plasmática, causa laentrada de iones Ca2+ en el citoplasma,y disminuye el colesterol y la cantidadde fosfolípidos en la membranaplasmática del espermatozoide. Estadisminución del colesterol induce unamayor fluidez de membrana y por tanto

resistencia a la congelación. Otrassustancias con propiedades lipofílicasutilizadas para extraer colesterol demembranas, como el metil-beta-ciclodextrina (un derivado de unoligómero cíclico de la glucosa),también han demostrado mejorar lasupervivencia espermática a lacongelación.

QUELANTES (EDTA, CITRATO)

Durante la criopreservación, existe undescontrol de la concentración decalcio intracelular. Este esprobablemente el motivo para lainclusión del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y citrato en algunosdiluyentes de semen; estos atraparían calcio y disminuirían el gradiente de concentración en toda la membrana plasmática delespermatozoide. Las concentracionesde calcio 0,1 mM. intracelulares soncuatro veces menores a las delambiente exterior. El EDTA atrapa otrosiones metálicos y podría también actuarinhibiendo la peroxidación de lípidos.

AGENTES QUE EVITAN LA PEROXIDACIÓNLIPÍDICA

Una serie de estudios han implicado a la peroxidación de los lípidos demembrana como causa de la funcióndefectuosa del espermatozoide despuésde la criopreservación del semen(Salamon and Maxwell, 1995). Losintentos de superar la peroxidacióndurante la criopreservación de semenhan incluido la realización del procesobajo condiciones anaeróbicas, ademásde el uso antioxidantes y la inclusión deagentes quelantes. Confirmar la eficaciade estas estrategias ha sido algoproblemático. Butirato hidroxitolueno,Glutation y Ditiotreitol han sido descritos como agentes protectores de la peroxidación durantecriopreservación, con mejoras en lamotilidad postdescongelación y laintegridad acrosomal.

BUFFER

Además de la elección del crioprotectory varios posibles aditivos, los diluyentesde semen deben estar preparados en unmedio acuoso. Algunas formulacionescomúnmente utilizadas, especialmente

aquellas con alto contenido de azúcar,no contienen un buffer de pH por lo quecomponentes como yema de huevopuede afectar el pH la solución. Muchosmedios incluyen citrato de sodio, TRIS( t r i s f o s f a t o - ( h i d r o x i m e t i l ) -aminometano) o buffers zwitterionicoscomo TES (N-trisfosfato (hidroximetil)-metil-2-aminoetanosulponico ácido).No se debe utilizar tampón fosfato salino(PBS) como buffer en la congelaciónespermática, pues sus elevadasconcentraciones de sodio, al alterarselas bombas Na-K durante el proceso decongelación, pueden sen perjudicialespara el espermatozoide alcanzandoniveles tóxicos intracelulares.

VITRIFICACIÓN

La Vitrificación es la solidificación de unasolución alcanzándose el estado vítreocomentado anteriormente, sin formaciónde cristales. En este estado el agua sesolidifica pero no se expande, esto sucedegracias a un rápido enfriamiento queconduce a un aumento extremo de laviscosidad sin formación de hielointracelular. Este proceso es alcanzado poraumento tanto de la tasa de enfriamientocomo de la concentración de la solucióncrioprotectora (Taylor et al., 2004).

De hecho aunque introdujéramosdirectamente una pajuela decongelación en nitrógeno líquido ydespués lo sumergiéramos en agua paracalentarlo las tasas de enfriamiento ycalentamiento serían del orden de>2500ºC/min., lo que podría formarcristales de hielo intracelulares, yprovocar daños en el espermatozoide.Para aumentar la velocidad decongelación se han utilizado otrosdispositivos diferentes a la pajuelaclásica que permiten un mayor contactoentre la suspensión celular y elnitrógeno líquido como rejillas demicroscopia electrónica, semipajuela,cryoloop, cryotop, cryotip y cryoleaf(Fuller et al., 2004). Las tasas deenfriamiento y calentamiento puedenaumentar hasta 30000 ºC/min y42000ºC/min respectivamente, y asíevitar con éxito la formación de hielointracelular. Para conseguir esta altatasa es necesario que el volumen dondeestán contenidos los espermatozoidessea muy pequeño (micras), lo que haceque el número de espermatozoides

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vitrificados sea muy escaso, no siendoesta técnica útil para congelaciones desemen destinados a inseminaciónartificial o FIV sólo para ICSI.

La mayoría de los protocolos devitrificación requieren una altaconcentración de crioprotectores a finde deshidratar rápidamente elespermatozoide y prevenir el hielointracelular. Por lo tanto, la toxicidad delos crioprotectores debe ser consideradapara el éxito de la congelación. Engeneral, crioprotectores rápidos ypermeables son preferibles porque larápida permeabilidad acorta el tiempode exposición, reduce la lesión tóxica yminimiza la hinchazón osmótica durantela eliminación de los crioprotectores. Envitrificación es muy importante durante el calentamiento eliminar elcrioprotector rápidamente. Si las célulasestán directamente expuestas a soluciónisotónica, existe un riesgo de hinchazónosmótica, porque el agua difunde másrápido al interior de la célula que ladifusión al exterior del crioprotectordesde el espermatozoide. La estrategiamás común para evitar este daño esdescongelar las células o de losembriones en una solución hipertónicaque contiene agentes no-permeablespara contrarrestar el exceso de flujo deagua. La sacarosa es utilizadousualmente para diluir las célulasvitrificadas después de ladescongelación, actuando como unafuerza osmótica que restringe lapermeabilidad del agua en las células, yasí evitar “ lesiones por hinchazón”.

Sin embargo, se ha visto que losespermatozoides son capaces derecuperarse con técnicas de vitrificaciónsin adicción de CPA, utilizando tasas muyaltas de enfriamiento que podríadepender en cierto grado de una altapermeabilidad innata de la membrana alagua (Isachenko et al., 2004) óutilizando como único crioprotector lasacarosa (Hossain et al., 2007) ó elglicerol (Schuster et al., 2003). Portanto, el papel de las técnicas devitrificación de espermatozoides estátodavía por aclarar.

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D E B A T E

Debate.

Según datos de la European Society ofHuman Reproduction and Embryology(ESHRE), en el año 2004 acudieron aEspaña alrededor de 1000 pacientespara someterse a un tratamiento dereproducción asistida. Cuatro años mástarde, en el 2008, sólo en el I.U. Dexeusya habíamos tratado a una cifra similar de pacientes extranjeras. Estos datos nos demuestran que los desplazamientos a otros países parasometerse a tratamientos dereproducción asistida son un fenómenoque va en aumento, razón por la cualnos parece de enorme interés tratarloen esta sección de Debate.

Lo primero que sorprende al ver el temade debate es precisamente su título:Turismo reproductivo. No se puedenegar el impacto de este titular al igualque otros generalmente empleados porlos medios de comunicación como“Bebé medicamento” o “Niño probeta”.Desde nuestro punto de vista, lautilización de estos términos nosparece poco acertada y consideramosque en ámbitos de carácter científicodeberíamos intentar utilizar unaterminología más precisa y no caer entérminos sensacionalistas, propios dela prensa general.

Utilizando la palabra turismo serelaciona un fenómeno de origenmédico con el concepto de ocio. Es pocoobjetivo, además de poco riguroso y sealeja del verdadero sentido de lacuestión. Creemos que ésta no es lamejor manera de corregirlo y ademáspuede llevar a que una parte de lasociedad tenga una percepciónequívoca sobre esta cuestión. Por ello,cuando en el Máster de Biología de laReproducción debatimos este tema, loprimero que hicimos fue pensar ennombres alternativos que se ajustaranmás a la realidad, como por ejemploFlujo de pacientes entre países paraTRA. Del mismo modo, la ESHRE lodenomina Cross-border reproductivecare, el cual está en consonancia con el

término usado por la comunidad médicaCross-border health care.

Teniendo en cuenta la repercusión queha tenido la salida de pacientes enpaíses como Italia, que han vistodisminuir considerablemente el númerode ciclos realizados por su situaciónlegal particular, podemos entender queestos países mantengan una actitudcrítica e incluso contraria al flujo depacientes hacia otros países comoEspaña. Si lo que queremos es evitar laoposición de la UE y sociedades como laESHRE tendríamos que intentar nocaptar a las pacientes con paquetesturísticos u otra publicidad meramentecomercial. Campañas publicitarias quecomplementan el tratamiento médicocon otras actividades lúdicas comovisitas a parques de atracciones, golf,rutas culturales, etc., frivolizan quizá laimagen de nuestros centros de TRA,cuyo alto nivel científico y técnico esindiscutible.

