Presentacin de PowerPoint

Julio LozanoElia Salazar

Identificacin de interaccin de protenasSistema doble hibridoLa tcnica Y2H permite la deteccin de las protenas que interactan en que viven las clulas de levadura [17].Como se describe con todo detalle en el captulo 3, la interaccin entre dos protenas, llamado cebo y presa, activa genes indicadores que permiten el crecimiento en medios especficos o una reaccin de color.Y2H puede ser fcilmente automatizado de alto rendimiento estudios de interacciones de protenas en un genoma de gran escala, como se muestra en busca de virus como el bacterifago T7 [18],Saccharomyces cerevisiae[19,20],Drosophila melanogaster[21],Caenorhabditis elegans[22] y los seres humanos [23,24].Y2H datos experimentales han sido una parte fundamental en el establecimiento de grandes interactomes humanos sintticos [25,26] o para diseccionar los mecanismos de la enfermedad humana [27].Dos enfoques de cribado se pueden distinguir: la matriz (o matriz) y el enfoque de la biblioteca.En el enfoque de la matriz, todas las combinaciones posibles entre de longitud completa marcos de lectura abierta (ORFs) se examinan sistemticamente mediante la realizacin de apareamiento directo de un conjunto de cebos frente a un conjunto de presas expresada en diferentes tipos de apareamiento de levadura (por ejemplo, tipo de apareamientounade cebos y apareamiento Tipo depara presas).Este enfoque es fcilmente automatizable y se ha utilizado en la levadura y pantallas de dos hbridos de escala del genoma de humanos.En la levadura, 6000 ORFs fueron clonados y se identificaron ms de 5.600 interacciones, involucrando 70% del proteoma de levadura [19,20,28].La posicin definida de cada cebo en una matriz permite la rpida identificacin de interactuar presas sin secuenciacin, pero las pantallas se restringe generalmente a un conjunto limitado de ORF de longitud completa de y por lo tanto dejar de detectar ciertos interactores (llamados falsos negativos).Las bsquedas de pantalla clsicos-cDNA biblioteca para pair wise interacciones entre las protenas de inters definidas (cebo) y sus compaeros de interaccin (presas) presentes en las bibliotecas de ADNc o sub-grupos de bibliotecas.Una pantalla exhaustiva de bibliotecas con cebos seleccionados puede ser una alternativa a un enfoque de la matriz.Aqu, presas no estn separados en una matriz, pero agruparon (revisado en [29]), y las bibliotecas pueden contener fragmentos de ADNc adems de ORFs de longitud completa, por lo que cubre en gran medida un transcriptoma y reducir la tasa de falsos negativos.Sin embargo, inherente a este tipo de seleccin de la biblioteca, la tasa de las protenas identificadas de forma errnea (llamado falsos positivos) se incrementa.Adems, los socios de interaccin tienen que ser identificado por colonia anlisis de PCR y secuenciacin, por lo que tales pantallas ms caro y consume mucho tiempo.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2705515/1Mtodos comunes para analizar interaccin protena-protena

El sistema del doble hbrido en levaduras (Yeast Two-Hybrid System, Y2H)es una tcnica usada para estudiar las interacciones protena-protena, que son crticos en prcticamente todos los procesos celulares.

1989, Fields y SongLab. PtashneMuchos factores de transcripcin constan de 2 dominios, ambos imprescindibles para que se produzca la expresin del gen que regulan.La idea de este sistema proviene del hecho que la mayora de los factores de transcripcin son modulares, teniendo al menos dos dominios claramente diferenciados: el dominio de unin a DNA (DB del ingls "DNA binding") y el dominio de activacin de la transcripcin (AD del ingls "activation domain"). La interaccin entre dos protenas fusionadas, una al AD y otra al DB de un factor de transcripcin, podra comprobarse por la activacin de la transcripcin de un gen reportero que contuviera la secuencia de reconocimiento para el DB correspondiente

Incluso aunque el factor de transcripcin sea separado en dos fragmentos, , uno que reconoce UAS y el otro que promueve la activacin de la maquinaria de transcripcin, es capaz de activar la transcripcin cuando los dos fragmentos son conectados indirectamente.

