SÍNTESIS DE NANOPLATAFORMAS MAGNÉTICAS...

REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN

SÍNTESIS DE NANOPLATAFORMAS MAGNÉTICAS MULTIFUNCIONALES

PARA SU USO EN BIOMEDICINA

Mendoza Reséndez Raquel Dra1, Luna Criado Carlos Dr1

1Facultad de Ingeniería Mecánica y Eléctrica, Universidad Autónoma de Nuevo León, 2Facultad de Ciencias Físico-Matemáticas, Universidad Autónoma de Nuevo León Email: [email protected], [email protected]

Introducción:

Uno de los retos más importantes de la investigación científica en el área médica es el de introducir

nuevas tecnologías que permitan realizar diagnósticos más precisos y diseñar nuevas terapias más

eficaces con efectos secundarios minimizados. A este respecto, la nanotecnología ofrece nuevas

posibilidades de resolución de algunos problemas clínicos difíciles de afrontar con los

procedimientos convencionales. En concreto, el uso de partículas nanométricas en el campo de la

biomedicina, tanto en aplicaciones in vivo como in vitro, presenta un enorme potencial debido al

reducido tamaño de estos sistemas (inferior al de los virus, bacterias y células) y a sus propiedades

únicas, considerablemente distintas a las de sus análogos macroscópicos.

Cuando están estabilizadas con ciertos ligandos, las nanopartículas exhiben una gran resistencia a la

actividad del sistema fagocítico mononuclear (SFM) pudiendo circular por el torrente sanguíneo

durante largos períodos de tiempo y superar algunas de las barreras biológicas como la barrera

hematoencefálica, las cuales dificultan la labor terapéutica y retrasan dramáticamente el

diagnóstico de enfermedades tan graves como el cáncer de cerebro1. Esta propiedad junto a su alta

relación superficie/volumen hacen que estos materiales nanoscópicos puedan emplearse

eficazmente como plataformas depositando en su superficie iones o moléculas que puedan

interactuar selectivamente con patógenos (virus, bacterias, células cancerosas, etc.) por medio de

interacciones ligando-receptor o anticuerpo-antígeno. En este aspecto, las nanopartículas que

presentan un comportamiento superparamagnético a temperatura ambiente son especialmente

interesantes debido a que es fácil dispersarlas en una solución coloidal y a que exhiben una alta

direccionalidad ante la presencia de un campo magnético distante. De este modo, se pueden

emplear estas partículas como vectores de transporte de agentes terapéuticos (medicamentos,

drogas, agentes radiactivos y genes) guiados magnéticamente a una zona en cuestión2. Por otra

parte, además de poder realizar un suministro localizado de fármacos, este tipo de nanopartículas

pueden desempeñar otras funciones después de alcanzar un tejido u órgano dañado. Por ejemplo,


gracias a su carácter superparamagnético, estas nanopartículas son excelentes agentes de contraste

de resonancia magnética nuclear3 (estándar y funcional) debido, principalmente, a la relajación

transversal de su momento magnético (decaimiento T2). De este modo, el principio activo de

algunos medios de contraste que se comercializan actualmente para uso diagnóstico son

nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (por ej. Endorem®). Asimismo, en estudios

experimentales recientes4 se han empleado nanopartículas superparamagnéticas como diminutos

centros de irradiación de calor (42-56°C) para destruir selectivamente células cancerígenas sin

dañar a los tejidos sanos adyacentes. Estos tratamientos térmicos localizados se basan en que las

nanopartículas superparamagnéticas disipan energía en forma de calor cuando se encuentran en el

seno de un campo magnético alterno (típicamente con amplitudes de 1 a 50 kA/m y frecuencias de

1 kHz a 1MHz) por medio de la rotación de su momento magnético (relajación de Néel) y la

rotación de las partículas producida por el torque ejercido por el campo aplicado (relajación

browniana)3. Otras tendencias en la aplicación biotecnológica de nanopartículas con

comportamientos superparamagnéticos y ferromagnéticos incluyen el diseño de nuevos protocolos

de análisis clínicos más rápidos y fiables que los ya existentes. Éstos se basan en el reconocimiento,

captura y separación magnética de patógenos y sustancias nocivas en medios líquidos como el

agua, la orina y la sangre5.

En todas (o casi todas) estas aplicaciones es crucial que los materiales empleados sean muy

uniformes dado que sus propiedades físicas y bioquímicas son, en general, muy sensibles al

tamaño, forma, estructura y composición del sistema. Asimismo, es decisivo el control de la

naturaleza de su superficie, la cual va a determinar, junto a otros factores, la estabilidad y

movilidad de las partículas en el medio en el que se encuentren (en una muestra de orina,

circulando en el torrente sanguíneo, etc.). Por estos motivos, resulta esencial desarrollar y mejorar

nuevas técnicas de preparación de nanopartículas monodispersas con propiedades adaptables a los

requerimientos específicos de las aplicaciones biomédicas. A este respecto, es importante destacar

que el disponer de partículas con formas alargadas amplía considerablemente las posibilidades de

explotación tecnológica de las nanopartículas dado que, usualmente, una forma anisotrópica

implica un cambio significativo en las propiedades químicas, térmicas, ópticas, magnéticas y

eléctricas del material según la dirección del agente que produzca el efecto estudiado (por ej. un

campo eléctrico o magnético). Sin embargo, la mayoría de las técnicas de preparación de partículas

conllevan un control muy limitado en la forma de las mismas.


