TÉCNICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DEL VIH EN EL · CUESTIONARIO 129 Cuestionario 131 ... utilizada en...

TÉCNICASPARAELDIAGNÓSTICODELVIHENELLABORATORIO

Título original: Técnicas para el Diagnóstico del VIH en el Laboratorio Autores: José Morillas Navarro. Técnico Superior en Desarrollo de Aplicaciones Informáticas

Alicia Díaz Estrella. Licenciada en Psicología / Psicóloga con experiencia en Docencia

Edita e imprime: FESITESS ANDALUCÍA

C/ Armengual de la Mota 37 Oficina 1 29007 Málaga Teléfono/fax 952 61 54 61 www.fesitessandalucía.es

ISBN: 978-84-695-5019-9 Diseño y maquetación: Alfonso Cid Illescas Edición Octubre 2011

ÍNDICE

UNIDADDIDÁCTICAI

PRESENTACIÓNYMETODOLOGÍADELCURSO 5 1.1 Sistema de Cursos a Distancia 7 1.2 Orientaciones para el estudio 8 1.3 Estructura del Curso 10 UNIDADDIDÁCTICAII

ELVIH.ESTRUCTUTADELVIRUS. MARCADORESSÉRICOSESPECÍFICOS

DELVIH 17 2.1 Estructura y genoma del VIH 19 2.2 Ciclo vital del VIH 22 2.3 La infección VIH 22 2.4 Procesos patogénicos inducidos por el VIH 23 2.5 Marcadores séricos. Cinética de la respuesta inmunitaria en los distintos estadios de la infección 24 2.6 Caso práctico 26 2.7 Resumen de la Unidad Didáctica II 26 2.8 Glosario 30 UNIDADDIDÁCTICAIII

DIAGNOSTICOSEROLOGICODELVIH 31 3.1 Pruebas de cribado de anticuerpos frente al VIH 33 3.2 Pruebas de confirmación de la presencia de anticuerpos frente al VIH 36 3.3 Caso práctico 41 3.4 Resumen de la Unidad Didáctica III 42 3.5 Glosario 42 UNIDADDIDÁCTICAIV

ESTRATEGIASENELDIAGNÓSTICOSEROLÓGICODELAINFECCIÓNVIH45 4.1 Principios generales 47 4.2 Estrategias en la determinación de anticuerpos VIH 47 4.3 Caso práctico 56 4.4 Resumen de la Unidad Didáctica IV 56 4.5 Glosario 57 UNIDADDIDÁCTICAV

PROBLEMASENLAPRUEBASDECRIBADOYCONFIRMACION.

ALGORITMODEDECISIONENLASEROLOGIADELVIH 59 5.1 Problemas en el cribado y confirmación del VIH. 61 5.2 Falsos positivos en la determinación de anticuerpos VIH 61 5.3 Falsos negativos en la determinación de anticuerpos VIH 65 5.4 Algoritmo de decisión en la serología del VIH 68 5.5 Caso práctico 68 5.6 Resumen de la Unidad Didáctica V 69 5.7 Glosario 69

UNIDADDIDÁCTICAVI

DIAGNOSTICOMOLECULARDELVIH 71 6.1 Introducción: La Biología Molecular del VIH y otros métodos de diagnóstico directo 73 6.2 Detección de la Viremia Plasmática del VIH (Carga Vírica Plasmática – CVP –) 76 6.3 Obtención y manejo de las muestras 79 6.4 Carga vírica en LCR, semen y otros fluidos 80 6.5 Interpretación de los resultados 80 6.6 Resumen de la Unidad Didáctica VI 81 6.7 Glosario 82 6.8 Caso practico 82 UNIDADDIDÁCTICAVII

TÉCNICASDEDETECCIONDERESISTENCIASDELVIHALOS ANTIRRETROVIRALES 85 7.1 Detección de resistencias 87 7.2 Predicción del fenotipo a partir del genotipo: Fenotipo virtual 94 7.3 Indicaciones de las pruebas de resistencia 95 7.4 Limitaciones de las pruebas de resistencia 96 7.5 Caso clínico 98 7.6 Resumen de la Unidad Didáctica VII 98 7.7 Glosario 98 UNIDADDIDÁCTICAVIII

NORMASDEBIOSEGURIDADYPRECUACIONESCONELMANEJODELAS MUESTRAS 101 8.1 Áreas de trabajo en el laboratorio 103 8.2 Laboratorio de virología 107 8.3 Laboratorio de serología 108 8.4 Laboratorio de microbiología molecular 109 8.5 Caso práctico 113 8.6 Resumen de la Unidad Didáctica VIII 114 8.7 Glosario 114 ANEXO

SOLUCIÓNALOSCASOSPRÁCTICOS 115 Respuestas al caso práctico 117 BIBLIOGRAFIA 125 Bibliografia 127 CUESTIONARIO 129 Cuestionario 131

UNIDADDIDÁCTICAIPRESENTACIÓNYMETODOLOGÍADELCURSO

TécnicasparaelDiagnósticodelVIHenelLaboratorio

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Presentación,normasyprocedimientosdetrabajo.

IntroducciónAntes de comenzar el Curso, es interesante conocer su estructura y el método que

se ha de seguir. Este es el sentido de la presente introducción.

Presentación

1. Sistema de Cursos a Distancia

En este apartado aprenderá una serie de aspectos generales sobre las técnicas de formación que se van a seguir para el estudio.

2. Orientaciones para el estudio.

Si usted no conoce la técnica empleada en los Cursos a Distancia, le recomendamos que lea atentamente los epígrafes siguientes, los cuales le ayudarán a realizar el Curso en las mejores condiciones. En caso contrario, sólo tiene que seguir los pasos que se indican en el siguiente índice:

Se dan una serie de recomendaciones generales para el estudio y las fases del proceso de aprendizaje propuesto por el equipo docente.

3. Estructura del Curso

Mostramos cómo es el Curso, las Unidades Temáticas de las que se compone, el sistema de evaluación y cómo enfrentarse al tipo test.

1.1SistemadeCursosaDistancia

1.1.1RégimendeEnseñanza

La metodología de Enseñanza a Distancia, por su estructura y concepción, ofrece un ámbito de aprendizaje donde pueden acceder, de forma flexible en cuanto a ritmo individual de dedicación, estudio y aprendizaje, a los conocimientos que profesional y personalmente le interesen. Tiene la ventaja de estar diseñada para adaptarse a las disponibilidades de tiempo y/o situación geográfica de cada alumno. Además, es participativa y centrada en el desarrollo individual y orientado a la solución de problemas clínicos.

La Formación a Distancia facilita el acceso a la enseñanza a todos los Técnicos Especialistas/Superiores Sanitarios.

1.1.2CaracterísticasdelCursoydelalumnadoalquevadirigido

Todo Curso que pretenda ser eficaz, efectivo y eficiente en alcanzar sus objetivos, debe adaptarse a los conocimientos previos de las personas que lo estudiarán (lo que saben y lo que aún no han aprendido). Por tanto, la dificultad de los temas presentados se ajustará a sus intereses y capacidades.

Un buen Curso producirá resultados deficientes si lo estudian personas muy diferentes de las inicialmente previstas.

Los Cursos se diseñan ajustándose a las características del alumno al que se dirige.

TécnicoSuperiorSanitariodeLaboratoriodeDiagnósticoClínico

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1.1.3OrientacióndelosTutores

Para cada Curso habrá, al menos, un tutor al que los alumnos podrán dirigir todas sus consultas y plantear las dificultades.

Las tutorías están pensadas partiendo de la base de que el aprendizaje que se realiza en esta formación es totalmente individual y personalizado.

El tutor responderá en un plazo mínimo las dudas planteadas a través de correo electrónico exclusivamente.

Diferenciamos para nuestros Cursos dos tipos de tutores:

Académicos. Serán aquellos que resuelvan las dudas del contenido del Curso, planteamientos sobre cuestiones test y casos clínicos. El tutor resuelve las dudas que se plantean por correo electrónico.

Orientadores y de apoyo metodológico. Su labor se centrará fundamentalmente en cuestiones de carácter psicopedagógicas, ayudando al alumno en horarios, métodos de trabajo o cuestiones más particulares que puedan alterar el desarrollo normal del Curso. El tutor resuelve las dudas que se plantean por correo electrónico.

1.2Orientacionesparaelestudio

Los resultados que un estudiante obtiene no están exclusivamente en función de las aptitudes que posee y del interés que pone en práctica, sino también de las técnicas de estudio que utiliza. Aunque resulta difícil establecer unas normas que sean aplicables de forma general, es más conveniente que cada alumno se marque su propio método de trabajo, les recomendamos las siguientes que pueden ser de mayor aprovechamiento.

Por tanto, aún dando por supuestas la vocación y preparación de los alumnos y respetando su propia iniciativa y forma de plantear el estudio, parece conveniente exponer algunos patrones con los que se podrá guiar más fácilmente el desarrollo académico, aunque va a depender de la situación particular de cada alumno y de los conocimientos de la materia del Curso:

Decidir una estrategia de trabajo, un calendario de estudio y mantenerlo con regularidad. Es recomendable tener al menos dos sesiones de trabajo por semana.

Elegir el horario más favorable para cada alumno. Una sesión debe durar mínimo una hora y máximo tres. Menos de una hora es poco, debido al tiempo que se necesita de preparación, mientras que más de tres horas, incluidos los descansos, puede resultar demasiado y descendería el rendimiento.

Utilizar un sitio tranquilo a horas silenciosas, con iluminación adecuada, espacio suficiente para extender apuntes, etc.

Estudiar con atención, sin distraerse. Nada de radio, televisión o música de fondo. También es muy práctico subrayar los puntos más interesantes a modo de resumen o esquema.


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a) Fase receptiva.

Observar en primer lugar el esquema general del Curso.

Hacer una composición de lo que se cree más interesante o importante.

Leer atentamente todos los conceptos desarrollados. No pasar de uno a otro sin haberlo entendido. Recordar que en los Cursos nunca se incluyen cuestiones no útiles.

Anotar las palabras o párrafos considerados más relevantes empleando un lápiz o rotulador transparente. No abusar de las anotaciones para que sean claras y significativas.

Esquematizar en la medida de lo posible sin mirar el texto el contenido de la Unidad.

Completar el esquema con el texto.

Estudiar ajustándose al horario, pero sin imbuirse prisas o impacientarse. Deben aclararse las ideas y fijarse los conceptos.

Resumir los puntos considerados primordiales de cada tema.

Marcar los conceptos sobre los que se tengan dudas tras leerlos detenidamente. No insistir de momento más sobre ellos.

b) Fase reflexiva.

Reflexionar sobre los conocimientos adquiridos y sobre las dudas que hayan podido surgir, una vez finalizado el estudio del texto. Pensar que siempre se puede acudir al tutor y a la bibliografía recomendada y la utilizada en la elaboración del tema que puede ser de gran ayuda.

Seguir paso a paso el desarrollo de los temas.

Anotar los puntos que no se comprenden.

Repasar los conceptos contenidos en el texto según va siguiendo la solución de los casos resueltos.

c) Fase creativa.

En esta fase se aplican los conocimientos adquiridos a la resolución de pruebas de autoevaluación y a los casos concretos de su vivencia profesional.

Repasar despacio el enunciado y fijarse en lo que se pide antes de empezar a solucionarla.

Consultar la exposición de conceptos del texto que hagan referencia a cada cuestión de la prueba.

Solucionar la prueba de cada Unidad Temática utilizando el propio cuestionario del manual.


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1.3EstructuradelCurso

Todo lo relativo a los cursos de Formación Continuada será gestionado personalmente por el alumno a través de la página web:

http://www.fatedocencia.info/

En esta Web le proponemos una metodología especial de enseñanza: la formación a distancia, diferente a los métodos tradicionales en los cuales el formador y el alumnado asisten diariamente a un aula donde se desarrollan las clases. Esta nueva metodología le ofrece la ventaja de ser uno mismo quien estructure su tiempo y tareas orientado por el tutor del curso.

1.3.1ContenidosdelCurso

Guía del alumno.

Temario del curso en PDF, con un cuestionario tipo test.

FORMULARIO, para devolver las respuestas al cuestionario.

ENCUESTA de satisfacción del Curso.

1.3.2Guíadelalumno

El curso se estructura de forma que tenga tiempo suficiente para el estudio y la asimilación de los contenidos de las materias que lo forman. Este material está diseñado específicamente para la formación a distancia, con él, podrá seguir la secuencia de contenidos de una forma clara y sencilla, ya que intentan facilitarle lo más posible el proceso de aprendizaje.

