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Técnicas de análisis genético- PCR

MÓDULO 1: GENÓMICA EN ONCOLOGÍA

CURSO DE MEDICINA GENÓMICA EN ONCOLOGÍA Y SUS

APLICACIONES CLÍNICAS

Material didáctico: Módulo 1-Clase 3

Técnicas de análisis genético- PCR

Material didáctico: Módulo 1 - Clase 3

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ÍNDICE

MÓDULO 1: GENÓMICA EN ONCOLOGÍA

Clase 1.3: Técnicas de análisis genético- PCR

Profesor: Dr. Antonio Jiménez

1. FUNDAMENTOS DE LA PCR ....................................................................................................... 1

2. ESTUDIOS DE REORDENAMIENTOS CROMOSÓMICOS O GENES DE FUSIÓN MEDIANTE PCR

CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL ................................................................................................... 2

3. ESTUDIOS DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL EN LEUCEMIAS AGUDAS (EMR) .................... 3

4. ESTUDIOS DE QUIMERISMO EN EL TRASPLANTE DE MÉDULA ÓSEA ........................................ 4

5. PCR DIGITAL ............................................................................................................................... 6

6. CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 7

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1. FUNDAMENTOS DE LA PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue descubierta en 1985 por Kary Mullis, que

recibió el premio Noble de química por ello en 1993. Esto marcó el inicio de la revolución

genética y genómica que vivimos hoy en día.

Es una técnica in vitro utilizada para amplificar enzimáticamente, mediante una polimerasa,

una región específica de ADN/ADNc, situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se

conoce.

En la diapositiva 3, se muestra la secuencia del gen ABL1. Se han diseñado unos cebadores

(primers), marcados en rojo en la diapositiva, para poder amplificar la secuencia que nos

interesa. Para la amplificación se pone en un tubo los cebadores, el ADN, Taq polimerasa,

tampón con magnesio, agua libre de nucleasas, y nucleótidos, y se lleva a un termociclador.

En cada ciclo del termociclador se dan los pasos que se muestran en la diapositiva 4. Estos

pasos son: desanturalización del ADN a 95º C, hibridación con los cebadores a 55º C y

extensión de ADN a 72º C. Se suelen hacer al rededor de 35 ciclos, porque luego se agotan los

reactivos y la eficiencia baja mucho. La amplificación que se da es exponencial, y podemos

llegar hasta 34.000 millones de copias, que ya son visibles mediante electroforesis en un gel

de agarosa (diapositiva 6). La PCR es cualitativa, nos permite ver si hay un gen o no. Se

intentó hacerla cuantitativa antes de la PCR en tiempo real, lo que se llamó la PCR

competitiva, pero no funcionó.

DIAPOSITIVAS 2-6

A finales de los 90 apareció la PCR cuantitativa en tiempo real. En esta PCR hay unas sondas

marcadas con fluorescencia que es lo que se va a medir. Hay varios tipos de sondas:

- sondas de hidrólisis TaqMan

- sondas de hibridación FRET

- fluorocromo inespecífico SybrGreen

El nivel de fluorescencia detectado en cada momento será proporcional a la cantidad de

producto amplificado, este nivel es procesado mediante un programa informático y

visualizado a tiempo real como curvas de amplificación. En la diapositiva 9 se ven estas

curvas. Cuanto mayor número de copias del gen diana en la muestra, menor será el número

de ciclos necesarios para comenzar a detectar fluorescencia.

DIAPOSITIVAS 7-9

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2. ESTUDIOS DE REORDENAMIENTOS CROMOSÓMICOS O GENES DE FUSIÓN

MEDIANTE PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL

Mediante la PCR es relativamente fácil detectar los genes de fusión que se dan en las

leucemias. En la diapositiva 11 se muestran la cantidad de mutaciones diferentes que se

pueden dar en la leucemia mieloide aguda y en la diapositiva12 los reordenamientos

cromosómicos que se pueden dar en esta enfermedad. De estos reordenamientos, hay

algunos que no tienen impacto clínico, pero otros son importantes para el pronóstico de los

pacientes o para la elección de la terapia. Los reordenamientos también se utilizan para

determinar el tipo de leucemia.