Si como ya hemos dicho no existeninguna razón médica, científica otécnica que desaconseje dichosdesplazamientos, y aceptamos quecualquier paciente tiene derecho a sertratada y a escoger el centro dondequiere hacerlo, no debería existir puesregulación alguna que los limitara.

En conclusión, las pacientes deberíanescoger el centro de TRA por cuestionesmédicas y no por otros motivos. Lasrazones legales no deberían ser elmotivo del desplazamiento. Si existierauna legislación única, esto nosucedería. Sin embargo, dado que estoes una utopía y las diferencias legalesentre países seguirán existiendo, lo quedebemos intentar es ofrecer el mejortrato posible y la máxima calidadcientífica. Estas deberían ser lasverdaderas razones por las quepacientes extranjeras escogierannuestros centros y no los atractivospaquetes turísticos con los que enalgunos casos se intentan captarlas.

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“TURISMO REPRODUCTIVO”, NO. “FLUJO DE PACIENTES”, SI.

Xavier Orriols y Montse Boada. Servicio de Medicina de la Reproducción. Institut Universitari Dexeus.


D E B A T E


In some ways very little has changed inIVF laboratories since I started workingas a clinical embryologist in Londonback in 1991. But in the UK what can attimes seem like an ever increasingregulation of clinics by the HFEA hasensured that we have not stood still interms of compliance with the changes inthe European legislation of ART.

But for me the greatest change, and soimpact on the way we work in the UK,came about following changes in the useof donor gametes after theimplementation of requirements set outin the SEED report. The use of iD release(non-anonymous) gamete donors herein the UK is now the norm. Our fears thatthere would be fewer sperm donorsavailable was seen initially and led manyof our patients to apply to importsamples from overseas. This process washalted for a few months when the HFEAstopped all applications to import fromoutside of the UK due to an issue overhow gamete donors were being‘reimbursed’, or ‘paid’.

The limitations placed upon themovement of patients’ own gametes andembryos between the European statesbeing dependent upon the readiness ofeach member state to have ensured thatclinics had introduced the regulation asper the EUTD by the named governingbodies responsible for their compliance,has made it a more complicated processdespite the perceived increasedopenness within the EU.

For patients seeking treatment withdonated oocytes, the access to clinics inEastern Europe led to an alleviation inthe length of time waiting for access tothe chance to become pregnant. But atwhat cost? And what really concernedme? The overseas clinics I have had thepleasure to work with have been bothprofessional and successful in producingthe end product. A take-home baby. Butin the UK where we are currently allworking towards reducing the rate of

multigestations, particularly wheredonor oocytes are involved. I wasconcerned that where in the UK amaximum of two embryos could bereplaced that our patients could havethree replaced. This means an increasedchance of a twin or triplet pregnancy andthe costs and risk of such a pregnancywould need to be met here in the UK bythe system we were trying to reducethem in. With the added complication ofthe mother being of advanced maternalage in many cases where a singletonpregnancy would be classed as a ‘highrisk’. Patient fixation on gettingpregnant at any cost, financial orclinical, could endanger their chance ofactually taking home a baby orincreasing the risk of a pre-term deliveryin addition to the risk of disability.

But what of the cost to the patients? Thestress of traveling to another country,where the first spoken language may notbe their own. That ART provisiondelivered differently due to thatcountry’s enforcement of the law andregulation, make the treatment a moredifficult experience?

I have often wondered whether thechanges to the laws within the UK withregards to the anonymity status ofdonors was meant to reduce the numberof children born following suchtreatment? Or that our obsession in theUK to consider the welfare of the unbornchild has led us to increase the pressureon altruistic donors and those whoreceive limited reimbursement fordonating to ensure that any resultingchild is able to trace his genetic parentonce they are 18 years of age. The limiton reimbursement here in the UK whilstbeing seen as morally correct in manypeoples eyes appears less than honestwhen compared to the straight ‘cash forgametes’ in place overseas. Can thisreproductive tourism be taken as in thewords of Professor Guido Pennings asmerely a ‘safety valve’, so allowing thoseseeking these treatments the personal

freedom and cheaper and moreimmediate access to the services theyrequire in order to become parents thatthey may not be eligible for in their owncountry.

What role should UK clinics play in thesearch for treatment overseas, if any? Asonce involved they are duty bound to tryand extend our tight regulationsoverseas. But with all things consideredshould it not be a personal decision as towhere and how a patient achieves theirdream of becoming a parent?

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REPRODUCTIVE TOURISM

Bonnie Collins. Laboratory Manager. Centre for Reproductive Medicine, St Bart's Hospital. London


D E B A T E

Marta Tresanchez y Montserrat Boada, Flujo de pacientes entre países

El desplazamiento de pacientes entrepaíses para acceder a técnicas dereproducción asistida es un fenómenoque en los últimos años ha ido enaumento y en la mayoría de los casosoriginado por las distintas normativasque rigen en cada país. A menor escala,también podríamos considerar queexiste el mismo fenómeno entre lasdistintas comunidades autónomas denuestro país que a pesar de compartir una misma legislación tienen diferencias debido a que lascompetencias de sanidad estántransferidas a las CCAA y el acceso adeterminadas técnicas o las ayudaseconómicas a los tratamientos puedenser distintas.

Legislaciones restrictivas como las deItalia y Alemania, o cambios en lasleyes como en el caso del Reino Unido,en relación al anonimato de lasdonaciones, están provocando quemuchas parejas vengan a España enbusca de tratamientos prohibidos en supaís de origen. A pesar de que Españaes uno de los países que más pacientesextranjeras recibe debido al carácterprogresista de nuestra legislación,otros países también son destinatariosde estas pacientes.

Es indiscutible que el flujo de pacientespara TRA genera un gran negocio para loscentros receptores, pero no hay queolvidar que esta situación puede variar enel momento en que se produzca un nuevocambio normativo. Sin ir más lejos, elpasado mes de Abril la CorteConstitucional Italiana declaró la“ilegitimidad constitucional” de algunospuntos de la Ley italiana de TRA. Todavíano sabemos qué medidas tomará elgobierno italiano al respecto, y si semodificará sustancialmente la ley pero en caso afirmativo se reduciríasignificativamente el número de pacientesque se desplacen a nuestro país.

Un punto importante a tener en cuentaes el esfuerzo personal y económico que

les supone a estas pacientes. Las TRArepresentan una fuente de estrés en simismas para la mayoría de los casos yesto se ve acentuado cuando sedesplazan a otro país donde ni conocenla lengua, ni el centro, ni tienen unsoporte familiar adecuado. Losproblemas laborales que puedenderivarse debido a los tratamientos enel extranjero pueden ser muy graves yllegar a provocar la pérdida del empleo.Todas estas dificultades pueden llegara ocasionar repercusiones a nivelpsicológico: estrés, frustración, bajaautoestima, problemas de pareja, etc.Facilitarles la comunicación en sumisma lengua y disponer de un serviciode atención al paciente internacionalasí como de un servicio de apoyopsicológico especializado conseguirándisminuir los efectos adversos.

Para las pacientes que se desplazan aotros países el coste económico de untratamiento de TRA es mucho máselevado que si lo realizaran en su paísde origen. ¿Está pues el flujo depacientes discriminando a favor de lasparejas con un nivel socio-económicomás alto? ¿Qué pasa con las parejas queno se pueden permitir un gasto así?¿Esta situación vulnera el Principio deIgualdad? Recientemente se hadetectado un incremento del flujo depacientes hacia países del Este u otrosdestinos como la India donde el accesoa las TRA es económicamente muchomás asequible pero en los que la calidady el rigor científico no siempre estángarantizados. La falta de informaciónverídica sobre los centros a los quepueden dirigirse o en ocasiones laelección preferencial por determinadoscentros (no siempre los mejores)recomendados por su ginecólogo,puede vulnerar también el Principio deAutonomía y de Beneficencia.