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En 1989, Fields y Song revolucion el anlisis de la interaccin de protenas mediante la descripcin de un sistema gentico para detectar interacciones directas entre protenas en la levaduraSaccharomyces cerevisiae

Slo unos pocos aos antes, el Laboratorio Ptashne haba descubierto la estructura modular de Gal4, un activador transcripcional en la levadura.Ellos mostraron que Gal4 se une a una secuencia especfica de ADN (el dominio de activacin aguas arriba, UAS) y por lo tanto activa la transcripcin en presencia de galactosa.Si se separa en dos fragmentos, el fragmento N-terminal no todava se unen al ADN, pero no activan la transcripcin en presencia de galactosa, mientras que esta ltima funcin estaba mediada por el fragmento C-terminal [45].Sin embargo, ambos fragmentos podran interactuar y no covalentemente reconstituir una Gal4 completamente funcional.As, se identificaron dos dominios funcionales diferentes de Gal4: un dominio de unin a ADN N-terminal (DBD) y un dominio C-terminal (transcripcin) de activacin (AD), con ambos dominios individuales que mantienen su funcin independiente de la presencia de la otra.

Inspirado por estos hallazgos, Fields y Song explotaron las propiedades modulares del factor de transcripcin Gal4 para monitorear las interacciones protena-protena.La idea bsica era para fusionar las dos protenas de inters X e Y a DBD y AD de Gal4, respectivamente, de manera que la interaccin entre X e Y reconstituye un factor de transcripcin funcional, que podra entonces conducir la expresin del gen indicador (Figura 1).En el cebo primera constructo llamado, la protena X (por ejemplo, la glucosa-SNF1 sensor) se fusion a la parte N-terminal de GAL4 que contiene el DBD (GAL4DBD).En la segunda construccin, la presa, la protena Y (por ejemplo, la protena reguladora SNF4) se fusion a la parte C-terminal de Gal4 que contiene la AD (GAL4AD).La expresin de ambas protenas de fusin en levadura y la interaccin entre el cebo y presa de hecho reconstituy un factor de transcripcin Gal4 funcional de los dos polipptidos separados.Gal4 entonces reclut a la ARN polimerasa II, que conduce a la transcripcin de unGAL1-lacZgen de fusin.Este gen indicador codifica la enzima beta-galactosidasa que las etiquetas de la clula de levadura cuando se utiliza un sustrato colorimtrico.