Para cualquier duda, problema o inconveniente que pueda surgir, tendrá a su disposición al tutor de curso. El modo de recibir esta atención personal será mediante correo electrónico.

Para la evaluación del grado de asimilación de conocimientos, se realizará una prueba a distancia que se hará a través de la misma aplicación.

Al finalizar el curso le pediremos que sea usted quien nos evalúe a nosotros, en la calidad de los materiales y sus contenidos, en nuestra organización y el grado de apoyo del tutor. Esta evaluación es necesaria aunque no obligatoria para poder rectificar posibles errores y mejorar el funcionamiento de nuestra formación. La encuesta de satisfacción la podrá hacer en el apartado de “historial” de cada alumno.

1.3.2.1RégimendeEnseñanza

La metodología de la enseñanza a distancia, por su estructura y concepción, le ofrece un ámbito de aprendizaje donde puede acceder, de forma flexible en cuanto a ritmo individual de dedicación, estudio y aprendizaje, a los conocimientos que profesional y personalmente le interesan. Todo curso que quiera ser eficaz, efectivo y eficiente en el cumplimento de su objetivo, debe adaptarse a los conocimientos previos de las personas que lo cursarán.


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1.3.2.2Contacteconsututor

La consulta y resolución de dudas se realizará mediante correo electrónico a la dirección: [email protected]

Ejemplo:

Para: [email protected]

Asunto: Nombre del Curso.

Mensaje: Nombre y Apellidos del alumno y dudas a resolver.

1.3.2.3Criteriosdeevaluación:

Se valorará los conocimientos adquiridos por medio del cuestionario tipo test, que deberá realizar, siendo necesario superar el 80% del total de las respuestas.

1.3.2.4DuracióndelosCursos

Los cursos tendrán un plazo para realizarlos, que vendrá indicado en el apartado “Historial” del menú principal de la página de cursos (http://www.fatedocencia.info/).

El no cumplimiento de la fecha de entrega, llevará consigo el cierre de la convocatoria y pérdida del curso. Si alguien por algún problema personal le fuera imposible terminarlo en su fecha, deberá ponerse en contacto a través del correo: [email protected]

GUIADEUSODELAWEBLo primero de todo es registrarse donde pone: Registrarse.

Le saldrá a continuación un formulario que deberá rellenar fijándose muy bien en que no cometa ningún error. Lea muy bien estos comentarios

REGISTRO

Al abrir la página nos pide que introduzcamos un usuario y contraseña, o bien, que nos registremos si no disponemos de ellos.

Tras picar en registro se nos abre un formulario donde nos pide los datos necesarios para emitir diplomas, remitirlos a un domicilio y poder contactar con el alumno.

Es importante rellenar los campos con * y en letra mayúscula.

Es necesario revisar bien los datos puesto que de aquí saldrán los diplomas, la revisión de un diploma con error en datos personales correrá por cuenta del alumno.

Elegir un password o contraseña y picar en registrarse.

Nos pedirá que nos identifiquemos, introducimos el usuario: “dirección de correo electrónico” y la contraseña elegida.


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MENUPRINCIPAL.

Una vez identificados, nos muestra una bienvenida y una descripción de lo que podemos hacer, así como, los 4 enlaces u opciones que nos permite. Datos, Matrícula, Historial, Liquidación.

DATOS.

Nos lleva a un formulario donde podemos modificar o rectificar cualquier dato personal.

MATRICULA

Nos lleva al listado de cursos.

Cuenta con un enlace a la Web www.fesitessandalucia.es donde debemos consultar las características de los cursos y elegir los que nos interesan.

Cuando sabemos el/los cursos que queremos solo hay que picar en seleccionar del primero de ellos y después confirmar.

Si estamos interesados en más cursos, volvemos a picar en Matrícula y en seleccionar en el siguiente curso, así con todos los que tengamos interés.

Si ya los tenemos todos, picamos en Liquidación, donde se nos muestran todos los cursos solicitados y no abonados, con un resumen de horas, créditos y precio.

HISTORIAL

Como su nombre indica es un historial de todos los cursos de ese alumno, donde muestra el estado de cada curso (solicitado, abonado, test resuelto, pretítulo).

24/48 horas después del abono del curso o cursos se activan los enlaces al manual en PDF (y archivos de ayuda si el curso los llevara) y al formulario de respuestas.

Una vez el alumno ha resuelto los test, se activa automáticamente un enlace a un pretítulo o borrador del diploma que se puede imprimir o visualizar cuando se quiera. Además si el cuestionario es superado verá un mensaje de aprobación y las respuestas correctas del cuestionario.

El diploma original llegará en unos días por correo ordinario al domicilio elegido.

LIQUIDACIÓN

Este enlace nos lleva a un resumen de los cursos solicitados y no abonados.

Si se ha equivocado al elegir un curso puede eliminarlo en este paso


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Muestra un resumen con horas, créditos y precio parcial y total, así como el total a ingresar si es en libro o PDF y afiliado o no afiliado, con los descuentos por afiliado y lote ya realizados.

Podemos Imprimir la página con los datos del banco para hacer el ingreso correspondiente.

Una vez haya realizado el ingreso y nosotros lo hayamos visto y comprobado se le habilitará en el Historial de cursos para que puedas abrir el curso y hacerlo.

Paracualquierconsultapuedesdirigirtea:

[email protected]

Sedes provinciales: Málaga 952 61 54 61; Córdoba 957 43 02 37

Delegado Sindical de tu centro más cercano.

1.3.3LosCursos

Los cursos se presentan en un archivo PDF cuidadosamente diseñado en Unidades Didácticas.

1.3.4LasUnidadesDidácticas

Son unidades básicas de estos Cursos a distancia. Contienen diferentes tipos de material educativo distinto:

Texto propiamente dicho, dividido en temas.

Bibliografía utilizada y recomendada.

Cuestionario tipo test.

Los temas comienzan con un índice con las materias contenidas en ellos. Continúa con el texto propiamente dicho, donde se desarrollan las cuestiones del programa. En la redacción del mismo se evita todo aquello que no sea de utilidad práctica.

El apartado de preguntas test serán con los que se trabajen, y con los que posteriormente se rellenará el FORMULARIO de respuestas a remitir. Los ejercicios de tipo test se adjuntan al final del temario.

Cuando están presentes los ejercicios de autoevaluación, la realización de éstos resulta muy útil para el alumno, ya que:

Tienen una función recapituladora, insistiendo en los conceptos y términos básicos del tema.

Hacen participar al alumno de una manera más activa en el aprendizaje del tema.

Sirven para que el alumno valore el estado de su aprendizaje, al comprobar posteriormente el resultado de las respuestas.


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Son garantía de que ha estudiado el tema, cuando el alumno los ha superado positivamente. En caso contrario se recomienda que lo estudie de nuevo.

Dentro de las unidades hay distintos epígrafes, que son conjuntos homogéneos de conceptos que guardan relación entre sí. El tamaño y número de epígrafes dependerá de cada caso.

1.3.5SistemadeEvaluación

Cada Curso contiene una serie de pruebas de evaluación a distancia que se encuentran al final del temario. Deben ser realizadas por el alumno al finalizar el estudio del Curso, realizando el Test que se encuentra en la pestaña Historial de la página web para la realización y gestión de Cursos de Formación Continuada:

http://www.fatedocencia.info/

La elaboración y posterior corrección de los test ha sido diseñada por el personal docente seleccionado para el Curso con la intención de acercar el contenido de las preguntas al temario asimilado.

Si no se supera el cuestionario con un mínimo del 80% correcto, se tendrá la posibilidad de recuperación, verá un mensaje donde le indicará que lo repita.

Al superar el cuestionario automáticamente verá un mensaje de aceptación, las respuestas correctas del cuestionario y se habilitará un enlace a un pretítulo con los datos del certificado a la espera de recibir el Diploma original en su domicilio.

Es IMPRESCINDIBLE haber rellenado el Test y envío de las respuestas para recibir el certificado o Diploma de aptitud del Curso.

1.3.6Fechas

El plazo de entrega de las evaluaciones será de un mes y medio a partir de la recepción del material del curso. Si este plazo caduca puede solicitar un aplazamiento (2 veces como máximo) a través del correo: [email protected].

Una vez pasado este plazo conllevará una serie de gestiones administrativas que el alumno tendrá que abonar.

La entrega de los certificados del Curso estará en relación con la fecha de entrega de las evaluaciones y NUNCA antes de la fecha de finalización del Curso.

1.3.7Aprendiendoaenfrentarseapreguntastipotest

La primera utilidad que se deriva de la resolución de preguntas tipo test es aprender cómo enfrentarnos a las mismas y evitar esa sensación que algunos alumnos tienen de “se me dan los exámenes tipo test”.

Cuando se trata de preguntas con respuesta tipo verdadero / falso, la resolución de las mismas está más dirigida y el planteamiento es más específico.


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Las preguntas tipo test con varias posibles respuestas hacen referencia a conocimientos muy concretos y exigen un método de estudio diferente al que muchas personas han empleado hasta ahora.

Básicamente todas las preguntas test tienen una característica común: exigen identificar una opción que se diferencia de las otras por uno o más datos de los recogidos en el enunciado. Las dos palabras en cursiva son expresión de dos hechos fundamentales con respecto a las preguntas tipo test:

Como se trata de identificar algo que va a encontrar escrito, no va a ser necesario memorizar conocimientos hasta el punto de reproducir con exactitud lo que uno estudia. Por lo tanto, no debe agobiarse cuando no consiga recordar de memoria una serie de datos que aprendió hace tiempo; seguro que muchos de ellos los recordará al leerlos formando parte del enunciado o las opciones de una pregunta de test.

El hecho de que haya que distinguir una opción de otras se traduce en muchas ocasiones en que hay que estudiar diferencias o similitudes. Habitualmente se les pide recordar un dato que se diferencia de otros por ser el más frecuente, el más característico, etc. Por lo tanto, este tipo de datos o situaciones son los que hay que estudiar.

Debe tenerse siempre en cuenta que las preguntas test hay que leerlas de forma completa y fijándose en determinadas palabras que puedan resultar clave para la resolución de la pregunta.

La utilidad de las preguntas test es varia:

Acostumbrarse a percibir errores de conceptos.

Adaptarse a los exámenes de selección de personal.

Ser capaces de aprender sobre la marcha nuevos conceptos que pueden ser planteados en estas preguntas, conceptos que se retienen con facilidad.

1.3.7Envío

Una vez estudiado el material docente, realizado y superado el test del Curso se procederá al envío del Diploma Acreditativo del mismo.

En ningún caso se entregará el Diploma Acreditativo del Curso antes de la entrega de las pruebas de evaluación y la finalización de la fecha de Convocatoria del Curso.

UNIDADDIDÁCTICAIIELVIH.ESTRUCTUTADELVIRUS.

MARCADORESSERICOSESPECIFICOSDELVIH


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2.1EstructuraygenomadelVIH

Los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2) son retrovirus que, como su propio nombre indica causan inmunodeficiencia en los seres humanos. El más extendido y virulento es el VIH-1, cuyos diversos subtipos derivan de virus muy semejantes encontrados en chimpancés. El VIH-2 es menos virulento y se encuentra en África Occidental.

Los retrovirus son virus ARN con envoltura, aproximadamente esféricos, con un diámetro de entre 80- 100nm. La envoltura contiene glicoproteínas víricas.

El genoma del virus es un ARN de cadena única formado por dos hebras idénticas de polaridad positiva. Como virus retroide, se encapsida la fase ARN, que se replica mediante la acción de la transcriptasa inversa, una enzima contenida en el virión, que cataliza la formación del provirus en forma de doble cadena de ADN, que se integra en el genoma de la célula huésped. A partir de este provirus se transcriben los ARN mensajeros que codificarán las proteínas correspondientes, que se unirán al ARN genómico viral, constituyendo la partícula que emerge por gemación a través de la membrana celular. Durante el proceso de gemación se incorporan lípidos de membrana y las glicoproteínas de la envoltura, que a su vez se glucosilan con azúcares derivados de la célula huésped.

El virus de la inmunodeficiencia humana es esférico. Esta forma viene determinada por tres estructuras superpuestas: una bicapa lipídica externa, una matriz esférica y una capside que contiene el genoma viral

Figura 1: VIH

Figura 2: Partícula vírica.


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El genoma del VIH tiene un extremo 5` y otro 3` y tiene tres genes principales que codifican poliproteínas enzimáticas y estructurales del virus y otros que codifican proteínas accesorias y reguladoras.

