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Metodologías para la determinación estructural de fármacos y el estudio de fenómenos de

reconocimiento molecular

Programa de doctorado en Química Médica

1USP-CEU

RMN de proteínasJavier Pérez Castells

RMN de proteínas

• ¿Porqué estudiar la estructura 3D de proteínas?– Porque son dianas terapéuticas– Porque el diseño de pequeñas moléculas que interaccionen con

ellas exige conocer su estructura– Además la RMN nos da información dinámica

• ¿Puede la RMN sola, dar una estructura 3D?

2USP-CEU

• ¿Puede la RMN sola, dar una estructura 3D?– Muy difícil. Con la RMN podemos situar protones en el espacio

fundamentalmente a partir del efecto NOE.– Pero ya en péptidos relativamente pequeños necesitamos un apoyo

de programas que nos construyan una estructura.– Combinar el resultado con modelado molecular es imperativo para

tener resultados fiables y especialmente para extraer información dinámica.

•Estudio de estructura 3D de macromoleculas, en particular proteínas y carbohidratos.

• Posiblemente la RMN es la técnica más potente en la elucidación estructural de proteínas, aunque no es la única:

• Los datos de rayos-X nos dan una imagen que puede ser considerada complementaria a la RMN. Cuando se logran, los cristales dan imágenes muy

RMN de proteínas

3USP-CEU

complementaria a la RMN. Cuando se logran, los cristales dan imágenes muy completas de la proteína sin embargo hay que tener en cuenta que:

•Es más rápida que los rayos-X porque no necesitamos cristales. Esto nos evita la difícil fase de cristalización que muchas veces no se logra.

• Nos da la estructura 3D en agua, que es el disolvente donde ocurren las reacciones biológicas

• Nos da información sobre la dinámica de la molécula. No es una imagen estática.

• Repasemos un poco de bioquimica…20 aa proteinogénicos (resíduos)

Estructura de proteinasEstructura de proteinas

4USP-CEU

• La estructura primaria de la proteína es la secuencia de aminoácidos que la forman. Siempre la escribimos del NH2 libre al COOH libre:

N

O

A A 3O

AA 2 H

NN

O

A A 1

H

Hαααα Hαααα

Hαααα

N

H

residuo


5USP-CEU

• Entre cada AA tenemos grupos C=O. O sea, el sistema de espines de cada AA esta aislado del de los otros.

• El espectro 1H de la proteína sería una superposición de los espectros de los AA aislados, pero las pequeñas variaciones de desplazamiento químico ocasionadas por el entorno 3D nos permiten estudiarlas por RMN…

A A 3OA A 1 HHαααα Hαααα H

enlacepeptídico


NH2CH

R1

C

O

N

H

CHC

O

NCH

R2

R3

COOH

C-terminal

Enlaces peptídicos

6USP-CEU

Organización local: estructura secundaria . Los elementos más comunes de estructura secundaria son la αααα-hélice y la lámina ββββ (paralela o anti):


7USP-CEU

• Otro elemento importante de estructura secundaria es el giro ββββ, que permite a la cadena cambiar de dirección:

• La estructura terciariaes cómo los distintos elementos de estructura secundaria se organizan espacialmente entre


8USP-CEU

ellos. Resolverla es nuestro objetivo

Determinación de la estructura 3D

• ¿Qué información obtendremos/necesitaremos de los espectros de RMN?– Información de desplazamiento químico– Constantes de acoplamiento siempre intra-resíduo– Distancia espacial entre protones con el efecto NOE.

9USP-CEU

– Distancia espacial entre protones con el efecto NOE.

• Si trabajamos con proteínas no marcadas los experimentos a utilizar serán fundamentalmente:– TOCSY– NOESY

• Si está marcada podemos añadir una 3ªD con correlaciones INEPT

Lo que el conjunto de NOEs nos da:

• Situar los protones espacialmente

• Previamente sabemos quien es quién

• Hay que tener en cuenta que el NOE no es una magnitud fácilmente predecible. Depende de muchas cosas

10USP-CEU

predecible. Depende de muchas cosas y hay efectos como la difusión de spin que pueden hacer que aparezcan NOEs falsos u otros que hagan que no aparezcan

•Por eso exigimos redundancia y criterios de calidad a través de programas de cálculo.