En resumen, teniendo en cuenta lasgrandes dimensiones que ha adquiridoel flujo reproductivo en los últimos añosy las múltiples implicaciones éticas y

psicológicas que se derivan de él,consideramos que un análisis profundode la situación nos daría a conocer conexactitud el volumen que representa, lascondiciones en las que se realiza y nospermitiría mejorarlas para garantizaruna buena praxis. No creemos que seanecesario regularlo legalmente pero siconsideramos que las sociedadescientíficas especializadas deberíanregistrar estos casos y realizar unseguimiento de ello.

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FLUJO DE PACIENTES ENTRE PAÍSES. ¿QUÉ SABEMOS DE ELLO?

Marta Tresanchez y Montserrat Boada. Servicio de Medicina de la Reproducción. Institut Universitari Dexeus.


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COMITÉ DE HONOR:

· Con fecha 6 de febrero, el Excmo. Sr. D. Bernat Soria, Ministro de Sanidad y Consumo, aceptó formar parte del Comité de Honor del V CongresoNacional ASEBIR. Estamos a la espera de la aceptación de la Excma. Sra. Dña. Trinidad Jiménez García-Herrera, actual titular del Ministerio deSanidad y Política Social del Gobierno de España.

PRESIDENTA· Dra. Mª José de los Santos

VOCALES· Dra. Carmela Albert· Dra. Pilar Buendía· Dra. Juana Crespo· Dr. José Mª de los Santos· Dra. Arancha Delgado· Dra. Blanca Gadea· Dra. Arancha Galán

· Dra. Pilar Gámiz · Dra. Noelia Grau · Dra. Emilia Mateu· Dra. Amparo Mercader· Dra. Amparo Mifsud· Dr. Miguel Milán· Dr. Antonio Pellicer· Dra. Amparo Ruiz· Dr. Alberto Tejera · Dra. Tamara Viloria· Dr. Jesús Zulategui

· Dra. Begoña Arán· Dra. Montserrat Boada· Dra. Ana Cobo· Dra. Nieves Cremades· Dr. Jorge Martín Cuadros· Dra. Mª José Escribá· Dr. Nicolás Garrido· Dr. Julio Martín· Dr. Marcos Meseguer

· Dra. Inmaculada Molina· Dr. Joaquín Moreno· Dra. Sonia Pérez· Dra. Lorena Rodrigo· Dr. Josep Lluis Romero· Dra. Carmen Rubio· Dra. María Vila

V C O N G R E S O N A C I O N A L D E A S E B I R

Programa Científico Preliminar32

COMITÉ ORGANIZADOR COMITÉ CIENTÍFICO

SECRETARÍA ASEBIRTelf.: +34 91 367 89 94E-mail: [email protected]

SECRETARÍA TÉCNICA DEL CONGRESOGrupo ProcessTelf.: +34 91 377 14 23E-mail: [email protected]


TARDE15:00 - 20:00 hrs. Apertura de secretaría y colocación de Pósters.

16:00 - 17:00 hrs. Inauguración oficial del V Congreso Nacional ASEBIR.

17:00 - 19:30 hrs. Grupos de Interés ASEBIR.Moderadora: Mª José Figueroa (Cádiz) - Inmaculada Molina (Valencia).

17:00 - 17:30 hrs. Estado actual del Grupo de Interés de Calidad Embrionaria. Actualización de la clasificación de ASEBIR.Ponente: Jorge Martín Cuadros (Clínica FIV, Madrid)

17:30 - 18:00 hrs. Creación del tercer Cuaderno de Embriología “Afianzamiento de calidad: aspectos técnicos y aspectos biológicos”.Ponente: Manuel Ardoy (H. Univ. Gregorio Marañón, Madrid)

18:00 - 18:30 hrs. Indicadores Laboratorio de Embriología Clínica.Ponente: Juan Manuel Moreno (Clínica Vistahermosa, Alicante)

18:30 - 19:00 hrs. Estado actual de Grupo de Interés de DGP.Ponente: Esther Fernández (GENIALITY, Madrid)

19:00 - 19:30 hrs. Registros SEF.Ponente: José Antonio Castilla (H. U. Virgen de las Nieves, Granada)

20:30 hrs. Cocktail Inaugural en el Palacio de Congresos.

MIÉRCOLES, 25 DE NOVIEMBRE DE 2009

Junio 2009 Vol. 14 · Nº 133


Programa Científico Preliminar



Programa Científico Preliminar

MAÑANA08:00 - 14:00 hrs. Apertura de secretaría y colocación de Pósters II.

09:00 hrs. Apertura mesa electoral ASEBIR.

09:00 - 11:00 hrs. Sesión Embriología.Moderadores: Amparo Ruiz (Valencia) - María Bonada (Londres).

09:00 - 09:40 hrs. Ponencia I: Requisitos del laboratorio de embriología clínica: Implicaciones de la transposición de las Directivas Europeas.Ponente Dra. Cristina Magli (Clínica SISMER, Bologna).

09:40 - 10:20 hrs. Ponencia II: Manejo de pacientes con enfermedades infecciosas en laboratorio de Reproducción Asistida. ¿Representa realmente un riesgo en el laboratorio?Ponente Dr. Fernando Marina (I. de Reproducción CEFER, Barcelona)

10:20 - 11:00 hrs. Ponencia III: Métodos no invasivos de evaluación de la calidad embrionaria. Respirometría.Ponente Dra. Lynette Scott (Reading. MA, USA)

11:00 - 11:30 hrs. Pausa café.

11:30 - 13:10 hrs. Comunicaciones Orales. (10)Moderadores: Mª José Escribá (Valencia) – Ezequiel Pérez Campos (SEC).

13:10 - 13:55 hrs. Simposium Satélite. EMB.

14:00 - 16:00 hrs. Comida congresual.

TARDE15:00 - 19:30 hrs. Apertura de secretaría.

16:00 - 17:20 hrs. Sesión Andrología.Moderadores: Miguel Ruiz (Valencia) - Ferran García (ASESA).

16:00 - 16.40 hrs. Ponencia I: Marcadores moleculares de calidad espermática.Ponente. Dr. Marcos Meseguer (IVI, Valencia).

16:40 - 17:20 hrs. Ponencia II: Integridad del ADN espermático y su efecto sobre la calidad embrionaria. ¿Es clínicamente útil?Ponente Dr. Jorge Ten (Instituto Bernabeu, Alicante)

17:20 - 18:20 hrs. Sesión de Pósters.

18:00 hrs. Cierre mesa electoral ASEBIR.

18:20 - 20:00 hrs. Comunicaciones Orales. (7)Moderadores: Joaquín Moreno (Valencia) -Nieves Cremades (Alicante).

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JUEVES, 26 DE NOVIEMBRE DE 2009




MAÑANA08:00 - 14:00 hrs. Apertura de secretaría.

08:30 - 10:30 hrs. Sesión Genética y Reproducción. Moderadores: Begoña Arán (Barcelona) - Carmen Rubio (Valencia).

08:30 - 09.10 hrs. Ponencia I: Uso de Microarrays en Diagnóstico Genético PreimplantacionalPonente: Carles Giménez (Reprogenetics Spain, Barcelona).

09:10 - 09:50 hrs. Ponencia II: Qué nos aporta el análisis genético en espermatozoides en la pareja infértil.Ponente Dr. Joan Blanco (UAB, Barcelona)

09:50 - 10:30 hrs. Ponencia III: Infertilidad y genética: Producción de gametos a partir de células madre embrionarias.Ponente Dra. Anabel Marqués (C. de Investigación Príncipe Felipe, Valencia)


11:00 - 11:50 hrs. Comunicaciones Orales. (5)Moderadores: Montserrat Boada (Barcelona) - Ana Monzó (SEF)

11:50 - 12:35 hrs. Simposium Satélite. MediCult.

12:35 - 14:00 hrs. ASAMBLEA ASEBIR

14:00 - 16:00 hrs. Comida congresual

TARDE15:00 - 19:30 hrs. Apertura de secretaría.

16:00 - 16.40 hrs. Sesión Aula VirtualModeradores: Victoria Hurtado de Mendoza (Sevilla) – Jesús Zulategui (Valencia)Uso y aplicación de clínica de la luz polarizada en ReproducciónPonente: Gemma Arroyo (Institut Universitari Dexeus, Barcelona).