Genes que codifican proteínas estructurales del virus

- gag , pol, env

Genes que codifican proteínas reguladoras del virus

- tat, rev, nef

Genes que codifican proteínas accesorias del virus

- vif, vpr, vpu, vpx.

Como hemos comentado anteriormente, el genoma del VIH tiene un extremo 5` y otro 3` y tiene tres genes principales que codifican proteínas enzimáticas y estructurales del virus:

2.1.1Elgengag

El gen gag que es traducido a una proteína precursora, la p55, de otras de menor peso molecular p17, p24, p7, p6, p1, todas ellas internas en la estructura del virión.

Una proteasa (p10), producto del gen pol corta durante la maduración del virión la p55 en cuatro proteínas que se incorporan a sus lugares respectivos:

La proteína p24 forma la cápside.

La proteína p17 constituye la matriz, situada bajo la envoltura, a la que estabiliza. Una parte de las proteínas se unen al complejo molecular que acompaña al ADN viral al interior del núcleo. En la superficie de la proteína existe una región cariofílica (literalmente afin al núcleo) que es reconocida por la maquinaria molecular de importación nuclear. Éste es el mecanismo que permite al VIH infectar células diferenciadas, no destinadas a dividirse, algo que no ocurre en ningún otro retrovirus.

Las proteínas p6 y p7 forman la nucleocápside. La región de la p55 correspondiente al polipéptido p6 es responsable de la incorporación de la proteína accesoria Vpr (producto de la traducción del gen vpr) al virión en formación y de la interacción con la membrana de la célula que hace posible la gemación. La p7 es responsable del reconocimiento y la incorporación del ARN al virión y además interviene en la transcripción inversa facilitándola.

2.1.2Elgenpol

El gen pol codifica una proteína precursora que es cortada a su vez para formar cuatro proteínas funcionales:

La proteasa (p10). Se trata de una aspartil-proteasa cuya forma funcional es un dímero del que se conoce la estructura tridimensional. Actúa cortando las


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piezas de las proteínas Gag, Pol y de la Gag-Pol. Una parte de los fármacos empleados contra el VIH son inhibidores de su función.

La transcriptasa inversa (p51 y p66) cuya función es la síntesis del ADN de doble cadena del provirus usando como patrón la cadena singular del ARN viral. Es una ADN-polimerasa que puede actuar como dependiente del ADN tanto como del ARN. Una vez formada la primera cadena de ADN, complementaria del ARN viral, la ARNasa lo separa de él, lo que permite a la transcriptasa inversa ejecutar la síntesis de la segunda cadena de ADN tomando como molde la primera que se formó. Así pues, para la síntesis de la primera cadena la actividad de la transcriptasa inversa es ARN-dependiente, pero para la de la segunda es ADN-dependiente. También existen múltiples fármacos contra la actividad de la transcriptasa inversa.

La ARNasa (p15), que como se ha dicho separa las cadenas de ARN de las de la ADN durante la transcripción inversa.

La integrasa (p31) realiza la inserción del ADN proviral en el genoma de la célula huésped. No se requiere ATP para su actividad y debe cumplir sucesivamente tres funciones:

o Con una actividad exonucleasa corta dos núcleótidos del extremo 3' de cada una de las dos cadenas del ADN proviral.

o Con una actividad endonucleasa (de doble cadena) corta el ADN del huésped en el punto de integración. No hay un lugar fijo en el genoma para que esto se realice, sino que ocurre en cualquier región muy accesible de la cromatina, lo que se supone que favorece la expresión del provirus, al coincidir esas regiones del genoma con las más transcritas.

o Por último, con una actividad ligasa el ADN proviral es soldado, mediante sólo un enlace covalente en cada extremo, en el ADN celular.

2.1.3Elgenenv

La envoltura del virus se basa en una bicapa lipídica, lo mismo que cualquier membrana biológica, y sus componentes estructurales básicos proceden de la membrana plasmática de la célula parasitada. Pero la envoltura porta además regularmente espaciadas 72 espículas, que son complejos proteicos integrados en la membrana formados por proteínas virales codificadas por el gen env. Cada espícula está formada por una pieza de la proteína gp41, integral en la membrana, y una cabeza externa formada por la proteína gp120, esencial para el acoplamiento con el exterior de ciertas células previo a su invasión. Entre los dos componentes de las espículas existe una unión no covalente. Las proteínas gp41 y gp120 se sintetizan como una sola poliproteína, gp160, con la información del gen env antes de que sea cortada por una proteasa de la célula. La proteína env existe como trímero en la superficie de los viriones y las células infectadas.


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2.2CiclovitaldelVIH

Figura 3: Ciclo vital del VIH

La proteína externa del VIH (la gp120) es capaz de unirse a una proteína llamada CD4 que se encuentra en la superficie de los linfocitos CD4 y de los macrofagos. Este hecho permite que el VIH infecte y destruya estos linfocitos.

El ciclo vital del VIH se inicia por la unión de las partículas virales a la célula diana, posteriormente la proteína gp120 interacciona con una segunda proteína de la superficie celular (los receptores de quimiocinas CXCR4 o CCR5) permitiendo que la proteína gp41 produzca la fusión de las membranas viral y celular. Tras la fusión de las membranas, la cápside viral entra en el interior celular y libera el genoma viral (en forma de ARN), el cual es entonces retrotranscrito (convertido a ADN ) por la enzima viral RT e integrado en el genoma celular por la enzima integrasa. Una vez el genoma viral esta integrado, la célula no puede identificarlo como extraño por lo que la maquinaria celular comienza a producir proteínas virales. Estas proteínas son ensambladas para formar nuevas partículas virales que son liberadas por la célula y maduradas por la proteasa viral. Estas partículas maduras son capaces de infectar nuevas células diana.

La infección de una célula por una partícula viral puede producir varios miles de partículas virales infecciosas.

2.3LainfecciónVIHNuestro sistema inmune tiene la capacidad de identificar y destruir agentes

patógenos externos. El correcto funcionamiento de este sistema requiere un complejo equilibrio entre diferentes tipos de células. Entre ellas, una clase especial de linfocitos, los llamados linfocitos T4 o linfocitos CD4 juegan un papel primordial en el establecimiento y el mantenimiento de nuestra respuesta inmune. La destrucción de estas células por el HIV es la causa de la immunodeficiencia asociada a la infección por el VIH

Poco tiempo después del primer contacto con el virus (primoinfección) el virus replica libremente y la carga viral puede alcanzar las 106-107 copias de ARN viral por mililitro de plasma. Rápidamente se establece una fuerte respuesta inmune que controla la replicación del VIH (seroconversión). Sin embargo, el control de la replicación del VIH no


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es total, y se observa una lenta pero sostenida destrucción de linfocitos CD4, que finalmente debilitará y suprimirá la función inmune. Es el comienzo del SIDA.

2.4ProcesospatogénicosinducidosporelVIHEn la infección VIH se distinguen 3 periodos:

1) Primoinfección, en el que el virus se disemina por los órganos linfoides, se caracteriza por altos niveles de viremia. Dura entre 2 – 6 semanas y se acompaña a menudo de síntomas inespecíficos, similares a los de otras infecciones virales agudas. Su paso a infección crónica coincide con la aparición de anticuerpos contra el VIH.

2) Infección crónica asintomática, de 10 años de duración como media, se caracteriza por niveles de células CD4+ relativamente estables, aunque con tendencia a descender progresivamente. En esta fase, la viremia desciende mucho y puede incluso hacerse indetectable por los métodos convencionales en algunos casos, pero el virus continua su replicación en el tejido linfoide, pese a la presencia de anticuerpos neutralizantes y de linfocitos T citotóxicos (CTL) contra el virus.

3) Infección avanzada o SIDA: en ella los recuentos de células CD4+ son inferiores a 200/µl, la replicación viral se acelera, la actividad de los CTL anti-VIH desciende, se destruye la arquitectura linfática y se desarrollan infecciones oportunistas

2.4.1PatologíadelafaseagudaA los pocos días de tener lugar la primoinfección, se producen grandes cantidades

de virus en los linfocitos activados de los nódulos linfáticos, originando una inflamación ganglionar y los primeros síntomas de linfoadenopatías. Los síntomas pueden ser muy débiles en las infecciones en que el organismo responde firmemente contra el virus. La primera reacción de inmunidad contra la infección, antes de que se detecten anticuerpos neutralizantes corre a cargo de los linfocitos T CD8+ citotóxicos o CTL, que lisan a las células infectadas que presentan antígenos virales en su superficie. La viremia baja mucho al cabo de 6 semanas coincidiendo con la primera detección de anticuerpos anti-VIH, distintivo esencial con que se inicia la fase asintomática. El virus nunca llega a eliminarse del todo durante la primoinfección, ya que se mantiene una replicación viral residual que se detecta más o menos acentuada en el plasma o en los nódulos linfáticos. Aparecen además mutantes de escape que eluden por mutación en determinados epítopos la presión inmune de los linfocitos T auxiliares y de memoria, escapando así a la destrucción favorecida por los CTL. Estos mutantes son difíciles de detectar cuando aparecen en proteínas virales de expresión temprana como tat o rev.

2.4.2FaseasintomáticaHacia el tercer mes después de la infección la viremia desciende a niveles más bajos,

interrumpidos por pequeños brotes ocasionales de replicación viral ocasional. El número de linfocitos CD4+ decae persistentemente a un ritmo de unos 60 CD4+ menos por µl de sangre y por año. El nivel de viremia de este periodo refleja los años que durará el periodo


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asintomático, de forma que a menor nivel de viremia alcanzado, mayor será la duración de esta fase.

Las causas del descenso de linfocitos CD4 + durante esta fase de la infección solo se conocen parcialmente. El aumento de carga viral y el descenso de CD4+ se correlacionan de forma inversa, pero a veces describen curvas de cinética compleja que sugieren la presencia de múltiples factores que influyen sobre la lisis de los linfocitos infectados y sobre la producción de nuevas partículas de virus. Los linfocitos CD8+ permanecen ligeramente aumentados durante el periodo asintomático, lo que indica la existencia de reacciones citotóxicas contra el virus, pero que no llegan a suprimir la replicación viral. Sólo un número muy reducido de células en los ganglios linfáticos producen virus en esta fase de latencia clínica, pero los antígenos víricos se detectan claramente en las células foliculares dendríticas. Como consecuencia de las mutaciones producidas en respuesta a la presión inmune, las subpoblaciones víricas o cuasiespecies se hacen cada vez más heterogéneas.

2.4.3FasesintomáticaySIDAEl comienzo del desarrollo de síntomas de SIDA se caracteriza por unos niveles de

linfocitos CD4+ del orden de 200/ µl y una concomitante destrucción de la arquitectura celular de los ganglios linfáticos. La degeneración del tejido linfoide puede deberse tanto a la replicación directa del virus como a ser consecuencia de estimulación inmune crónica.

En la fase sintomática la población viral se hace mucho más homogénea y desarrolla un claro tropismo hacia los linfocitos, con mayor tendencia a formar sincitios. La cinética de replicación viral se hace más rápida y la infección se propaga hacia mayor número de tipos celulares. El tropismo neurológico de la infección se acentúa y los virus que se producen son más insensibles a los anticuerpos neutralizantes.

2.5Marcadoresséricos.Cinéticadelarespuestainmunitariaenlosdistintosestadiosdelainfección

Figura 4: Cinética viral VIH.


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Primoinfección: tras el contacto con el VIH se produce un periodo ventana de 4-12 semanas, que corresponde a la fase de la primoinfección y durante el cual no es posible detectar la presencia de anticuerpos específicos frente al VIH a pesar de existir niveles de viremia muy elevados. Durante este periodo “ventana” es posible detectar actividad citotóxica frente al VIH mediante la caracterización clonal de los linfocitos CD8 del paciente. La detección de actividad antiviral celular en ausencia de anticuerpos sugiere que la respuesta celular es más precoz e importante en el control inicial de la replicación viral que la síntesis de anticuerpos. Probablemente, ambos brazos de la inmunidad (humoral y celular) son importantes en el control de la replicación viral tras la primoinfección. Este control es el resultado del equilibrio entre los dos factores: la virulencia de las cepas infectantes y la intensidad de la respuesta antiviral generada por el huésped. La resultante de estos dos factores se refleja en la carga viral basal del paciente tras la primoinfección, que representa un dato de enorme valor pronóstico den la evolución de la infección, ya que indica el equilibrio alcanzado en un sujeto determinado entre el virus y su sistema inmunitario. En cualquier caso, esta respuesta antiviral es incapaz de erradicar el virus ya que se ha acantonado en las primeras horas de la infección en el organismo y se limita a contener (aunque sea en una proporción importante) la replicación viral. Se establece así una infección crónica persistente en el sujeto infectado.

