Seminario Técnico: Compuestos Azufrados Volátiles en Vinos

8/2/2019 Seminario Tcnico: Compuestos Azufrados Voltiles en Vinos

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Seminario Tcnico

Compuestos azufrados

voltiles en vinosProblemas de reduccin

y aromas varietales

Organizan:

Colaboran:

Tarragona, 23 de abril de 2009

Madrid, 24 de abril de 2009


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dc

Ponencias4 01. Relacin entre el contenido nitrogenado

en mosto/uva y la sntesis de aromas: eecto

sobre la produccin de sulhdricoPo. Gmm BeltranUniversidad Rovira i Virgili

Po. Jos M GuillaMnUniversidad Rovira i Virgili

Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Ali-

mentos IATA-CSIC

18 02. Los nuevos retos en microbiologa delvino. Levaduras no productoras de SH

2

isk S. Pos

The Australian Wine Research Institute, PO

Box 197, Glen Osmond, Adelaide, SA 5064,

Australia

30 03. La micro-oxigenacin de vinos tintos:Control de la reduccin y estabilizacin del

color

Po. ec Gmz PzUniversidad de Murcia

36 04. Los compuestos voltiles no son todosperjudiciales!

rm Guerin-SCHneiDer

Institut Franais de la Vigne et du Vin

ENTAV-ITV France

Artculos relacionados41 Inuence o the Timing o Nitrogen Additions

during Synthetic Grape Must Fermentations

on Fermentation Kinetics and Nitrogen

Consumption

51 Formacin de compuestos voltiles azuradospor levaduras vinicas.

59 Una revolucin en el sector enlogico:

59 Levaduras de vinifcacin que no producenSuluro de hidrgeno (H

2S)

63 Nitrogen management is critical or wineManaging Director, avour and style

73 Unravelling the genetic blueprint o wine yeast

77 When the heat is on, yeast ermentation runsout o pu

83 Taking control o alcohol

87 A la recerca del codi digital dels llevats del vi

91 Eect o Micro-oxygenation on Color andAnthocyanin-Related Compounds o Wines

with Dierent Phenolic Contents

103 Eectos de la microoxigenacin en vino tinto

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Contenido

6 Resumen

6 1. Introduccin

7 2. Eecto de la concentracin y tipo denitrgeno sobre el crecimiento de las

levaduras y su cintica ermentativa.

9 3. Eecto de la concentracin y tipo denitrgeno sobre la cintica ermentativa

10 4. Relacin entre el contenido en nitrgeno yla sntesis de compuestos aromticos

15 Bibliograa

01. Rc r codorogdo moso/uv y sss d roms:co sobr producc dsuhdrco

Pro. Gmm BeltRanUvrsdd Rovr Vrgl

Pro. Jos Mu GUillaMnUvrsdd Rovr Vrgl

isuo d agroqumc y tcolog d

almos iata-CSiC


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Smro tcco

Compusos urdos vos vos

Jos M. Gum nvrroRequena, 6 de julio de 1967.

e-mail: [email protected]

ivsgc:

Coautor de 50 artculos cientfcos en revistas interna-

cionales de las reas de Tecnologa de Alimentos, Bio-

tecnologa y Microbiologa. Coautor de 20 artculos en

revistas de divulgacin del sector agroalimentario y vi-tivincola. 80 comunicaciones a Congresos nacionales

e internacionales, 24 de ellas como ponente invitado o

comunicacin oral. Autor de 5 captulos de libros espe-

cializados y 37 captulos en libros de congresos. Autor

de 3 patentes de levaduras vnicas en explotacin. Di-

rector de 3 tesis doctorales (2 de ellas con ormato de

doctorado europeo)

ls d ivsgc

Estudio del metabolismo de las levaduras encondicionesdefermentacinvnica.Efectodelasbajas temperaturas de ermentacin y del meta-

bolismo del nitrgeno.

Estudiodelaspoblacionesdelevadurasybacte-rias acticas durante los procesos de elaboracin

de vino. Utilizacin de marcadores moleculares

para la caracterizacin e identifcacin de los mi-

croorganismos del vino.

escs Cos exjos:

Estanciapost-doctoralenlaUniversidaddeUtre-cht (junio del 1998 a mayo del 1999).

Estancia post-doctoral en elInstitute forWineBiotechnology (Stellenbosch University) en

Stellenbosch (Sudrica) (septiembre del 2004 amarzo del 2005).

Gmm Br Css31 de octubre de 1975

Posc c:

ProfesoraayudantedoctordelDepartamentodeBioqumica y Biotecnologa de la Universidad Ro-

viraiVirgili,FacultaddeEnologa,desdediciem -bre del 2007.

MiembrodelgrupodeinvestigacindeBiotec-nologaEnolgicadelaFacultaddeEnologadela URV, dentro de la lnea de estudio de las leva-

duras vnicas.

A lo largo de su carrera investigadora Gemma Beltran

ha colaborado en proyectos sobre el estudio las leva-

duras y sus requerimientos nutricionales, analizando

los actores que pueden condicionar a una mejora en

la ermentacin alcohlica, tanto los que se derivan

del mosto (niveles de nitrgeno disponible) como de

varias prcticas enolgicas (ermentaciones a bajas

temperaturas, rehidratacin). Sus investigaciones pre-

doctorales se centraron principalmente en el estudiola represin catablica por nitrgeno a lo largo de la

ermentacin (Beltran et. al. 2004, 2005), as cmo en

el eecto de las bajas temperaturas de ermentacin

sobre los cambios en la expresin gnica global y el

metabolismo de la levadura vnica (Beltran et al. 2006,

2007, 2008). Adems, en su estancia post-doctoral rea-

lizada en el grupo de Biologa Molecular de levaduras

del proesor Stean Hohmann (Suecia), estuvo invo-

lucrada en estudios de sealizacin de nutrientes, en

concreto estudiando el metabolismo de la tiamina y la

ruta de la represin catablica por glucosa, como par-

te de un proyecto europeo de investigacin.

Gemma Beltran es autora o co-autora de un total de15 publicaciones internacionales y 9 publicaciones na-

cionales, ha participado en un total de 12 proyectos

investigacin o contratos de transerencia, asistido a

22 congresos cientfcos, dirigido tesis de master y est

actualmente dirigiendo una tesis doctoral.

Actualmente es proesora de Bioqumica y Microbio-

logiaEnolgicaenlaFacultaddeEnologa,ydesdesureincorporacinalgrupodeBiotecnologaEnolgicade la URV en diciembre de 2007 ha estado colabora-

do en proyectos de investigacin y transerencia con

el sector vitivincola, centrndose nuevamente en el

estudio de los requerimientos nitrogenados de las le-

vaduras vnicas de primera y segunda ermentacin.

Ponencias

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Captulo

Rsum:

La cantidad y calidad del componente nitrogenadode los mostos no determina nicamente un buencrecimiento de la levadura y una buena capacidadermentativa, sino que inuye directamente sobre lasntesis de un buen nmero de compuestos voltileso aromas. En un trabajo de nuestro grupo (Beltran etal., 2005) comprobamos que las adiciones de nitrge-no asimilable en orma de aminocidos, y despus dela ase exponencial de crecimiento, aumentaban losniveles de alcoholes superiores y de algunos steres.En un estudio similar, Vilanova y cols. (2007) observa-ron tambin incremento en la sntesis de alcoholessuperiores y en steres de acetato cuando los mostoseran suplementados con concentraciones de amoniono superiores a los 300 mg/l. Sin embargo, la concen-tracin y uente nitrogenada no solo tiene inuenciaen la sntesis de compuestos con impacto positivo

en las calidades organolpticas de los vinos, sino quetambin varios trabajos han sealado una relacindirecta entre el nitrgeno asimilable y la sntesis desulhdrico. Otros actores nutricionales y ambientalesrelacionados con la sntesis de este compuesto hansido: la concentracin de sulatos y sultos (en ormade SO2) y la deciencia en vitaminas (en concreto elcido pantotnico y la tiamina).

1. iroducc:

La transormacin de la uva en vino es un procesobiotecnolgico donde los microorganismos presen-tes, undamentalmente las levaduras, utilizan los nu-trientes del mosto para su crecimiento, produciendotoda una gama de metabolitos que convierten unlquido empalagoso en una solucin hidroalcohlicade sabor y aroma ms agradable. La principal reaccinbioqumica durante la ermentacin alcohlica es laconversin de los azcares en etanol. Sin embargo, noes la nica. Un pequeo porcentaje de los azcaresvan destinados a la sntesis de metabolitos secunda-rios (glicerol, succnico, lctico, actico, alcoholes su-periores, steres, etc), de menor concentracin que el

etanol pero que son los determinantes de la calidaddel vino. Tambin hay una pequea parte de los az-cares del mosto que va destinada a la sntesis de com-ponentes celulares, es decir, a la sntesis de biomasa.En esta sntesis de biomasa no solo intervienen losazcares sino que es imprescindible el componentenitrogenado.