En la contribución presente se analizan las posibilidades que nos ofrecen algunas estrategias de

síntesis química en la producción de nanopartículas con tamaños y formas controlables.

Objetivo:

Analizar algunas rutas de síntesis que permitan la producción de nanopartículas magnéticas con

propiedades que puedan ajustarse flexiblemente a las necesidades requeridas para su uso como

nanoplataformas multifuncionales en el área biomédica.

Materiales y Métodos:

Preparación de las muestras.- En este trabajo hemos empleado varios métodos para preparar

sistemas de partículas con características estructurales, morfológicas y magnéticas diferentes:

1) Se prepararon nanocristales coloidales uniformes de FePt, con formas casi esféricas, mediante la

descomposición térmica de hierro pentacarbonilo, Fe(CO)5, y la reducción de una sal de platino en

presencia de surfactantes estabilizadores (oleilamina y ácido oleico) siguiendo el método descrito

por Sun y colaboradores6. En estos experimentos se mezclaron acetilacetonato de platino (0.5

mmol) y 1,2-hexadecanediol (1.5 mmol) en una solución de dioctiléter (20 ml). Esta solución fue

agitada mecánicamente y calentada a 100°C en presencia de un flujo de nitrógeno. A esta

temperatura, se le añadió ácido oleico (0.5 mmol) y oleilamina (0.5 mmol), los cuales actúan como

agentes estabilizadores proporcionando una barrera estérica a las partículas. Seguidamente, se

inyectó dentro de la solución una concentración variable de hierro pentacarbonilo (0.77-7.70

mmol). Después, la solución resultante se calentó hasta alcanzar su temperatura de ebullición

(∼300ºC) a reflujo en una atmósfera de nitrógeno aplicando una tasa de calentamiento de 5 ºC/min.

Dicha temperatura se mantuvo durante 30 minutos. Transcurrido este periodo de tiempo, se dejó

enfriar el medio de reacción hasta alcanzar la temperatura ambiente manteniendo la agitación y el

flujo de nitrógeno. Posteriormente, se removió la atmósfera inerte y se añadieron 40 ml de etanol a

la dispersión obtenida. Las partículas se recuperaron en forma de polvo fino tras centrifugar la

dispersión resultante y haber despreciado el material no precipitado. La purificación de la muestra

se realizó mediante la dispersión de las partículas en hexano y su separación por centrifugación tras

añadir etanol. Finalmente, el polvo obtenido se dispersó en hexano obteniendo una suspensión

coloidal estable.


2) Para obtener partículas con propiedades cristaloquímicas controlables y formas alargadas,

primeramente se prepararon nanoelipsoides aplanados monodispersos de hematites (α-Fe2O3)

mediante la hidrólisis asistida de una sal de hierro siguiendo el método descrito por Ocaña y

colaboradores7. El procedimiento consistió en disolver 0.1 M de perclorato de hierro (III),

Fe(ClO4)3⋅9H2O, 0.1 M de urea y una concentración entre 3.5 y 5.5 mmol·dm-3 de fosfato sódico

dihidrogenado, NaH2PO4, en 1l de agua bidestilada. Esta disolución se colocó en tubos cerrados de

vidrio Pyrex®, de 25 ml de capacidad aproximadamente, y fueron introducidos en una estufa a

100ºC por un período de 48 h. Después, se separó el precipitado de la solución madre por

centrifugación y se lavó varias veces con soluciones concentradas de NaOH (7.5M) y con agua

bidestilada. Finalmente, el polvo se secó a 50°C.

3) Para modificar las propiedades cristaloquímicas y magnéticas de los nanoelipsoides, éstos fueron

sometidos a tratamientos térmicos en atmósferas de hidrógeno en una línea de reducción8. Para

obtener nanoelipsoides de magnetita, las muestras de hematites se calentaron a 360°C durante 3

horas en una atmósfera estática de H2. Por otra parte, para obtener partículas alargadas de hierro,

las partículas de hematites precursoras fueron reducidas a su estado metálico calentándolas a 400°C

durante 4 horas en presencia de un flujo constante de H2. Después de este proceso se dejaron enfriar

hasta alcanzar la temperatura ambiente. Finalmente, la superficie de las partículas de hierro

resultantes fue pasivada para proteger a las partículas de una oxidación completa una vez que

entren en contacto con el aire. Para ello, se indujo una oxidación superficial en estas muestras

metálicas introduciendo en el sistema un flujo de N2/etanol por un período de 30 min.