En la diapositiva 13 se muestran las fusiones que se pueden dar en la leucemia linfoblástica

aguda (LLA), el 65% de los pacientes tienen genes de fusión, y cada año se van descubriendo

nuevas fusiones. Este es el cáncer más frecuente en niños.

Como ejemplo de reordenamiento detectado por PCR cuantitativa a tiempo real vamos a ver

el BCR-ABL1. Esta fue la primera anomalía genética asociada a cáncer. Fue descubierto a

principios de los 60 por Nowell y Hungerford, y se denominó cromosoma Philadelphia. Es

una translocación de los cromosomas 9 y 22. Hay distintos subtipos, y en cada caso

tenderemos que utilizar unos cebadores específicos. El reordenamiento da lugar a una

actividad tirosinkinasa de ABL muy incrementada, lo que provoca la leucemia.

DIAPOSITIVAS 11-15

Para cuantificar el reordenamiento con PCR a tiempo real se utiliza la fórmula de la

diapositiva 16. Se divide el número de copias del gen problema entre el número de copias de

un gen control (en este caso se ha utilizado ABL porque es un gen muy estable), y se

multiplica por 100, si se quiere dar en porcentaje, y por un factor de conversión.

Para cuantificar se crea una curva estándar (diapositiva 17) de BCR-ABL en un plásmido con

diferentes concentraciones. Y sobre esta curva estándar se lleva la muestra problema. En la

diapositiva 17 se ve un ejemplo de un paciente en el que el gen BCR-ABL ha empezado a

amplificar en el ciclo 31.5, esto corresponde a 65 copias de la fusión. Luego se hace lo

mismo con el gen control (diapositiva 18). Cuanto antes se amplifique el gen control mejor,

porque esto nos indica que la calidad de la muestra es buena. En la diapositiva 19 se ven las

dos curvas juntas para el paciente. Hay 65 copias de BCR-ABL y 85.600 copias de ABL,

aplicando la fórmula anterior nos sale que el paciente tiene un 0.087% de copias de BCR-

ABL. Esta información nos va a permitir determinar la respuesta molecular del paciente

(MR), y el tratamiento va a variar en función de estos niveles.

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DIAPOSITIVAS 17-20

Para

poder comparar los resultados obtenidos en diferentes laboratorios se utiliza el factor de

conversión. En este factor se tienen en cuenta el gen control, los cebadores que se han

utilizado y la plataforma de PCR. Se cogen 30 muestras estudiadas en el laboratorio y se dan

los resultados y el ARN a un centro de referencia, este centro luego nos manda el factor de

conversión que tenemos que aplicar. Multiplicando por este factor tenderemos nuestros

resultados en escala internacional. En el artículo de la diapositiva 23 publicado en Blood, se

puede ver que sin aplicar el factor de conversión la variabilidad entre 19 laboratorios era

muy grande.Teniendo en cuenta que el tratamiento del paciente depende de este resultado, y

que se basa en guías internacionales, es muy importante la estandarización de la PCR en

tiempo real. En el estudio anterior, después de aplicar el factor de conversión para cada

laboratorio solo había una variabilidad de 1,2 veces entre los 19 laboratorios. Esto se tiene

que hacer para todos los genes importantes a la hora de tomar decisiones.

En la diapositiva 24 se puede ver como varía la supervivencia de los pacientes en función de

la respuesta molecular que tengan para el gen BCR-AB, en el mes 12 ó 18 de tratamiento.

También dependiendo de esta respuesta molecular podemos saber si hay que cambiar de

tratamiento.

DIAPOSITVAS 22-24

3. ESTUDIOS DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL EN LEUCEMIAS AGUDAS

(EMR)

Cuando se hace el diagnóstico de un paciente con leucemia, este tiene una gran cantidad de

células leucémicas en la sangre y en la médula ósea. Después de un tratamiento, para decir

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que un paciente está en remisión completa, la carga tumoral de células leucémicas que se

ven al microscopio tiene que haber bajado un logaritmo. Aquí es donde intervienen todas las

técnicas de PCR cuantitativa, porque estamos en el límite de detección de la citomorfología,

pero todavía queda mucha carga tumoral. Se dice que con la PCR cuantitativa se determina la

enfermedad mínima residual. El límite de detección de la PCR y de las técnicas de citometría

de flujo es de una copia entre 100.000 ó 1.000.000. Por debajo de esto todavía puede quedar

enfermedad leucémica, pero el pronóstico va a ser diferente.