Aunque el componente nitrogenado es cuantitati-vamente el segundo nutriente ms abundante enel mosto, presenta una gran desproporcin con elcomponente carbonatado (azcares). Mientras que la

suma de glucosa y ructosa se encuentra del ordende 200 a 300 g/litro, concentraciones de mil vecesmenores (200-300 mg/litro) suelen ser valores muyhabituales para el nitrgeno asimilable. Por tanto, son

muy recuentes las situaciones industriales en las queel nitrgeno se convierte en un actor limitante parael desarrollo de las levaduras y para la nalizacin dela ermentacin alcohlica. Son varios los autores quehan tratado de establecer una concentracin mnimadonde se pone en peligro la ermentacin alcohlica.Estos valores no coinciden entre los distintos trabajos,uctuando de los 120-140 g Nitrgeno asimilable/l(Bely et al, 1990) hasta los 200 o 267 (Mendes-Ferreiraet al, 2004), es decir ms del doble. Dichas dierenciaspueden ser debidas a varios actores, pero entre losms importantes podemos destacar dos: la cepa delevadura, perectamente conocido por los producto-res de levaduras que incluso las catalogan como conelevado o bajo requerimiento nitrogenado o nutritivoy la orma qumica en que el nitrgeno est disponi-ble en el mosto. Evidentemente otros actores comola orma de vinicacin, variedad de uva, etc. tambinson relevantes, pero su eecto se puede considerar

como incluido en la orma qumica y cantidad de ni-trgeno en el medio.

El nitrgeno en el mosto puede estar presente en dosormas claramente dierenciadas: la inorgnica, bsi-camente como amonio, y la orgnica, ormada poraminocidos, pptidos y protenas. No todas estas or-mas son igualmente disponibles, ya que, por ejemplo,los pptidos y las protenas no se suelen considerarcomo autnticas uentes de nitrgeno, y los amino-cidos son muy variables como uentes nitrogenadas,ya que mientras algunos son consumidos vidamente

(glutamina, por ejemplo), otros no lo son en absolutoen condiciones anaerobias como la prolina. Curiosa-mente la prolina, junto con la arginina, son los dosaminocidos mayoritarios en mostos. La levaduranecesita la presencia de oxgeno para llevar a cabola utilizacin de la prolina, adems este proceso demetabolizacin de la prolina se lleva a cabo principal-mente en la mitocondria, que se encuentra muy pocouncional en condiciones ermentativas. Sin embargo,no se ha estudiado si en condiciones de ermentacio-nes ms aireadas, tales como durante la maceracinen tintos, puede haber un consumo mayor de esteaminocido. El nitrgeno en orma de amonio suele

ser altamente disponible para las levaduras, por lo quees una orma qumica que se suele utilizar de ormaabundante en la industria enolgica. La presencia denitrgeno en cualquiera de estas ormas qumicas esuertemente variable, dependiendo de diversos acto-res, entre ellos la variedad, grado de maduracin dela uva, caractersticas edao-climticas en las que sedesarrolla sta y diversos aspectos tecnolgicos (tipode vinicacin, prensado, etc).

En resumen, debemos considerar como nitrgenoasimilable (NA) por las levaduras en las condiciones

de vinicacin al amonio como uente inorgnica(representa hasta el 40% del NA), y todos los ami-nocidos excepto la prolina. Sin embargo, la levaduravnica Saccharomyces cerevisiae no consume este ni-


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trgeno asimilable de manera aleatoria, sino que tie-ne un orden de preerencia por los distintas uentesde nitrgeno. S. cerevisiae ha desarrollado dierentesmecanismos moleculares que le permiten utilizar pre-erentemente aquellas uentes que le permiten crecermejor. Este mecanismo de seleccin de la uente denitrgeno se conoce como Represin Catablica porNitrgeno (NCR). El NCR se caracteriza porque la clu-la es capaz de detectar la presencia de las uentes denitrgeno ms ricas. Esto desencadena una cadenade seales, que culmina con la activacin de los genesimplicados en el transporte y metabolismo de estasuentes ricas y en la represin de aquellos genes im-plicados en el transporte y utilizacin de uentes mspobres. Una vez consumida las uentes de nitrgenoms ricas (amonio, glutamina y asparagina), la levadu-ra activa la maquinaria metablica para la utilizacinde las ms pobres (arginina, glutamato, alanina, etc.)(Figura 1).

Sin embargo, la importancia del nitrgeno no resideexclusivamente en ser necesario para la ormacin debiomasa. El contenido en nitrgeno tambin tieneuna inuencia clara sobre la velocidad ermentativa(Taillandier et al., 2007). La mayor parte de la ermen-tacin alcohlica se produce en una ase de no proli-eracin celular o estacionaria. En este punto el nitr-geno del medio es utilizado para el recambio proteicode los dierentes enzimas celulares. Por ltimo, estecontenido en nitrgeno tiene una inuencia manies-ta en los dierentes metabolitos producidos durante la

ermentacin, muchos de ellos con un impacto muyclaro en el aroma del vino. A continuacin trataremosen mayor proundidad los dierentes aspectos de lasiologa y metabolismo celular que se ven aectadostanto por la cantidad como por la calidad del nitr-

geno del mosto. Especial hincapi dedicaremos a lasntesis de aromas de reduccin o produccin de SH2y otros compuestos derivados del metabolismo delazure.

2. eco d cocrc y po drgo sobr crcmo d svdurs y su cc rmv.

Varela y cols. (2004) propusieron que la velocidad deermentacin depende por un lado del estado meta-blico de las clulas y por otro del nmero de clulasalcanzados durante la ermentacin alcohlica. Dichode otro modo, de la viabilidad (nmero de clulasermentando) y la vitalidad de cada una de estas c-lulas. Ambos componentes tienen una dependenciaimportante del nitrgeno disponible en el mosto. Eneste punto nos vamos a centrar en como aecta el ni-

trgeno a la divisin celular o produccin de biomasay en el siguiente apartado abordaremos como aectaa la vitalidad o actividad celular.

En un trabajo reciente de nuestro grupo hemos com-probado como el nitrgeno es el substrato limitantedel crecimiento celular hasta alcanzar valores cerca-nos a los 200 mg/l, aunque esto depende de la uentede nitrgeno utilizada. Para ello hacamos crecer laslevaduras en un mosto sinttico (similar al natural)donde iba cambiando nicamente la concentracinde N y el tipo de uente de N. Como puede verse en la

gura 2, el nmero de clulas o biomasa (medido porla densidad ptica (O.D.) a 595 nm) iba aumentandoconorme aumentaba la concentracin de nitrgeno,en este caso en orma de arginina como nica uentede nitrgeno. Esto ue as hasta niveles de 180 mg de

Fgur 1. Rprsc grc d mcsmo dRprs Cbc por nrgo (nCR) sg Coopr (2002)

Ponencias

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01. Relacin entre el contenido nitrogenado en mosto/uva y la sntesis de aromas: efecto sobre la produccin de sulfhdrico

N/l (en la grca solo se representa hasta 140 mg deN/l), por encima de esta cantidad ya no determina-mos dierencias en la biomasa obtenida.

Como se comenta anteriormente, no solo tiene impor-tancia la cantidad sino la calidad o tipo de nitrgeno.En un experimento similar determinamos la biomasaproducida para la misma concentracin de dierentesuentes de nitrgeno. Como puede verse en la gura3, la glutamina permite un mayor crecimiento celular

que la arginina, y resulta sorprendente que la menorcantidad de biomasa producida se obtiene con la uti-lizacin de amonio, tericamente una de las uentesde nitrgeno ms interesante para la levadura.

Varela y cols (2004) determinaron el eecto que tenala cantidad de clulas en un mosto deciente en N

(50 mg/l) sobre la velocidad y tiempo de ermenta-cin. Para ello aadan dos y 5 veces ms de la dosisrecomendable de levadura seca activa a los mostos. Elresultado ue que en estas ermentaciones, con mayorconcentracin de clulas, se alcanzaban velocidadesde ermentacin similares a las obtenidas en un mostorico en nitrgeno (300 mg/l). De esta manera mostra-ban una relacin directa entre mayor concentracinde biomasa y mayor velocidad ermentativa en mostospobres en nitrgeno. Desde un punto de vista aplicado

para la industria enolgica, esto sugiere dos posiblessoluciones rente a un mosto pobre en nitrgeno. Laprimera y ms habitual solucin consiste en la suple-mentacin de los mostos con nitrgeno, undamen-talmente en orma de sales de amonio. Como posiblealternativa, sera la adicin de una mayor cantidad delevadura seca activa o la adicin de biomasa de otros

Fgur 2. evouc d OD d cp PDM moso sco co rg como c u drgo y co cocrcos crcs r 20 y 140 mg n/.

AmonioArgininaGlutamina

Fgur 3. Comprv d crcmo s rs us d rgopr u cdd dc d 140 mg n/.


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tanques de ermentacin. Aunque un aumento de labiomasa aadida podra tener eectos sobre el aroma ysabor del vino (excesivo sabor a levadura).

Mendes-Ferreira y col. (2004) tambin estudiaronel eecto de dierentes concentraciones de amoniosobre el crecimiento y la velocidad ermentativa. Eneste estudio, y para la cepa PYCC 4072, estos autoresdeterminaron la produccin mxima de biomasa (7,8g/l) para una concentracin de 402,5 mg de N/l. Enconcentraciones limitantes de N (66 mg de N/l) lacantidad de biomasa producida era 3,5 veces menor(2,2 g/l). Las concentraciones crecientes en N no soloaectaban a la produccin de biomasa, sino a la velo-cidad de ermentacin. Mientras la ermentacin conuna cantidad suciente de N acabo la ermentacinen 5 das, la ermentacin limitante en N (66 mg deN/l) requiri 28 das para su nalizacin.