Fase crónica de la infección. En la fase crónica de la enfermedad se mantienen durante años respuestas celulares y humorales intensas frente al VIH. Esta falta de atenuación de la respuesta refleja, por una parte, la intensidad y la cronicidad de la replicación viral que sigue estimulando persistentemente el sistema inmunitario, y por otra la capacidad de éste para controlar durante largos periodos la replicación masiva que se produce a lo largo de toda la enfermedad. Sin embargo, los mecanismos de inmunosupresión y de destrucción de los linfocitos CD4 por el VIH se producen de forma persistente, y a medio plazo conllevarán una incapacidad progresiva del sistema inmunitario para contener la replicación viral acelerada y de profunda inmunosupresión.

Estadio avanzado de la enfermedad: Los estadios finales de la enfermedad se caracterizan clínicamente por la aparición de infecciones oportunistas, desde el punto de vista inmunológico por la caída del número de linfocitos CD4 y virologicamente, por la elevación de la carga viral. En esta etapa se observa un deterioro de la respuesta humoral y celular frente al VIH: disminuyen los niveles de anticuerpos frente a p24 y otras proteínas virales, decrece la tasa de anticuerpos neutralizantes, la actividad citotóxica y el número de linfocitos CD8,y se observa un deterioro en la actividad ADCC y NK. Probablemente este deterioro refleja la destrucción masiva del sistema inmunitario por una replicación viral acelerada. No hay que olvidar que el sistema inmunitario se activa de forma coordinada entre sus distintos elementos y que en la generación de la respuesta inmunitaria específica de los linfocitos CD4 ocupan un lugar central. Es, por tanto previsible que la destrucción de los CD4 origine un deterioro funcional de otras subpoblaciones celulares. Esta situación de “cataclismo inmunológico” es debida probablemente a un aumento de la cinética de replicación viral debido a la generación de mutantes de escape, incapaces de ser contenidos por el sistema. Se entra así en un círculo vicioso en el que el deterioro inmunológico progresivo permite una replicación viral más agresiva.


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2.6CasoprácticoVarón de 30 años que acude a urgencias con un cuadro seudogripal y

adelgazamiento. Tras la realización de una anamnesis, el paciente refiere varios contactos sexuales en el último mes sin protección. Por ello, se decide realizar un screening de anticuerpos VIH que resulta negativo y se le ingresa para estudio. Ya en la planta, donde el paciente afirma ser UDVP (usuario de drogas por vía parenteral), se le realizan estudios de viremia frente a VHB, VHC y VIH teniendo el paciente una viremia VIH muy elevada.

2.6.1Preguntas:

1. ¿Cómo explicaría el resultado negativo en la detección de anticuerpos realizados en el servicio de urgencias antes del ingreso?

2. ¿En qué fase de la infección se encuentra el paciente en el momento del ingreso?

2.7ResumendelaUnidadDidácticaII

2.7.1AccióndelVIHsobreelSistemaInmunológico

La estructura del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) es parecida a la de otros virus (fig.1). Tiene un núcleo de material genético rodeado por una capa protectora, llamada cápside. El material genético que hay en ese núcleo es el ácido ribonucleico (ARN), que contiene la información necesaria para que el virus se reproduzca y para realizar otras funciones. Se podría decir que el ARN es como el conjunto de reglas que el virus obedece para vivir.

El ARN del VIH, posee una proteína llamada "transcriptasa inversa" (= escribir al revés), fundamental para la reproducción del virus dentro de la célula T, los glóbulos blancos que ayudan a coordinar las actividades del Sistema Inmunológico.

Se explicará más adelante la función de la transcriptasa inversa, cuando hablemos de cómo el VIH infecta a la célula T.


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El VIH, como otros virus, tiene proteínas específicas particulares que se llaman antígenos. Estos antígenos cumplen varias funciones en la reproducción de un virus.

En el caso del VIH, la combinación de dos antígenos, el gp120 y el gp41, permiten al virus conectarse a las células T. Estos antígenos se encuentran en la superficie del virus. Otro antígeno del VIH es el p24, situado en el núcleo del virus, que se mide para calcular la cantidad del virus que flota libre en la sangre de quien vive con VIH.

Las células T son el blanco principal del VIH en la sangre, y actúan como el anfitrión que el virus necesita para reproducirse. También los macrófagos, los monocitos y otras células pueden ser infectados por el VIH.

La célula T posee un núcleo que contiene material genético en forma de ADN (ácido desoxirribonucleico) (fig.2).

El ADN celular contiene toda la información necesaria para el funcionamiento de la

célula. ARN y ADN no son los mismos. El ARN es una cadena única de material genético y el ADN es una cadena doble (fig.3).

Esta diferencia es vital en el proceso de infección de la célula T, efectuado por el VIH.

Una zona importante de la célula T es el 'sitio receptor CD4 '(fig.2).


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El receptor CD4 es una proteína en la superficie de la célula T. El antígeno gp120 del virus es la imagen inversa del receptor CD4. Cuando un VIH se sitúa en el lugar apropiado de la superficie de la célula T, el gp120 del virus se conecta al receptor CD4 de la célula T (fig.4).

Por eso, el receptor CD4 se llama punto receptor del VIH o puerto de amarre.

Cuando el VIH logra conectarse a la célula T, el siguiente paso es inyectar su núcleo en la célula. Este núcleo del virus contiene el ARN del virus y la transcriptasa inversa (fig.5).


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2.7.2ElVIHtomaelcontrol

Una vez dentro de la célula la cápside del VIH se disuelve, liberando el ARN viral y la transcriptasa inversa. Luego, para infectar a la célula T completamente, el ARN del virus debe entrar al núcleo de la célula (para cambiar el código de la célula T y convertirla en una fábrica de virus). Para ello el virus utiliza una de sus más destructivas cualidades.

Normalmente, el núcleo de la célula T se comunica con las demás partes de la célula usando su ADN que lo convierte en ARN y lo envía fuera del núcleo. En todas las células del cuerpo el ARN actúa como mensajero entre el núcleo y el resto de la célula. El ADN fabrica ARN y lo envía a distribuir órdenes. El pasaporte del material genético para salir del núcleo, es convertirse en ARN de una cadena única. De igual modo, para entrar, el pasaporte es convertirse en ADN de doble cadena.

El ARN viral necesita convertirse en ADN para iniciar el proceso de replicación a través de la invasión y alteración del núcleo de la célula T. La transcriptasa inversa permite al ARN viral tomar material ('prestado') de la célula y escribir al revés una cadena (doble) de ADN viral (fig. 6).

ElVIHsereplica

El ADN del virus, ya transformado, se introduce en el núcleo de la célula T y se une al ADN (material genético) de la célula T (un proceso similar al de infectar con un "virus" una computadora) (fig. 7). A partir de entonces, si la célula T es activada, comenzará a producir nuevos virus en lugar de desempeñar las funciones normales de una célula T.

En esta etapa, pueden suceder varias cosas. Este virus nuevo (o "provirus") puede permanecer inactivo por mucho tiempo sin fabricar más virus. O bien, puede dividirse en dos provirus (mitosis). O bien, si es activado, el provirus puede fabricar más virus que van a salir a través de la pared de la célula y finalmente la destruirán. Debido a su manera de reproducirse, el VIH tiene un efecto devastador en el Sistema Inmunológico. Mientras se


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reproduce, el VIH destruye cada vez a más células T. Las células coordinadoras del Sistema Inmunológico (T) son aniquiladas, dejando al cuerpo expuesto a infecciones oportunistas.

2.8Glosario

VIH= Virus de la Inmunodeficiencia Humana

VIH-1= Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1

VIH-2= Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 2

CD4= Linfocitos T4

CD8= Linfocitos T8

CD4/CD8= Cociente CD4/CD8

T4/T8= Cociente linfocitos T4/ linfocitos T8

SIDA= Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida

CTL= Linfocitos T citotóxicos.

ADCC=Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

CRS= Complejo relacionado con SIDA.

CDC= Centres for Diseases Control.

DNA= Ácido desoxirribonucleico

RNA= Ácido ribonucleico

FDA= Food and Drug Administration

TR= enzima transcriptase

UNIDADDIDÁCTICAIIIDIAGNOSTICOSEROLOGICODELVIH


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3.1PruebasdecribadodeanticuerposfrentealVIHLas pruebas de detección habituales de anticuerpos frente al VIH han

experimentado un considerable desarrollo y mejoras desde su aparición inicial. Básicamente las mejoras han afectado, principalmente, al antígeno o antígenos utilizados en el ensayo y al principio técnico en el que se fundamentan dichas reacciones.

La mayoría de las primeras técnicas utilizaron antígenos víricos crudos más o menos purificados denominados "lisados víricos". Estos antígenos contenían gran cantidad de proteínas procedentes del sistema celular en el que se había cultivado el virus. La posibilidad de una reacción inespecífica del suero con algunos de estos componentes constituyó un problema que hizo obligado el empleo de pruebas de confirmación. En la Tabla 1 aparece la evolución de los antígenos que se han ido incorporando a los equipos de detección de anticuerpos frente al VIH.

Tabla 1. Antígenos empleados en las pruebas de detección primaria de anticuerpos frente al VIH

Técnica Antígeno

EIA 1ª generación EIA 2ª generación EIA/ELFA 3ª generación EIA/ELFA 4ª generación

Lisado vírico VIH-1 Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1 y VIH-2 Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1 y VIH-2 y antígeno VIH-1del grupo "O" (outlayer o marginal) Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1 y VIH-2 y VIH-1 "O" y anticuerpos para detectar el antígeno p24

EIA: enzimoinmunoanálisis. ELFA: enzime-linked fluorescent assay

La evolución de los antígenos incluidos en las pruebas de detección de anticuerpos frente al VIH ha permitido por una parte incrementar la sensibilidad sin merma de la especificidad y por otra ha hecho posible la detección de anticuerpos frente tipos y subtipos del VIH que escapaban a los equipos de diagnóstico habituales. A pesar de las mejoras introducidas en los equipos actuales, debe tenerse en cuenta la posibilidad real de encontrar sueros de pacientes infectados por subtipos inusuales del VIH, sobre todo en pacientes africanos o en personas con estancias prolongadas en ese continente.

Respecto al principio técnico que emplean, cabe mencionar que la gran mayoría están basados en el enzimoinmunoanálisis (EIA): indirecto, en sandwich y de captura. Existen EIA competitivos que tienen una gran especificidad aunque adolecen de cierta falta de sensibilidad en algunos momentos de la infección por el VIH, como al inicio de la seroconversión y en los pacientes en estadios terminales. Sin embargo, combinadas con otras pruebas de mayor sensibilidad en forma secuencial, pueden proporcionar excelentes resultados en la estrategia diagnóstica. Estos tipos de pruebas han sufrido también variaciones tecnológicas, siendo una de ellas la utilización de substratos fluorescentes que han dado lugar a las pruebas denominadas ELFA (enzime-linked fluorescent assay). La última aportación a las pruebas inmunoenzimáticas ha sido la detección simultánea de antígeno p24 y anticuerpos frente al VIH, lo que acorta el período ventana. Diversos trabajos publicados y experiencias realizadas en nuestro laboratorio ponen de manifiesto un adelanto entre una a dos semanas en la detección serológica de la infección por el VIH, aspecto a considerar si tenemos en cuenta que en el período ventana la infectividad de un individuo es más elevada.


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Figura 1: Cribado HIV (detección de Ac VIH y Ag p24)

Figura 2: Cribado HIV con EIA de 4ª generación (VIDAS® HIV DUO ULTRA )


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Existen pruebas basadas en la técnica de aglutinación pasiva que ofrecen ventajas por su sencillez y simplicidad de ejecución así como por la posibilidad de realizar titulaciones de forma sencilla. La dificultad de automatización las hace poco adecuadas para procesar gran número de sueros y están menos extendidas. Estas técnicas están diseñadas para detectar tanto anticuerpos de la clase IgG como IgM y en la actualidad son poco utilizadas.

Entre las pruebas de cribado de anticuerpos VIH, las denominadas pruebas rápidas han experimentado un desarrollo importante; los antígenos que emplean son similares a los EIA y ELFA y el tiempo en el que se puede obtener un resultado oscila entre 5 y 20 minutos. Aunque las características operacionales son inferiores a los EIA y ELFA deben tenerse en cuenta para situaciones de urgencia. Combinadas con otras pruebas de detección de anticuerpos constituyen una estrategia que mejora la especificidad de los resultados de forma asequible en términos de costes laborales y de tiempo.