Técnicas de caracterización.- Las propiedades morfológicas, cristaloquímicas y magnéticas de las

muestras obtenidas fueron caracterizadas mediante microscopía electrónica de transmisión (MET),

difracción de rayos X (DRX) y magnetometría de muestra vibrante y SQUID, respectivamente. La

composición química de los nanocristales ricos en hierro fue analizada mediante absorción atómica.

Resultados:

Nanocristales superparamagnéticos de FePt.- Se prepararon nanopartículas superparamagnéticas

muy uniformes, con formas casi esféricas, ricas en hierro y con tamaños controlables mediante el

método descrito por Sun y colaboradores6 (ver sección Materiales y Métodos). En los experimentos

realizados encontramos que, fijando la concentración de acetilacetonato de platino, el aumento de

la concentración del Fe(CO)5 inyectado al medio de reacción conlleva un aumento en el contenido


de Fe en las partículas finales y la reducción de su tamaño, ver figura 1. Las causas de esta

dependencia entre composición y tamaño de partícula no están claras debido a que no se sabe con

certeza cuáles son los procesos complejos responsables de la formación de las partículas por este

método. Los autores de otros trabajos9,10 sugieren que el mecanismo de formación de estas

partículas se inicia con la generación de núcleos ricos en platino. Después, el crecimiento de las

partículas ocurriría principalmente mediante la deposición de hierro en la superficie de los núcleos

ya formados. Seguidamente, cuando el medio de reacción se calienta hasta alcanzar su temperatura

de ebullición, desaparecería el gradiente de composición presente en cada partícula debido a un

proceso de difusión atómica. Este último paso es consistente con los patrones de DRX de las

muestras sintetizadas en este trabajo, ver fig.2, dado que no corresponden a fases separadas de Fe y

Pt, sino que se pueden relacionar con una estructura cúbica centrada en las caras de una aleación de

FePt químicamente desordenada. Adicionalmente, el tamaño promedio del cristal estimado a partir

de la reflexión (111) aplicando la fórmula de Scherrer coincidió con el tamaño de partícula

obtenido mediante análisis estadísticos de las imágenes de MET. Este resultado sugiere que cada

partícula de FePt es un monocristal de tamaño nanométrico. Finalmente, resulta esencial la

adsorción del ácido oleico y la oleilamina presentes en el medio de reacción. Estos ligandos

estabilizadores reducen la alta tensión superficial de las nanopartículas y las provee de una barrera

estérica hidrófoba que las separa entre sí, permitiendo la formación de partículas con dimensiones

de pocos nanómetros.

Fig. 1 Imágenes MET de nanocristales de a) Fe45Pt55, b) Fe55Pt45 y c) Fe75Pt25 sintetizados

inyectando al medio de reacción 0.77, 2.00 y 7.70 mmoles de Fe(CO)5.

Es importante destacar que, si no se tienen en cuenta algunos procesos, la disminución del tamaño

de partícula con el aumento de Fe(CO)5 inyectado podría parecer disonante con la hipótesis de una

nucleación de platino. De hecho, esta dependencia podría explicarse si una parte importante del

Fe(CO)5 inyectado se descompone antes de la reducción de la sal de platino, produciendo núcleos


de hierro. En estas circunstancias, un aumento de la concentración de Fe(CO)5 inyectado al medio

de reacción debería generar un número más grande de núcleos, y por lo tanto, fijando la

concentración de la sal de Pt a una dada, se esperaría una disminución en el tamaño de los

nanocristales generados de FePt. Sin embargo existen otras dependencias complejas que deberían

tenerse en consideración. Por ejemplo, varios estudios han demostrado que la variación de la

relación de concentraciones [agentes surfactantes]/[precursores metálicos] puede influir

significativamente en los tamaños finales de las nanopartículas ya que algunos surfactantes como el

ácido oleico forman complejos con las especies metálicas precursoras en solución, retrasando el

proceso de la nucleación11. Por otra parte, dada la gran diferencia entre las densidades del Fe y el

Pt, cabría esperar que la difusión atómica producida en una partícula con un corazón de platino

cubierto por una capa de hierro conlleve una ligera disminución del volumen de la partícula. Por

tanto, se necesitan más estudios para esclarecer cuáles son los procesos involucrados en la

formación de estas partículas y cuáles son sus dependencias.

Todas las muestras de FePt analizadas exhibieron un comportamiento superparamagnético a

temperatura ambiente con una respuesta ante un campo externo modulable con la variación del

contenido de hierro en las partículas y su tamaño (ver figura 3).

Fig. 2 Patrones de DRX de nanocristales de a)

Fe55Pt45 (2.67±0.26 nm) y b) Fe75Pt25

(1.79±0.34 nm).

Fig. 3 Dependencia de la magnetización de

las muestras de FePt con un campo magnético

aplicado. Las muestras, en forma de polvo

compactado, se midieron a temperatura

ambiente.


Nanoelipsoides magnéticos.- Con la intención de preparar nanopartículas magnéticas con formas

anisotrópicas, se prepararon primeramente partículas alargadas de hematites mediante la hidrólisis

asistida de una sal de hierro en presencia de iones fosfato y urea (ver sección Materiales y

Métodos). Las imágenes MET obtenidas con altos aumentos revelaron que cada partícula está

formada por cientos de nanocristales ordenados espontáneamente para formar un agregado con

forma elipsoidal aplanada (ver figura 4.a). La forma alargada de estos agregados se modificó

controladamente variando la concentración de iones fosfato en el medio de reacción (ver tabla 1).