En nuestro grupo, para comprobar el eecto que tenala adicin de nitrgeno durante la ermentacin alco-hlica, llevamos a cabo un trabajo donde adicionba-mos una mezcla de amonio y aminocidos a mostosdecientes en N (60 mg/l) en dierentes ases de laermentacin (Beltran et al., 2005). En concreto, estasadiciones se hicieron en ermentaciones que estabana densidades de 1080 (inicio de una ermentacin),1060 y 1040 (mitad de ermentacin) y 1020 y 1000(nal de ermentacin). Cuando la adicin se realizabaal principio y mitad de ermentacin (hasta 1040 dedensidad), sta tena un eecto claro sobre el aumento

de la biomasa (Figura 4). Si se realizaba en las asesnales (1020 y 1000 de densidad) ya no se registrabaun aumento de la biomasa, pero si que se produca unaumento de la velocidad de ermentacin (Figura 5).De hecho, la ermentacin suplementada a una den-sidad de 1020 nalizaba la ermentacin 5 das antesque la ermentacin no suplementada con N. Estosresultados mostraban que el mejor momento para laadicin de N era durante el crecimiento exponencialde la levadura (primeros das de ermentacin). Enesta ase tena un eecto sobre el crecimiento celular ysobre la velocidad de ermentacin.

En este trabajo tambin determinamos la cantidadde nitrgeno consumido en las dierentes ermenta-ciones. Como es de esperar, esta cantidad era mayorcuanto ms temprano en el proceso se adicionaba elN (Figura 6). En esta misma gura, podemos ver la pre-erencia de la levadura por el N inorgnico (amonio)o el orgnico (aminocidos) en las dierentes ases.Result muy curioso comprobar que el amonio pare-ce ser la uente de N preerida para la produccin debiomasa (mayor consumo durante las primeras ases)mientras que apenas era consumida en las ltimasases de ermentacin. Estas dierencias en la propor-

cin de consumo de amonio o aminocidos tambinprodujeron dierencias en los perles organolpticosde los distintos vinos, como se explica en los siguien-tes apartados.

Fgur 4. eco d dc d u mc dmoo y mocdos (240 mg d n/) sobr producc d boms mdd como dsdd

pc (O.D. 600 m). l dsdd qu srb dc v rfjd p d

gur.

Fgur 5. eco d dc d u mc dmoo y mocdos (240 mg d n/) sobr

vocdd rmv, mdd como rducc

d dsdd d moso. l dsdd qu srb dc v rfjd p d

gur.

Fgur 6. Cosumo d n o, moo ymocdos (xprsdos como mg d n/) s

dss rmcos.

3. eco d cocrc y po drgo sobr cc rmv

Resulta evidente de nuestro anterior trabajo (Beltranet al., 2005) que el enriquecimiento en N del mediode ermentacin tena un eecto sobre la cinticaermentativa, independiente del crecimiento celular.Algunos autores (Taillandier et al., 2007) conrman

que este eecto estimulador del consumo de azca-res es incluso ms importante que el eecto sobre elcrecimiento. Este hecho resulta muy interesante des-de el punto de vista industrial si tenemos en cuenta

Ponencias

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que la mayor parte de la ermentacin alcohlica seproduce en la ase estacionaria o de no prolieracincelular. A pesar de que durante este periodo no haymultiplicacin celular, las levaduras necesitan nitrge-no para mantener su metabolismo activo. El medio deermentacin es un ambiente cambiante y hostil querequiere una readaptacin continua para las nuevascondiciones. Esta readaptacin al medio supone unrecambio proteico continuo en la maquinaria enzi-mtica celular. Para este recambio de protenas celu-lares, es necesaria la disponibilidad de nitrgeno enel medio de ermentacin. Taillandier y col. (2007) es-tablecieron la cantidad de nitrgeno consumido porla levadura por gramo de azcar consumido (mg N/gde glucosa o ructosa). Como siempre hay que contarcon las dierentes necesidades de las distintas cepas,esta cantidad tena un rango de 0,61 a 0,91 mg de Npor gramo de azcar. Es decir, una relacin mg N/gazcar prcticamente asegura cubiertas las necesida-

des nitrogenadas y es una relacin muy sencilla para elenlogo poder calcular las dierentes necesidades desus mostos. Una relacin similar establecieron Bissony Butzke (2000), pero en este caso, entre necesidad deN asimilable rente a grado alcohlico probable (GAP)(gura 7).

Fgur 7. Rc r grdo cohco probb(GaP) y cdd csr d n smb (mg dn/) pr cr dch cdd (Bsso y Buk,

2000).

Sin embargo, el aumento de la cintica ermentativano debe ser solo entendido por la disponibilidad denitrgeno para acilitar el recambio proteico celular,sino que se ha demostrado que algunas uentes denitrgeno, en concreto el amonio, pueden actuarcomo activadores de la actividad de enzimas gluco-lticos claves. En concreto, se ha visto un incrementoimportante del transporte de azcares por activacinde las permeasas implicadas (genes HXT) (Bely et al.,1990). Taillandier y cols (2007) tambin inormaronde una mayor actividad ructolica (mayor consu-

mo de la ructosa rente a la glucosa) de la levaduraen presencia de mayor concentracin de nitrgeno,probablemente por un cambio en la anidad de lostransportadores de hexosas. Igualmente, Berthels y

cols (2004) observaron una activacin del enzima os-oructoquinasa, enzima clave de la glucolisis, con laadicin de amonio.

4. Rc r codo

rgo y sss d compusosromcos

Adems del eecto sobre el crecimiento, la disponibili-dad de nitrgeno tambin tiene un eecto importantesobre el metabolismo de las levaduras, aectando laormacin de compuestos voltiles y no voltiles, loscuales son de gran importancia para las calidades or-ganolpticas del vino nal (revisado por Alberts y col.1998, Bell y Henkschke, 2005). La concentracin decompuestos no voltiles como son el glicerol, el ci-do mlico, cido succnico o cido ala-cetoglutrico,puede variar dependiendo de la cantidad y la uen-

te nitrogenada presente en los mostos. Alberts y col.(1996) observaron, por ejemplo, que la concentracinde glicerol es mayor cuando la ratio nitrgeno amo-niacal respecto al nitrgeno orgnico representadopor los aminocidos. En un trabajo de nuestro grupo(Beltran y col. 2005) observamos que la concentracinde glicerol disminuye en ermentaciones con limita-cin de nitrgeno. Esto demuestra que la produccinde glicerol es directamente proporcional a la produc-cin de biomasa.

Muchos de los compuestos voltiles, que son los que

contribuirn al aroma nal del vino, tambin estn aec-tados por el tipo y/o concentracin de nitrgeno dis-ponible para la levadura. Los compuestos mayormenteaectados son el cido actico, los alcoholes superiores,los cidos grasos de cadena media y corta y sus steresetlicos, y los esteres de acetato. En la Figura 8 vemosrelacin entre la acumulacin de algunos compues-tos voltiles y la concentracin inicial de nitrgeno envinos producidos a partir de mosto sinttico con doscepas Saccharomyces cerevisiae (resultados obtenidospor Carrau y col. 2007). De este trabajo se desprendeque hay una relacin inversa entre crecimiento (o dis-ponibilidad de nitrgeno) y produccin de alcoholes

superiores. Mientras que la mayor presencia de nitrge-no parece estimular una mayor produccin de steres.Sin embargo, los resultados de este trabajo demues-tran que la concentracin ptima de nitrgeno parala sntesis de steres depende de la cepa en cuestin.La cepa KU1 produca su mxima concentracin desteres para una concentracin de nitrgeno muchomenor que la cepa M522. Esta ltima tena una mayorproduccin de estos compuestos.

La carencia en nitrgeno en los mostos es general-mente subsanada mediante adiciones de sales de

amonio. En la Tabla 1 y Figura 9 observamos cmoaecta tambin el momento de la suplementacin denitrgeno a la produccin de algunos de estos com-puestos.

0


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Smro tcco


El contenido en cido actico vara segn la concentra-cin de nitrgeno en el medio, habiendo una relacininversa entre la cantidad de cido actico producido yla disponibilidad de nitrgeno a concentraciones bajaso moderadas de nitrgeno, pero una relacin directaa concentraciones altas (Bely y col. 2003, Hernandez-Orte y col. 2006). De hecho, trabajos de Beltran y col.(2005) y de Vilanova y col. (2007) muestran que a mayordisponibilidad y consumo de nitrgeno por parte dela levadura, mayor produccin de cido actico (Figura9). Esta mayor produccin de actico a mayores con-centraciones de nitrgeno puede estar relacionadacon una mayor tasa de crecimiento. El actico es pro-ducido por las levaduras como substrato para la sntesisde cidos grasos, un mayor crecimiento podra justi-car una mayor sntesis de actico. Otra posibilidad esque siempre hay una relacin directa entre sntesis deglicerol y de actico. Por tanto, a concentraciones altasde nitrgeno se produce ms glicerol y, por tanto, ms

actico. Resultado similar se observ con la produccinde acetaldehdo.