Para una pantalla de todo el genoma para interactores de cebos dadas, una biblioteca de ADNc se utiliza para construir una biblioteca entera de presas.Desde un punto de vista metodolgico, este tipo de pantalla Y2H implica la transformacin de clulas de levadura con cebo y presa cDNA en diferentes vectores bajo el control de promotores de levadura.Los niveles de expresin dependern del promotor utilizado y pueden afectar a la sensibilidad y especificidad de la pantalla.Una vez que se expresa en el citosol, cebo y presa debe ser capaz de entrar en el ncleo para activar la transcripcin, una limitacin del enfoque original de Y2H se discute ms adelante.Este sistema Y2H clsica se ha ampliado para explotar diferentes otras protenas de unin al ADN (DBD por ejemplo deE. coliprotena represora LexA), activadores de la transcripcin (por ejemplo, AD de Herpes simplex virus VP16) y varios genes informadores.Un gen informador adecuado debe codificar una protena cuya funcin proporciona una sencilla lectura.As, adems de la reaccin colorimtrica con ellacZgen, los ms comnmente utilizados son los marcadores auxotrficos (por ejemplo,LEU2, HIS3, ADE2, URA3, LYS2) que permiten el crecimiento en medio mnimo.En el estado de la tcnica actual, ms de un gen reportero se ensaya en paralelo para aumentar la rigurosidad de las pantallas Y2H [46].De hecho, uno de los problemas comunes de Y2H es la generacin de falsos positivos debido a las interacciones no especficas (como se describe en detalle ms adelante).Seleccin por dos genes indicadores activos requiere una ms slida de activacin transcripcional y por lo tanto aumenta la rigurosidad del ensayo, pero concomitantemente penaliza la deteccin de interacciones dbiles y transitorios.Otra posibilidad para ajustar la rigurosidad del ensayo es la inhibicin parcial de la actividad enzimtica codificada por el gen reportero.Por ejemplo, el producto de laHIS3reportero, imidazol glicerol fosfato deshidratasa, se inhibi competitivamente por concentraciones crecientes de 3-aminotriazol.En comparacin con las pantallas de interaccin anteriores, el sistema de Y2H fue capaz de detectar interaccionesin vivoen un cierto entorno celular.Puesto que tambin es relativamente fcil de implementar y de bajo costo, Y2H convirti rpidamente en el sistema de eleccin para la deteccin de interacciones protena-protena.Sus principios fueron adoptados rpidamente para las proyecciones relativas a la interaccin de ms de dos socios.Para analizar las interacciones ligando-receptor, un heterodmero sinttica de dos pequeos ligandos orgnicos diferentes se utiliza como tercera molcula hbrida junto con dos receptores fusionados a DBD y AD.En este caso, la unin del ligando orgnico hbrido para ambos receptores forzar juntos para reconstituir el DBD-AD complejo [47].Este sistema de tres hbrido tambin se puede utilizar para identificar inhibidores de las interacciones protena-protena [48].Otra extensin del sistema de Y2H clsico es el uso de ms de un cebo, en particular, para comparar las especificidades de interaccin [49].En el llamado sistema de doble cebo, la protena X1se fusiona a la LexA DBD, y la protena X2se fusiona con el DBD del represor cI del bacterifago .As, cada cebo se dirige a un gen informador diferente.Las interacciones positivas con X1se registran a travs de la activacin del operador lexA deLEU2yLacZ, y las interacciones positivas con X2a travs de la activacin del operador cI deLYS2yGusA.GusAcdigos para la beta-glucuronidasa que puede utilizar un sustrato colorimtrico para informar de las interacciones.Este sistema ha sido utilizado con xito para identificar protenas que interaccionan con regiones especficas en las protenas ms grandes [50].Ms lejos ms recientes expansiones de Y2H para aplicaciones de alto rendimiento, el llamado enfoque de la matriz o una matriz, ha sido ya discutido en el captulo anterior.En su publicacin original Fields y Song ya se ha mencionado algunos de los lmites de su mtodo de Y2H: "El sistema requiere que la interaccin puede ocurrir dentro del ncleo de levadura, que la regin de activacin de Gal4 es accesible a la maquinaria de transcripcin y que el Gal4 (1 -147) -Protenas X hbrido es en s misma no es un potente activador ".Estas limitaciones podran excluir casi la mitad de todas las protenas, lo que explica el gran inters para el desarrollo de variantes alternativas Y2H

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BDADXYBDXADY

El sistema de dos hbridos de levadura clsica.(A) La protena de inters X, se fusiona con el dominio de unin a ADN (DBD), un constructo llamado cebo.El potencial de interaccin de protenas Y se fusiona con el dominio de activacin (AD) y se llama presa.(B) El cebo, es decir, la protena de fusin DBD-X, se une la secuencia de activador corriente arriba (UAS) del promotor.La interaccin de cebo con la presa, es decir, la protena de fusin AD-Y, recluta la AD y, por tanto reconstituye un factor de transcripcin funcional, lo que lleva a un mayor reclutamiento de la ARN polimerasa II y la posterior transcripcin de un gen reportero.4