Esto es debido a que los cristales de hematites tienden a adsorber estos iones en las caras

superficiales paralelas al eje cristalográfico c. Esta adsorción selectiva introduce interacciones

anisotrópicas adicionales al sistema que entran en competición con otras interacciones (magnéticas,

de van der Wals, etc.). El balance de estas interacciones promueve la auto-organización de los

nanocristales en superestructuras alargadas con propiedades similares a las de un monocristal7.

Para poder modular las propiedades cristaloquímicas y magnéticas de los nanoelipsoides, los

agregados elipsoidales de hematites fueron tratados térmicamente en atmósferas de hidrógeno tal

como se describió en la sección Materiales y Métodos. Los estudios de MET de las muestras

tratadas indicaron que la uniformidad y la relación axial del sistema no experimentaron un cambio

significativo (ver figuras 4b y 4c), sin embargo los patrones de difracción de rayos X mostraron que

estos tratamientos permiten modificar controladamente las propiedades cristaloquímicas de los

nanoelipsoides (figura 5). Adicionalmente, el comportamiento magnético de estos materiales varió

significativamente acorde a las transformaciones inducidas (figura 6).

50 nm

a b c

Fig. 4 Imágenes MET de nanoelipsoides aplanados de a) hematites, b) magnetita y c) hierro.


Tabla 1 Relación entre la concentración de NaH2PO4 empleada en la síntesis de las muestras

de hematites y las características morfológicas de estas partículas determinadas mediante

análisis estadísticos de las imágenes MET.

Dimensiones promedio de las partículas Muestra

[NaH2PO4]

(mmol·dm-3) Longitud (nm) Ancho (nm) Relación axial

1 3.5 177±35 67±9 ∼2.65

2 4.5 243±20 54±5 ∼4.50

3 5.5 315±24 46±5 ∼6.85

Fig. 5 Patrones de DRX de nanoelipsoides

con relación axial 5 antes (hematites) y

después (magnetita y hierro) de tratarlos

térmicamente en atmósferas reductoras.

Fig. 6 Dependencia de la magnetización de

nanoelipsoides con relación axial 5 y

propiedades cristaloquímicas diferentes con la

variación de un campo magnético aplicado.

Las muestras se midieron a temperatura

ambiente en forma de polvo compactado.

Discusión y Conclusiones:

La multifuncionalidad sin precedentes de las partículas nanométricas en las áreas de la biomedicina

y la biotecnología ha suscitado un entusiasmo generalizado en la comunidad científica. Sin

embargo, para poder evaluar el potencial real del uso de estos sistemas en alguna aplicación

específica es necesario diseñar técnicas de preparación que nos permitan preparar materiales

nanoscópicos uniformes con propiedades ajustables a los requerimientos de dicha aplicación.


Los métodos de preparación estudiados en el presente trabajo resultan apropiados para sintetizar

nanopartículas uniformes biocompatibles con propiedades morfológicas y magnéticas ajustables a

las necesidades requeridas en su uso científico y tecnológico. Dado su reducido tamaño y su posible

funcionalización con la adsorción de diferentes capas de ligandos, estos materiales podrían

emplearse como nanoplataformas magnéticas en diversas aplicaciones biomédicas. De este modo, a

los nanoelipsoides se les puede adherir directamente fármacos hidrófilos, mientras que a las

nanoplataformas estabilizadas con ácido oleico y oleilamina se les pueden adherir agentes

terapéuticos hidrófobos. Por otro lado, para poder dispersar a estas últimas en medios acuosos y/o

adherirlas ligandos hidrófilos, deben someterse a recubrimientos adicionales con copolímeros en

bloque que dispongan de cadenas hidrófobas e hidrófilas, tales como pluronic®. Asimismo,

después de la síntesis de las nanopartículas, el ácido oleico y la oleilamina pueden reemplazarse por

medicamentos o drogas tales como glicopéptidos de acción bactericida como la vancomicina5, la

cuál es sumamente efectiva contra bacterias Gram positivas.

Agradecimientos Esta investigación ha sido financiada por la Universidad Autónoma de Nuevo León mediante el

Programa de Apoyo a la Investigación Científica y Tecnológica (PAICYT) con la subvención del

proyecto CA1498-07.