Los alcoholes superiores pueden aportar aromas pe-sados y desagradables a los vinos si se encuentran en

concentraciones muy altas (excluyendo el 2-enileta-nol, que tiene aroma oral). Existe una relacin inversaentre el contenido en alcoholes superiores y la con-centracin inicial de nitrgeno, excepto por concen-traciones muy bajas de nitrgeno (Beltran y col. 2005,Vilanova y col. 2007, Carrau y col. 2008). Los alcoholessuperiores se pueden ormar a partir de aminocidos(via de Ehrlich) o a partir del catabolismo de los azca-res (via anablica) (Figura 10). Esta ltima es la principalva de produccin de alcoholes superiores durante laermentacin alcohlica. Cuando hay poco nitrgenodisponible en el medio, hay un aumento en la sntesisde alpha-cetocidos a partir de azcares. Estos ala-cetocidos son los precursores en la sntesis de ami-nocidos, pero la escasez de nitrgeno ala-amniconecesario en la reaccin de transaminacin, hace quelos ala-cetocidos ormados se acaben excretando enel medio en orma de alcoholes superiores, sin llegara ormar los aminocidos necesarios. Sin embargo, en

un medio con alto contenido en nitrgeno, el nitrge-no disponible permite la biosntesis de aminocidos,lo que reduce el exceso de ala-cetocidos y por tantola produccin de alcoholes superiores (Oshita y col.,1995).

Fgur 8. Rc r cumuc dguos compusos vos y cocrcc d rgo vos producdos prr

d moso sco co dos cps Scchromycs

crvs (cp M522 () y cp KU1 ()).(Crru y co., 2008)

Ponencias

11


12/112


tb 1. Rc r momo d dc d rgo y producc d mboos scudrospor vdur. ls rmcos s rro co moso sco m rgo (60 mg/

Yan), qu s d 240 mg/ d rgo (mc moo y mocdos) dsos momos drmc (dsdd 1080 g/ o co, 1060, 1040, 1020, 1000 g/ y o supmdo). (Br y co. 2005)

COOH

NH2C

R

H

COOH

OC

R

H

OC

R

H

H

OHC

R

H

AlcoholsuperiorAminocido Aldehido

Desaminacin Descarboxilacin Reduccin

NH3 CO2

NADHNAD+

ViadeEhrlich:viacatablicadeaas

Glucosa

Piruvato

Vaanablicaodesntesis

Fgur 9. Rc r cocrc dmboos scudros (ormdos co vor d myor producc cd cso) y momo d supmc d rgo.ls rmcos s rro co moso

sco m rgo (60 mg/ Yan), qu s d 240 mg/ d rgo (mcmoo y mocdos) dsos momos

d rmc (dsdd 1080 g/ o co, 1060,1040, 1020, 1000 g/ y o supmdo).

Fgur 10. Ru d sss d cohos suprors prr d mocdos (v d ehrch) o prr

d os crs (v bc)

2


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Smro tcco


Este eecto ha sido observado experimentalmentepor distintos trabajos. Carrau y col. (2008) muestranclaramente que la cantidad de alcoholes superioresdisminuye con el aumento de nitrgeno disponible,aunque se observa el eecto inverso en la produccinde 1-propanol (Figura 8d, 8e). Estos hechos tambinueron observados en estudios realizados por nues-tro grupo de investigacin (Tabla 1, Figura 9). En ellosvimos que la sntesis de alcoholes superiores dismi-nuye cuando un mosto limitante en nitrgeno se su-plementa durante la ase exponencial de crecimientode las levaduras, disminuyendo as su periodo de limi-tacin, y lo que lleva tambin a un mayor consumototal de nitrgeno que si se suplementa en ases mstardas de la ermentacin. Por otro lado, si el nitrge-no es adicionado en ase estacionaria, despus de unlargo periodo de limitacin, el contenido en alcoholessuperiores aumenta considerablemente.

Los esteres de etilo y de acetato muestran una rela-cin ms compleja con la disponibilidad de nitrge-no, debido a sus distintos orgenes de sntesis, pero,en la mayora de los estudios, el acetato de etilo y losesteres de acetato estn relacionados positivamentecon la concentracin de nitrgeno del medio.

4.1 Rc r codo rgo y sss d compusosurdos

Las levaduras vnicas pueden ormar H2S a partir decompuestos de azure inorgnicos (sulato o sulto), ocompuestos orgnicos azurados (cistena o glutatin).Normalmente el mosto es deciente en compuestosorgnicos azurados, y esto puede llevar a la levaduraa sintetizar algunos de estos compuestos a partir deuentes inorgnicas, normalmente abundantes en elmosto. En Saccharomyces cerevisiae, la produccinde H2S es el producto de la ruta de la secuencia dereduccin del sulato (SRS), y es un intermediario en labiosntesis de los aminocidos azurados (metionina,y cistena). (Figura 11).

Varios actores ambientales y nutricionales se han aso-ciado con la produccin de H2S en condiciones de vi-nicacin: la cepa de levadura utilizada, la cantidad deazure presente en los mostos (ya sea en orma de sul-to o de sulato), la carencia de vitaminas, y la carenciao disponibilidad de nitrgeno. Varios estudios se hancentrado en analizar este ltimo punto, el impacto delnitrgeno en la ormacin de aromas de reduccin oazurados.

Para la biosntesis de los aminocidos azurados (cis-tena y metionina) se requiere por un lado esqueletos

de carbono que contengan nitrgeno (O-AH: O-acetilhomoserina, O-AS: O-acetilserina), los cuales de-rivan de un pool intracelular de nitrgeno, y por otrolado sulto, que deriva de la ruta de reduccin del

sulato. En carencia de nitrgeno, disminuye el poolde nitrgeno intracelular y por tanto la sntesis de losprecursores nitrogenados O-AS y O-AH, con lo que elsulto producido no podr utilizarse para la sntesis deaminocidos y se excretar en orma de cido sulh-drico (SH2). As pues, el ratio de ormacin del H2S pa-rece estar regulado por los requerimientos celulares

de aminocidos azurados, y por el mantenimiento delos pools de nitrgeno intracelular.

Jiranek y col. (1995) observaron que en ermentacio-nes vnicas existe una relacin directa entre la limita-cin de nitrgeno y la sntesis de sulhdrico. Algunosde sus resultados se muestran el la Figura 12 y Tabla2. En la Figura 12 observamos que la produccin desulhdrico por parte de la levadura aumenta en elmomento en que el nitrgeno del medio se consume(en presencia de sulto). Este eecto es mucho mspronunciado en ase exponencial de crecimiento,cuando la levadura tiene ms requerimientos nitro-

genados, que en ase estacionaria, donde disminuyenlas necesidades nitrogenadas, y tambin la produc-cin de sulhdrico. Estos autores relacionaron tam-bin este aumento en la produccin con la actividadsulto reductasa, la cual es mayor en ase exponencialde crecimiento.

Por otro lado, si un medio limitante en nitrgeno sesuplementa con amonio o con la mayora de amino-cidos, la produccin de sulhdrico disminuye. Peroeste no es el caso de los aminocidos azurados (prin-cipalmente Cistena, de manera individual o en com-

binacin con Metionina), la adicin de los cuales dalugar a un aumento incluso mayor en la produccinde H2S por parte de las levaduras (Tabla 2). Esto es de-bido a la liberacin del sulhdrico como subproducto

Fgur 11. Ru d sss d H2S rvs d scuc d rducc d suo (SRS) y ru

d bosss d mocdos urdos (moy cs) S. crvs. adosy 5-ososuo

(aPS), 3-osodos 5-ososuo (PaPS),O-csr (O-aS), O-chomosr (O-aH).

(Swgrs y Prorus, 2007)

Ponencias

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de la degradacin / transaminacin de estos amino-cidos para ser utilizados como uente de nitrgeno.

En un trabajo reciente, Mendes-Ferreira y col. (2009)analizaron en varias cepas la relacin entre la concen-tracin de nitrgeno en el medio y la produccin devarios compuestos aromticos, entre ellos el cidosulhdrico. Los resultados obtenidos variaban entre

las distintas cepas, la Figura 13 muestra los resultadosde la cepa UCD522, considerada alta productora desulhdrico. La sntesis de H2S se produce en el mo-mento en que se consume el nitrgeno del medio,pero curiosamente el medio con una cantidad pti-ma de nitrgeno (267 mg/l), el cual se consume a las48 horas de ermentacin, presenta valores mayoresque el medio muy limitante en nitrgeno (66 mg/l).El exceso de nitrgeno disminuye la produccin de

sulhdrico, pero este exceso puede provocar por otro

lado la inestabilidad del vino y la produccin de otroscompuestos indeseados.

Pero el cido sulhdrico no es el nico compuestoazurado que podemos encontrar en los vinos, a partirde este compuesto se pueden ormar mercaptanos otioles, algunos de los cuales aportan olores desagra-dables a los vinos, los temidos caracteres de reduc-cin. H2S es un compuesto altamente reactivo, y se

tb 2. Producc d H2S por pr d vdur aWRi77, 6 hors dspus d hbr

supmdo u mdo m rgoco mocdos o moo d mr dvdu.l supmc s r u hor s d

qu rgo c ur cosumdo. los doss ormdos vor obdo por cuvo

supmdo co moo (Jrk y co. 1995)

Fgur 13. Pr d rmc y d brcd cdo suhdrco d cp UCD522 mdo

sco y co dss cocrcos d

rgo c: 66 mg/ (), 267 mg/ (b) y 402mg/ (c). (Mds-Frrr y co. 2009)

Fgur 12. Rc r producc d H2Sy momo qu s produc mc

d rgo dur rmc. lsrmcos s rro co cp aWRi77

moso sco co dss cocrcos drgo c: 3.3 (), 16.6 () o 24.9 () mM.ls fchs dc momo qu s d

suo (132 M) os mdos, 1 hor s dcosumo o d rgo. (Jrk y co. 1995)

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puede combinar con otros componentes presentesen el vino para ormar otros compuestos voltilesazurados (Vermeulen y col. 2005). Por ejemplo, la re-accin del sulhdrico con el etanol o el acetaldehdoda lugar a etil-mercaptano (con olor a cebolla o gasnatural), y por otro lado la ormacin de polisuluros(dimetil disuluro, dimetil trisuluro y dimetil tetrasul-uro) proviene de la oxidacin del metantiol, produc-to de la degradacin de la metionina (Swiegers y Pre-torius, 2007). La levadura puede luego reducir estoscompuestos disuluro y ormar mercaptanos, con lasconsecuencias organolpticas que esto supone.