16:40 - 17:20 hrs. Sesión DebateModeradores: Victoria Hurtado de Mendoza (Sevilla) – Jesús Zulategui (Valencia)Mitos y Leyendas en el laboratorio de Embriología Clínica: Efecto perjudicial de la luz del laboratorio sobre los embriones humanos. Ponentes: Dr. Antonio Urries (Clínica Quirón, Zaragoza). Dr. Emilio Gómez (TAHE Fertilidad, Murcia).


17:40 - 17:55 hrs. Premio IVI al Mejor Póster 2009 (Auditorio III - Sala Póster)Dra. Amparo Ruiz ( IVI, Valencia)

17:55 - 18:00 hrs. Anuncio de los Premios ASEBIR - EMB 2009Sergio Oliveró (Dir. Gral. Grupo EMB) - Mª José de los Santos (Pta. Comité Organizador)

18:00 - 19:00 hrs. Comunicaciones Orales. (6)Moderadores: Arancha Galán (Valencia) - Jorge Ten (Alicante).

19:00 - 19:30 hrs. Exposición Premios ASEBIR-EMB 2007Moderadores: Mark Grossman i Camps (Pte. ASEBIR) Mª José de los Santos (Pta. Comité Organizador)

19:00 - 19:15 hrs. Premio ASEBIR-EMB de Investigación Básica 2007 “Incidencia de anomalías epigenéticas de los loci H19 y SNRPN en espermatozoides de individuos que consultan por problemas de fertilidad”Ponente: Dra. Marta Pladevall Sierra (UAB, Barcelona)

19:15 - 19:30 hrs. Premio ASEBIR-EMB de Embriología Clínica 2007 “Eficacia de la vitrificación de embriones: resultados en CREA tras dos años de experiencia”Ponente: Dra. Empar Ferrer Robles (CREA, Valencia)

19:30 - 20:00 hrs. Clausura V Congreso de ASEBIR 2009 por parte del Dr. Mark Grossmann, Presidente de ASEBIR y la Dra. Mª Joséde los Santos, Presidenta del Comité Organizador.

21:30 hrs. Cena de Clausura y entrega de los Premios ASEBIR-EMB 2009

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VIERNES, 27 DE NOVIEMBRE DE 2009


F O R M A C I Ó N C O N T I N U A D A

REGULACIÓN ENDOCRINA, AUTOCRINA YPARACRINA DEL OVARIO

Los ovarios, son los órganos portadoresde la línea germinal y se caracterizan porla sencillez de su arquitectura tisularpese a su complejidad funcional; estánconstituidos por un estroma medularcentral y una región cortical periféricaen la que se disponen los folículosováricos.

Los folículos ováricos están en continuocambio durante la vida reproductiva dela mujer y evolucionan desde el estadiode folículo primordial hasta el defolículo maduro. Los folículosprimordiales quedan constituidos en elperiodo prenatal y están formados poruna célula germinal rodeada de una capade células somáticas planas.

Por tanto, a nivel celular, el ovario estáformado por células germinales y porcélulas somáticas de funcionalidaddiversa que incluyen células epiteliales ycélulas estromales.

Estas últimas se clasifican en células detejido conectivo y células productoras dehormonas. Todas ellas establecenprocesos de interacción y adhesióncelular con otras células vecinas y/o conlos componentes de la matrizextracelular (MEC).

La MEC forma un entramado deproteínas, secretado por las propiascélulas del entorno, que se disponenentre las células del folículo y formanparte de la lámina basal. Además,algunas proteínas de MEC se encuentranen suspensión en el líquido folicular.

Todo ello da lugar a un soporte celularadecuado que garantiza unaarquitectura tisular óptima para eldesarrollo de gametos femeninosfuncionales.

Aunque la función principal del ovario esla producción de oocitos maduros,desempeña además, una funciónendocrina adicional mediante laproducción de hormonas esteroideasque, a su vez, juegan un papel esencialen la generación de oocitos por parte delpropio ovario (revisado en Oktem andOktay, 2008).

La actividad del ovario es cíclica y estábajo el control del eje hipotálamo-hipofisario. Por tanto, la función delovario está sujeta a regulaciónendocrina, a través de dos hormonas

PAPEL DE LOS FACTORES SOLUBLES EN FOLICULOGÉNESISTHE ROLE PLAYED BY SOLUBLE FACTORS IN FOLLICULOGENESIS

Paloma Sánchez-Aparicio1, Sierra Muñoz-García2, Jorge Cuadros1

1 Clínica de Medicina de la Reproducción y Ginecología, FivMadrid, Madrid, Spain 2 Unidad de Genómica, Parque Científico, Universidad Autónoma, Madrid, Spain Correspondencia: Paloma Sánchez-Aparicio, [email protected]ón: Este trabajo ha sido financiado en su totalidad por la Fundación FivMadrid

Junio 2009 Vol. 14 · Nº 137

RESUMEN

La foliculogénesis es el proceso de crecimiento y maduración folicular que culmina con la ovulación. Este proceso está sujetoa complejos mecanismos de regulación endocrina, autocrina y paracrina que conjuntamente garantizan la formación de oocitosmaduros. En este contexto, los factores solubles desempeñan un papel clave actuando de forma coordinada con los mecanismosde comunicación e interacción celular. En este trabajo llevamos a cabo una revisión exhaustiva de aquellos mediadores solublesque están involucrados en el proceso de la foliculogénesis.

Palabras Clave: hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, foliculogénesis

SUMMARY

The folliculogenesis is the process of follicular development and maturation which leads to ovulation. This process is subjectto complex mechanisms of endocrin, autocrin and paracrin regulation which all together ensure the formation of matureoocytes. In this context, soluble factors play a key role, operating in a coordinated fashion with the mechanisms of cellcommunication and interaction. In this work we review in detail those soluble factors involved in the process offolliculogenesis.

Key Words: hormones, growth factors, cytokines, folliculogenesis



Paloma Sánchez-Aparicio et al. Factores solubles y foliculogénesis

hipofisarias: la FSH (hormona folículoestimulante) y la LH (hormonaluteinizante). Estas dos hormonas estándirectamente implicadas en elcrecimiento y la diferenciación foliculary su papel estimulador sobre el ovariogarantiza la producción de hormonasesteroideas (progesterona, estradiol)que, a su vez, ejercen un efecto feedback sobre la hipófisis (revisado en Palermo, 2007).

Durante las etapas iniciales de un cicloovárico, la producción de hormonasesteroideas está disminuida, haciendoposible la liberación de FSH. Estahormona estimula el crecimientofolicular, y la presencia adicional de lahormona LH hace posible la producciónde hormonas esteroideas por parte dedichos folículos. Cuando el nivel de lahormona esteroidea estradiol se veaumentado, se produce un efectofeedback negativo sobre la producciónde gonadotropinas hipofisarias. Sinembargo, cuando se llega a alcanzar unnivel crítico de estradiol, este efectofeedback negativo cesa. Comienzaentonces un efecto feedback positivo,que permite alcanzar un pico máximo deconcentración de la hormona LH. Estaelevación de LH es la inductora final dela ovulación.

Además de la regulación endocrinadescrita, el ovario dispone de sistemasde regulación locales; algunas célulasespecializadas producen factores queparticipan en el control de célulasvecinas de la misma gónada (regulaciónparacrina), al igual que las secrecionesgeneradas por otras células permiten laautorregulación (regulación autocrina).Estos factores intra-ovario son capacesde modular, amplificando o atenuando,la acción hormonal sobre el propioovario.

Aunque la regulación funcional del ovarioestá controlada fundamentalmente porlas gonadotropinas hipofisarias, loselementos paracrinos y autocrinosparticipan en el complejo entramado defactores que hacen posible el desempeñode la función ovárica.

FOLICULOGÉNESIS

La foliculogénesis es el proceso decrecimiento y maduración folicular que

culmina con la ovulación y permite laformación de oocitos maduros. Esteproceso garantiza la producción decélulas especializadas de forma únicapara transmitir el genoma ageneraciones sucesivas. Por tanto, lameiosis constituye un mecanismoobligado que garantiza la constituciónde gametos haploides a partir de célulasgerminales diploides.

Durante el desarrollo embrionario, losfolículos primordiales quedanconstituidos, iniciándose este procesohacia la semana 16 de la vida fetal, yfinalizando antes de terminar lagestación. Estos folículos estánformados por un oocito detenido en laprofase de la primera división meiótica,rodeado por una capa única de célulasplanas de la granulosa y una membranabasal que aísla el conjunto del tejidoadyacente.