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COMPORTAMIENTO DEL SEGMENTO N-TERMINAL DE LA PROTEÍNA SP-C DEL SURFACTANTE PULMONAR EN PELÍCULAS FOSFOLIPÍDICAS INTERFACIALES

González-Horta, Azucena1 y Pérez-Gil, Jesús2 1Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León 2Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Complutense de Madrid Introducción: El surfactante pulmonar es una compleja mezcla lipoproteica esencial para facilitar el trabajo respiratorio. Es sintetizada por los neumocitos tipo II y secretada en la interfase aire-líquido donde el surfactante reduce la tensión superficial previniendo el colapso alveolar1. El principal componente del surfactante es la dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) que representa cerca de un 40% del peso total2,3 siendo el responsable de las propiedades tensioactivas de este material4. El surfactante cuenta además con cuatro proteínas específicas: SP-A y SP-D proteína hidrofílicas implicadas en el sistema de defensa innata del epitelio pulmonar5,6 y SP-B y SP-C proteínas hidrofóbicas que interaccionan fuertemente con los lípidos y promueven la formación y el adecuado comportamiento dinámico de la película tensioactiva en la interfase aire-líquido7. La proteína SP-C, es un péptido de 35 aminoácidos que contiene una α-hélice transmembrana y un segmento N-terminal catiónico con dos cisteínas palmitoiladas. La mayor parte de las funciones atribuidas a la SP-C en el surfactante están relacionadas con el establecimiento de interacciones bicapa-monocapa que facilitan la transferencia de material tensioactivo durante la dinámica respiratoria, ya sea promoviendo la adsorción interfacial de fosfolípidos y estabilizando la monocapa durante los ciclos dinámicos de compresión-expansión o bien participando en la formación del reservorio superficial de material tensioactivo a partir del cual se restituyen las moléculas de surfactante de la película interfacial durante los sucesivos ciclos respiratorios8,9. Objetivo: Se sintetizaron dos péptidos con la secuencia correspondiente al segmento N-terminal de la SP-C, uno con las cisteínas libres y otro con las cisteínas palmitoiladas para caracterizar el modo y la extensión de la interacción de los péptidos con monocapas fosfolipídicas modelo con especial énfasis en el análisis del efecto de la palmitoilación de este segmento en la estructura y dinámica interfacial. Materiales y Métodos: La actividad interfacial de los péptidos se evaluó mediante cinéticas de adsorción, isotermas de compresión y organización interfacial de películas lipopeptídicas, empleando para ello una balanza de superficies de tipo Langmuir-Wilhelmy y monitorizando los cambios de presión superficial tras inyectar pequeños volúmenes de cada uno de los péptidos en solución metanólica. La subfase


estaba formada por tampón Tris 5mM NaCl 150mM pH 7.0 en agua bidestilada termostatizado a 25ºC. Resultados: La capacidad de una suspensión acuosa de surfactante para facilitar la formación de una película tensioactiva interfacial puede medirse de una manera sencilla mediante experimentos de extensión o spreading. La figura 1 muestra cómo cantidades crecientes del péptido con cisteínas libres mejora la capacidad de extensión tanto de DPPC como de la mezcla lipídica DPPC/PG 7:3 (p/p). En ausencia de fosfolípidos cargados negativamente, la presión máxima alcanzada por las suspensiones conteniendo péptido no acilado fue de alrededor de 14mN/m, valor que se incrementó hasta 30mN/m para suspensiones conteniendo cantidades equivalentes de péptido en presencia de PG. Esto sugiere que las interacciones electrostáticas lípido/péptido facilitan el tipo de perturbación que promueve la salida de moléculas lipídicas desde las membranas a la interfase. El péptido palmitoilado presentó un efecto casi nulo en el spreading de las muestras lipídicas, de manera que solo con un 10% (p/p) de péptido en suspensiones de DPPC/PG 7:3 se observó un aumento en la presión superficial hasta 12mN/m, lo que indica diferencias notables en el modo de interacción entre el péptido palmitoilado y el no-acilado.

Figura 1. Cinéticas de adsorción interfacial por spreading a partir de suspensiones acuosas de DPPC o DPPC/PG 7:3 (p/p) en presencia de diferentes porcentajes de péptido palmitoilado o no palmitoilado. Los porcentajes empleados son 0% ()1% (○), 5% (•) o 10% (•) en peso de cada uno de los péptidos.

El efecto de los péptidos en el comportamiento interfacial de las películas lipopeptídicas se analizó mediante isotermas de compresión las cuales en el caso de los péptidos puros, proporcionan información sobre su estructura y disposición interfacial. Dos datos importantes pueden obtenerse de estas gráficas. En primer lugar, el área por residuo a la cual la compresión comienza a inducir un


incremento en la presión superficial, da idea de lo que ocupa cada molécula de péptido en la disposición más extendida. Por otra parte, la máxima presión a la que puede comprimirse la película peptídica, indica el grado de estabilidad del péptido en la conformación más comprimida. La figura 2 muestra el comportamiento interfacial de monocapas exclusivamente peptídicas sujetas a compresión. Ambos péptidos, con cisteínas libres o palmitoiladas, tienen la capacidad de formar monocapas estables sobre la superficie acuosa como consecuencia de su carácter anfipático. Puede observarse como en ausencia de la acilación, la secuencia N-terminal de SP-C presenta una disposición interfacial mucho más extendida (21-22 A2/residuo vs 6-7A2/residuo). La monocapa de péptido con cisteínas libres colapsa aproximadamente a 24mN/m, mientras que el péptido palmitoilado puede mantener monocapas a presiones superficiales mayores, en torno a 46mN/m. La isoterma del péptido palmitoilado presenta un “plateau” a alrededor de 30mN/m antes de alcanzar las mayores presiones superficiales lo que indica la expulsión de la interfase de los segmentos peptídicos. La transición interfacial del péptido palmitoilado conduciría a una película en la que, tras la expulsión de la mayor parte de péptido, permanecerían orientadas hacia el aire las cadenas de palmítico, permitiendo todavía alcanzar presiones superficiales de casi 50mN/m. Este resultado confirma el papel de la palmitoilación para estabilizar la asociación de la secuencia N-terminal de la SP-C en la interfase, en estados de elevada compresión.