Sin embargo, a pesar de la mala popularidad que tienenlos compuestos aromticos azurados, no todos ellosaportan caractersticas negativas a los vinos, otros pue-den llegar a contribuir positivamente, como es el caso

de los tioles voltiles 4-mercapto-4-metilpentanona(4MMP), 3-mercaptohexanol (3-MH) y 3-mercaptohexi-lacetato (3MHA), los cuales orman parte de la identi-dad varietal del vino, especialmente en los vinos de lavariedad Sauvingon Blanc. Estos compuestos azuradosvarietales, se originan por la levadura en ermentacinalcohlica a partir de precursores tiolicos inodoros quecontienen molculas de cistena en su estructura (Swie-gers y col. 2007). Thibon y col. (2008) demostraron queen Saccharomyces cerevisiae, la represin catablicapor nitrgeno controla tambin la liberacin de estostioles voltiles a lo largo de la ermentacin, reprimien-do probablemente las permeasas de aminocidos quepermiten la entrada de estos precursores a la clula,y reprimiendo la expresin del gen IRC7, que codicapara el principal enzima involucrado en la bioconver-sin de tioles (cistationa--liasa).

Bbogr

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Ponencias

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02. los uvos ros mcroboog d

vo.lvdurs oproducors d SH

2

isk S. Prorusth ausrl W Rsrch isu, PO

Box 197, Gl Osmod, adld, Sa 5064,

ausrl

Contenido

19 Resumen

19 1. Introduccin

20 2. Control de la dinmica de la ermentacin

de la levadura para mejorar la calidad del vino

21 3. Optimizacin de la ermentacin

22 4. Optimizacin de la calidad del vino: evitar laproduccin de sabores y aromas indeseables

23 5. Optimizacin de la calidad del vino: mejoradel aroma deseable, el sabor y el color

24 6. Aumento de las opciones de los vinicultores

mediante el desarrollo de cepas de levadurasvincolas mejoradas y novedosas

25 7. Conclusiones y previsiones uturas

25 8. Agradecimientos

25 9. Lecturas complementarias


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Prossor i.S. (Skk) ProrusManaging Director

TheAustralianWineResearchInstituteLtd,PO Box197,GlenOsmond,Adelaide,SA5064,Australia

Tel.: +61-8-83036610; Fax: +61-8-83036601

E-mail:[email protected]

SakkiePretoriusselicencienlaUniversityofthe

OrangeFreeState(Sudfrica)yobtuvosudoctoradoen gentica molecular de levaduras , bajo la direc-

cindelProfesorJuliusMarmurenelAlbertEinsteinCollegeofMedicinedeNewYorken1986.Enlaac-tualidadesdirectorgerentedelAustralianWineRe-searchInstitute,localizadoen Adelaida. Esademsproesor asociado de la Universidad de Adelaida

Sus investigaciones estn centradas en la microbio-

loga y biotecnologa del vino. Ha supervisado a 31

estudiantes de Doctorado y 56 estudiantes de Mas-

ter en Ciencias. Ha publicado ms de 200 artculos

de investigacin y captulos de libros, impartido ms

de 500 lecciones magistrales y conerencias y es au-

tor de 6 patentes.Defende como principio que la investigacin del

vino debe perseguir en primer lugar el conocimien-

to, pero tambin responder a las necesidades de

productores y consumidores, tanto en la seleccin

del tema de investigacin como en el diseo expe-

rimental. Cree que la investigacin inspirada en la

bsqueda de conocimiento de los principios un-

damentales y en las consideraciones de una aplica-

cin utura es la ms poderosa dinamo del progreso

tecnolgico y que con una mnima inyeccin de re-

cursos obtiene una sustancial calidad mejorada del

producto, benefcios en la salud del consumidor y

escaso impacto ambiental.

Rsum

Un mundo sin levaduras, esos humildes hongos uni-celulares que nos ayudan a coneccionar alimentos ybebidas, tambin nos negara la capacidad de haceravanzar las ronteras de la ciencia y de la tecnologa.La mayor parte de todo el abanico de unciones des-empeadas por las levaduras es realizada por una solaespecie, la Saccharomyces cerevisiae. De todas sus un-ciones, esta levadura es bien conocida por su capa-cidad para impulsar la transormacin del mosto envino. Si bien la Saccharomyces cerevisiae es conocidacomo la levadura vinica, no se pueden considerar to-das sus cepas iguales, dadas sus dierencias en el de-sarrollo de la ermentacin y atributos organolpticos.En la enologa moderna, donde es esencial disponerde ermentaciones rpidas y ables para producir vi-nos estables en el tiempo y con estilo predetermina-do y una calidad predecible, se preere la inoculacin

en el mosto de cepas seleccionadas de Saccharomy-ces cerevisiae. Actualmente seguimos proundizandoen el conocimiento de las interacciones asociadas conel vino que se producen entre nutrientes, precurso-res de sabores derivados de la uva, condiciones de laermentacin y cepas especcas de levaduras. El pre-sente documento aborda cmo los enologos puedengestionar correctamente la ermentacin a travs dela dinmica de las levaduras en los mostos con el nde optimizar su rendimiento y evitar el desarrollo desabores y aromas indeseables, y sacar partido de ce-pas especializadas de levaduras de nuevo desarrollo

y de las estrategias de inoculacin para mejorar la ge-neracin de sabores.

1. iroducc

Imagnese, si puede, un mundo sin levaduras. Ima-gnese que se encuentra entre las muchas personasque asumen la comida y la bebida que hay en susmesas sin preguntarse cmo ha llegado hasta all, tansana y rica. Imagnese un mundo sin nada para su-bir la masa al cocer el pan, sin nada con lo que hacercerveza, vino o bebidas de alta graduacin. Imagne-

se tambin un mundo en el que nuestra capacidadpara hacer avanzar las ronteras de la ciencia y de latecnologa en varios rentes de manera sana y relati-vamente barata estuviera muy limitada. Y por ltimoimagnese un mundo con muy pocas alternativas conlas que convertir los residuos agrcolas ricos en azcaren bioetanol para el uso como uentes de energa re-novables. Si puede imaginarse todo eso, estar vien-do un mundo en el que nuestro avance tecnolgicoy nuestro patrn de utilizacin de energa, nuestragastronoma, jovialidad y buen estilo de vida se veranaectados considerablemente.

Lo que necesitamos y explotamos parar evitar talmundo inimaginable es un humilde hongo unicelularque durante milenios nos ha ayudado a coneccionar

Ponencias

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02. Los nuevos retos en microbiologa del vino. Levaduras no productoras de SH2

alimentos y bebidas, y que en los ltimos tiempos hasido moldeado por seleccin articial para realizar unams vasta, si cabe, variedad de unciones primerocomo agente de ermentacin vital en panicadoras,bricas de cerveza, bodegas de vino y destileras y,en los tiempos ms recientes, como herramientacientca en los laboratorios de investigacin y comominibricas para la produccin de productos biotec-nolgicos de bajo volumen y gran valor tales comoenzimas, productos qumicos, protenas teraputicasy otros productos armacuticos importantes comer-cialmente. Lo que es an ms increble es que la ma-yora de esta gama de diversas unciones es realizadapor una nica especie de levadura, la Saccharomycescerevisiae. No obstante, de todas estas unciones yproductos, esta extraordinaria levadura es probable-mente mejor conocida por su capacidad para trans-ormar la dulce, azucarada y poco sabrosa uva en elproducto distintivo y rico en sabor que conocemos

como vino.

Los trminos levadura y ermentacin provienen eti-molgicamente de palabras que se reeren al eectode hervir o burbujear producido cuando el azcarse convierte bioqumicamente en alcohol etlico ydixido de carbono, pero la ermentacin producidapor las levaduras es mucho ms que eso. De hecho,es la responsable de la mayora de los cambios asocia-dos con la biotransormacin del mosto en vino elaroma, el sabor, la sensacin en el paladar, el color y lacomplejidad qumica son producidos por la levadura

conorme diversica y ampla su mundo con los pro-ductos de su metabolismo.

Tradicionalmente el vino se elaboraba con las de leva-duras ambientales que realizaban una ermentacinespontnea; la inoculacin deliberada de cultivos delevaduras puras es una tcnica relativamente reciente.En la ermentacin espontnea, existe una sucesinde levaduras indgenas provcedentes del viedo y dela bodega, pero las etapas nales estn dominadas demanera invariable por cepas de Saccharomyces cere-visiae tolerantes al alcohol. Hace mucho tiempo estaimportante especie conocida universalmente como

la levadura del vino, evolucion su capacidad para a-bricar, acumular, tolerar y, bajo ciertas condiciones decrecimiento, incluso consumir alcohol, mientras quesimultneamente produce metabolitos que mejoranel sabor y el aroma, tan importantes en nuestra apre-ciacin sensorial del vino. No obstante no todos losmiembros de la tribu Saccharomyces cerevisiae pue-den considerarse iguales, dado que existen dieren-cias en su robustez, rendimiento de la ermentacin yen los atributos sensoriales que introducen en el vinoque las hacen nicas.