En la diapositiva 27 se muestra un artículo, en el que se analiza la enfermedad mínima

residual tras el primer ciclo de quimioterapia o al final del tratamiento. En la gráfica de la

izquierda se puede ver como varía la posibilidad de recaída de la leucemia, si el paciente no

presenta enfermedad mínima residual la probabilidad de recaída es mínima. De la misma

manera, la supervivencia es del 90% en pacientes con enfermedad mínima residual

negativa. En la diapositiva 28 se presenta otro trabajo parecido, en el que se mide la

enfermedad mínima residual en el día 33 y 78 de tratamiento, la supervivencia cambia

según el número de células leucémicas que se encuentren.

DIAPOSITIVAS 27-29

4. ESTUDIOS DE QUIMERISMO EN EL TRASPLANTE DE MÉDULA ÓSEA

El único tratamiento curativo para un paciente de leucemia será el someterlo a un trasplante

de médula ósea. En este caso puede que el paciente no tenga un marcador específico para

poder seguir la enfermedad residual, por ello podemos utilizar la PCR para hacer un estudio

del quimerismo. El quimerismo se define como la presencia en un mismo organismo de dos

o más tipos celulares con distinta carga genética.

Tenemos un paciente que va a recibir una médula de un donante HLA compatible. Antes del

trasplante se tiene que dar una quimioterapia muy intensiva o radioterapia para eliminar

las células leucémicas, pero a la vez se eliminan las células sanas. Por tanto hay que

infundirle células progenitoras de un donante compatible. En el periodo postransplante el

paciente adquiere la carga genética y el grupo sanguíneo del donante, porque las células que

funcionan son las del donante. Pero puede haber situaciones en que el paciente tengas sus

células y las del donante, quimeras mixtas. En los estudios de quimerismo se detecta si hay

más de una población celular. Estos estudios se empezaron a hacer por RFLPs, grupos

sanguíneos hibridación in situ, etc., pero el boom fue con la PCR.

Los primeros estudios de PCR se hicieron con micro y minisatélites, que son polimorfismos

muy variables. Este tipo de estudios todavía se utilizan en algunos centros. En la diapositiva

34 vemos un VNTR en un gel de agarosa. El donante solo tiene una banda y en el receptor

aparecen 2, así podemos hacer un seguimiento. Lo mismo se hace con electroforesis capilar.

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En la diapositiva 35 se ve un seguimiento. En el primer gel solo hay ADN del donante, y en

los demás se da quimerismo, es decir hay ADN del donante y del paciente.

DIAPOSITIVAS 31-35

Lo

más importante de todo esto es la sensibilidad de la metodología. Hoy en día con la

electroforesis capilar la sensibilidad está entorno al 3%. Cuando hay menos de un 3% de

células del paciente en el postransplante, ya nos se detectan. Esta sensibilidad no es muy alta,

es casi como la de la microscopia. También es importante la exactitud en la cuantificación de

la metodología.

En la diapositiva 37 se muestra un estudio del 2003, en el que se vio que cuando se podía

detectar el quimerismo mixto mediante PCR de VNTR, los pacientes recaían. Cuando se

detectaba una quimera completa también había una proporción importante de recaída,

porque había una falta de sensibilidad. De 53 recaídas que hubo en la serie, el 49% no se

pudieron predecir. Después se intentó estudiar VNTR o STR mediante PCR a tiempo real,

pero esto no era posible porque estas son repeticiones con un número variable de copias y

no se podían hacer sondas. Al final se decidió utilizar los polimorfismos de

inserción/deleción, de más de un nucleótido, mediante PCR en tiempo real. Hay genes

completos que pueden estar en el paciente y no en el receptor, si el donante y el receptor

son de diferente sexo también se pueden detectar secuencias del cromosoma Y. Con todo

esto se creó un panel, en el que se miran genes del receptor que no están presentes en el

donante. Con esta técnica se obtenía una sensibilidad del 0,01-0,001% en celularidad total, y

había una correlación estrecha entre los resultados obtenidos de las diluciones celulares y la

cantidad real de células del receptor. Además, la detección se podía hace con sangre

periférica, no hacía falta que fuese médula ósea.