Figura 3: Pruebas rápidas VIH (Determine® HIV-1/2 Test)

Figura 4: Determine® HIV-1/2

Figura 5: Determine® HIV-1/2 Ag/Ab Combo. Detecta simultaneamente antigeno p24 y anticuerpos VIH 1 y 2


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En la Tabla 2 se exponen algunas de las más utilizadas; son preferibles aquellas que permiten detectar anticuerpos frente al VIH-1 y VIH-2 de forma separada. Su mayor inconveniente reside en la lectura que siempre es subjetiva y con algunos sueros pueden producirse reactividades que generen dudas de interpretación.

Tabla 2. Pruebas rápidas para la detección de anticuerpos frente al VIH

Técnica Antígeno

Dot-EIA 1ª generación Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1 y VIH-2 en un único "spot".

Dot-EIA 2ª generación Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1, VIH-2 y VIH-1"O" en "spots" diferenciados para VIH-1 y VIH-2

Látex/Aglutinación pasiva

Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1, VIH-2 y VIH-1"O".

Inmunocromatografía capilar

Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1, VIH-2 y VIH-1"O".

En los últimos años, han aparecido pruebas rápidas basadas en el principio de la inmunocromatografía capilar que han mejorado de forma importante la sensibilidad y la especificidad de éstas respecto a las de Dot-EIA. Se deben elegir aquellas que tengan controles internos que verifiquen el correcto funcionamiento de la reacción.

3.2 Pruebas de confirmación de la presencia de anticuerposfrentealVIH

La trascendencia de la infección por el VIH hace necesaria la confirmación de los resultados positivos obtenidos en las pruebas de detección primaria de anticuerpos; este paso es inexcusable cuando el objetivo de las pruebas sea el diagnóstico y puede ser obviado cuando aquellas se realicen para seguridad biológica. Sin embargo en el ámbito hospitalario es cada vez más frecuente que se confirmen todos los resultados positivos de sueros u otras muestras, incluidas aquellas en las que el objetivo principal no es el diagnóstico. Existen diferentes pruebas de confirmación; entre ellas cabe citar las basadas en los principios de inmunoelectrotrasferencia o western blot (WB), de inmunofluorescencia indirecta (IFI), de radioinmunoprecipitación (RIPA) y de inmunoblot con antígenos recombinantes (LIA). La técnica más ampliamente utilizada para confirmación es el WB. Las técnicas de IFI y RIPA por razones distintas (subjetividad de la lectura, requerimientos de laboratorio, etc.) se emplean cada vez menos, de tal forma que los resultados de confirmación por WB son considerados el estándar o patrón para confirmar la presencia de anticuerpos frente al VIH. Existen distintos criterios de positividad emitidos o recomendados por organismos o sociedades involucrados en el diagnóstico de la infección por el VIH (Tabla 3), de ellos el de la OMS es el más específico cuando se manejan sueros de procedencia poblacional muy diversa.


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Tabla 3. Criterios de positividad en WB para confirmación de infección por el VIH-1.

CRITERIO REACTIVIDAD FRENTE A

Organización Mundial de la Salud

Dos glicoproteinas cualquiera de: gp160, gp120, gp41

Cruz Roja Americana Una proteína de cada gen estructural (env, pol y gag)

Food and Drug Administration p24 + p32 + (gp41o gp120 o gp160)

CRSS* p24 + (gp41o gp120 o gp160) o p32 + (gp41o gp120 o gp160)

CDC/ASTPHLD** p24 + (gp41o gp120 o gp160) o gp41 + (gp120 o gp160)

*Consortium for Retrovirus Serology and Standardization. **Centers for Disease Control/Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors

Tabla 4: PRUEBAS DE CONFIRMACION SEROLOGICA DE LA INFECCION VIH

CARACTERISTICA WB IFI RIPA

Lectura Subjetiva Subjetiva Subjetiva

Automatización Parcial No No

Dificultad Media Baja Alta

Sensibilidad +++ ++ ++++

Especificidad +++ ++ ++++

Rapidez ++ +++ +

INDICACIONES

WB Confirmación de todo tipo de sueros VIH 1 y VIH 2

IFI Confirmación en grupos de alta prevalencia VIH 1

RIPA Confirmación de referencia en nuestras especialmente problemáticas. Investigación


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Figura 6: Prueba de confirmación LIA

El WB contiene los antígenos del propio VIH, algunas de sus proteínas precursoras y antígenos de origen celular. Existen modalidades que incorporan en un extremo diferenciado de la tira un péptido sintético específico del VIH-2 (gp36), que facilita la sospecha de infección por VIH-2 en coinfecciones y en WB indeterminados para el VIH-1. Debido a que las tiras de nitrocelulosa en las que se depositan los antígenos del VIH contienen, en mayor o menor cantidad, proteínas de la célula huésped en la que se ha cultivado el virus, a menudo se observan bandas de reactividad contra dichas proteínas, de ahí la necesidad de adiestramiento en la lectura e interpretación de las bandas de origen vírico. Es conveniente adoptar una disciplina metodológica en la lectura e interpretación de bandas de reactividad del WB (Tabla 4); que deberá ser uniforme y sistematizada para cada laboratorio.

Los sueros se consideran positivos cuando cumplen el criterio de positividad adoptado por el laboratorio, negativos cuando no se observa ninguna banda de reactividad, e indeterminados cuando se observan reactividades distintas a las del criterio de positividad.

Tabla 5. Pautas de lectura del Western-Blot

1º-Identificación de bandas específicas víricas de reactividad. 2º-Valoración de la reactividad de cada banda (0, 1, 2, etc.) 3º-Anotación individualizada de resultados en cada muestra. 4º-Aplicación del criterio de positividad. 5º-Emisión de resultados e informe.

Los resultados indeterminados de la prueba WB son la mayor fuente de ansiedad en pacientes y los que pueden llegar a generar desconcierto en los responsables del diagnóstico. Las causas de reactividades anormales en WB son muy variadas y no están totalmente explicadas. Se han descrito resultados indeterminados en personas con factor


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reumatoide en el suero, lupus eritematoso, hiperbilirrubinemias, infección por otros retrovirus, parasitosis y por otras causas. En la membrana de envoltura del VIH pueden estar presentes antígenos HLA que produzcan reactividades en el WB hasta en el 30% de los individuos multitransfundidos que originen falsas reactividades. En la Tabla 5 se reflejan algunas de las reactividades más frecuentemente observadas en las pruebas de confirmación mediante WB. La conducta a seguir en estos casos, tenderá a limitar y minimizar la ansiedad en el paciente sin descartar la posibilidad de una seroconversión u otra infección por retrovirus (HTLV-I y HTLV-II), alertando al clínico sobre dicha eventualidad.

Tabla 6. Reactividades frecuentes en resultados indeterminados de Western Blot

Bandas de reactividad observadas Posible causa y seguimiento

Una glicoproteina aislada (gp160, gp120 o gp41)

Inicio de la seroconversión, infección por otros tipos de VIH, frecuente en la serorreversión pediátrica (hijos de madres infectadas) Repetir WB en otro suero 7 días más tarde en adultos. En niños PCR y seguimiento. Descartar VIH-2 u otros tipos VIH según procedencia geográfica

P24 aislada

Frecuente en resultados indeterminados de embarazadas, multitransfundidos y pacientes africanos. Descartar VIH-2 u otros tipos de VIH. Otros retrovirus (HTLV-I/II) Puede persistir años en pacientes VIH-seronegativos

P17 aislada Causa desconocida No es necesario el seguimiento

Otras bandas del core aisladas

Inespecificidades muy variadas (ver tabla 8) Anamnesis para posibles factores de riesgo o de WB indeterminado Seguimiento a los 7-15 días si hay factores de riesgo

Más de una banda del core o bandas no víricas

Frecuente en multitransfundidos, enfermedades autoinmunes, etc. Anamnesis para posibles factores de riesgo. Seguimiento hasta 3-6 meses para ver evolución.

Para minimizar los problemas debidos a resultados indeterminados observados en el WB se han desarrollado técnicas de inmunoblot con péptidos recombinantes o pruebas de LIA. Estas tienen una lectura más estructurada, que se puede hacer por densitometría en


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algunos casos, obviando los problemas de subjetividad en la apreciación de la intensidad de las bandas. En nuestra opinión pueden ser empleados por laboratorios que precisen confirmar un gran número de muestras (automatización) y en los que importe menos el conocimiento de las causas de falsa positividad obtenidas en las pruebas de cribado de anticuerpos.

Por lo general estas pautas se utilizan para confirmar sueros positivos pero, en determinados casos, pueden usarse para confirmar sueros negativos, debido al amplio contenido de antígenos del VIH respecto a las pruebas de detección primaria de anticuerpos. Los informes clínicos de los resultados de estas pruebas deben expresar de forma clara si la persona es positiva o negativa para anticuerpos frente al VIH o si se aconseja seguimiento o pruebas adicionales; cualquier cambio que haga el laboratorio respecto a los criterios de positividad adoptados deberá comunicarse a los clínicos que atienden a los pacientes infectados por el VIH.

gp160gp120

p24

p31

p17

gp41

HIV-2

HIV-1

“O” ? A D C E F F 2 2“O” ? A D C E F F +

Detection of non-Subtype B HIV reference samples on Subtype B HIV-1 (WB & LIA) antigen kits

Figura 7: Western-Blot y LIA


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Figura 8: Ejemplos de Western-Blot (Método de confirmación del VIH)

3.3Casopráctico

Como TEL del Laboratorio de Virología de un Hospital de tercer nivel realiza la confirmación del Western-Blot a 3 pacientes (A, B y C) que se encuentran ingresados en la planta de infectología de dicho Hospital.

3.3.1Pregunta:

Explique los resultados de cada uno de ellos y si existe algún resultado indeterminado enumere las posibles causas del mismo.


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3.4ResumendelaUnidadDidácticaIII

Las pruebas de detección habituales de anticuerpos frente al VIH han experimentado un considerable desarrollo y mejoras desde su aparición inicial. La evolución de los antígenos incluidos en las pruebas de detección de anticuerpos frente al VIH ha permitido por una parte incrementar la sensibilidad sin merma de la especificidad y por otra ha hecho posible la detección de anticuerpos frente tipos y subtipos del VIH que escapaban a los equipos de diagnóstico habituales.

La gran mayoría de las pruebas de detección de anticuerpos frente al VIH están basados en el enzimoinmunoanálisis (EIA). Estas pruebas han sufrido variaciones tecnológicas, siendo la más extendida la utilización de substratos fluorescentes que han dado lugar a las pruebas denominadas ELFA (enzime-linked fluorescent assay).

Entre las pruebas de cribado de anticuerpos VIH, las denominadas pruebas rápidas han experimentado un desarrollo importante. Aunque las características operacionales son inferiores a los EIA y ELFA deben tenerse en cuenta para situaciones de urgencia. Además, combinadas con otras pruebas de detección de anticuerpos, constituyen una estrategia que mejora la especificidad de los resultados de forma asequible en términos de costes laborales y de tiempo.

La transcendencia de la infección por el VIH hace necesaria la confirmación de los resultados positivos obtenidos en las pruebas de detección primaria de anticuerpos.

Existen diferentes pruebas de confirmación, entre ellas cabe citar las basadas en los principios de inmunoelectrotrasferencia o western blot (WB), de inmunofluorescencia indirecta (IFI), de radioinmunoprecipitación (RIPA) y de inmunoblot con antígenos recombinantes (LIA). La técnica más ampliamente utilizada para confirmación es el WB.

3.5Glosario

Anticuerpo: proteína producida por el organismo en respuesta a un antígeno y capaz de unirse específicamente con él.

Antígeno: cualquier sustancia que origina la formación de anticuerpos y reacciona específicamente uniéndose al antígeno que provoco su formación.

Defensas del huésped: son mecanismos (de diversa naturaleza) que impiden la entrada de microorganismos a zonas del huésped donde normalmente no hay microorganismos patógenos, y que además dificulta su diseminación si los gérmenes llegan a penetrar en el huésped.

EIA y ELISA: grupo de técnicas sexológicas que usan reacciones enzimáticas como indicador.

Fluorescencia: propiedad de una sustancia de emitir luz de un color distinto cuando se ilumina con luz de un color.

Huésped u hospedador: persona en la que se aloja un microorganismo patógeno.

Serología: conjunto de pruebas diagnósticas que utilizan el suero ( a veces otros fluidos) del enfermo para detectar la presencia de anticuerpos o antígenos.


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Título de anticuerpos: estimación de la cantidad de anticuerpos en el suero determinada diluyendo éste. Se expresa como el recíproco de la dilución más diluida que aún presenta actividad.

