El sistema ACQUITY UPLC le permite aprovechar los importantes beneficios cromatográficos de la LC con partículas de menos de 2 µm.

La UltraPerformance LC® (UPLC®) de Waters® se basa en las mismas reglas y principios cromatográficos a los que

estamos acostumbrados con la HPLC con columnas de 5 µm y 3 µm, pero añade un diseño instrumental innovador

específicamente creado para reducir al mínimo y controlar el ensanchamiento de la banda cromatográfica. Para

aprovechar plenamente la química de las partículas de menos de 2 µm, el sistema ACQUITY UPLC® exige caudales

de la fase móvil generalmente más elevados para garantizar el funcionamiento en la región adecuada de la curva de

rendimiento del caudal, así como algunas consideraciones básicas acerca de la transferencia y optimización de métodos.

Siguiendo estos sencillos pasos, aprenderá usted a aprovechar al máximo el sistema para obtener magníficos resultados

cromatográficos.

Columnas de 2,1 mm D.I. (40 °C)

Velocidad lineal de la UPLC (mm/s)

3 4 5 6

Dimensiones de la columna (mm)

Caudal (mL/min)

Contrapresión (psi)

Caudal (mL/min)

Contrapresión (psi)

Caudal (mL/min)

Contrapresión (psi)

Caudal (mL/min)

Contrapresión (psi)

2,1 x 30 0,45 3000 0,60 4100 0,75 5100 0,90 6100

2,1 x 50 0,45 4800 0,60 6400 0,75 8000 0,90 9500

2,1 x 100 0,45 9100 0,60 12.100 0,75 15.200 0,90 18.200

2,1 x 150 0,45 13.400 0,60 17.900 0,75 22.400 0,90 26.900

Velocidad lineal de la UPLC a diferentes caudales con columnas de 2,1 mm D.I.

Nota: A) Columnas de fase reversa con partículas de 1,7 μm ACQUITY UPLC BEH C18. B) Gradiente ACN/acuoso, Pmax a ~30% ACN. C) Se indica la contrapresión total máxima aproximada del sistema.

RECOMENDACIONES AC ERCA DE LAS CONDIC IONES OPERAT IVAS GENERALES DE LA UPLC

¿Necesita más resolución? Aumente la longitud de la columna.¿Necesita más rapidez? Aumente el caudal.

[INDICACIONES]

[TARJETA DE INICIO RÁPIDO DEL SISTEMA ACQUITY UPLC]

Puntos de partida del caudal Para columnas de 2,1 mm D.I., los puntos de partida del caudal adecuados suelen ser 0,60 mL/min para moléculas pequeñas y 0,1 mL/min para compuestos de elevado peso molecular, como péptidos y proteínas.

Puntos de partida generales del gradiente para moléculas pequeñas

Nº de analitosLongitud de la columna (mm)

Caudal (mL/min)Tiempo del gradiente

(minutos)

1 a 3 30 1,20 1

3 a 10 50 1,00 5

10 a 25 100 0,60 10

> 25 150 0,40 25

Comunidad en línea de ACQUITY UPLC®

Para obtener más información acerca de ACQUITY UPLC, junto con una copia de esta tarjeta en su idioma, visite:

Aprenda, comparta y potencie su cromatografía.

Lavado suave: Modo de bucle completo Condiciones iniciales del gradiente Modo de bucle parcial Condiciones iniciales (asistido por presión) del gradiente Modo de sobrellenado de Metanol o acetonitrilo/ aguja con bucle parcial agua 1:1

[TARJETA DE INICIO RÁPIDO DEL SISTEMA ACQUITY UPLC]

RECOMENDACIONES PARA LA T RANSFERENCIA Y OPT IMIZACIÓN DE MÉTODOS DE HPLC A UPLC

Proceso paso a paso

4. Seleccionar las nuevas condiciones basándose en las consideraciones geométricas

Volumen de inyección: nNuevo volumen de inyección = volumen de inyección original x (volumen de la nueva columna/volumen

de la columna original).

nCaudal = los métodos isocráticos solo requieren el ajuste del flujo y de la inyección.

nNuevo caudal = caudal original x (π x r2 de la nueva columna/π x r2 de la columna original).

Perfil del gradiente: nExpresar la duración del gradiente en cambio porcentual por unidad de volumen de la columna (cv).

nCalcular cada segmento como un número de volúmenes de la columna.

nCalcular el tiempo necesario para suministrar el mismo número de volúmenes de columna a la nueva columna con el caudal escalado geométricamente.

nCalcular el tiempo necesario para suministrar el mismo número de volúmenes de columna a la nueva columna con el caudal de UPLC.

5. Optimizar a los intervalos de caudal de UPLC

Los caudales óptimos son más elevados para las partículas de 1,7 µm.

La pérdida de eficiencia es mínima a caudales superiores al óptimo para las partículas de 1,7 µm.