Estructura 3D

• La asignación de frecuencias se hace con experimentos TOCSY o COSY. Necesitamos una cierta dispersión de desplazamientos químicos.• Localizamos NOEs intra residuo y entre resíduos consecutivos para asignarlos (estrategias de Wütrich)

11USP-CEU

asignarlos (estrategias de Wütrich)• Cuantificamos los NOEs y los de larga distancia. Podemos medir constantes de acoplamiento.• Usamos restricciones de ángulo y distancia para determinar estructuras secundarias.

12USP-CEU

13C y 15N también son activos para RMN e interactúan con los 1H

Bo CHH

H

En proteínas más grandes

La magnetización puede trasferirse entre 1H, 13C y15N para establecer conectividades

13USP-CEU

Bo

N

H

C

H

C

C

H H H

N

H

C

H

C

C

HH

H

N

H

C

H

C

C

HH

H3D HSQC - NOESY para contactos inter-resíduo

14USP-CEU

N

H

C

H

C

C

HH

H HNCAHNCOCAHNCOCACB etcHSQC-TOCSY

Todos usan trasferencias INEPT

N

H

C

H

C

C

HH

H

• Lo primero que tenemos que saber es dónde aparecen los picos de los 1Hs de los aminoácidos en el espectro: Como están muy cerca unos de otros, necesitamos hacer espectroscopia 2D para poder resolver las señales.

Aromaticos agua

Determinación de la estructura de proteínasDeterminación de la estructura de proteínas

15USP-CEU

• Inputs:– Para poder determinar la estructura de una proteína por RMN necesitamos

saber la estructura primaria de la proteína.

– Enlaces disulfuro.

Iminas Amidas HCββββ, γγγγ, δδδδ, ...HCαααα

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Cα

CH3

Helice lámina

C=O 175 ppm 172 ppmC 52 ppm 48 ppm

Los desplazamientos químicos (1H, 13C, 15N) son sensibles a los ángulos de torsión φ y ψ

Desplazamiento químico

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NH

CCα

OH

C=O 175 ppm 172 ppmCα 52 ppm 48 ppmCβ 15 ppm 20 ppm

Para la alanina

Relación entre acoplamiento escalar y estructura secundaria J-couplings

3JHNα

NH

CCα

O

CβH

H

3JHNα = 6.4 cos2θ - 1.4 cosθ + 1.9 con θ = |φ - 60°|

Constantes de acoplamiento

17USP-CEU

3JHNα

2

4

6

8

10

-160° -120° -80° -40° 0°

φ

β

αα-helice (φ = -57°), 3JHNα = 3.9 Hz310helice (φ = -60°), 3JHNα = 4.2 HzLámina β antiparalela, (φ = -139°), 3JHNα = 8.9 HzLámina β paralela, (φ = -119°), 3JHNα = 9.7 Hz

•La constante de acoplamiento 3J esta relacionada con el ángulo diedro por la ecuación de Karplus; la ecuación es una suma de cosenos, y dependiendo de la topología (H-N-C-H ó H-C-C-H ) tenemos distintos parámetros:

3JNαααα = 9.4 cos 2( φφφφ - 60 ) - 1.1 cos( φφφφ - 60 ) + 0.4

3Jαβαβαβαβ = 9.5 cos 2( ψψψψ - 60 ) - 1.6 cos( ψψψψ - 60 ) + 1.8


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• Los parámetros han sido derivados de moléculas rígidas y datos de rayos-X. Gráficamente:

φφφφ - 60

3 J (

Hz)

• ¿Como medimos las 3J? Si tenemos pocos aminoácidos, directamente del 1D. También las podemos medir de espectros HOMO2DJ, o de espectros tipo COSY de alta resolución (MQF-COSY y E-COSY).

• El problema mas grande de la ecuación de Karplus es que introduce ambigüedades. Si tenemos acoplamientos 3JNαααα menores de 4 Hz vemos que podemos tener hasta 4 valores posibles para el ángulo φφφφ:

9.4


19USP-CEU

• En estos casos podemos hacer dos cosas. Una es tratar de determinar la estructura usando solo NOEs y después confirmar lo que nos da con los acoplamientos J.