Viremia: presencia del virus en la sangre.

Suero: líquido que queda cuando la sangre coagula y que contiene albúmina, anticuerpos (inmunoglobulinas), etc.

HTLV: virus linfotrópico de células T humanas

UNIDADDIDÁCTICAIVESTRATEGIASENELDIAGNÓSTICOSEROLÓGICO

DELAINFECCIÓNVIH


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4.1PrincipiosgeneralesEn la actualidad, existen diferentes tipos de técnicas de detección de anticuerpos

específicos VIH. La selección de la técnica o combinación de técnicas más apropiada dependerá de:

objetivo de la prueba;

sensibilidad y especificidad de las técnicas a utilizar

la prevalencia de la infección VIH en la población estudiada.

a. Objetivos de la Determinación de Anticuerpos VIH

La determinación de anticuerpos VIH se realiza con cuatro objetivos fundamentales:

Cribado de los donantes de sangre, órganos, semen y óvulos.

diagnóstico de la infección VIH.

vigilancia seroepidemiológica de la infección VIH

investigación.

b. Sensibilidad y Especificidad del Diagnóstico

Las técnicas de detección de anticuerpos con un elevado nivel de sensibilidad son las técnicas de elección en el cribado de donantes de sangre, órganos, semen y óvulos. Aquellas técnicas con un elevado nivel de especificidad serán las técnicas de elección en el diagnóstico de la infección VIH.

c. Valores Predictivos del Diagnóstico

La probabilidad de que una técnica de detección de anticuerpos VIH determine con certeza el verdadero estado de infección de un individuo, varía de acuerdo con a la prevalencia de infección VIH en la población de estudiada. Así, a mayor prevalencia de infección mayor probabilidad de que un resultado positivo signifique que el paciente se halla realmente infectado, es decir, la técnica poseerá un elevado valor predictivo positivo (VPP). Sin embargo, poseerá un valor predictivo negativo (VPN) menor.

4.2EstrategiasenladeterminacióndeanticuerposVIH

4.2.1Estrategiasdecribadoyconfirmación

La OMS hizo unas recomendaciones hace años que pueden servir de base para establecer la estrategia de confirmación, siempre teniendo en cuenta el objetivo para el que se realiza la prueba de detección de anticuerpos frente al VIH y la prevalencia de éstos observada o estimada en una población dada (Tabla 1). La estrategia I de seguridad biológica, que constituye el proceder actual en la mayor parte de centros de hemoderivados, se basa además de las técnicas de cribado de anticuerpos frente al VIH en la detección por PCR del VIH en lotes de sueros.

De esta forma se acorta el periodo ventana que precede a la aparición de anticuerpos y se confiere mayor seguridad a las donaciones. La estrategia II se basa en la


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realización de dos pruebas que emplean un principio técnico diferente y sólo sería de aplicación para estudios de serovigilancia cuando la prevalencia sospechada de infección por el VIH fuera inferior al 10%.

Finalmente la estrategia III es la más recomendable en el entorno español con alta demanda de solicitudes y una baja prevalencia (<10%) de diagnósticos positivos. En esta estrategia, las muestras reactivas por dos técnicas de cribado son analizadas por una tercera prueba de confirmación (W-B, LIPA,…). En este sentido cabría fácilmente implementarse en el laboratorio un algoritmo que combinara una prueba de EIA para detectar anticuerpos frente al VIH de 3ª, o mejor de 4ª generación y otra de las denominadas rápidas, preferiblemente basada en el principio técnico de inmunocromatografía capilar (ICC). De esta forma las muestras inicialmente reactivas por un EIA o ELFA de 3ª o 4ª generación se pueden informar y solicitar una nueva muestra para prueba de confirmación basada preferentemente en el principio del inmunoblot (Western-Blot o similares).

Cuando el objetivo de la prueba de detección de anticuerpos frente al VIH es el diagnóstico y la prevalencia de positivos es <10% se recomienda el uso de tres técnicas con un principio o antígeno distinto y parece obligado que figure entre aquéllas el WB u otra técnica que identifique de forma individualizada las distintas reactividades de los antígenos del VIH. Para diagnosticar a una persona como positiva e infectada por el VIH las tres pruebas deben ser positivas. Es probable que en muchos laboratorios sólo se disponga de una prueba de detección de anticuerpos (EIA o ELFA) y una segunda de confirmación (WB, LIA o IFI) en este caso pueden producirse por las razones mencionadas previamente, situaciones problemáticas respecto al diagnóstico de la infección por el VIH sobre todo en individuos asintomáticos. Por ello es altamente recomendable que en el laboratorio o en el hospital al menos, se disponga de dos pruebas primarias de detección de anticuerpos frente al VIH de distinto fabricante o que empleen un principio técnico distinto. Esta precaución permite fácilmente cumplir con la recomendación mencionada en la estrategia III y aumenta nuestra fiabilidad diagnóstica. Además de poner antes de manifiesto la existencia de posibles discrepancias, la adopción de esta medida permite no tener que depender del mismo proveedor, lo cual soslaya los fallos temporales con lotes concretos de reactivos. En todo caso, la técnica utilizada en primer lugar, en cualquiera de las estrategias debe ser la que posea la máxima sensibilidad y las siguientes deben ser las de mayor especificidad.

Tabla 1. Estrategias de determinación de la presencia de anticuerpos frente al VIH

OBJETIVO PREVALENCIA ESTRATEGIA

Seguridad biológica Cualquiera I

Diagnóstico

Paciente sintomático Cualquiera II

Asintomático > 10% II

< 10% III

Serovigilancia > 10% I

< 10% II


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4.2.2Estrategiaenladonacióndesangre/órganos

Con el objetivo de disminuir al máximo el riesgo de transmisión de la infección VIH mediante sangre transfundida, hemoderivados, semen, óvulos u órganos contaminados, desde 1987 es obligatoria la detección de anticuerpos VIH en todas las unidades a transfundir y en suero de donantes de semen, óvulos u órganos. Esto ha obligado a que los Bancos de Sangre incluyan protocolos de cribado para localizar y desechar las unidades presumiblemente contaminadas.

La técnica de cribado indicada es aquella que presenta la máxima sensibilidad y tenga posibilidades de automatización con la finalidad de obtener resultados reproducibles de forma rápida y procesar un gran número de muestras al mismo tiempo. Actualmente, son las técnicas de enzimoinmunoanálisis (EIA) de 3ª y 4ª generación que incorporan antígenos de VIH-l y VIH-2 las que cumplen estos requisitos de forma más satisfactoria o las técnicas no serológicas (PCR).

4.2.3EstrategiaeneldiagnósticodelainfecciónVIH

En la actualidad, prevalece la hipótesis de que el VIH, desde el momento en que penetra en el organismo humano, prolifera de una forma continua, aunque a velocidades diferentes según el estadio evolutivo de la infección. Se distinguen tres fases:

- primoinfección.

- asintomática, de varios años de duración.

- sintomática, que clínicamente se corresponde con el complejo relacionado o el SIDA.

4.2.3.1PrimoinfecciónVIH

Una vez el VIH penetra en el organismo humano, por los mecanismos de transmisión actualmente reconocidos, inicia una replicación activa a consecuencia de la cual se desarrolla el cuadro clínico de la primoinfección, que suele ser asintomática o bien su sintomatología es tan leve que suele pasar desapercibida. No obstante, también puede manifestarse como un síndrome mononucleósico asociado o no a una meningitis o meningoencefalitis aguda o subaguda de tipo linfocitario, o una neuropatía central o periférica o una depresión transitoria de la inmunidad celular. Las técnicas de PCR cualitativa pueden detectar en esta fase al VIH. Su cuantificación durante este momento de la infección permite valorar la evolución posterior de la misma. Durante esta fase y no antes de las 3-6 semanas después del contagio ("período ventana"), la infección puede ponerse de manifiesto serológicamente mediante la detección de los antígenos del virus, concretamente del antígeno p24 libre, por técnicas de enzimoinmunoanálisis (EIA). La aparición de anticuerpos suele acontecer alrededor de los 2-4 meses después de la exposición al virus, y salvo en raras ocasiones, persistirán durante toda la vida. A medida que aumenta el título de anticuerpos específicos frente a las proteínas de envoltura y de core, se produce una disminución paulatina de la concentración sérica de antígeno p24 libre hasta su total negativización en las técnicas de EIA, pero con frecuencia en los niños y ocasionalmente en los adultos coexisten títulos altos de antígeno y de anticuerpo.


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La estrategia diagnóstica ante la sospecha de primoinfección VIH incluirá necesariamente la detección de anticuerpos totales y antígeno p24 libre en sangre con las siguientes consideraciones:

1) Un resultado negativo frente a los dos marcadores citados de infección VIH puede ser debido a:

la ausencia de infección

el paciente está en el "periodo ventana". En ambas situaciones se procederá a la realización de determinaciones seriadas de anticuerpos y de antígeno a las 2 y 4 semanas y a los 3 y 6 meses para confirmar la ausencia o presencia de infección VIH.

2) Un resultado de anticuerpos negativo con presencia de antígeno p24 libre en sangre, es indicativo de infección reciente, probablemente durante las 8 semanas anteriores. Se procederá a realizar determinaciones seriadas de anticuerpos y antígeno siguiendo la pauta indicada en el punto anterior.

3) Un resultado de anticuerpo positivo con ausencia de antígeno libre circulante, es diagnóstico de infección VIH completamente establecida.´

4.2.3.2FaseAsintomáticadelaInfecciónVIH

Esta fase se caracteriza por la presencia de anticuerpos y ausencia de antígeno p24 libre, o presencia intermitente, no mantenida, de dicho Ag. Esta fase puede durar años manteniendo dicho perfil sérico.

Los diferentes estudios de seguimiento longitudinal de pacientes infectados indican que la probabilidad de que la infección progrese hacia estadíos más avanzados es baja en los primeros estadíos más avanzados es baja en los primeros 2-4 años de infección y aumenta considerablemente a partir de los 5 años, siendo de casi el 60% a los 10 años de haberse producido la infección y sin que, aparentemente, parezca haber diferencias importantes entre los distintos subgrupos importantes afectados.

Los niveles de antígeno y anticuerpos varían enormemente entre individuos. Si el médico que sigue a un paciente infectado por VIH decide emplear marcadores séricos específicos víricos, debe conocer que son necesarios los test seriados para confirmar una tendencia. Así, los pacientes, en esta fase de la infección por VIH, deben monitorizarse para detectar cambios en el perfil serológico y establecer un pronóstico de evolución de la infección.

Un descenso en el título de anticuerpos anti-p24 y/o la positivación del antígeno p24 libre en, por lo menos, dos muestras consecutivas, son un indicador de progresión de la infección.

En el momento actual no existe una recomendación de amplio consenso sobre la cronología de detección de estos marcadores en la fase asintomática, por ello su determinación debe ser realizada en el contexto clínico individualizado teniendo en cuenta otros parámetros clínicos.


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4.2.3.3FaseSintomáticadelainfecciónVIH

Esta fase se inicia a consecuencia de un aumento de la actividad replicativa del virus y se caracteriza por la positividad mantenida del antígeno p24 libre por técnicas de EIA, asociada, en un 60-70% de los casos, a un descenso en los niveles de anticuerpos anti-p24 manteniéndose positivos los anticuerpos frente a las proteínas de envoltura, y con una importante disminución de los linfocitos CD4 (+).

Clínicamente se manifiesta por la aparición de una grave alteración del estado general, infecciones oportunistas, ciertos tipos de neoplasias o de trastornos neurológicos, cuyo grado de evolución se clasifica según los criterios de la O.M.S. (tabla 2 y 2 bis). El pronóstico vital a partir de este momento, aún con tratamiento específico antivírico es, en las mejores estimaciones, del 50-75% a los 365 días. La edad, el sexo, la actividad de riesgo a través de la cual se adquirió la infección y la forma de presentación (reflejo indirecto del grado de inmunosupresión) influyen en el pronóstico.