Estudios llevados a cabo con animalesexperimentales demuestran laimplicación de un factor clave eimprescindible en el proceso deconstitución de los folículosprimordiales. Se trata del factor detranscripción específico de oocitos FIG(factor de la línea germinal) (Soyal etal., 2000). Este factor determina elperfil de expresión génica propia delovocito y controla la regulacióntranscripcional de aquellos genesimplicados en la iniciación del desarrollofolicular, así como otros relacionadoscon la formación de la zona pelúcida(Dean, 2002).

Por tanto, al nacer, el ovario dispone deuna población finita de folículosprimordiales que permanecen en estadoquiescente durante un periodo detiempo extenso. Una vez alcanzada laedad reproductiva, un númerodeterminado de folículos primordialesreciben la señalización adecuada que leshace abandonar su estado de reposo yentrar en fase de crecimiento ydiferenciación celular. El destino de lamayor parte de los folículos reclutadosen este proceso es la apoptosis, y sólounos pocos llegan a competir por ser elfolículo dominante. El tiempo estimadohasta alcanzar la ovulación a partir de unfolículo primordial es aproximadamentede 90 días.

Durante el desarrollo folicular, losfolículos primordiales evolucionan y danlugar a los folículos primarios. Estosúltimos están constituidos por un oocitoque permanece detenido en la profasede la primera división meiótica, y estárodeado por una capa de células de lagranulosa que han cambiado sumorfología y presentan ya un aspectocúbico (Fortune et al., 2000).

En esta fase se establecen unionesintercelulares tipo gap junctions entrelas células de la granulosa y entre estasúltimas y el oocito. Estas unionesestablecen una comunicacióncitoplasmática directa entre célulasadyacentes que permite el intercambiode nutrientes, metabolitos y pequeñasmoléculas mediadoras. La señalizaciónresulta ser bidireccional, de forma que las células de la granulosa producensustancias que mantienen el oocito detenido en meiosis y,simultáneamente, el oocito liberafactores que controlan el crecimiento yla diferenciación de las células de lagranulosa circundantes (Gershon et al.,2008).

A continuación, las células de lagranulosa entran en mitosis sucesivas yvan disponiéndose en capasconcéntricas que están separadas delresto de las células estromales por lalámina basal. Cuando el número de capasconcéntricas es superior a tres, lascélulas estromales circundantes sediferencian y reciben el nombre de tecainterna. A su vez, las más alejadas, encontacto directo con la lámina basal, sellaman teca externa. El folículo recibe,entonces, la denominación de folículosecundario.

El proceso de crecimiento foliculardescrito hasta ahora es independientede la estimulación de las gonadotropinashipofisarias. Por tanto, estas etapasiniciales no están sujetas a regulaciónendocrina. Este patrón de crecimientocambia cuando las células de lagranulosa de algunos folículos empiezana expresar receptores de membrana parala hormona FSH. De este modo, unacohorte de folículos responde a laestimulación inducida por estahormona. Este momento se asocia a unincremento de los niveles de FSHsubsiguientes a la disminución de la

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producción de hormonas esteroideas porparte del ovario.

En su evolución, el oocito aumenta detamaño y se rodea de la zona pelúcida,las células de la granulosa continúanproliferando y aumentando el número decapas, y la teca sigue organizándose apartir de las células estromales.

Las células de la granulosa expresan yaun número considerable de receptorespara la hormona FSH. La proliferacióncelular pasa a ser dependiente de FSH, yesta hormona se convierte en laresponsable de la producción crecientede estrógenos por parte de las células dela granulosa. A su vez, la FSH actúa deforma sinergística con los estrógenos,promoviendo un aumento del número dereceptores de la FSH y estimulando laproliferación celular.

Sin embargo, es la presencia precoz deestrógenos en el entorno folicular lo quehace posible que los folículos seancapaces de responder a cantidadesreducidas de FSH. Este mecanismojustificaría la acción autocrina de losestrógenos en el ovario. Además,aunque sólo algunas células expresen ensu membrana receptores para FSH, lacascada de señalización activada puedepropagarse a otras células adyacentes,vía los canales intercelulares de las gapjunctions, haciendo posible lasincronización del comportamientocelular dentro del folículo.

Simultáneamente al cambioexperimentado por las células de lagranulosa foliculares, las células delestroma ovárico continúan con suproceso de diferenciación y organización.Las células situadas alrededor de lamembrana folicular, envolviendo lascélulas de la granulosa, generarán la tecainterna, y la capa de células más alejadas,con incipiente vascularización, generaránla teca externa. Cuando las células de lacapa interna de la teca se especializandefinitivamente se habla de folículospreantrales.

Además, en los folículos preantrales,como consecuencia de la acciónsinergística FSH/estrógenos, se producela acumulación de líquido folicular en losespacios intercelulares de la granulosa.El líquido folicular termina por

acumularse en un espacio únicodenominado antrum, que divide lascélulas de la granulosa en dospoblaciones distintas, espacial yfuncionalmente. Las células máspróximas al oocito se denominan célulasdel cúmulo y aquellas que se encuentrandelimitando la pared del antrum sellaman células de la granulosa murales.El líquido folicular acumulado permite laperfecta nutrición del oocito y lascélulas del cúmulo. Una vez que lacavidad del antrum ha quedadocompletamente definida, se habla defolículos antrales. Estos últimoscontinúan su evolución aumentando detamaño y recibiendo nutrientes ysuplementos a través de los capilaressanguíneos que irrigan la teca.

Finalmente, un único folículo alcanza elestadio de madurez y la superficie delovario, teniendo lugar la ovulación. Esteproceso está mediado por los niveleselevados de la hormona LH, que conducea la finalización de la primera divisiónmeiótica del oocito y a la liberación delprimer corpúsculo polar, y al inicioinmediato de la segunda divisiónmeiótica. Sin embargo, la finalización dela segunda división meiótica y laexpulsión del segundo corpúsculo polarsólo tendrá lugar si existe fecundacióndel oocito por un espermatozoide. Losrestos foliculares tras la ovulaciónsufrirán ciertas modificacionesinducidas por la LH, dando lugar a laformación del cuerpo lúteo.

FACTORES SOLUBLES

Los factores solubles son elementosbioactivos, de pequeño tamaño ynaturaleza proteica, que ejercen suacción biológica a través de receptoresde membrana expresados en las célulasdiana. Estos factores son sintetizadospor diferentes tipos celulares y actúancomo comunicadores químicos entrecélulas y tejidos.

Estos factores son pleiotrópicos ydesempeñan un papel relevante en elcrecimiento, la diferenciación y lasupervivencia celular. El grupo defactores solubles incluye, entre otros, lascitoquinas, los factores de crecimiento ylas hormonas.

Las citoquinas constituyen una familia

de glicoproteínas hidrosolubles, muydiversas en origen y función, quedesempeñan un papel clave en lacomunicación celular. Esta familiaengloba las linfoquinas, lasinterleuquinas y las chemoquinas. Cadacitoquina se une a su receptor demembrana, activando una cascada deseñalización intracelular que alcanza elnúcleo y termina por activar o silenciarla expresión de determinados genes. Secaracterizan por su considerableredundancia, pudiendo actuar sobre lapropia célula que las secreta (acciónautocrina), sobre las células vecinas(acción paracrina), o sobre células deregiones dístales que alcanzan víaplasmática (acción endocrina).

Los factores de crecimiento son péptidossecretados por distintos tipos celulares,que ejercen su función biológica como señalizadores extracelulares,estimulando la proliferación de suscélulas diana. Dichas células debenexpresar el receptor específico parapoder responder a determinado factorde crecimiento que ejerce su función deforma autocrina o paracrina.

Las hormonas son sustancias quedesarrollan su acción biológica en unnúmero considerable de procesos queincluyen la reproducción y ladiferenciación sexual. Una sola hormonapuede desarrollar varias funciones, ycada función puede ser controlada porvarias hormonas. La acción de lashormonas siempre tiene lugar a travésde receptores específicos expresados enlas células diana, y su efecto varía segúnsu patrón de expresión y concentración.

La naturaleza de las hormonas esvariable dependiendo de su origen,pudiendo derivar de amino ácidos,colesterol o fosfolípidos. Las másabundantes son las hormonas proteicascomo la FSH, la LH y la TSH, seguidas delas derivadas del colesterol como lashormonas esteroideas, producidas por lacorteza adrenal y las gónadas.