El mtodo de rastreo ms comn es el ensayo del doble hbrido en levadura. Este sistema suele servirse de una cepa de levadura modificada genticamente para que sea defectiva en labiosntesisde ciertos nutrientes (comnmenteaminocidosocidos nucleicos. Cuando estas cepas se cultivan en medio que carecen de estos nutrientes, no son capaces de sobrevivir. Esta cepa mutante puede ser capaz de incorporar ADN forneo vehiculado por un plsmido. En el sistema del doble hbrido de levadura, dos plsmidos independientes conteniendo el cebo y el anzuelo son simultneamente introducidos en la cepa mutante de levadura.Los plsmidos son diseados para producir un producto proteico en el cual el dominio de unin al ADN (en ingls,DNA-binding domaino BD) es fusionado con una de las protenas mientras que otro plsmido es diseado para producir un producto proteico en el que el dominio de activacin (activation domaino AD, en ingls) es fusionado con la otra protena a estudiar. La protena fusionada con el BD se suele denominar protena anzuelo o cebo (bait proteinen ingls), y es comnmente una protena conocida que el investigador utiliza para identificar nuevas dianas de unin de la misma. La protena fusionada con el AD se conoce como protena presa (prey proteinen ingls) y puede tratarse de una nica protena conocida o de una librera de protenas conocidas o desconocidas. En este sentido, una librera consistira en una coleccin de secuencias que en conjunto codifican para todas las protenas expresadas en un organismo o tejido, o podra ser generada por sntesis aleatoria de secuencias de DNASi las protenas cebo y presa interaccionan (por ejemplo, unindose), se hace posible la conexin indirecta entre los dominios AD y BD, haciendo que el dominio Ad se coloque en las proximidades del sitio de inicio de la transcripcin y la transcripcin del gen reportero se d. Si por el contrario no interaccionan, no se da la transcripcin del gen reportero. De esta manera, una interaccin entre las protenas se puede asociar a un cambio fenotpico en la clula.

El primer paso es contruir un bait plasmido y una librera. Cada plasmido contiene un marcador selectivo como un aminoacido esencial.

5a) probar la interaccin de un par de protenas, que utilizando otros criterios, se sospecha que interaccionanb) definir el dominio o los aminocidos que juegan un papel importante en la interaccin de dos protenas, que se sabe que interactanc) tamizar bibliotecas para detectar protenas que interaccionen con una protena dada.

APLICACIONESHace posible el screening de interaccin entre muchas protenas involucradas en los procesos biolgicos.Identificar mutaciones que podran afectar las unionesAunque tiene desventajas, mecanismos moleculares de muchas cascadas de sealizacin han sido definidas usando esta tcnica.

http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios/Cap16/http://genemol.org/biomolespa/levadura/levaduras.html

7Ventajas Desventajas Tcnica in vivoActivacin automticaRapidez Interferencia entre los dominios fusionadoscDNA del gen

Modificaciones post-transcripcional Interacciones sensibles plegamiento puede variar entre levaduras y otros organismosSemi-cuantitativoverificacin independiente de la interaccinfalsos negativos (64%) y falsos positivos (50%)Sistema de doble hibrido. En este sistema la protena cebo se expresa en una levadura como protena quimrica fusionada al dominio de unin de DNA de un factor de transcripcin. El resto de las protenas blanco contra las que se va a probar el cebo se expresan en la misma clula fusionadas con el dominio activador del mismo factor de transcripcin. Cuando las dos protenas se unen, ambos dominios estarn suficientemente cerca como para que el factor de transcripcin sea funcional y permita la activacin de un gen que posibilite el crecimiento de la levadura en un determinado medio. La principal ventaja de este mtodo se encuentra en que se manipula DNA y no protenas para estudiar las interacciones protena-protena, no siendo necesaria la purificacin de los complejos formados. Adems es un mtodo de alto rendimiento que permite el estudio de todos los complejos presentes en un determinado organismo.Como desventaja este mtodo solo permite la deteccin de interacciones binarias y presenta un alto porcentaje tanto de falsos positivos (hasta el 50%) como de falsos negativos (64%), de modo que los resultados obtenidos exigen comprobacin utilizando otros mtodos.