Figura 2. Isotermas de compresión de monocapas de cada uno de los péptidos formadas en ausencia de lípido.

Para analizar los efectos de esta interacción en el empaquetamiento y organización de las moléculas lipídicas se realizó microscopía de epifluorescencia (figura 3). En las isotermas de compresión de monocapas de DPPC en ausencia o presencia de cantidades crecientes de cada uno de los péptidos puede observarse como la inclusión de cualquiera de los dos péptidos provoca un ligero pero progresivo desplazamiento de las isotermas hacia mayores áreas con respecto a la isoterma del lípido puro como consecuencia de la inserción de las secuencias peptídicas en la interfase. La inserción del péptido desacilado induce una reducción del tamaño de los dominios a la vez que aumenta su número en todo el rango de presiones analizado. Sin embargo no tiene un efecto importante en el empaquetamiento de las cadenas de acilo ya que no produce cambios significativos en la cantidad total de área condensada (datos no mostrados) lo que sugiere que el


péptido interacciona con la monocapa de una manera superficial. El péptido palmitoilado muestra un efecto bifásico, por debajo de ∼18mN/m el péptido no perturba el empaquetamiento lipídico de la monocapa de DPPC como se deduce del tamaño y número de los dominios observados en las imágenes de epifluorescencia. Sin embargo a presiones mayores, el péptido produce una drástica disminución del área total ocupada por fase condensada lo que ocurre posiblemente como consecuencia de la inserción de los palmíticos en las regiones más condensadas de la monocapa una vez que la región peptídico ha sido expulsada de la interfase.

Figura 3. Isotermas de compresión (π-A) de monocapas de DPPC en ausencia o presencia de diferentes proporciones de los péptidos indicados (% en peso), obtenidas a 25ºC. A derecha e izquierda se muestran imágenes de epifluorescencia de monocapas de DPPC comprimidas hasta las presiones indicadas (mN/m) en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de un 10% en peso del péptido con cisteínas libres o del péptido palmitoilado. Cada imagen cubre una distancia de 350µm.

Figura 4. Isotermas de compresión (π-A) de monocapas de DPPC en ausencia o presencia de diferentes proporciones de los péptidos indicados (% en peso), obtenidas a 25ºC. A derecha e izquierda se muestran imágenes de epifluorescencia de monocapas de DPPC/PG 7:3 (p/p) comprimidas hasta las presiones indicadas (mN/m) en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de un 10% en peso del péptido con cisteínas libres o del péptido palmitoilado. Cada imagen cubre una distancia de 350µm.

En las monocapas de DPPC/DPPG (7:3) ambos péptidos producen un aumento en el tamaño de los dominios y reducen su número (figura 4) debido a que el establecimiento de interacciones


electrostáticas permiten una mayor condensación favoreciendo la nucleación de regiones condensadas lo que lleva a un aumento en el porcentaje de área total condensada a presiones superficiales mayores a 11mN/m. Al igual que ocurría en las películas de DPPC, el péptido palmitoilado muestra un efecto bifásico. Estos resultados sugieren que durante la compresión, los segmentos peptídicos son expulsados de la interfase mientras que el péptido palmitoilado mantiene la interacción de los palmíticos en las películas interfaciales altamente comprimidas. Discusión y Conclusiones: Se ha demostrado en numerosas ocasiones que la proteína SP-C del surfactante pulmonar es capaz por sí sola de promover la inserción de moléculas fosfolipídicas desde los complejos lipoproteicos en que el surfactante es secretado a la interfase aire-líquido8-10. El segmento transmembranal de la SP-C es fundamental para la función de la proteína, sin embargo algunas características funcionales esenciales de la SP-C pueden residir en las interacciones lípido-proteína en las que participa el segmento N-terminal, especialmente si se considera que este segmento puede ser la única parte de la estructura que la SP-C proyecta hacia el exterior de las membranas y monocapas de surfactante11. El segmento N-terminal de la SP-C inicia posiblemente su contacto con la interfase aire-líquido durante el proceso de adsorción de los complejos lipoproteicos del surfactante a la interfase. Este proceso de adsorción debe estar necesariamente relacionado con la perturbación que el segmento N-terminal de SP-C es capaz de producir en el empaquetamiento lipídico de bicapas y monocapas12,13. La mayor parte de los modelos planteados sobre la estructura y disposición de la SP-C en las bicapas y monocapas de surfactante suponen que el segmento N-terminal de la proteína se asocia con las membranas a través de la palmitoilación de sus cisteínas14. Sin embargo, los resultados obtenidos en este trabajo muestran que la inclusión del péptido palmitoilado en membranas fosfolipídicas no resulta muy eficiente para promover la transferencia de especies fosfolipídicas tensioactivas desde las bicapas a la interfase. La diferencia en actividad debe necesariamente estar relacionada con la diferencia que introduce la palmitoilación en la extensión y modo de interacción del segmento N-terminal con las superficies lipídicas. La adsorción interfacial de fosfolípidos desde las bicapas probablemente requiere la perturbación simultánea del empaquetamiento lipídico en bicapas y monocapa. Esta perturbación podría ser más accesible al péptido desacilado, con una conformación aparentemente más extendida, que al péptido palmitoilado. La eficiente actividad interfacial de la SP-C nativa, a pesar de poseer su segmento N-terminal estequiométricamente palmitoilado, podría depender de la simultánea presencia del segmento helicoidal, que manteniéndose integrado en la membrana permite el acercamiento y perturbación por parte del segmento N-terminal en una monocapa adyacente. El hecho de que el segmento N-terminal palmitoilado aislado pueda poseer una conformación más compacta es probable que dificulte la capacidad para perturbar simultáneamente membrana y monocapa, y de ahí el poco efecto observado durante la extensión de suspensiones lipídicas en la interfase aire-líquido. Sin embargo, una vez en la película interfacial, el péptido palmitoilado resulta asociarse