Las hormonas de naturaleza proteicadependen de la expresión génicainmediata, mientras que las derivadasdel colesterol requieren más bien de lapresencia de enzimas específicascapaces de convertir el colesterol en elesteroide apropiado. Esta últimas son

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menos solubles en agua que lasprimeras, de forma que circulan unidasa una proteína transportadora tipoalbúmina o globulina plasmática.

El tercer grupo de hormonas sonaquellas derivadas de la tyrosina o eltryptófano; una simple molécula detyrosina produce catecolaminas,epinefrina y norepinefrina.

FACTORES SOLUBLES IMPLICADOS EN LAFOLICULOGÉNESIS

Las etapas iniciales del proceso de lafoliculogénesis son independientes de laestimulación de las gonadotropinashipofisarias y, sin embargo, dependende los factores autocrinos y paracrinosproducidos localmente dentro del ovarioo incluso en el propio folículo. La bi-direccionalidad de la señalizaciónoocito-células somáticas circundantesresulta esencial para la funcionalidad deambos tipos celulares.

Durante la etapa reproductiva, losfolículos primordiales reciben laestimulación adecuada y abandonan suestado de quiescencia. Las células de lagranulosa adquieren morfologíacuboidal y se habla de folículosprimarios. A continuación, entran enintensa actividad mitótica y se vandisponiendo en capas concéntricasalrededor del oocito. Se habla entoncesde folículos secundarios.

Aunque los mecanismos precisos queinician el proceso de desarrollo ydiferenciación de los folículosprimordiales no se han establecido conexactitud, hasta la fecha se ha descritola implicación de tres factores intra-ovario:

Hormona anti-mülleriana (AMH).Sustancia producida por las células dela granulosa, con un papel esencial enel desarrollo folicular inicial. El nivelsérico de AMH se correlaciona con elnúmero de folículos en el ovario, yalgunos autores han sugerido lautilidad de la AMH como marcador de lareserva ovárica en casos de sub-fertilidad asociada a edad avanzada(Broekmans et al., 2008).

Activinas. Péptidos sintetizados por lascélulas de la granulosa, de los que se

conocen tres formas. Las activinas estánformadas por dos cadenas idénticas a launidad de las inhibinas, cuya actividades inversa a las activinas.

BMP-15 (bone morphogenetic protein15). Proteína que pertenece a lasuperfamilia de factores de crecimientodel TGF Expresada por los oocitos de losfolículos primordiales, actúa sobre lascélulas de la granulosa promoviendo suactividad mitótica. Su expresión semantiene en el oocito hasta el momentode la ovulación.

Asimismo, se han reportado otrosfactores sintetizados por el propiooocito, que actuarían como potentesreguladores de la proliferación y ladiferenciación de las células de lagranulosa. Entre ellos:

GDF-9 (growth differentiation factor 9).Factor de crecimiento que pertenece asuperfamilia del TGF Es de naturalezaproteica y es secretada por el propiooocito, y actúa sobre las células de lagranulosa alterando su expresióngénica, estimulando su actividadmitótica, su proliferación ydiferenciación. Determina el número defolículos destinados a desarrollarse yparticipa en la formación de gapjunctions de Cx43, que permiten lacomunicación citoplasmática directaentre las células de la granulosaadyacentes. Parece que desempeña unpapel clave en la evolución del folículoprimario a secundario, dado que en elratón knockout para GDF-9 el desarrollofolicular se paraliza antes de alcanzar elestadio de folículos preantrales. Otrosautores han descrito que el gradiente deGDF-9, sintetizado desde el oocito, seríaresponsable de la estratificación de lascélulas de la granulosa en el cúmulo delos folículos preantrales, promoviendo,a su vez, la formación y la integridad delcomplejo cúmulo-oocito induciendo -hyaluronan syntasa 2, pentraxin 3, TNF-e inhibiendo el activador deplasminógeno urokinasa.

BMP-6 (bone morphogenetic proteins6). Secretado por el oocito, su papel esimportante pero no imprescindiblesegún demuestra el análisis delknockout de este factor.

Otros elementos implicados en la

formación de los folículos secundarios sonlos procesos mediados por la interacciónkit-kit ligand (Driancourt et al., 2000; Huttet al., 2006; Thomas and Vanderhyden,2006) así como Kit ligand a través de lainteracción con GDF9 y BMP15.

El receptor de c-kit se expresa en lasuperficie de los oocitos mientras que kitligand se expresa en la membrana de lascélulas de la granulosa. En este estadiotambién desempeñan un papel relevanteotros factores secretados por las célulasde la teca como KGF (keratinocytegrowth factor), EGF (Epidermal growthfactor) y BMP-7 (bone morphogeneticproteins 7).

Es importante recordar que en latransición de folículos preantrales aantrales es cuando el oocito adquiere lacapacidad de reanudar el proceso demeiosis, hasta ese momento detenido enprofase de la primera división meiótica,e incorporar, a su vez, modificacionesepigenéticas esenciales.

Tanto en el caso de folículos preantrales,como en el de folículos antrales, lascélulas de la granulosa expresan yareceptores para la hormona hipofisariaFSH, siendo a partir del estadio defolículo antral cuando las células de lagranulosa expresan en su membranareceptores para la LH. La expresión deestos receptores hace posible el efectode la hormona LH sobre estas células,induciendo cambios esenciales en laexpresión génica preovulatoria eindirectamente promoviendo lafinalización de la primera divisiónmeiótica y la ovulación de un oocitomaduro que ha iniciado ya la segundadivisión meiótica.

En definitiva, el desarrollo hastafolículos preantrales dependeexclusivamente de la acción de factoresintra-foliculares de crecimiento ydiferenciación y, a partir de esta etapa,el desarrollo folicular pasa a serdependiente de las gonadotropinashipofisarias. A medida que el desarrollofolicular avanza, la acción de la hormonaFSH vía receptores de membrana vaadquiriendo una importancia creciente,siendo responsable de la proliferaciónde las células de la granulosa y de laproducción de la hormona esteroideaestradiol. Actuaría pues como potente

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factor de crecimiento y diferenciación paralos folículos pre-antrales y como factor desupervivencia para los folículos antrales.

Sin embargo, pese a la influenciaprioritaria de las gonadotropinas enestas etapas del desarrollo, durante elestadio preantral también se handescrito factores intra-ovario deespecial relevancia. Es el caso de lasactivinas, que actuarían como factor decrecimiento en el estadio de folículopreantral estimulando la liberación deFSH así como su acción en el ovario.

Durante la fase lútea temprana de unciclo ovárico existen folículospreantrales procedentes de ciclosprevios que se convierten en folículosantrales. En un ciclo posterior, aquellosfolículos no degenerados alcanzan lafase de selección y optan alreclutamiento folicular; una cohorte defolículos avanza en su desarrollo,aunque sólo uno de ellos será finalmenteseleccionado para alcanzar la madurez.

Los mecanismos responsables de laselección del folículo dominante vienendeterminados por el número dereceptores de FSH, la concentración dehormonas esteroideas y la presencia defactores de crecimiento específicos.

Durante las etapas más avanzadas deldesarrollo folicular, el número dereceptores de la LH se ve muyincrementado en las células de la teca yaparece de novo en las células de lagranulosa. Las inhibinas, a su vez,potencian el efecto de la hormona LHsobre las células de la teca y promuevenademás la síntesis de andrógenos.

En la última etapa del desarrollofolicular, el folículo dominante llega aalcanzar un tamaño de 20 mm, siendocreciente su producción de estradiol.Más aún, se produce la diferenciaciónfinal de las células de la teca y laexpansión del cúmulo por acción de losfactores GDF-9 y BMP-15, producidos porel oocito.

Por último, se produce la ovulación,después de la culminación de la primeradivisión meiótica, en la que desempeñaun papel relevante el factor BMP-15 quepromueve la separación de loscromosomas homólogos con la extrusióndel primer corpúsculo polar, y del iniciode la segunda división meiótica. Elfolículo residual dará lugar al cuerpolúteo con la participación de la LH.