En la vinicultura moderna, donde es esencial dispo-ner de ermentaciones rpidas y ables para producirhomogneamente vino segn unas especicacionesdenibles de sabor, unos estilos predeterminados y

una calidad predecible, se preere la inoculacin decepas seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae enel mosto. Las unciones principales de estas cepasseleccionadas son establecer un dominio numricoy metablico en la ase temprana de la ermentacindel vino y catalizar la conversin completa y ecientede los componentes de la uva a alcohol, dixido decarbono y metabolitos que mejoran su sabor y aromasin desarrollar sabores y aromas indeseables.

La eleccin de la cepa de levadura a inocular en el cal-do y la gestin ecaz de las interacciones entre la leva-dura, el mosto y las condiciones de ermentacin sonactores importantes que determinan la duracin dela ermentacin y la composicin qumica y las pro-piedades organolpticas de un vino. En los apartadossiguientes se aborda brevemente cmo los enlogospueden controlar la dinmica de la levadura en los cal-dos para optimizar el desempeo de la ermentacin

y por tanto evitar el desarrollo de muchos sabores yaromas indeseables y cmo pueden aprovecharse decepas especializadas de reciente desarrollado paragestionar correctamente la ermentacin del vino.

2. Coro d dmc d rmc d vdur pr mjorr cdd d vo

A dierencia de las prcticas microbiolgicas en otrossectores de la industria agroalimentaria, en enologa

los microorganismos asociados con las uvas, otrasmaterias primas y la maquinaria de procesamientopueden entrar en el proceso de ermentacin e inuiren su ecacia y en la calidad del producto. Las uvasalbergan una gran variedad de levaduras y bacteriasepiticas y, dependiendo de la adicin de sultos,la temperatura de la uva, el tiempo empleado en eltransporte a la bodega, el estado higinico de las ma-quinaria de procesamiento de la uvas y los procedi-mientos de premaceracin, prensado y claricacin,as ser la proporcin de levaduras que sobreviven enel zumo o mosto. Estas levaduras pueden prolierar enel zumo o mosto junto con los microorganismos aso-

ciados al equipo de procesamiento dependiendo delas condiciones sicoqumicas y de nutrientes.

Las etapas tempranas de la ermentacin son domina-das habitualmente por especies poco ermentativascomo la Hanseniaspora uvarum (anamoro de Kloec-kera apiculate), debido a su gran tamao poblacionalinicial. Con una prevalencia numricamente inerior aestas levaduras existen especies de Candida, Crypto-coccus, Debaryomyces, Dekkera (anamoro de Bretta-nomyces), Issatchenkia, Kluyveromyces, Metschnikowia,Pichia, Rhodotorula, Saccharomycodes, SchizoSaccha-

romyces, Torulaspora y ZygoSaccharomyces. Algunasde las levaduras mejor adaptadas no pertenecientesal gnero Saccharomyces tienden a reemplazar a lasespecies dbilmente ermentativas, pero nalmente

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son tambin reemplazadas por las Saccharomyces, yaque stas ltimas estn mejor adaptadas al elevadocontenido etlico y las condiciones anaerbicas delmosto o zumo en ermentacin. Saccharomyces cere-visiae es habitualmente la levadura dominante en lamayora de las regiones vincolas del mundo, si bienla especie criotolerante Saccharomycesbayanus es ladominante ms recuente en las regiones ms ras.Saccharomyces paradoxus se encuentra en varias re-giones ras de Europa del Este.

Los tratamientos de claricacin y la aplicacin de sul-tos habitualmente reducen el nmero de levadurasindgenas y, si inocula un cultivo vigoroso activador,ste dominar a la microora indgena. Sin perjuiciode lo anterior, el uso subptimo de sultos antes de laermentacin puede, por ejemplo, aectar a la ecaciade la ermentacin y a la calidad del vino. Si las condi-ciones lo permiten, la Hanseniaspora uvarum indgena

puede desarrollarse rpidamente y eliminar nutrientesimportantes del mosto. Por ejemplo, la tiamina, la cuales esencial para que las Saccharomyces produzcanetanol ecazmente, puede consumirse rpidamen-te. La Hanseniaspora uvarum puede tambin generarsabores y aromas no deseables, especialmente cidoactico y acetato de etilo. Los lactobacilos tambinse pueden multiplicar rpidamente y producir cidoactico junto con otros compuestos antagonistas delas levaduras, de modo que ralentizan o paran la er-mentacin. Con el reciente descubrimiento de quela Dekkera bruxellensis puede estar presente en las

uvas, al menos en la regin de Burdeos, la entrada deesta levadura contaminante en la corriente del vinoahora es ms obvia. Adems, el uso de sultos apa-rentemente no aecta a su establecimiento durante laermentacin dado que posee una tolerancia relativa-mente alta a este agente antimicrobiano.

A pesar de que los caldos en ermentacin espont-neos (levaduras naturales, salvajes o silvestres) ha-bitualmente tardan ms en ermentar que los inocula-dos (y habitualmente ms de lo que la mayora de losvinicultores estn dispuestos a aceptar) y a pesar deque el resultado de un mosto en ermentacin espon-

tnea no siempre es predecible, no existe consensoentre los vinicultores del mundo sobre si es mejor usarcultivos iniciales o dejar la ermentacin espontnea.En un extremo se encuentran aquellos que continanutilizando levaduras indgenas exclusivamente, dadoque creen que la contribucin nica de diversas espe-cies de levaduras conere una complejidad al vino novista en ermentaciones inoculadas o guiadas. Otrospreeren empezar con levaduras nativas y posterior-mente inocular un cultivo activador. Otros inician laermentacin con activadores pero a un nivel de ino-culacin inerior al recomendado. En la produccin

vincola a gran escala, donde es esencial disponer deermentaciones rpidas y ables para conseguir unsabor homogneo y una calidad predecible, se pre-ere utilizar cultivos seleccionados de levaduras puras

con una capacidad, un conteo de clulas viables y unavitalidad conocidos. Con el n de obtener los bene-cios de la ermentacin espontnea y guiada, cadavez ms vinicultores estn co-inoculando dos o mscepas dierentes pero compatibles de Saccharomycescerevisiae, o mezclas de cultivos compuestas de unacepa de Saccharomyces cerevisiae y otra especie deSaccharomyces o no perteneciente a este gnero. Sedebe optimizar la proporcin de las cepas o especiesseleccionadas en los cultivos de siembra con el n deobtener los mejores resultados previstos.

3. Opmc d rmc

Cuando se prepara el mosto a partir de uvas sanas ymaduras, con una poblacin baja de microorganismoindgenas y un buen equilibro de nutrientes, si a estemosto se inocula un cultivo de levaduras vigoroso,

la ermentacin empieza y naliza rpidamente, de-jando una pequea cantidad de azcar residual. Bajoestas condiciones ideales, las ermentaciones subp-timas son relativamente inrecuentes. No obstante,cuando se producen, es necesario recuperar recursosconsiderables y pueden conducir a la prdida de lacalidad del vino por un deterioro oxidativo, microbio-lgico o autoltico de las levaduras.

Se pueden producir ermentaciones subptimas encualquier tipo de vino o producto en ermentacin,y stas pueden ocurrir incluso cuando se utilizan las

cepas ms robustas siolgicamente hablando. Sibien las levaduras son enormemente adaptativas alambiente del mosto, las condiciones sicoqumicasy nutritivas no siempre son avorables para una acti-vidad siolgica vigorosa y, a menos que la levadurase pueda adaptar a condiciones cambiantes durantela ermentacin, una reduccin del estado siolgicopuede conducir a una ermentacin incompleta.

Habitualmente se observan cuatro tipos de ermenta-ciones subptimas: (i) inicio con retraso; (ii) ermenta-cin continuamente lenta; (iii) ermentacin ralentiza-da; y (iv) ermentacin incompleta o interrumpida. Las

ermentaciones que comienzan despus de un tiem-po, pero que a menudo nalizan por ellas mismas demanera normal, son habitualmente el resultado de lautilizacin de un cultivo activador con una calidad de-ciente. Las ermentaciones que constantemente sonlentas, que pueden llegar a su nalizacin, habitual-mente son el resultado de una cantidad reducida denitrgeno asimilable. Las ermentaciones ralentizadase interrumpidas, sin embargo, parecen ser causadaspor varios actores relacionados con las interaccionesentre la siologa de las levaduras, el estado de losnutrientes del mosto, la presencia de inhibidores y las

condiciones de ermentacin.

Concentraciones elevadas de azcar en el mosto, locual viene determinado principalmente por la ma-

Ponencias

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durez de la uva en su vendimia, es probablemente lacausa principal de ermentaciones ralentizadas e inte-rrumpidas, y esto se debe a su vez primordialmente ala relacin entre la concentracin inicial de azcar y laproduccin nal de etanol; cuanto ms azcar hay enla uva, ms alcohol habr en el vino. Este problema semagnica por la tendencia a utilizar uvas muy madu-ras o demasiado maduras en las bodegas. Por tanto,cada vez es ms importante elegir cepas de levadurascon alta tolerancia al etanol.

