PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa):

Mtodo para conseguir un gran nmero de copias de fragmentos de ADN a partir de una nica molcula de ADN, llamado amplificacin del ADN.

1) Se disean cebadores o primers que comiencen la sntesis de ADN en el punto deseado. Dos iniciadores comienzan la sntesis de ADN en direccione opuestas desde hebras opuestas (in vitro)

2) Se calienta el ADN a 95 y por desnaturalizacin se separan las hebras.

3) Se busca luego una temperatura adecuada para el cebador se una a las hebras molde de ADN.

4) La ADN pol utiliza los cebadores para sintetizar la nueva hebra complementaria.

5) Se baja la temperatura (regulado por mquinas) y las hebras se re-naturalizan. Esto da la posibilidad de amplificar una sola molcula de ADN la cantidad de veces que se necesite.

Hibridacin de cidos Nucleicos:

Mtodo para detectar secuencias especficas de cidos nucleicos mediante el apareamiento de bases entre hebras complementarias de ARN o ADN. Pueden hibridar entre s dos hebras de ADN, dos hebras de ARN y una de ARN con otra de ADN.1) Se somete a altas temperaturas (90-100C) a las hebras complementarias para que se desnaturalicen, dando molculas de cadena simple.

2) Cada molcula simple es incubada a 65C para que re-naturalice y formar molculas de doble cadena por apareamiento de propias bases.

3) El ADN clonado puede ser marcado con nucletidos radioactivos o modificados que pueden detectarse por fluorescencia o quimioluminiscencia, antes de que se vuelvan a aparear las bases.

4) Este ADN marcado es despus empleado como sonda para la hibridacin con secuencias de ADN o ARN complementario, que luego pueden ser detectados mediante radioactividad, fluorescencia o luminiscencia de los hbridos de doble cadena resultantes

Southern Blotting:

Tcnica utilizada para la deteccin de genes especficos en el ADN celular.

1) El ADN con el que se est experimentando es digerido por una endonucleasa de restriccin, y los pedazos obtenidos se separan por electroforesis en gel (se ordenan por tamao segn las cargas)

2) El gel se adhiere a un filtro de nitrocelulosa o nylon, al cual se le transfieren los fragmentos de ADN, para dar una rplica en del gel, a travs de una solucin salina.3) Se hibrida el filtro con una sonda radioactiva, que se une a las secuencias de ADN complementarias.

4) La sonda adherida al filtro es detectada mediante autoradiografa, que revela el fragmento de ADN con el cual se ha hibridado la sonda.

Northern Blotting:

Variante de la tcnica Southern Blotting, utilizada para la deteccin de ARN en vez de ADN. Principalmente, se usa para hacer estudios de expresin gnica, para determinar la presencia de ARNm especficos en distintos tipos celulares.

1) Se extrae la totalidad del ARN celular

2) Es fragmentado y separado mediante electroforesis en gel.

3) Los ARN se transfieren a un filtro y se detectan por hibridacin con una sonda clonada.

Hibridacin in situ:

Tcnica utilizada para hibridar cidos nucleicos y detectar secuencias de ADNn o ARN homlogas en cromosomas o clulas intactas. Por ejemplo, se emplean sondas marcadas para hibridar con cromosomas intactos con el fin de identificar la regin del cromosoma que contiene un gen determinado. Tambin puede emplearse para detectar ARNm especficos en los distintos tipos celulares de un tejido.

Western Blotting o Inmunotransferencia:

Tcnica variante de Southern Blotting para identificar proenas.

1) Las protenas de una clula se separan por una tcnica llamada electroforesis en gel de SDS-PAGE, en el cual son disueltas en una solucin con el detergente SDS cargado negativamente.

2) Cada protena se une a muchas molculas del detergente, que desnaturaliza y le da a la protena una carga negativa.

3) En la electroforesis en gel, las protenas migrarn todas la electrodo positivo (porque estn todas cargadas negativamente) segn su tamao (la tasa de migracin est determinada por el tamao, que determina, a su vez, el nivel de carga)

4) Las protenas se transfieren a un filtro que se incuba con el anticuerpo que hace reaccionar a la protena que se quiere estudiar. 5) La quimioluminiscencia ayuda a detectar la protena contra la cual fue dirigida el anticuerpo.

Inmunoprecipitacin:

En esta tcnica se busca aislar las protenas contra las que reaccionan determinados anticuerpos.

1) Las clulas son incubadas con aminocidos radiactivos para marcar sus protenas.

2) Al extracto celular marcado se le aade el anticuerpo, que se une a su antgeno protenico determinado.

3) El complejo antgeno-anticuerpo resultante se asila se somete a electroforesis, permitiendo la deteccin del antgeno radiactivo por autorradiografa.

4) Los complejos proteicos tambin pueden ser analizado para identificar las protenas contra la cual fue dirigido el anticuerpo y, adems, otras protenas con las que se encontraba asociado el extracto celular. Variante in situ:

Los anticuerpos pueden ser utilizados para visualizar protenas en el interior de las clulas, y tambin en clulas aisladas.

1) Las clulas se tien con anticuerpos marcados con pigmentos fluorescentes.2) Con el microscopio de fluorescencia, se visualiza la localizacin subcelular de las protenas antignicas.

3) Estos anticuerpos pueden ser etiquetados con marcadores visibles al microscopio electrnico, como metales pesados, permitiendo la visualizacin de antgenos a nivel ultraestructural.