CONCLUSIONES

La foliculogénesis es un proceso de unaextraordinaria complejidad, que estásujeto a una estricta regulación en laque están implicados factores extra-ovario e intra-ovario, siendo sucontribución relativa, variable ydependiente del estadio del desarrollofolicular. A su vez, las rutas reguladorasde estos factores concurren y seimbrican en los procesos directamenterelacionados con los mecanismos decomunicación e interacción celular.

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REFERENCIAS

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JUNIOXXX Congreso SEGOBARCELONADel 15 al 19 de Junio [email protected]

Curso Teórico Práctico de vitrificación con CRYOTOPOrganizado por el IVI Madrid AravacaFECHA: 15 al 16 de junio de 2009.INSCRIPCIÓN: www.ivi.es/ividocencia

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JULIO7th Annual Meeting International Society for Stem Cell Research (ISSCR)Julio, del 8 al 11. Barcelonahttp://www.isscr.org/meetings/index.cfm

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SEPTIEMBREI Workshop de biopsia y fijación de corpúsculo polarOrganizado por Centro de medicina EmbrionariaPeríodo de realización:Grupo I: 22 de SeptiembreGrupo II: 23 de SeptiembreInscripciones: Enviando la solicitud a [email protected] o directamente en la Web www.pgdcem.com

7th European Congress of Reproductive ImmunologySeptember 17-20 · Marathon, Greece

OCTUBREAmerican Society for Reproductive Medicine 65th Annual MeetingOctober 17-21 · Atlanta, Georgia. USAhttp://www.asrm.org/Professionals/Meetings/annualmeeting.html

NOVIEMBRE36 Symposium Internacional. Fertilidad 2009Noviembre 2-4 · USP Institut Universitari Dexeus. Barcelonahttp://www.dexeus.com

V Congreso Nacional ASEBIRNoviembre 25-27 · Valenciahttp://www.asebir.com/Vcongreso/

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C A L E N D A R I O

Calendario.



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El pasado 8 de Mayo se celebró, enMálaga, la Jornada SEF-ASEBIR sobrecontroversias en DGP que ambassociedades científicas organizaron conla colaboración de ANGELINI. Lasponencias se grabaron y está previstoque los patrocinadores las distribuyandurante los próximos meses.

COMISIÓN NACIONAL DE REPRODUCCIÓNHUMANA ASISTIDA

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CONVOCATORIAS ASEBIR 2009

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Cumplido el plazo de los cargos de la JuntaDirectiva, se convoca a todos los sociosinteresados en pertenecer al órganodirectivo a que propongan su candidaturapara las próximas elecciones, según losestatutos de ASEBIR Capítulo III,Apartado 1º, artículo16.

Los asociados interesados en presentarsu candidatura a la Junta DirectivaASEBIR deberán enviar a la secretaría dela asociación, a la atención de laSecretaria de la Junta, la siguientedocumentación:

· Carta de presentación de candidatura. · Candidatura.

· Lista cerrada de 12 miembros.· Debe cubrir todos los cargos de la Junta Directiva, especificando qué cargo ocupará cada uno de los miembros.

· Programa de actuación. · Avales.

· Mínimo 30 socios con nombre completo, DNI y firma original de cadaavalista.

El plazo de presentación de lasdiferentes candidaturas quedará abiertoa partir del 26 de septiembre de 2009 yse prolongará hasta el día 26 de octubrede 2009 a las 17:00 hrs.

Las votaciones se realizarán el día 26 denoviembre, dentro del marco del VCongreso ASEBIR de Valencia. Si algúnsocio tiene pensado no acudir al Congresoeste día, deberá realizar su voto por correoo utilizar la modalidad de voto delegado.Todos los formularios necesarios pararealizar el voto se encuentran en la Web delCongreso en formato PDF.

Se informará de los resultados de lasvotaciones y se presentará a la nuevaJunta Directiva durante la AsambleaGeneral Ordinaria del día 27 denoviembre de 2009.

SEDE DEL VI CONGRESO ASEBIR 2011

También queda abierto el plazo depresentación de candidaturas para laorganización del próximo congresoASEBIR en el año 2011, las candidaturasse podrán presentar hasta el día 1 deSeptiembre de 2009.

Los interesados deberán mandar a lasecretaría de ASEBIR, a la atención de laVocalía de Congresos, la siguientedocumentación:

· Datos de la persona responsable de la solicitud, incluido centro de trabajo y comité organizador local.

· Memoria con la trayectoria de la actividad en Biología de la Reproduccióndel comité organizador solicitante.

· Ciudad que representa la candidatura, especificando comunicaciones y disponibilidad de alojamiento.

· Sede del Congreso (especificar ubicación, espacios disponibles, etc.).

La nueva sede será presentada en laAsamblea General Ordinaria del día 27 denoviembre de 2009 dentro del marco delV Congreso ASEBIR de Valencia

Si precisáis más información podéisponeros en contacto con nuestra secretaríao consultar en la Web del Congreso.

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N O T I C I A S


1ª JORNADA DE FORMACIÓN ASEBIRSOBRE REPRODUCCIÓN ASISTIDA

ASEBIR, en un esfuerzo por cumplir elmandato estatutario de fomentar laformación continuada entre susmiembros, presenta la 1ª Jornada deFormación ASEBIR sobre ReproducciónAsistida, especialmente orientada a losembriólogos jóvenes.

Esta iniciativa nace con la voluntad dellegar a ser una actividad principal ennuestra sociedad, con carácter bienalalterna al congreso y dos objetivosconcretos: que los participantesaprendan en base a los manuales queASEBIR publica y que se conozcan ydebatan entre ellos.

Para esta 1ª Jornada de FormaciónASEBIR las sedes y fechas fueron lassiguientes:

Barcelona – 6 de Marzo de 2009Can Cortada

Madrid – 17 de Abril de 2009La Quinta del Marques de la Concordia

Sevilla – 15 de Mayo de 2009Hotel Cortijo El Esparragal

JORNADAS ACREDITADAS

Para estas Jornadas se solicitó laacreditación a la Comisión de FormaciónContinuada de las Profesiones Sanitariasde la Comunidad de Madrid y fueconcedido 1 crédito, lo que refleja elalto nivel del programa científico ya quepara un Curso de una sola Jornada lonormal viene siendo entre 0,50 y 0,75créditos.

PONENTES Y MODERADORES

Como ponentes contamos con lainestimable participación de:

Dr. Miguel Ruiz (CREA, Valencia), con laexposición “Actualización en elLaboratorio de Andrologia”.

Dr. Fernando Abellán (Derecho SanitarioAsesores, Madrid), con la exposición“Aspectos Jurídicos de TRAs, exposiciónde casos prácticos”.

Dr. José Antonio Castilla (H. U. Virgen delas Nieves, Granada), con la exposición“Calidad Embrionaria. CatalogaciónASEBIR, casos prácticos y test de controlde calidad”.

Y como moderadores actuaron miembrosde la Junta directiva de ASEBIR:

En Barcelona moderaron la jornada elPresidente de ASEBIR, Dr. MarkGossmann i Camps (Centro MédicoTecknon) y la Dra. Montserrat Boada(Institut Universitari Dexeus)

En Madrid moderaron el Dr. Jorge M.Cuadros (Clínica FIV) y el Sr. ManuelArdoy (H. U. Gregorio Marañón), y En Sevilla fue moderadora de laJornada la Vicepresidenta de ASEBIR,Dra. M. Victoria Hurtado de Mendoza(CEHISPRA).

PATROCINIOS

Las Jornadas también contaron con elpatrocinio de Angelini y Cook, sin cuyacolaboración no hubiera sido posiblehacer este despliegue.

ASISTENTES

El número de asistentes por Jornada sehabía limitado a 25 personas, perofinalmente la distribución fue lasiguiente: Barcelona – 26 alumnos;Madrid – 23 alumnos, y Sevilla – 25alumnos.

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N O T I C I A S

Noticias.


N O T I C I A S


La mayoría socios de ASEBIR, perocontamos con un total de 17 asistentesque no son asociados, pero quemostraron su interés en formar parte denuestra asociación si estos Cursos serepiten de forma periódica.

VALORACIÓN DE LAS JORNADAS POR LOSASISTENTES

Con el fin de evaluar las Jornadas, sepaso a los asistentes un brevecuestionario en el que se les pedía queseñalasen con una cruz en la escala de 0a 5 su grado de satisfacción en cada unode los siguientes aspectos.