con la interfase de una manera más estable que el péptido no palmitoilado, como había sido propuesto mediante estudios de IRRAS15, manteniéndose asociado a presiones mucho mayores que las necesarias para expulsar el péptido desacilado. Los experimentos aquí presentados sugieren que la compresión primero expulsa los segmentos peptídicos y después permite la integración a través de la intercalación de los palmíticos en las regiones hidrofóbicas altamente empaquetadas de los fosfolípidos comprimidos de las películas interfaciales. Esta asociación podría entonces mantenerse hasta las mayores presiones superficiales y ser consistente con un papel de la palmitoilación en la capacidad de la SP-C para sostener la asociación de los complejos lipoproteicos del surfactante con las fases comprimidas de las películas interfaciales que se forman al final de la espiración, facilitando su posterior reextensión tras cada ciclo respiratorio. Bibliografía:

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13. Plasencia, I., et al., The N-terminal segment of pulmonary surfactant lipopeptide SP-C has intrinsic propensity to interact with and perturb phospholipids bilayers. Biochim J, 2004. 377: 183-193.

14. Johansson, J., Structure and properties of surfactant protein C. Biochim Biophys Acta, 1998. 1408: 161-172. 15. Bi, X., et al., Secondary structure and lipid interactions of the N-terminal segment of pulmonary surfactant

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EFECTO HEPATOPROTECTOR DE leucophyllum frutescens EN RATAS ALBINO

WISTAR INTOXICADAS CON TETRACLORURO DE CARBONO

José Ángel Merino Mascorro1, Isaías Balderas Rentería1, María del Rayo Camacho-Corona1, Pilar Carranza-Rosales2, Héctor G. Lozano-Garza2

1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Nuevo León, 2Centro de Investigación Biomédica del Noreste, IMSS.

Introducción:

Las enfermedades hepáticas como la cirrosis, hígado graso, y hepatitis crónica son temas de

importancia mundial. La efectividad del tratamiento con interferón, colchicina, penicilamina, y

corticosteroides, son inconsistentes y tienen severos efectos adversos. Existe la necesidad de

agentes terapéuticos efectivos. La medicina Herbolaria tradicional se ha practicado por miles de

años y está basada en la experiencia y práctica. Por estas razones, el desarrollo de drogas para el

tratamiento de enfermedades hepáticas obtenidas a partir de plantas utilizadas en la medicina

tradicional, puede mejorar las terapias.

Existen aproximadamente 1000 plantas utilizadas en la medicina tradicional Mexicana, y solo un

20% ha sido estudiado química y biológicamente. Leucophyllum frutescens (Berl.) I.M. Johnst

(Scrophulariaceae) es nativo de Texas, Nuevo México, y el norte de México. En la actualidad, es

ampliamente cultivado en Florida y el Sudeste de Asia, donde florece magníficamente en un clima

húmedo tropical. L. frutescens es utilizado para aliviar fiebres, tos, asma, y dolor reumático.

También es utilizado para tratar desordenes de higado y vejiga en México. Con el fin de validar su

uso en la medicina tradicional Mexicana, se evaluó el efecto hepatoprotector del extracto

metanólico de L. frutescens contra la hepatotoxicidad en ratas inducida por CCl4.

Objetivo:

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto anticirrótico del extracto metanólico de

Leucophyllum frutescens nativa del noreste de México, sobre ratas intoxicadas con tetracloruro de

carbono como modelo experimental de cirrosis hepática.