Se hizo un análisis retrospectivo de detección de quimerismo, de muestras que se tenían, y

se vio que dos incrementos consecutivos de la cantidad de células del receptor precedían en

60 días a la recaída morfológica, tiempo suficiente para poder hacer algo. Los pacientes

trasplantados son inmunodeprimidos para evitar la enfermedad injerto contra huésped, es

decir que el propio sistema del donante no se vuelva contra el cuerpo del receptor.

Comparando los datos de los dos trabajos, con las mismas muestras se vio que con PCR a

tiempo real de indels se podían anticipar el 94% de las recaídas frente al 42% con PCR de

VNTR.

DIAPOSITIVAS 36-43

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5. PCR DIGITAL

La PCR digital necesita los mismos reactivos que la PCR a tiempo real. Esta mezcla se carga

en un chip con muchos pocillos, hasta 20.000, y en cada pocillo se da una reacción de PCR

individual, luego se hace una lectura del chip. Cada pocillo dará un resultado positivo si hay

amplificación y un resultado negativo si no la hay, esto se ve mediante puntos de

fluorescencia (diapositiva 47). En cada pocillo también se amplifica un gen control, marcado

con una fluorescencia diferente del gen problema, para saber que se ha dado la reacción de

PCR.

Para cuantificar dividimos el número de puntos en los que hay señal del ADN problema

entre el número de puntos en los que hay amplificación de referencia, y se multiplica por

100, si se quiere dar en porcentaje. Con este sistema no hace falta utilizar curvas patrón.

Esta PCR es más precisa que la PCR en tiempo real.

Se hizo un estudio de quimerismo para comparar la PCR digital con la PCR a tiempo real

(diapositiva 47). Antes del trasplante el polimorfismo del receptor está al 100% (diapositva

48), al estudiar la muestra del donante el polimorfismo no está presente (diapositiva 49). La

ventaja que tiene la PCR digital es que el % del receptor se puede calcular con un ratio, y que

la PCR del gen problema (target) y del gen control se dan en el mismo pocillo, por tanto

eliminamos mucha variabilidad.

DIAPOSITIVAS 44-49

En la diapositiva 52 se ve la muestra de un paciente analizada por los dos métodos. La línea

roja es la PCR digital y la azul es la PCR en tiempo real. Vemos como el incremento del

quimerismo se observa con la PCR digital en el día 376, mientras que en la PCR a tiempo

real no se detecta hasta el día 417. En la diapositiva 53 se muestra un caso en la que las dos

técnicas han dado un resultado parecido. En la diapositiva 54 se ve como en el día +60

postrasplante aparecen puntos del receptor y en el día +83 ya hay un 2% de células del

receptor. En estos casos hay que actuar y tomar decisiones como interrumpir el tratamiento

inmunosupresor, lo que libera el sistema inmune del donante para destruir las células

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leucémicas residuales. En el trasplante de médula, lo que realmente cura al paciente no es la

quimioterapia, sino que con el trasplante el sistema inmune del donante destruye las células

leucémicas residuales que son interpretadas como extrañas. Vemos que poco a poco

desaparecen las células del receptor (diapositivas 57 y 58), evitando de esta manera una

recaída.

DIAPOSITIVAS 50-57

6. CONCLUSIONES

- Las técnicas de PCR son una herramienta de gran utilidad clínica en hematología, tanto

para el diagnóstico, como en el seguimiento de los pacientes y en la estratificación

pronóstica.

- Son fundamentales en la identificación de genes de fusión y mutaciones puntuales. Las

mutaciones somáticas de las células tumorales son de gran utilidad.

- La PCR en tiempo real permite estratificar el pronóstico de los pacientes en función de la

enfermedad mínima residual. También se pueden detectar marcadores específicos y el

quimerismo en el trasplante de médula ósea.

- Hay que estandarizar más técnicas (factor de conversión). Esta estandarización se podrá