En las encuestas las puntuaciones dadaspor los asistentes se han concentrado,en su gran mayoría, entre los valores 3 y5, siendo el nivel del profesorado lo másvalorado por los asistentes.

También se les pidió que indicaran suscomentarios o sugerencias siendo lo másdestacable: El deseo de que se haganmás cursos, pero con una duración dedos días, para profundizar en algunostemas; repetir las jornadas y dividirlas enAndrología y Embriología; o dedicar mástiempo de discusión y preguntas.

Las comparativas de las encuestas sonlas siguientes:

VALORACIÓN DE LAS JORNADAS PORMARK GROSSMANN

La Dra. M. Victoria Hurtado de Mendozay yo mismo, como responsables deASEBIR y avaladores de esta iniciativaformativa, estamos muy satisfechos delos resultados y agradecemosenormemente y públicamente elesfuerzo de los tres ponentes ya queellos son el Alma Mater de esta Jornada:ellos han conseguido, con unascomunicaciones ambiciosas y actuales,captar el interés de los asistentesdurante todo el día y hacer útil estaempresa.

Para esta actividad pedimos a lasecretaría de ASEBIR que seleccionaraespacios singulares y acogedores parafacilitar la interacción entre losasistentes. Como siempre nuestrasecretaría estuvo a la altura: coordinóperfectamente la logística y acertó enlas sedes.

Agradecer, finalmente, el apoyoeconómico de Cook y Angelini, másespecialmente en este año que tambiénorganizamos el Congreso ASEBIR. Sin suparticipación no hubiésemos podidoponer en marcha este proyectoformativo. Para las próximas ediciones,proponemos alternar Congreso los añosimpares con Jornada en los años pares yasí dar aire a la carga formativa yeconómica.

Como decía al principio, estamos muysatisfechos ya que, además de la calidadde la Jornada, conseguir que en suprimera edición se llegue a 74 alumnos“júnior” es ¡todo un éxito! que da alas anuestras sociedad.

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I N F O R M A C I Ó N P A R A L O S A U T O R E S

Normas de publicación.

NORMAS DE PUBLICACIÓN

La revista ASEBIR es una publicación delámbito de la Biología de la Reproducciónabierta a considerar cuantos trabajosafines a esta área de conocimientopuedan adaptarse a uno de lossiguientes apartados: ArtículosOriginales; Temas de Actualización oDebates. Además, la revista ASEBIR dacabida a la actualidad en sus seccionesde Noticias y Agenda.

La revista ASEBIR se publicasemestralmente por lo que esindispensable que los escritos para lassecciones de Debates, Noticias y Agendasean enviados antes del 30 de Abril parael primer número del año (Junio) y antesdel 15 de Noviembre para el segundonúmero del año (Diciembre).

Los originales deben enviarse a:

Secretaría de ASEBIR, C/ Cronos 20,Edificio 4, 1º Piso, 6ª. 28037 (Madrid).Se recomienda utilizar sobres queprotejan adecuadamente el contenidoinformático.

Manuscritos: Todos los trabajosremitidos deberán ser inéditos y sepresentarán en un manuscrito original ydos copias impresas, a doble espacio enhojas din A4, así como también ensoporte informático. Se acompañarán deuna carta de presentación en la que sesolicite su valoración y se indique lasección donde se desea su publicación.En esta carta debe constar claramenteque el trabajo no ha sido publicadopreviamente y que todos los autoresestán de acuerdo en su contenido yceden los derechos de su publicación aASEBIR. Para la reproducción dematerial ya editado es necesaria laautorización expresa de los propietariosdel copyright.

Para artículos originales y temas deactualización se sugiere una extensiónno superior a las trece hojas din A4 a 30líneas, con no más de seis figuras y seistablas.

En la primera página de todos lostrabajos se indicará, en el siguiente

orden: título en castellano; título eninglés; nombre y un apellido de cada unode los autores y nombre completo delcentro, con la dirección paracorrespondencia, incluido correoelectrónico. En la segunda página seincluirá un resumen y las palabras clave(ambos en castellano e inglés). Laestructura de los manuscritospreferentemente deberá organizarse enlos apartados de Introducción, Materialy Métodos, Resultados, Discusión,Agradecimientos, Bibliografía, Tablas yGráficas. Las tablas se numerarán connúmeros romanos y las figuras connúmeros arábigos. Los pies de figura seimprimirán en hoja aparte y cada figurallevará escrito en el dorso sunumeración.

Las citas bibliográficas deben serdirectas, consignándose en el texto elnombre del autor o de los dos autores yel año (Ej.: Smith, 1993 o bien Smith andMichigan, 1997) y si son más de dosautores consignándose el primeroseguido de "et al.," (Ej.: Smith et al.,1998). Para agrupar varias citas seencadenarán con ";" (Ej.: Smith andMichigan, 1997; Smith et al., 1998).

Las referencias bibliográficas sepresentaran en la sección de Bibliografíapor orden alfabético siguiendo lasnormas del International Committee ofMedical Journal Editors 5th edition(dichas normas se pueden consultar enJAMA 1997; 277:927-934). Los nombresde las revistas se abreviarán de acuerdocon el estilo usado en el Index Medicus(que se puede consultar en la List ofJournals Indexed que se incluye todoslos años en el número de enero). Acontinuación se dan un ejemplo deformato de citas bibliográficas:

A) Artículo de revista con menos de 6autores:

Lewis SE, Moohan JM, Thompson W.Effects of pentoxifylline on humansperm movility in normospermicindividuals using computer-assistedanalysis. Fertil Steril 1993;59:418-423.

B) Artículo de revista con más de 6autores:

Marrama P, Baraghini GF, Carani C, Celani MF, Giovenco P, Grandi F, et al.Further studies on the effect ofpentoxifylline on sperm count andsperm movility in patients withidiopathic oligo-asthenozoospermia.Andrologia 1985;17:612-616.

C) Libro completo:Colson JH, Armour WJ. Spermatogénesis.2º ed. Londres: Delmar Publishers;1996.

D) Capítulo de libro:Siracusa G, Felici M, Salustri A.

Meiotic maturation of the mammalianoocyte. En: Ach RH, Balmaceda JP,Johnston I, editors. Gamete Physiology.2º ed. New York: Raven Press; 1990. p.129-144.

E) Comunicación a congreso:Bengston S, Solheim. Hatching assisted.XXII Meeting of European Society ofHuman Reproduction and Embriology;1997 Jun20-23; Roma, Italia. p. 1561-2.

Para la sección de debate se aceptarántextos (de no más de dos hojas din A4 a30 líneas, incluidas un máximo de cincocitas bibliográficas y dos figuras si lashubiere), que reflejen la opinión de

los diferentes firmantes sobre el tema dediscusión que se propondrá en el númerode la revista anterior.

Para las secciones de noticias y agendase aceptarán escritos que informen decongresos u otros eventos relacionadoscon la Biología de la Reproducción o laactividad asociativa de ASEBIR siempreque identifiquen de manera clara losorganizadores de los mismos.

INFORMACIÓN PARA LOS AUTORES - NORMAS DE PUBLICACIÓN48


B O L E T Í N D E I N S C R I P C I Ó N

DATOS PERSONALES:

D./Dña.:Domicilio: C.P.:Ciudad: Teléfono: Móvil:E-mail:Formación básica (Médico, Biólogo, Farmacéutico, etc...):Grado académico (Licenciado, Doctor, Especialista en ..., etc.):

CENTRO DE TRABAJO:

Domicilio profesionalCalle: C.P.:Centro de trabajo: Departamento:Ciudad: Teléfono.: Fax.:E-mail:

¿Desea pertenecer como miembro numerario a la asociación para el estudio de la biología de la reproducción, ASEBIR?

DATOS BANCARIOS:Banco/Caja: Agencia:Nº de cuenta: Provincia:Desea recibir la correspondencia en: Dirección particular Dirección de trabajo

FIRMA FECHA

Enviar a: Secretaría ASEBIR C/Cronos Nº20 Bloque 4, Planta 1ª, Nº6, 28037 Madrid.

HOJA DE ORDEN DE PAGO BANCARIO (EJEMPLAR PARA EL BANCO)Sr. Director de la Agencia Nº: Banco/Caja:C/ Provincia:Ruego a Ud. se sirva cargar en:Nº de cuenta:

Los recibos que le presente al cobro la ASOCIACIÓN PARA EL ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN

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Revista Asebir junio 2009

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