9.4

0.0

5.0 ~ -60 ~0 ~110

4.0

~170

φφφφ - 60

Otra cosa que se puede hacer es usar solo los ángulos que son mas comunes que conocemos de estructuras de rayos-X. Para φφφφ, los ángulos ‘estandar’ tienen valores negativos de ~ -60 y ~ -170). Usando rangos:

3JNαααα < 5 Hz -80 < φφφφ < -403JNα α α α > 8 Hz -150 < φφφφ < 170 (-190)


20USP-CEU

• Para las cadenas laterales hay que elegir entre tres posibles rotámeros (como en etano…). Como se pueden medir dos acoplamientos 3Jab (hay 2 protones ββββ), nos

permiten elegir el confórmero adecuado:N

NN

C’C’

C’HααααHαααα

Hαααα

Hββββ1 Hββββ2Cγγγγ Hββββ1

Hββββ2

Hββββ1CγγγγHββββ2

Cγγγγ

3Jαβαβαβαβ1 < 5 Jαβαβαβαβ2 > 83Jαβαβαβαβ1 ~ 3Jαβαβαβαβ2 < 5

Asignación de la secuencia

Fases en la determinación de la estructura

Núcleos: H, 13C, 15NUso de peptidos naturales

Frente a marcados

Escala de tiempos:

Aparición de los N-H y O-HEn espectros en D2O

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Estructura secundaria

Estructura 3D completa

Gran detalleInformación en disolución

Datos sobre flexibilidad de diferentes regiones

Escala de tiempos:Dependiendo de la velocidad Pueden verse más de un set

Señales (Pro).

• Un TOCSY nos permite identificar todo un sistema de espines. Como en proteínas, cada aminoácido nos va a dar una línea independiente en el TOCSY empezando en el NH hasta el ultimo protón de su cadena lateral, es idóneo.

• Las únicas excepciones son Phe, Tyr , Trp , e His, donde el sistema de espines de la cadena lateral esta dividido en dos por un carbono cuaternario, pero nos

Asignacion de sistemas de espines

22USP-CEU

de la cadena lateral esta dividido en dos por un carbono cuaternario, pero nos apoyaremos en el NOESY.

•No sólo hay que reconocer el sistema de spin sino colocarlo en la secuencia, ahí entra el NOESY. Se basa en que hay correlaciones NOE características de 1Hs del residuo i a los de residuos (i ± 1).

• Con suerte podemos asignar todas las señales a aminoácidos, pero lo más probable es que nos queden algunas sin asignar porque estén solapadas. Si pasa esto necesitamos mas dimensiones y/o proteína marcada.

Patrones NOE caracteristicos típicos son correlaciones interesidualesy secuenciales, que corresponden con NOEs entre protones de un residuo a protones de residuos (i ± 1):

dααααNdNNdαααααααα

Asignacion de sistemas de espines

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N

O

AA 3O

AA 2 H

NN

O

AA 1 H

H

Hαααα Hαααα

Hαααα

N

H

dααααααααdαβαβαβαβ, dαγαγαγαγ, …dNββββ, dNγγγγ, …

Determinación de la estructura secundaria

• Aparte de estos, regiones de estructura secundaria definida

van a dar NOE caracteristicos. En αααα-helicesy láminas ββββ:

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i+4i+3

i+2

ii-1

C

N

C

N

N

C

N

C

dαααα(i)N(j)

i+1

dαβαβαβαβ(i, i+3)dααααN(i, i+3)dNN(i, i+3)dααααN (i, i+4)

• Se elige un residuo cuyas señales estén bien resueltas en el TOCSY y se busca en el NOESY correlaciones NOE de sus protones a protones en otros sistemas de spines.

• Después de encontrar esos, volvemos al TOCSY para identificar a que residuo corresponden las correlaciones que vimos en el NOESY. Y los situamos en la cadena.

Asignacion de sistemas de spin

25USP-CEU

TOCSY NOESY

LeuAla

AsnGly

NH

HC

LeuAla

AsnGly

NH

HC

• Una vez asignadas las señales, se integran para cuantificar los NOEs:

• Los datos (NOE y desplazamientos) pueden completarse con valores de acoplamientos y se introducen en un programa que busca αααα-hélices, láminas β, y después determina las zonas de estructura menos definida.

•El programa nos devuelve un modelo teórico generado por computadora, mejor

Cálculo de la estructura

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•El programa nos devuelve un modelo teórico generado por computadora, mejor nos da tantas estructuras posibles como queramos que representan posibles conformaciones. En realidad lo que sacamos son los mismos datos de RMN pero mejorados.

•En este punto es bueno combinarse con el modelado molecular. Utilizamos un programa de modelado que combine un campo de fuerzas con los datos de RMN que hemos obtenido, refinamos las estructuras.