TABLA 2 CLASIFICACION DE LA O.M.S. DE LA INFECCION POR VIH EN LOS ADULTOS

ESTADIO 1

Paciente asintomático

Adenopatías generalizadas persistentes

Nivel 1: asintomático, actividad normal

ESTADIO 2

Pérdida de peso de menos del 10% del peso habitual

Manifestaciones cutáneas mínimas (dermatitis seborreica, prurito, onicomicosis, úlceras orales, quielitis angular)

Herpes zoster durante los últimos 5 años

Infecciones respiratorias altas recurrentes

Y/o nivel 2: presencia de síntomas, actividad normal

ESTADIO 3

Pérdida de peso de más del 10% del peso habitual

Diarrea crónica no explicada de más de 1 mes de evolución

Fiebre prolongada (constante o intermitente) no explicada de más de 1 mes de evolución

Candidiasis oral vellosa

Tuberculosis pulmonar durante el último año

Infecciones bacterianas severas

Y/o nivel 3: paciente encamado menos del 50% del tiempo el último mes


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ESTADIO 4

Pérdida de más del 10% del peso habitual más diarrea crónica (>1 mes) no explicada o debilidad crónica y fiebre crónica (>1 mes) no explicada

Neumonía por P.carinii

Toxoplasma cerebral

Criptosporidiosis con diarrea de más de 1 mes

Criptococosis extrapulmonar

Enfermedad por CMV con afectación de otros órganos aparte del hígado, bazo y ganglios linfáticos

Infección mucocutánea por virus del herpes simple de más de 1 mes de duración o visceral de cualquier duración

Leucoencefalopatía multifocal progresiva

Cualquier micosis endémica diseminada

Candidiasis esofágica, traqueal, bronquial o pulmonar

Infección diseminada por micobacterias atípicas

Sepsis por Salmonella sp. diferente a S. Typhi

Tuberculosis extrapulmonar

Linfoma

Sarcoma de kaposi

Encefalopatía por VIH

Y/o nivel 4: paciente encamado más del 50% del tiempo el último me

TABLA 2 BIS CLASIFICACIÓN DE LA INFECCIÓN POR EL VIH (CDC 1993)

CD4 CATEGORIA CLÍNICA

>= 500/MM³ A1 B1 C1

200-499 mm³ A2 B2 C2

<200/mm³ A3 B3 C3

4.2.4Estrategiasensituacionesespeciales

4.2.4.1Embarazo

En ausencia de terapia/profilaxis materna con tratamiento antirretroviral o cesárea electiva, el riesgo de transmisión vertical del VIH en la paciente no tratada es del 14-25%.


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El momento de mayor riesgo es el parto con dos terceras partes de las transmisiones, mientras que la parte restante suele producirse al final de la gestación. La lactancia materna añade un riesgo suplementario.

La cesárea programada (antes del inicio del parto), en ausencia de tratamiento de la madre, ejerce un efecto protector para el feto. La baja incidencia actual en la transmisión vertical impide evaluar su efecto protector en mujeres con terapia combinada con carga viral indetectable (con bajo riesgo de base). Por tanto, su posible efecto beneficioso debe reducirse a los casos con fracaso terapéutico parcial y a los no correctamente tratados.

La transmisión vertical de la infección VIH es la responsable de más del 80% de los casos de SIDA en niños menores de 1 año de edad.

La determinación de anticuerpos VIH en las mujeres embarazadas se justifica por:

posibilidad de interrupción del embarazo

modificación de la conducta obstétrica durante el parto, para evitar al máximo el riesgo de transmisión perinatal

medidas de atención al recién nacido.

La recomendación mas ampliamente aceptada es realizar determinación de anticuerpos VIH en la mujer gestante cuando existan prácticas de riesgo. Sin embargo, los datos recientes demuestran que la identificación de la embarazada con prácticas de riesgo, presentes o pasadas, puede fallar, bien porque ésta no se identifica como adicta a drogas por vía parenteral o no es consciente del riesgo de la transmisión heterosexual por contactos sexuales previos con individuos seropositivos. En este sentido, estudios recientes demuestran, que hasta un 25% de las mujeres embarazadas VIH (+), desconocían haber estado expuestas a un riesgo de infección VIH. Por ello, es necesario realizar esta prueba en el control serológico de la gestación. Es importante el consentimiento informado de la embarazada y una adecuada información sobre la transmisión del virus.

Únicamente en aquellas mujeres seronegativas que presenten prácticas de riesgo persistentes se repetirá periódicamente la determinación, teniendo siempre en cuenta que se ha descrito transmisión en casos que presentaban resultados indeterminados en Western -Blot.

La determinación de anticuerpos VIH en las parejas que acuden a clínicas de esterilidad para fecundación asistida, se deberá realizar por razones obvias.

4.2.4.2ReciénNacidosdeMadresPortadoras

La terapia antirretroviral instaurada precozmente en el tratamiento de la infección congénita, disminuyo el riesgo de aparición de infecciones oportunistas, incrementando, incluso, la supervivencia del niño infectado. Así, la detección precoz de la infección es especialmente importante Sin embargo, se halla dificultada por:

presencia de anticuerpos específicos en todos los recién nacidos de madre seropositiva, a consecuencia de una transferencia pasiva de las IgG anti-VIH de la madre.


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persistencia de los anticuerpos maternos por encima de los 10 meses de edad

resultados falsamente negativos, durante los tres primeros meses de vida, en caso de infección perinatal.

infección VIH en ausencia de seroconversión, debido a una importante hipogammaglobulinemia, a consecuencia de una disfunción de los linfocitos B.

La estrategia de diagnóstico serológico en los hijos nacidos de madre seropositiva incluirá necesariamente la detección de anticuerpos totales VIH y antígeno p24 libre en sangre.

1) La presencia de infección VIH en el recién nacido se caracteriza por:

La persistencia de anticuerpos VIH por encima de los 18 meses de edad.

aparición, en sueros seriados, de nuevas bandas de reactividad en el Western Blot, a pesar de que su valor es inferior al anterior marcador.

presencia de antígeno p24 libre en sangre. Este marcador de actividad replicativa del virus, suele asociarse con una evolución rápida de la infección hacía estadios sintomáticos. El principal problema en la determinación de antígeno p24 radica en que no se positiviza hasta que los anticuerpos anti-p24 del tipo IgG de la madre disminuyen o desaparecen de sangre, como consecuencia de la formación de inmunocomplejos antigeno-anticuerpo circulantes no detectados por las técnicas de EIA. En ésta situación el tratamiento del suero para disociar los inmunocomplejos (acidificación, guanidina, etc.) puede ser de gran ayuda.

La disminución del nivel de anticuerpos anti-p24 seguido de un aumento de éstos, en el transcurso de uno o dos meses, podrá correlacionarse con la pérdida de anticuerpos maternos y la producción propia, de los mismos, por parte del niño infectado por vía vertical.

Las dificultades derivadas de importante retraso en el diagnóstico de la infección VIH en los recién nacidos de madre seropositiva (18 meses), hace necesario la utilización futura de otros marcadores de infección no serológicos, como cultivo o amplificación genética (PCR).

4.2.4.3AccidentesconRiesgodeExposiciónaVIH.

La sangre contaminada es la fuente principal del virus de la inmunodeficiencia humana, a partir de la cual se puede infectar un profesional sanitario. Las formas más potenciales de transmisión del VIH son similares a las de otros virus como el virus de la hepatitis B o C. No obstante, la posibilidad de infección entre el personal sanitario es muy superior en el caso del VHB.

Se ha comprobado la transmisión del VIH en personal sanitario a partir de sangre, líquidos corporales o contaminados con sangre o concentrados de virus que fueron


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inoculados o estuvieron en contacto con mucosas o piel no intacta. El riesgo de infección por VIH a partir de una punción con aguja contaminada con sangre de persona infectada con el VIH es del 0,3-0,5%. Tras la exposición de las mucosas a sangre infectada, el riesgo se reduce al 0,09% siendo incluso menor cuando la exposición se realiza con la piel intacta.

Protocolo de Actuación Después de una Exposición Accidental a Productos Biológicos Probablemente Contaminados:

En primer lugar si la herida sangra, debe permitirse el sangrado de forma profusa, eliminar posibles cuerpos extraños y lavarla con agua y jabón, no debiendo retrasarse esta maniobra para utilizar antisépticos, cuyo papel no ha sido demostrado y evitando maniobras agresivas (frotar bruscamente la zona lesionada) para evitar producir erosiones que favoreciesen la infección. Si se contamina piel no intacta, hay que lavarla con agua y jabón; Si lo hace la mucosa oral, se han de hacer irrigaciones con agua estéril. Ante una exposición accidental (pinchazo, etc.) de un profesional sanitario con una persona afectada de SIDA, VIH positiva o que rechace el estudio de su estatus serológico para el VIH, hay que informar al trabajador de los riesgos de infección y proceder a una valoración clínico-serológica lo más pronto posible, con el fin de descartar o confirmar la infección por VIH y valorar la indicación de profilaxis postexposición. Se le indicará que comunique cualquier episodio febril que suceda en las 12 semanas siguientes. Después de la valoración inicial, a los trabajadores seronegativos, se les repetirán las pruebas a las 6 semanas, a las 12 semanas y a los 6 meses para determinar si han sufrido la infección-algunos autores recomiendan prolongar el seguimiento hasta 12 meses dado que se han descrito seroconversiones tardías. Durante este periodo, sobre todo durante las 12 primeras semanas, deberán seguirse las recomendaciones para evitar una posible transmisión secundaria del VIH, como evitar donar sangre y utilizar preservativos en sus relaciones sexuales. Es vital mantener la confidencialidad profesional, si el accidente sucedió a partir de una persona seronegativa para el VIH, la evaluación basal y a las 12 semanas no será obligatoria, pero puede llevarse a cabo si el trabajador lo desea o el médico encargado lo aconseja. Si la persona es seronegativa, pero lleva a cabo una conducta de riesgo para el VIH o el accidente sucede en una zona de alta prevalencia para el VIH, sería aconsejable efectuar la valoración clínica serológica, tal y como se indicó anteriormente. Hay casos descritos de infección por VIH en personal sanitario tras pinchazo accidental, a partir de una aguja utilizada en un usuario de drogas por via parenteral seronegativo para el VIH en el momento del accidente, pero con Ag p24 del VIH positivo. Si el status serológico no puede determinarse, las decisiones deben individualizarse de común acuerdo entre el trabajador accidentado y el médico encargado. Siempre que sea posible, es aconsejable almacenar suero en el momento del accidente, tanto del paciente como del personal sanitario, por si es preciso reanalizarlo en el futuro.

Los primeros intentos de reducir el riesgo de infección del VIH en sujetos expuestos fueron realizados con AZT (Zidovudina). Si se decide iniciar la quimioprofilaxis, debe hacerse lo antes posible, preferiblemente durante las 1-2 primeras horas del accidente, cuando la probabilidad de infección por el VIH sea alta y siempre que se asegure un buen cumplimiento. La profilaxis postexposición no debería ser usada cuando el riesgo sea muy bajo o hayan pasado más de 72 horas. Estudios en animales sugieren una pérdida de efectividad si se inicia tratamiento a las 48-72 horas tras la exposición o si la duración total del tratamiento se acorta a 3 ó 10 días. Siempre deberá explicarse al accidentado la naturaleza de la terapia, así como sus posibles riesgos.


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El tratamiento antirretroviral indicado en la profilaxis postexposición depende del tipo de riesgo existente en la exposición accidental.

En exposiciones con riesgos muy bajos, por ejemplo, escasas gotas de sangre sobre la piel intacta, o tiempo transcurrido superior a 72 horas, el inicio de tratamiento puede no estar justificado. Si se inicia tratamiento éste se mantendrá durante 4 semanas.

El tratamiento antirretroviral en pacientes expuestos a infección por VIH se acompaña de una frecuencia alta de efectos secundarios que pueden condicionar la calidad de vida, y consecuentemente, el buen cumplimiento del tratamiento indicado.

El empleo creciente del tratamiento antirretroviral y el aumento de la supervivencia secundario al mismo han conllevado un aumento creciente en la transmisión de cepas resistentes. La determinación de resistencias en el caso fuente, si es conocido, se debe considerar en la profilaxis postexposición, si bien su inicio en ningún momento deberá diferirse hasta la determinación de las mismas.

4.3Casopráctico

Enfermera de la cuarta planta de un hospital comarcal que tras realizar una cura a un paciente se corta de forma accidental con un bisturí.

4.3.1Pregunta

Explique de forma esquemática el protocolo de actuación que debe seguir el hospital y la enfermera implicada en este caso

4.4ResumendelaUnidadDidácticaIV

En la actualidad, existen diferentes tipos de técnicas de detección de anticuerpos específicos VIH. La selección de la técnica o combinación de técnicas más apropiada dependerá de: a) objetivo de la prueba, b) sensibilidad y especificidad de las técnicas a utilizar y c) la prevalecía de la infección VIH en la población estudiada.