Los sistemas eucariotas superioresADNc del gen ---- no requiere grandes cantidades de protenas purificadas o anti-cuerpos de buena calidadInteracciones sensibles ---- dbiles y transitoriosSemi-cuantitativo ---- discriminacin entre los enlaces de alta, intermedia y baja afinidad

Modificaciones post-transcripcional ---- tales como formacin de puentes disulfuro, glicosilacin o fosforilacinLas modificaciones postransduccionales difieren entre las levaduras y otros organismos, por lo que puede ser difcil realizar un screening de interacciones entre protenas de mamferos o de procariotas usando el sistema de doble hbrido en levaduras.

8Falsos negativosFalsos positivosProtena diana no disponible en la bibliotecaNo especficaProtenas cebo o diana que activan sin objetivoLas protenas no se pliegan correctamente o interactan en las condiciones utilizadas en el screeningLas protenas de levadura reportero fusionados o anclajes pueden causar impedimento estrico que impide la interaccinEspecficaLas interacciones entre protenas que nunca se expresan juntos en clulas vivasLas interacciones entre protenas que normalmente son inhibidas por la presencia de otras protenas / condicionesSobreexpresin de protenas

No permiten la activacin de dominiohttp://tesis.ipn.mx/xmlui/bitstream/handle/123456789/4494/tesis%20Aldo.pdf?sequence=1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2705515/

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Lneas 1 y 5 mostrando actividad beta-galactosidasa

En el primer ensayo gentico para estudiar la interaccin entre dos protenas con este mtodo, se estudi la interaccin entre dos protenas (Snfl y Snf4) implicadas en la regulacin del gen SUC2 deS. cerevisiae, expresndolas como protenas quimricas en la levadura. Una de las protenas quimricas estaba formada por la fusin del dominio de unin a DNA de Gal4 (DB-Gal4) al extremo N-terminal de la protena Snf1, y la otra por la fusin del dominio de activacin de Gal4 (AD-Gal4) al extremo N-terminal de la protena Snf4. La interaccin entre Snfl y Snf4, conlleva a la interaccin de las dos protenas de fusin y por lo tanto a la activacin de la transcripcin del genlacZintegrado en el genoma de la levadura que contena en su promotor, sitios de unin de Gal4. Al interaccionar ambas protenas en el interior de la levadura, se expresa el gen LacZ producindose B-galactosidasa. La activacin del gen se detecta porque la colonia de la levadura adquiere color azul en un medio que contenga X-Gal.

Este gen es un gen llamado reportero que permite detectar su expresin porque suele ser el gen de una enzima cuya expresin produce la sntesis de un producto fcilmente detectable. Muchas veces se ha utilizado como gen reportero el gen lacZ que codifica la enzima beta-galactosidasa que metaboliza la galactosa y en el ensayo habitual produce un color azul en las colonias positivas en las que se ha producido una interaccin entre una protena del conjunto A y otra del conjunto B.Durante los ltimos aos este tipo de ensayo ha sido muy til para detectar a gran escala interacciones entre protenas. As por ejemplo se han analizado proteomas completos detectando nuevas interacciones entre protenas y colaborando de forma significativa a aumentar el conocimiento de las complejas redes de interaccin entre protenas de un organismo completo.La debilidad de esta tcnica es que puede dar muchos falsos positivos sobre todo en los ensayos a gran escala ya que se expresan juntas y a la vez protenas que en condiciones fiosiologicas no tienen por qu coincidir nunca en el espacio (pueden expresarse en compartimentos o tipos celulares distintos) ni en el tiempo (su regulacin puede hacer que nunca se expresen a la vez). Las distintas modificaciones postraduccionales (fosforilacin, glicosilacin ) son otra de las causas de algunos falsos positivos ya que este tipo de modificaciones puede impedir que ocurran en estado fisiolgico interacciones detectadas por el sistema Y2H. An as es un filtro de seleccin realmente til que ha permitido descubrir importantes interacciones que han podido ser confirmadas posteriormente por tcnicas ms especficas como la coinmunoprecipitacin.

10Ejemplos de interaccin

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