• Como ninguna de estas estructuras se puede descartar, lo que hacemos es presentarlas como un set de estructuras de baja energía superpuestas en las regiones mas rígidas:

•En esta solo mostramos los átomos pesados

C-terminal

N-terminal

Resultados

27USP-CEU

•En esta solo mostramos los átomos pesados del esqueleto peptídico. La flexibilidad de ciertas regiones indica una falta de estricciones NOE, y refleja que esa parte de la molécula es algo más flexible en solución.

N-terminal

• Los puentes de hidrógeno permiten que zonas del péptido relativamente distantes en la cadena pero que queden cerca uno de otro en el espacio estén unidas. Son muy comunes en proteínas, y si se identifican constituyen una restricción estructural importante.

• Los puentes-H mas interesantes son entre los protones NH y carbonilos del esqueleto peptídico, como los que vemos en α-helices y láminas β. También son posibles entre cadenas laterales (Asn, Asp, Gln, Glu) y grupos CO y NH del

Busqueda de puentes de hidrógeno

28USP-CEU

posibles entre cadenas laterales (Asn, Asp, Gln, Glu) y grupos CO y NH del esqueleto peptídico:

•Una forma experimental de determinarlos es estudiar las velocidades de intercambio de los protones NH, lo que además nos da info sobre la exposición del protón al disolvente.

4.0t = 0 (Sin D 2O)

Velocidad de intercambio de amidasVelocidad de intercambio de amidas

•Agregamos D2O (más

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4.0

4.0

(Hαs)

8.0 (NHs) 7.0

D2O

t1

t2

•Agregamos D2O (más del 10% que siempre hay) a una solución de nuestra proteína en H2O y tomamos espectros a distintos tiempos vemos que las señales de los NH desaparecen a distintas velocidades.

•Si estamos seguros de un enlace de hidrógeno lo podemos usar como una restricción estructural en la generación del modelo 3D.

• Aun así solo conocemos al dador del puente-H, no cual es el C=O aceptor. Si erramos en esto, el resultado es catastrófico: obtendremos una estructura incorrecta.

• Si decidimos que es razonable, podemos usar los puentes-H en los cálculos como


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• Si decidimos que es razonable, podemos usar los puentes-H en los cálculos como una restricción de distancias:

• rPH-ideal es ~2.5 Å. Como los puentes-H también tienen una componente angular (el ángulo N-H…O tiene que estar entre 135 y -135), podemos hacer el termino EHBmas complejo para incorporar esto también …

EHB = KHB * ( r i - rHB-ideal )2

• Los péptidos pequeños intercambian en tiempos más cortos (minutos en vez de horas).

•En esos péptidos, en vez de estudiar velocidades de intercambio podemos analizar los cambios de desplazamiento químico de los NH con la temperatura.

• Cuanto más expuesto es el protón NH, más rápido será su intercambio con los


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• Cuanto más expuesto es el protón NH, más rápido será su intercambio con los protones del agua, lo que apantalla la señal.

•Valores por debajo de -2 ppb por grado indican que está protegidos del disolvente, entre -2 y -5 ppb que está parcialmente protegido (puede haber un puente-H parte del tiempo), y por encima de -6 el protón NH esta completamente expuesto al agua.

• Como no podemos determinar cual es el aceptor (qué oxigeno), tenemos que tener cuidado si queremos usar esta información para imponer restricciones…


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• Peptido: Ala-Arg-Pro-Tyr-Asn-Aic-Cpa-Leu-NH 2:

El NH de la Leu forma un puente-H parcial

Aic: 2-aminoindane-2-carboxylic acidCpa: Ciclopentylalanine

Como es arriesgado usar datos de puentes-H antes de los cálculos podemos utilizarlos después de tener las estructuras 3D para descartar las estructuras en las que NHs que sabemos que están involucrados en puentes-H no aparezcan en puentes-H.

• También los podemos usar directamente si tenemos datos de NOE y 3Js complementarios, como ser en casos que tengamos hélices-α y láminas β bien definidos. El problema son los giros β.

Puentes de hidrógeno

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definidos. El problema son los giros β.