DIRECT RIC ES OPERAT IVAS ADIC IONALES

Eluyente de lavado del sistema de gestión de muestras para cromatografía de fase reversa

Lavado fuerte: Todos los modos de inyección Metanol/agua/IPA 70:20:10 Metanol, acetonitrilo, agua, IPA, 25% de cada Se puede añadir un 0.1% de ácido fórmico a cualquiera de ellos

En todos los casos, los eluyentes de lavado deben ser compatibles con la muestra y con su diluyente.

Preparación de las muestrasPreparar las muestras utilizando uno de los siguientes métodos:n Extracción en fase sólida (p. ej., cartuchos Oasis® o Sep-Pak®)

para eliminar impurezas antes del análisis. Estas impurezas contribuyen con frecuencia a la contaminación de la columna.

n La placa de precipitación de proteínas (p. ej., placas Sirocco™) ofrece un extracto más limpio por UV y MS que la centrifugación y que muchos otros métodos, al tiempo que facilita la eliminación de partículas.

n Centrifugación (20 minutos a 8000 rpm) y transferencia cuida-dosa del líquido sobrenadante.

Filtrar las muestras a través de un filtro compatible de 0,2 µm para eliminar partículas. Cuando sea posible, disolver las muestras en la fase móvil de partida (o en un modificador más débil, esto es, menos orgánico).

Para garantizar la limpieza y evitar picos fantasma, utilizar viales certificados para LC/MS de Waters.

INDICACIÓN: Utilice la calculadora para cambio de columnas ACQUITY UPLC Column Calculator para facilitar estos cálculos. La ACQUITY UPLC Column Calculator está diseñada para orientar fácilmente la metodología de transferencia de HPLC a ACQUITY UPLC. La calculadora da tres opciones diferentes para los métodos de UPLC: condiciones de igual eficacia, máxima eficacia y mínimo tiempo de análisis.

1. Recopilar información acerca del método de HPLC existente

Utilizar exactamente la misma fase móvil: nModificador npH nFuerza iónica nEluyente orgánico nComposición porcentual

2. Comparar los instrumentos

Anotar y ajustar el volumen del sistema o volumen de retraso del gradiente.

3. Seleccionar la columna nueva o objetivo

Química: consultar el gráfico de selectividad.

Dimensiones: calcular la longitud/tamaño de partícula (L/dp) de la columna original y seleccionar una longitud de columna de UPLC adecuada.

Si el objetivo principal es: Velocidad extrema 30 mm de longitud para empezar (L/dp = 17.770)

Velocidad con resolución 50 mm de longitud para empezar (L/dp = 29.500)

Resolución con velocidad 100 mm de longitud para empezar (L/dp = 58.900)

Resolución extrema 150 mm de longitud para empezar (L/dp = 88.300)

Por ejemplo:Columna: 2,1 x 50 mm; 1,7 μm con un caudal de 0,8 mL/min Volumen de la columna = ∏ x r2l = ∏ (0,105 cm)2 x (5 cm) = 0,173 mL Volumen del sistema = 0,080 mL

Tiempo de estabilización del sistema: = (5 volúmenes de la columna + 3 volúmenes del sistema)/caudal = (0,865 mL + 0,240)/(0,80 mL/min) = 1,4 min

Componentes del sistema ACQUITY UPLCSistema de gestión de eluyentes binario (BSM)

Sistema de gestión de muestras Detectores

Utilizar eluyentes, tampones y aditivos de la máxima calidad y agua ultrapura (libre de partículas, químicamente limpia, con una resistividad de 18 megaohmios/cm).

Mantenerse dentro de los límites recomendados para cada modo de inyección y tamaño de bucle.

Comprobar siempre que esté instalado el regulador de contrapresión si el detector de UV es el último de la línea.

Vigilar el nivel del recipiente de desechos.

Utilizar el modo de bucle completo cuando precisión y exactitud son críticas.

Retirar el regulador de contrapresión del TUV o PDA si el último de la línea es un MS (u otro segundo detector).

Filtrar los tampones (se recomienda una membrana de filtración de 0,2 µm).

Utilizar el modo de bucle parcial (asistido por presión) cuando el consumo de muestra es crítico.

Elegir una frecuencia de adquisición adecuada para obtener 25 a 50 puntos a lo ancho del pico.

No bloquear el conducto de purga del desgasificador.

Utilizar el modo de inyección con sobrellenado de la aguja y bucle parcial cuando se requiere la mejor exactitud, precisión y linealidad del bucle parcial para una amplia gama de muestras.

Elegir la constante inicial del filtro digital en función de los requisitos del método. Si la velocidad es más importante, empezar con FAST (RÁPIDO). Si la sensibilidad es más importante, empezar con NORMAL.

Mantener cebados los cuatro tubos de eluyente (mantiene la eficiencia del desgasificador).

Definir los volúmenes de la aguja y del bucle al cambiar los eluyentes de lavado suave, así como los bucles y agujas.

Optimizar las constantes del filtro digital una vez desarrollado el método, para equilibrar la sensibilidad y la resolución.

Mantener cebado el lavado de juntas (aumenta la duración de la junta del BSM).

Utilizar siempre el tubo del estabilizador de columnas, aunque no se utilice la temperatura.