El riesgo de que aparezcan problemas de ermenta-cin aumenta cuando el mosto tiene un contenidosubptimo de nutrientes, especialmente de nitrge-no asimilable y vitaminas. Es importante saber queestas ltimas se pueden perder durante la vendimiay el procesamiento del mosto. Un elevado ndice deazcar con respecto a otros nutrientes puede provo-car una reduccin de la cantidad de biomasa y una

bajada de la velocidad de ermentacin, as como elinicio precoz de la inactivacin del transporte de az-car en las levaduras.

La claricacin del mosto es un actor importante enla ermentacin de vinos blancos debido al proundoeecto que la disminucin de los slidos de las uvastiene sobre la denicin de la variedad de la uva, so-bre el sabor y aroma del vino y sobre la aparicin dearomas enlicos indeseables. No obstante, el excesode claricacin elimina lpidos importantes necesa-rios para que las levaduras puedan tolerar el etanol; en

la prctica se adquiere una solucin de compromisodeterminada por la experimentacin para establecerel nivel de slidos de la uva que avorecen una tasasatisactoria de ermentacin manteniendo la calidaddel vino en un nivel aceptable. La incapacidad de -nalizar la ermentacin de mostos demasiado clari-cados, con una elevada cantidad de azcar y una er-mentacin anaerbica, pueden evitarse parcialmenteintroduciendo un paso de aireacin breve durante laermentacin. La aireacin, unida a la adicin de ni-trgeno asimilable despus de que haya nalizado laase de crecimiento de las levaduras, revigoriza con-siderablemente la ermentacin. Este paso de airea-

cin no tiene un impacto detectable sobre el sabordel vino e incluso es benecioso ya que minimiza elriesgo del desarrollo de sabores y aromas indeseablesque podran originarse a partir de una ermentacinincompleta.

No obstante, cuando la ermentacin se rena debidoa una cantidad elevada de azcar, el procedimientode rescate ms exitoso depende de la adaptacin se-cuencial de un cultivo resco de levaduras a los inhi-bidores del vino en ermentacin interrumpida. Esteprocedimiento, que comienza preparando un cultivo

activador de una levadura altamente tolerante al eta-nol, implica multiplicar sucesivamente por dos el vo-lumen de cultivo, por adicin al vino en ermentacininterrumpida, a la vez que se mantienen la aireacin y

el aporte de nutrientes. Despus de dos a cuatro ciclosde adaptacin al vino en ermentacin interrumpida,el cultivo de rescate altamente adaptado puede na-lizar la ermentacin en presencia de concentracionesde etanol y de cidos grasos voltiles normalmenteinhibidoras. Los procedimientos que mantienen la le-vadura en suspensin hasta que vuelve a comenzar laproduccin de CO2 mejoran ms la tasa y la probabili-dad de que se complete la ermentacin.

4. Opmc d cdd d vo:vr producc d sbors y romsdsbs

Es importante gestionar los nutrientes de la ermenta-cin con el n de mantener una tasa de ermentacinvigorosa, alcanzar un punto nal de bajo contenido deazcar residual y disminuir la produccin de sabores y

aromas indeseables. Las uvas cultivadas en regionescon suelos de bajo contenido orgnico y pocas lluviasen la temporada de crecimiento pueden contener unnivel de nutrientes inerior al ptimo, especialmentede nitrgeno asimilable, el cual es necesario para elcrecimiento de las levaduras y su uncin metablica.Se conoce bien cmo aecta la nutricin del nitrge-no sobre la produccin de compuestos voltiles deazure. Durante la ermentacin de mostos con pocosnutrientes, la cantidad de nitrgeno asimilable bajaprecozmente e induce la produccin de suluro dehidrgeno (H

2S) debido a la ausencia de compuestos

que capten el suluro. En muchos casos se puede con-trolar la produccin de H2S mediante la adicin de sa-

les nitrogenadas como el osato de diamonio. Otrosestudios sugieren que es necesaria una concentracinde 200 250 mg/L de nitrgeno asimilable para mi-nimizar el riesgo de produccin de H

2S. No obstante,

no todas las cepas comerciales responden a la mejoradel mosto por la adicin de osato de diamonio, y elallo en la respuesta habitualmente indica una de-ciencia en el mosto de una o ms vitaminas, de cidopantotnico, de piridoxina o biotina, los cuales estnimplicados en el metabolismo del H

2S. La persisten-

cia de problemas por produccin de H2S, an con la

suplementacin de nutrientes, requiere la seleccinde una levadura de baja produccin de H

2S en tales

mostos. La ausencia de respuesta sobre el H2S tam-

bin puede venir originada por la presencia de azureelemental residual que no se ha utilizado en la viasegn las recomendaciones del abricante o cuandola vendimia se ha realizado prematuramente debido acondiciones meteorolgicas adversas.

El exceso de algunos nutrientes tambin puede pro-vocar la aparicin de sabores y aromas indeseables.La utilizacin excesiva de cido nicotnico, presente

en algunos suplementos nutritivos, se asocia con laproduccin de cido actico. La utilizacin excesivade osato de diamonio tambin puede provocar laaparicin de sabores indeseables. El osato de dia-

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monio estimula la produccin de steres, los cualesen cantidades moderadas pueden ser beneciosos,pero cuando la concentracin total de in amonio seacerca al nitrgeno mximo que la levadura puedeconsumir (aprox. 400 500 mg/L de nitrgeno asimi-lable), la produccin de acetato de etilo es excesivaprovocando un sabor indeseable debido a este stervoltil. Como una posible alternativa, existen algunosdatos sobre productos de levaduras inactivadas queal utilizarse cuando se rehidrata la levadura seca activapueden reducir el riesgo de produccin de H

2S. Dado

que el nitrgeno asimilable aecta tanto sobre la pro-duccin de sabores indeseables durante la ermenta-cin, es importante medir el nitrgeno asimilable enlos zumos o mostos antes de la ermentacin con eln de optimizarlo. En los viedos con historia de pro-blemas de ermentacin, se deben llevar a cabo anli-sis de nitrgeno en varias temporadas.

A menos que existan condiciones higinicas decien-tes en la bodega, normalmente no se puede detectarla contaminacin por Brettanomyces durante la er-mentacin. Sin embargo, cuando la Dekkera bruxellen-sis est presente, incluso en un nmero relativamentebajo, si el inicio o la terminacin de la ermentacinmalolctica tarda mucho, el riesgo de crecimientode la D. bruxellensis y la produccin de etil enoles au-menta considerablemente. Las condiciones sicoqu-micas y nutritivas existentes durante la ermentacinmalolctica son avorables para el desarrollo de estalevadura contaminante, y toda condicin que perju-

dique el desarrollo de la Dekkera bruxellensis tambinretrasar el desarrollo de bacterias malolcticas. Portanto, para controlar esta levadura contaminante esobligatorio mantener su tamao poblacional en unmnimo inmediatamente despus de la ermentacinalcohlica y antes de la induccin de la ermentacinmalolctica. Minimizar los nutrientes residuales, espe-cialmente ructosa y nitrgeno asimilable puede serbenecioso para este n, y la compatibilidad entre lalevadura y las bacterias malolcticas utilizadas para lasermentaciones primaria y secundaria est resultandoser un actor importante para el xito de las ermenta-ciones malolcticas.

5. Opmc d cdd d vo:mjor d rom dsb, sbor y coor

De lo anterior se desprende claramente que existenmuchas herramientas para minimizar el riesgo de de-sarrollar sabores y aromas indeseables durante la er-mentacin, pero debemos considerar qu estrategiaspodemos emplear para que las ermentaciones pro-porcionen caractersticas positivas al vino.

La rehidratacin de la levadura con nutrientes de le-vaduras inactivas puede estimular la produccin dearomas arutados. De manera similar, niveles modera-

dos de nitrgeno asimilable, ca. 200 350 mg/L, me-jora el equilibrio de los steres orales con respectoa los alcoholes de usel, dotando al vinos de saboresms rescos y limpios. El osato de diamonio estimu-la la produccin de steres de acetato especialmen-te, pero tambin de etil estres arutados, e impidela produccin de alcoholes superiores, los cualestienden a aectar negativamente al aroma del vino.No obstante, se debe tener cuidado de no sobredi-mensionar la adicin de nitrgeno a partir de uen-tes como el osato de diamonio, ya que, como se haindicado anteriormente, esto puede conducir a unaproduccin excesiva de steres de acetato. Es ms,investigaciones recientes indican que la adicin deosato de diamonio puede reducir la respuesta de losprecursores responsables de los aromas a rutas tropi-cales en Sauvignon Blanc y otras variedades similares;ya que se desavorece la hidrlisis de conjugados de lacistena, por lo que disminuye la produccin de tioles

poliuncionales de cadena larga.