• Podemos probar todos los aceptores razonables posibles en simulaciones independientes y ver cuales son los que nos dan menor energía:

O OOH

O OOH

O OOH

O OOH

E1

E3

E2

• Para péptidos y proteínas pequeños (~ 10 KDa,~ 80 aminoácidos) con el péptido nativo podemos identificar los NOEs, y medir la mayoría de los acoplamientos 3J con TOCSYs, COSYs, y NOESYs. En moléculas mas grandes (> 10 KDa), el solapamiento se torna problemático. Muchos residuos quedan sin identificar, y no podemos asignar partes del esqueleto peptídico.

• Si marcamos con 15N o 13C la proteína podríamos editar los espectros en base a ellos, o agregar una tercera(y tal vez cuarta) dimensión.

Marcaje isotópico

34USP-CEU

ellos, o agregar una tercera(y tal vez cuarta) dimensión.

•¿Cómo se hace?

- Necesitamos a un biólogo molecular que prepare un plásmido con el gen, normalmente usando E. coli como vector, y se pueda sobreexpresar. La proteína sobreexpresada tiene que ser funcional. El 85% de las veces la proteína se sobreexpresa pero precipita …y purificar.

• Si resolvemos todo, hacemos crecer al vector con el plásmido en medio enriquecido isotópicamente. Generalmente, un medio que solo tiene NH4Ac y glucosa como fuentes de N y C.

• Si queremos proteína marcada con 15N, usamos 15NH4Ac (es barato). La glucosa-U-13C es mas cara. Así obtenemos proteína marcada parcial o totalmente, (15N) o todos (13C=O, 13Cα, 15Ns). Los núcleos del esqueleto peptídico tienen actividad de RMN.

Marcaje isotópico

35USP-CEU

(13C=O, 13Cα, 15Ns). Los núcleos del esqueleto peptídico tienen actividad de RMN.

1 3 C1 3 C

1 5 N1 3 C1 3 C1 5 N

1 3 C1 3 C

15 N

O

A A 3O

A A 2O

A A 1 H

HH

• Teniendo la proteína marcada en con 15N hacemos una correlación heteronuclear 1H-15N. Hacemos un HSQCo HMQC.

• Un conjunto de señales solapadas en un bidimensional se dispersan en la 3D

7.0

Marcaje isotópico

36USP-CEU

• También sirve para medir velocidades de intercambio de amidas.

15N δδδδ

1H δδδδ

“0”

7.0

8.0

185.0 165.0

•Los principios de la espectroscopia 3D son los mismos que los de la 2D. De la misma forma que el tiempo de evolución t1 nos da la segunda dimensión f1, podemos agregar otro tiempo de evolución y obtener un tercer eje de frecuencia (3D):

• Para un 2D teníamos:

Evolución Adquisición

Espectroscopía RMN 3DEspectroscopía RMN 3D

37USP-CEU

• En un 3D tenemos:

PreparaciónEvolución

(t1)Adquisición

(t2)Mezcla

PreparaciónEvolución

(t2)Adquisición

(t3)Mezcla

(2)Evolución

(t1)Mezcla

(1)

f1 f2

f1 f2 f3

90 90

t1 tm

90s

•Es como excitar selectivamente solo a ciertos protones NH de la muestra. Solo los protones acoplados con estos protones nos darían picos de cruce:

• Es decir sería como una excitación selectiva seguida por un experimento


38USP-CEU

• Es decir sería como una excitación selectiva seguida por un experimento TOCSY 2D. Nuestro 2D solo va a tener una franja que corresponde a la amida que elegimos. Para una Leu:

• Y luego vamos cambiando gradualmente la frecuencia del pulso selectivo

NH

Hα α α α Hββββ Hγγγγ Hδδδδ

• Si apilaramos los espectros 2D plano tendría únicamente las conectividades de un sistema de espines aislado:

Frecuencias deNHs resueltas


39USP-CEU

• La correlación 1H-15N es ideal para esto, porque la mayoría de los cross-peaks están bien resueltos en la dimensión de 15N.

Frecuencias de 1H alifaticas

•En un 3D hay picos de cruce debidos a transferencia de polarización entre los núcleos que tenemos en las 3 dimensiones.

• Un 3D que combine a una correlación 15N-1H y un TOCSY tendría esta apariencia. Mirar este cubo es difícil con 200 amidas. En general solomiramos planos a distintas frecuencias de 15N.