Volver a cebar los tubos de eluyente antes de empezar (utilizar System Prep [Preparación del sistema] o System Start-up [Puesta en marcha del sistema]).

Utilizar Load Ahead (Carga adelantada) cuando se requieren ciclos más largos.

Iniciar el gradiente con un pequeño porcentaje de solvente orgánico, 0,1% como mínimo, (ofrece una formación de gradiente más constante y predecible que empezar desde 0%).

Modos de inyección del sistema ACQUIT Y UPLC***Volumen de inyección de muestra (µL) Volumen del bucle (µL)

Modo de bucle parcial 1 2 5 10 20 50**

Sobrellenado de aguja Intervalo de inyección (µL) 0,20 a 0,75 0,40 a 0,150 1,00 a 3,80 2,00 a 7,50 4,00 a 15,00 10,00 a 37,50

Asistencia por presión* Intervalo de inyección (µL) N.R. N.R. N.R. 2,00 a 5,00 4,00 a 10,00 10,00 a 25,00

Modo de bucle completo asistido por presión (utilizar el factor de sobre-llenado predeterminado)****

1 2 5 10 20 50**

N.R. = No recomendado.

* Modo de bucle parcial: debe reservarse para las situaciones en que el tiempo de análisis tiene preferencia sobre cualquier otra consideración, en que el volumen de muestra es muy limitado o en que el volumen de inyección es muy grande.

** Hay que utilizarlo con una jeringa de carga de 250 µL.

*** La exactitud/recuperación para el diseño de inyector de bucle fijo en el modo de bucle parcial depende de los parámetros/límites de volumen para garantizar la máxima exactitud/recuperación.

**** % RSD del área < 1,0 para los modos parcial y parcial con sobrellenado de la aguja (PLNO). % RSD del área < 0,3% para el modo de bucle completo.

[INDICACIONES]

Estabilización del sistema En general, hace falta un total de tres veces el volumen del sistema y cinco veces el volumen de la columna para la estabilización de la columna y del sistema tras una cromatografía en gradiente.

[TARJETA DE INICIO RÁPIDO DEL SISTEMA ACQUITY UPLC]

Estabilización de la columnaEstabilizar con el número adecuado de volúmenes de columna, normalmente cinco veces el volumen de la columna.

Waters Corporation 34 Maple Street Milford, MA 01757 U.S.A. T: 1 508 478 2000 F: 1 508 872 1990 www.waters.com

Waters, ACQUITY UPLC, UltraPerformance LC, Oasis, Sep-Pak, y UPLC son marcas registradas de Waters Corporation. The Science of What’s Possible, Empower y Sirocco son marcas comerciales de Waters Corporation. Todas las demás marcas comerciales pertenecen a sus respectivos propietarios.

©2008 Waters Corporation. Creado en EE.UU.Junio de 2008 720002688ES LB-UM

Función de preparación del sistema ACQUIT Y UPLC En la consola del sistema ACQUITY UPLC seleccionar Start-up (Puesta en marcha) en el menú desplegable principal y cumplimentar cada ficha; una vez cumplimentados los parámetros, hacer clic en Start (Inicio).

Función de puesta en marcha: todos los pasos necesarios para acondicionar el sistema combinados en una sola función:n Cebar/purgar todas las bombas y tubos de eluyente.n Cebar/purgar todas las jeringas.n Equilibrar el sistema y la columna con parámetros personalizados

(eluyente, caudal, temperatura).n Desde la consola o incluidos en la secuencia de muestras

del software Empower™, o haciendo clic con el botón derecho del ratón en analizar muestras.

Función de actualización de condiciones del sistema (preparación del sistema):n Cebar los eluyentes A1 y B1 (2 min).n Cebar todas las jeringas una vez.

Puesta en marcha del sistema ACQUITY UPLC.Cumplimentar cada ficha de la consola del sistema ACQUITY UPLC; después hacer clic en Start (Inicio).

[TARJETA DE INICIO RÁPIDO DEL SISTEMA ACQUITY UPLC]

[HERRAMIENTAS]

Visite la comunidad en línea de ACQUITY UPLC en www.waters.com/myuplc para obtener recursos y herramientas para aprovechar al máximo la UltraPerformance LC.n ACQUITY UPLC Column Calculator: Automatiza los cálculos de escalado necesarios para convertir métodos HPLC isocráticos o de gradiente en métodos UPLC.

n Gráfico de selectividad de las columnas de fase reversa de Waters: Seleccione de forma interactiva kits de columnas de desarrollo de métodos, elija columnas por proveedor o por tipo de ligando y busque con rapidez químicas de columna equivalentes para métodos existentes.

n Tarjeta de referencia rápida para el sistema ACQUITY UPLC: Procedimientos diarios de puesta en marcha y números de referencia importantes del sistema.

n Consejos y trucos, P+F y foros de usuarios: Temas presentados por los usuarios, preguntas más frecuentes y debates científicos.

n Notas y pósteres sobre aplicaciones.

n Presentaciones y vídeos de expertos.

...y mucho más.