Materiales y Métodos:

Material de las Plantas

Las partes aéreas de la planta fueron recolectadas en Lampazos de Naranjo, Nuevo León, México

en Mayo del 2003. La planta fue autentificada por M.C. Mauricio González Ferrara. El número de


referencia (24759) fue dado por la Dra. Marcela González y se depositó una muestra en el Herbario

UNL ubicado en la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León,

México.

Extracto de la Planta

El material vegetal fue secado y pulverizado en un molino Wiley. Un kg de polvo del material

vegetal fue macerado exhaustivamente con metanol a temperatura ambiente. El extracto fue filtrado

y destilado al vacío. El rendimiento de la extracción fue de 2.6 por ciento p/p de extracto

metanólico, el cual se almacenó en refrigeración para su uso posterior.

Animales

Se utilizaron ratas macho albino Wistar, alrededor de los 200 g de peso. Con acceso libre a dieta

estándar (Rodent Laboratory Chow 500I-PMI Purina) y agua. Los animales fueron contenidos en

cajas de flujo laminar a 22±2 ºC, humedad relativa 50-60%, bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h.

Todos los animales recibieron 1 ml de aceite mineral oralmente, dos veces por semana durante 28

días como acondicionamiento.

Tabla 1: Diseño Experimental

GRUPO CARACTERÍSTICAS INTOXICACIÓN (1º PERÍODO) TRATAMIENTO

(2º PERÍODO)

I Grupo blanco, sin tratamiento

alguno Ninguno Ninguno

II Grupo control positivo, que sólo

recibió CCl4

2 ml/kg de peso oralmente dos veces

por semana por 50 días Ninguno

III

Grupo testigo, que recibió CCl4 y

posterior tratamiento con un

preparado farmacéutico de

Silimarina


por semana por 50 días

20 mg/kg de peso, 3 veces por

semana por 28 días

IV Grupo de prueba para el L.

frutescens



100 mg/kg de peso, del

extracto metanólico de cenizo

disuelto en agua potable, 3

veces por semana por 28 días

V Grupo de prueba para el L.

frutescens



200 mg/kg de peso, del

extracto metanólico de cenizo

disuelto en agua potable, 3


veces por semana por 28 días

Evaluación del daño hepático:

El Sacrificio se hizo mediante la sedación con Fenobarbital y una vez que se extrajeron la sangre y

el hígado, se procedió a la inyección de aire directamente a músculo cardiaco para provocar la

muerte del animal.

La sangre se centrifugó para separar el suero y evaluar las enzimas de funcionamiento hepático

AST y ALT, por medio de un kit convencional (Johnson&Johnson)

Los hígados fueron extraídos y se preservaron en buffer de formalina, se observaron sus

características macroscópicas y fueron procesados en parafina para su estudio histopatológico.

Se tiñeron con hematoxilina y eosina, así como con la técnica Tricrómica de Mason y fueron

procesados para observar los cambios histopatológicos

Resultados:

Tabla 2: Efecto del extracto metabólico de L. frutescens sobre la actividad de enzimas séricas

en ratas. N = 6 ratas por cada grupo. Los resultados están dados como el promedio ± la

desviación estándar. ALT = Alanin aminotransferasa, AST = Aspartato aminotransferasa.


Grupo/Niveles

séricos de

enzima

Grupo I Control

Normal

Grupo II

Control CCl4

Grupo III

Tratado con

Silimarina

(6mg/kg)

Grupo IV

Tratado con L.

frutescens (100

mg/kg)

Grupo V Tratado

con L. frutescens

(200 mg/kg)

ALT (IU/ml) 202.08 ± 2.19 385.85 ± 8.62 228.22 ± 3.6 226.73 ± 3.48 247.07 ± 2.22

AST (IU/ml) 193.29 ±1.51 402.68 ± 1.96 202.67 ± 5.12 223.68 ± 3.10 255.38 ± 7.03

Discusión y Conclusiones:

El Hígado es un órgano muy importante, altamente involucrado en las funciones metabólicas y

frecuentemente es objeto de agentes tóxicos. El CCl4 es un agente muy eficiente en la inducción de

daño hepático, debido a la formación de radicales libres. La eficacia de una droga con acción

hepatoprotectora, escencialemente depende de su habilidad de reducir los efectos dañinos

provocados por una hepatotoxina o mantener la fisiología hepática en condiciones normales. En el

presente estudio, se observó que la administración de 100 o 200 mg/Kg de extracto metanólico de

L. frutescens disminuyó la elevación inducida de los niveles de enzimas hepáticas, por CCl4. Esto

sugiere que el mantenimiento de la estructura del hepatocito o la regeneración del daño se observó

en las células que se trataron con el extracto.

El presente estudio ha demostrado que el extracto metanólico de L. frutescens tiene efecto

hepatoprotector contra daño inducido por CCl4. No obstante, es necesario determinar otros

parámetros como marcadores de estrés oxidativo y ensayos de biología molecular para confirmar

este descubrimiento. La siguiente etapa consistirá en aislar y purificar el principio activo

responsable de la actividad hepatoprotectora y determinar su mecanismo de acción

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