40USP-CEU15N δδδδ

1H δδδδ

1H δδδδ

Así se entresacan planos:


41USP-CEU

• Puede ser una ayuda para determinar sistemas de spin al principio del proceso de asignación. Lo hacemos con una excitación selectiva que actúe solo en parte de los spines del péptido:

• Un pulso no selectivo es corto y rectangular, lo que le da un ancho de banda amplio centrado en la portadora. Para mejorar la selectividad podemos hacer el tiempo de pulso mucho mas largo, lo que nos da un rango de frecuencias mas estrecho:

Pulsos selectivos

42USP-CEU

ωωωωoωωωωo

estrecho:

Tiempo:

Frecuencia:

• Aun así necesitamos un pulso en el dominio de los tiempos que afecte exclusivamente ciertas frecuencias. Se logra con un pulso no rectangular, sino con forma (i.e., intensidad modulada).

• Un método aproximado para determinar cual seria la forma de un pulso es ver como queremos que sea la exitación en el dominio de frecuencias y hacer una TF inversa(TF-1) para obtener la forma necesaria en el dominio del tiempo :

∆ω∆ω∆ω∆ω

Pulsos selectivos

43USP-CEU

• Para hacerlo bien se debe hacer un análisis completo de las ecuaciones de Bloch. Las formas de pulso mas comunes son la gausianay la gausiana al cuadrado. Cambiando ya sea la forma, la potencia, o largo del pulso podemos seleccionar,

los Hαααα, NH, 13Cαααα, o 13C=O.

TF-1

∆ω∆ω∆ω∆ω

∆∆∆∆t

ωωωω t

9090

{X}13C

: 15N 90 180

{X}

90 90

∆∆∆∆ ∆∆∆∆t2

• El experimento más usado cuando hacemos espectroscopia 3D. La secuencia de pulsos es:

Secuencia de pulsos TOCSYSecuencia de pulsos TOCSY--HSQCHSQC

44USP-CEU

t31H:

DIPSIt1

Primero una secuencia TOCSY en 1H, donde tenemos que saturar 13C o 15N (porque lo hacemos en proteína marcada). Tenemos t1 (f1), o sea que tenemos un TOCSY 1H-1H en esta dimensión.

• La segunda parte es un HSQC, donde vamos a tener frecuencias de 1H en un eje (f1) y de 13C o 15N en el otro (f2).

90

{X}13C

: 15N 90 180

90

{X}

90 90

∆∆∆∆ ∆∆∆∆t2

De manera similar se puede combinar un NOESY con el HSQC:

Secuencia de pulsos NOESYSecuencia de pulsos NOESY--HSQCHSQC

45USP-CEU

t31H:

90 18090 90

t1 tm

En el 3D vamos a tener una correlación 1H-15N (o 13C) en el plano f1-f2, y espectros NOESY en los planos f1-f3. Cada uno de estos espectros NOESY tendrán unos pocos protones. Si la resolución es buena, cada NH tendrá su plano f1-f3.

http://bioc.rice.edu/~mev/spectra3.html#top0

•Podemos ajustar lo que queremos ver con el 3D. Ejemplo, excitar solo los 13Cαdel esqueleto peptídico. De esta forma solo tenemos transferencia de polarización que involucre a estos carbonos.• Esto es muy útil porque nos permite seguir átomos a lo largo del esqueleto peptídico de manera selectiva. Estos experimentos se nombran de acuerdo a como se transfiere la polarización de un núcleo a otro. Por ejemplo, el ‘HNCA’:

Experimentos HNCA

46USP-CEU

Estamos transfiriendo polarización de 1H a 15N (mejorando la señal de 15N y a su vez obteniendo una correlación entre los dos núcleos), pasándola solo a los núcleos 13Cα (usamos pulsos ππππ / 2 y ππππ selectivos).

• Terminamos teniendo transferencia de polarización de los 1Hs a los 13Cα a través de 15N, y por lo tanto los 13Cα quedan marcados con información de δs de 1H y 15N.

• Al final obtenemos un correlación de 15N-1H-13Cα. Usando otros pulsos selectivos podemos ver otras correlaciones. Por ejemplo, el HNCACB:

Experimentos HNCACB

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podemos ver otras correlaciones. Por ejemplo, el :

http://bioc.rice.edu/~mev/spectra2.html

HSQC-NOESY 15N-1H

HNCA

7 Hz11 Hz

C C NN

C

H

C

H H

C

O

C HHH H

H O

ASSIGNMENT of 3D-experiments

1H

Otro ejemplo

48USP-CEU

77-84

77 84

77 841H

13C1H

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