Otra herramienta importante que puede ayudar a losvinicultores a producir vinos con perles sensorialesespeccos y segn las especicaciones del mercadoes la eleccin de la cepa de levadura y la estrategiade inoculacin. Por ejemplo, ahora sabemos que la le-vadura desempea un papel esencial en la evolucinde molculas responsables del aroma provenientesde la propia levadura y de la uva. Las primeras son lasgrandes responsables del carcter del vino, e incluyenmetabolitos voltiles de la levadura como steres, al-

coholes superiores, cidos, carbonilos y compuestosde azure, mientras que las ltimas contribuyen a loscaracteres especcos de las variedades. Existen dosclases importantes de compuestos derivados de lauva que son precursores del sabor y el aroma: los con-

jugados de la cistena y los conjugados con grupo deenlace de azcar (o grupo gluco-). Los conjugados dela cistena, que estn presentes en la variedad Sauvig-non Blanc y en variedades relacionadas, son hidroliza-dos durante la ermentacin por la accin de enzimascarbono-azure-lasas. Esta hidrlisis libera potentestioles voltiles como 4-mercapto-4-metilpentan-2-ona (4MMP) y 3-mercaptohexanol (3MH), los cuales

son responsables de aromas a maracuy, boje, po-melo y grosella negra. Adems, el 3MH es esterica-do por una alcohol acetiltranserasa codicada porel gen ATF1 para producir el ms potente acetato de3-mercaptohexilo (3MHA). En unos recientes estudiosde co-ermentacin se inocularon dos cepas de leva-duras vincolas en zumo de uva Sauvignon Blanc. Unacepa hidroliz el conjugado y la otra esteric el pro-ducto, por lo que las dos se complementaban entres y mejoraban los sabores y aromas de la SauvignonBlanc.

Los glucoconjugados no voltiles de las uvas son es-pecialmente importantes para el desarrollo del aromade los vinos a partir de variedades de uvas muy aro-mticas como la Muscat y la Riesling, y tambin de al-

Ponencias

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gunas variedades no aromticas como la Chardonnay,la Semillon y la Sauvignon Blanc. Entre los ejemplos decompuestos derivados de la ruta con sabor y aromapotenciales se encuentran los alcoholes monoterpe-nos orales linalool y geraniol, as como los norisopre-noides tales como la -damascenona. En variedadesno aromticas, estos sabores y aromas se desarrollandurante la ermentacin, y la acidez del vino, la cualpermite una hidrlisis qumica de los precursores novoltiles de aromas lenta, se ha considerando durantemucho tiempo una ruta importante de la ormacinde estos compuestos. No obstante, trabajos recientesdemuestran la existencia de al menos otras cuatrosrutas (en las que estn implicadas las levaduras). Deestas, la hidrlisis de glucoconjugados por glucsidosextracelulares de las levaduras parece ser la ms im-portante cuantitativamente durante la ermentacin.

El color es otro atributo sensorial del vino muy impor-

tante y, en el vino tino, ste est ampliamente deter-minado por los antocianinos y pigmentos derivadosde la antocianina. Existen numerosos actores viticul-turales y viniculturales implicados en la ormacin yen la estabilizacin del color del vino tinto, no obstan-te el papel de la levadura solamente se ha estudiadorecientemente. La eleccin de la cepa de levadurano slo aecta a la proundidad del color, sino quetambin a su matiz; los tonos rojo-morados. Existeun estudio en curso para comprender el mecanismobioqumico que aecta al desarrollo del color del vino.Los conocimientos extrados de este estudi permiti-

rn desarrollar estrategias genticas para personalizarcepas de levadura con el n de orecer a los consumi-dores vinos de un aspecto excepcional.

6. aumo d s opcos d osvcuors md dsrroo dcps d vdurs vcos mjords yovdossActualmente es indudable que las levaduras desem-pean un papel esencial a la hora de dotar al vino desus propiedades sensoriales. Durante siglos de vini-

cultura se han aislado y utilizado, accidental o deli-beradamente, cepas de Saccharomyces cerevisiae porsu capacidad para convertir ecazmente el mosto deuva en vino a pesar de su exposicin a un esuerzoosmtico, de nutrientes y etlico. Estas levaduras handesarrollado una serie de caractersticas especcas decada cepa, como la produccin de diversos sabores yaromas y dierentes perles de utilizacin de nutrien-tes, lo cual es reejo de su historia y ahora puede em-plearse para adecuar cepas especcas a las condicio-nes y estilos concretos de cada vino. Adems de estadiversidad de opciones disponibles en la actualidad,

se han mejorado muchas cepas de levadura vincolautilizando mtodos genticos clsicos (mutagnesis,hibridacin, evolucin adaptativa), y en los ltimostiempos mediante ADN recombinate (tambin cono-

cida como tecnologa de modicacin gentica).

A este respecto, el desarrollo de cepas de levadurasde vino es una uente importante de una nueva di-versidad gentica para mejorar las opciones disponi-bles de los vinicultores. Por ejemplo, la produccin dehbridos intra- e inter-especcos del gnero Saccha-romyces permite la generacin de cepas novedosasde levaduras con las propiedades de ermentacinrobusta de la levadura vincola comercial y las diversaspropiedades sensoriales orecidas por otras especies.El sector est actualmente evaluando desde un puntode vista vincola los hbridos interespeccos de Sac-charomyces kudriavzevii y Saccharomyces cariocanuscon Saccharomyces cerevisiae. Se espera que estos h-bridos aporten aromas multicapa dierenciadores enciertos estilos de vinos.

Otro ejemplo de aplicacin satisactoria de estrategias

sin modicacin gentica en nuestro programa dedesarrollo de cepas es la produccin y la comerciali-zacin de cepas novedosas de Saccharomyces cerevi-siae con la capacidad de ermentar robustamente y deproducir simultneamente niveles ptimos de tiolesarutados deseables y cantidades mnimas de H

2S. En

primer lugar, la investigacin de los benecios de lasestrategias de co-inoculacin ha contribuido al desa-rrollo de dos productos comercializados mixtos (unamezcla de cepas de un proporcin especca) quemejoran los aromas arutados provenientes de tioles.En segundo lugar, se han utilizado estrategias sin mo-

dicacin gentica para desarrollar cepas de vino queermentan excepcionalmente bien sin producir can-tidades detectables de H

2S. Estas cepas comerciales

que producen menos H2S obtuvieron resultados ex-

celentes a escala industrial.

Con el n de empezar a investigar las bases genticasde las dierencias entre cepas de la levadura vnica, elAustralian Wine Research Institute (Instituto de Inves-tigacin Enolgica de Australia) obtuvo el genoma deuna cepa de levadura vincola y lo compar con el dela cepa de Saccharomyces cerevisiae de laboratorio. Lacepa de vino result ser muy dierente a su homloga

de laboratorio. La secuenciacin del genoma de otrascepas industriales proporcionar una visin ms pro-unda de las variaciones presentes en las cepas vinco-las y debera resaltar variaciones comunes y espec-cas de cepas que puedan asociarse con caractersticasindustriales importantes.

As como las investigaciones undamentales sobre le-vaduras pasaron de estrategias clsicas reduccionistaa estudios que implican todo el genoma, estos ltimospasarn tambin al siguiente nivel de investigacinbiolgica conocido como la biologa de sistemas. La

denominada revolucin -mica promete, con la ayu-da de modelos matemticos, la consecucin de unacomprensin total de las clulas de la levadura vnicaen toda su complejidad. Esta metodologa permitir el

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desarrollo de cepas con una precisin y velocidad sinrival, y acilitar la utilizacin a medida del metabolis-mo de la levadura para satisacer las cada vez mayoresdemandas de los vinicultores y las preerencias siem-pre cambiantes de los consumidores en un mercadomasicado y sobre-abastecido.

7. Cocusos y prvsos uursEn conclusin, el sector enolgico y sus organismosde investigacin estn continuamente proundizandoen el conocimiento de las interacciones entre nutrien-tes, los precursores de sabores derivados de la uva, lascondiciones de ermentacin y las cepas especcasde levaduras para la produccin del vino. Existen mu-chas oportunidades innovadoras abiertas para inves-tigaciones uturas. El sector del vino se centrar en eldesarrollo de la evaluacin de nutrientes rpidos y elcontrol de la ermentacin a travs de tcnicas ante-riormente inimaginables como la tecnologa del inra-

rrojo cercano en lnea. Tambin mejorarn las cepasespecializadas de la levadura vincola y las estrategiasde inoculacin que puedan potenciar los caracteresdeseables los vinicultores ahora buscan cepas debajo alcohol, tolerantes al etanol y potenciadoras desabores deseables, con capacidades bioconservantesy biosaludables para satisacer las demandas espera-

das del mercado en el uturo y reducir o eliminarsabores y aromas indeseables.

8. agrdcmos

El Australian Wine Research Institute Ltd (AWRI, Ins-tituto de Investigacin Enolgica de Australia), unmiembro del Wine Innovation Cluster (Grupo de In-novacin del Vino) de Adelaida, recibe el apoyo deviticultores y vinicultores australianos a travs de suagencia de inversiones, la Grape and Wine Researchand Development Corporation (Corporacin para laInvestigacin y el Desarrollo de la Uva y el Vino), lacual lo nancia segn una metodologa matchingunds con el Gobierno australiano. Me gustara agra-decer la contribucin investigadora indicada en estedocumento a todos los miembros actuales y pasadosdel departamento de biociencia del AWRI: Caroline

Abrahamse, Eveline Bartowsky, Jenny Bellon, Etjen Bi-zaj, Paul Chambers, Anthony Borneman, Antonio Cor-dente, Peter Costello, Chris Curtin, Angus Forgan, PaulHenschke, Wanphen Jitjaroen, Robyn Kievit, Ellie King,Dariusz Kutyna, Jane McCarthy, Jean Macintyre, SimonSchmidt, Tina Tran, Hentie Swiegers, Maurizio Ugliano,Cristian Varela y Gal Winter.

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Seminario Técnico: Compuestos Azufrados Volátiles en Vinos

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