Cuando el objetivo de la prueba de detección de anticuerpos frente al VIH es el diagnóstico y la prevalecía de positivos es <10% se recomienda el uso de tres técnicas con un principio o antígeno distinto y parece obligado que figure entre aquéllas el WB u otra técnica que identifique de forma individualizada las distintas reactividades de los antígenos del VIH. Para diagnosticar a una persona como positiva e infectada por el VIH las tres pruebas deben ser positivas

Es obligado que los Bancos de Sangre incluyan protocolos de cribado para localizar y desechar las unidades presumiblemente contaminadas por el VIH.

La determinación de anticuerpos VIH en las mujeres embarazadas se justifica por: a) posibilidad de interrupción del embarazo b) la modificación de la conducta obstétrica durante el parto, para evitar al máximo el riesgo de transmisión perinatal y c) las medidas de atención al recién nacido. Es necesario realizarlo en todas las embarazadas.


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La estrategia de diagnóstico serológico en los hijos nacidos de madre seropositiva incluirá necesariamente la detección de anticuerpos totales VIH y antígeno p24 libre en sangre.

Es necesario conocer el Protocolo de Actuación después de una exposición accidental a un producto biológico probablemente contaminado.

4.5Glosario

Prevalencia: proporción de casos de una enfermedad en una población dada (con relación al total de población) y en un momento determinado.

Primoinfección: primer episodio de infección por un microorganismo determinado

Sensibilidad de una prueba: es la proporción de individuos realmente enfermos que dan la prueba positiva.

Especificidad: es la proporción de individuos realmente sanos que dan la prueba negativa.

Valor predictivo positivo (VPP): es la proporción de enfermos que dan la prueba positiva (verdaderos positivos) con relación a la cantidad total de los que dan la prueba positiva (verdaderos positivos + falsos positivos).

Valor predictivo negativo (VPN): es la proporción de individuos sanos que dan la prueba negativa (verdaderos negativos) con relación al total de los que dan la prueba negativa (verdaderos negativos + falsos negativos).

Infección subclínica: enfermedad infecciosa cuya sintomatología es leve y puede pasar desapercibida

UNIDADDIDÁCTICAVPROBLEMASENLAPRUEBASDE

CRIBADOYCONFIRMACION.ALGORITMODEDECISIONEN

LASEROLOGIADELVIH


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5.1ProblemasenelcribadoyconfirmacióndelVIH.

Los problemas que se presentan en el cribado y confirmación de la detección de anticuerpos frente al VIH son similares a los de otras pruebas de diagnóstico serológico aunque, en este caso, adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia clínica de la infección.

Es importante conocer la evolución serológica de la infección y disponer tanto de protocolos diagnósticos, como de experiencia con ellos. Así, una practica infrecuente en la mayoría de los hospitales, y sin embargo imprescindible, es el hecho de acompañar las solicitudes de diagnóstico de una anamnesis detallada enfocada a determinar no sólo los factores de riesgo de transmisión sino también las posibles causas que condicionan los resultados, tanto falsos positivos como falsos negativos. Al mismo tiempo, debe mantenerse una actitud vigilante respecto a los resultados obtenidos mediante las distintas técnicas diagnósticas.

El primer peldaño para la ejecución correcta del diagnostico de la infección por el VIH son las condiciones y precauciones observadas de forma habitual en la obtención de la muestra. Algunos hospitales realizan la extracción de sangre en el mismo laboratorio disponiendo para ello personal entrenado; otros confían dicha tarea a equipos de extracción comunes, y en casi todos los hospitales se recibe un número importante de muestras que han sido obtenidas en lugares en los que el laboratorio diagnóstico carece de capacidad de supervisar los métodos y pautas de extracción, conservación o tratamiento previo de los sueros. La relación médico-enfermo está basada en la confianza mutua y esta peculiaridad se extiende al resto del personal sanitario; ello hace que, en algunos puntos de extracción, no se verifique de forma fehaciente la identidad de la persona que acude a realizarse el análisis. Este proceder, cuando se refiere a la prueba diagnóstica de VIH, basada en el consentimiento informado por parte del paciente, tiene gran trascendencia para evitar lo que denominamos errores en la extracción e identificación de sueros y pacientes. A este respecto, cabe señalar la importancia de una correcta y cuidadosa identificación de los pacientes y su correspondiente suero.

Desde el punto de vista serológico, en la infección por el VIH ocurren cambios en la dinámica de producción de anticuerpos desde el momento de la seroconversión. El periodo ventana de dos a cuatro semanas de duración se caracteriza por la ausencia de anticuerpos y la presencia de antígeno p24, proteína mayoritaria del core del VIH y ARN vírico. En estadios finales de la infección desaparecen los anticuerpos frente a algunas de las proteínas estructurales internas del virus (p24, p17, p55, etc.) y en algunos individuos se ha comunicado la ausencia de criterios diagnósticos de positividad por WB en los meses finales de la enfermedad, como consecuencia del intenso deterioro inmunitario.

5.2FalsospositivosenladeterminacióndeanticuerposVIH

En el laboratorio de virología tienden a preocupar más los resultados falsos positivos, tanto en las pruebas de cribado como en las de confirmación (menos frecuente), sobre todo cuando éstos se producen en personas sin ningún factor de riesgo como ocurre generalmente. Las causas de falsos positivos son variadas (Tabla 1) y dependen básicamente de dos elementos, la técnica (antígenos y principio técnico empleado) y las condiciones derivadas del paciente.


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El número de peticiones analíticas para la detección de anticuerpos frente al VIH ha experimentado un importante aumento en la mayoría de los hospitales o laboratorios; este aumento se ha acompañado de un descenso en el porcentaje de resultados positivos. Las causas de ambos fenómenos son variadas y entre las mismas podemos señalar el aumento de la sensibilidad hacia la infección VIH por parte de los profesionales sanitarios, la existencia de protocolos específicos de detección de anticuerpos VIH (enfermos renales, hemodializados, accidentes con riesgos de exposición), su inclusión en los protocolos de embarazo e incluso en las determinaciones analíticas preoperatorias quirúrgicas. En este contexto de incremento en la demanda y descenso de los porcentajes de positividad se eleva la posibilidad de resultados falsos positivos y, con ellos, surgen situaciones de difícil manejo clínico que obligan a una diversificación en las estrategias diagnósticas y en los métodos de cribado.

La evolución de las técnicas y antígenos utilizados ha reducido la aparición de falsos positivos que en las primeras pruebas podía llegar en algunas situaciones particulares hasta el 5% y que en la actualidad es inferior al 1%. A pesar de ello hay causas de falsos positivos relativas a la extracción, conservación y procesamiento del suero que pueden minimizarse manteniendo determinadas precauciones en la recogida de los sueros por ejemplo evitar mantenerlos más de 24 h a temperatura ambiente. La utilización de tubos estériles reduce al mínimo las contaminaciones microbianas, así como la conservación a +4 ºC no más allá de 72 h. En el caso de períodos de conservación más prolongados es aconsejable utilizar temperaturas de –20 ºC y –70 ºC, sobre todo si se prevé la necesidad de detectar antígeno p24 u otros componentes estructurales del VIH, ya que se desnaturalizan gradual y paulatinamente a temperaturas superiores a –70 ºC.

Entre las causas debidas a condiciones del paciente se indican repetidamente en la literatura las reactividades por autoanticuerpos; a este respecto cabe señalar la presencia en la envoltura del VIH de antígenos del sistema HLA procedentes de la célula huésped que explican en parte las falsas reactividades observadas en sueros de individuos trasplantados, multitransfundidos y otros con enfermedades autoinmunes. Por último existen otras condiciones que se han señalado como causa de falsas positividades listadas en la Tabla 1; la peculiaridad y complejidad de las mismas ilustran sobre la necesidad de realizar una anamnesis para identificar la existencia de esas condiciones ante un caso de falsa positividad en la determinación de anticuerpos frente al VIH.


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Tabla 1. Causas de falsos positivos en pruebas séricas de detección de anticuerpos frente al VIH

En el momento actual de la demanda analítica de VIH pueden producirse situaciones clínicas que den lugar a la necesidad de seguimiento serológico del paciente, al menos durante dos o tres semanas y a la utilización de otros marcadores serológicos de infección VIH (antígeno y anticuerpos anti-p24) ante resultados positivos débiles. Aunque se disponga de técnicas sensibles de biología molecular (PCR) será necesario confirmar el status de infección de un paciente mediante WB u otras pruebas serológicas de confirmación. Una práctica recomendable que se sigue en pocos laboratorios es la repetición de la detección de anticuerpos en otro suero del mismo paciente recogido en distinto momento temporal. A veces los falsos positivos son temporales o pueden obedecer a la ingestión de determinadas sustancias.

Durante la primoinfección por el VIH se suceden cambios en la producción de anticuerpos que condicionan los resultados de las pruebas diagnósticas. Este período se asocia con resultados falsos negativos, como ya se ha apuntado antes anterioridad, pero también con positivos débiles o reactividades próximas al umbral, que requieren seguimiento y confirmación.

Relativas al suero Relativas a autoanticuerpos

Relativas a otras condiciones

Congelación y descongelación repetida

Almacenamiento a temperatura subóptima

Aspecto lipídico o turbio del suero

Contaminación microbiana

Sueros tratados con calor (> 60 ºC)

Errores de extracción o identificación

Personas con anticuerpos anti-HLA-DR4, DQw3

Enfermedades reumatoideas Polimiositis

Lupus eritematoso Multitrasfundidos Trasplantados

renales Multíparas

Hemodializados, fracaso renal crónico

Síndrome de Stevens-Johnson Administración previa de

inmunoglobulinas Sueros postvacunales (gripe,

hepatitis B) Infecciones agudas por virus

ADN Enfermedad hepática alcohólica

grave Cirrosis primaria biliar,

colangitis esclerosante Pacientes con parasitosis

(sanguíneas o tisulares) Pacientes con discrasias

sanguíneas congénitas Usuarios de drogas por vía

parenteral


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5.2.1Falsospositivosconlaspruebasdeconfirmación

Los criterios de confirmación están basados en la experiencia y conocimientos de los expertos pero no son infalibles. El laboratorio deberá evaluar el criterio de positividad empleado para el Western-Blot (WB) (si es la técnica que se utiliza para confirmar) ya que algunos de los criterios recogidos son menos restrictivos que otros y pueden propiciar falsas confirmaciones. En nuestra experiencia el criterio propuesto por la OMS es el que se adapta mejor a la realidad hospitalaria y las pruebas LIA que utilizan dicho criterio son las que dan menos errores en la confirmación.

Los resultados indeterminados con el WB son la mayor fuente de ansiedad en los pacientes y desconcierto en los responsables del diagnóstico. Las causas de reactividades anormales en WB son muy variadas y aún no están totalmente esclarecidas. Se han descrito WB indeterminados en personas con factor reumatoide en suero, lupus eritematoso, hiperbilirrubinemias, infección por otros retrovirus, parasitosis y por otras causas. Si tenemos en cuenta que en la cubierta del VIH están presentes antígenos HLA podemos entender que hasta el 30% de los individuos multitransfundidos presenten reactividades en la prueba WB y se han descrito falsos positivos por dicha técnica. La conducta a seguir irá encaminada siempre a limitar la ansiedad en el paciente sin perder de vista la posibilidad de descartar una seroconversión u otra infección por otros retrovirus, alertando al clínico sobre dicha eventualidad.

Con el fin de reducir al mínimo los resultados indeterminados se han desarrollado las técnicas LIA, inmunoblots con péptidos recombinantes. La principal ventaja de esta técnica es la lectura más estructurada que puede hacerse mediante densitometría en algunos casos, con lo cual se obvia la subjetividad del WB. Su desventaja es que, al no poseer el LIA trazas de impurezas celulares y de otras proteínas que acompañan a los extractos purificados de VIH del WB, se pierde la posibilidad de observar bandas de reactividad que pudieran explicar reacciones aparecidas en las pruebas de cribado.

Tabla 2. Causas de reacciones indeterminadas en las pruebas WB.

Una glucoproteina aislada (gp160, gp120 o gp41)

Posible causa Inicio de la seroconversión Infección por otros tipos de VIH Hijos de madres infectadas Seguimiento En adultos: repetir WB en otro suero 7 d más tarde En niños: PCR y seguimiento Descartar VIH-2 u otros tipos VIH según procedencia geográfica

p24 aisladaa

Posible causa Frecuente en indeterminados de embarazadas Multitrasfundidos Pacientes africanos Seguimiento Descartar VIH-2 u otros tipos de VIH Descartar otros retrovirus (HTLV-I/II)


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p17 aislada

Causa desconocida No es necesario el seguimiento

Otras bandas del core aisladas

Posible causa Inespecificidades muy variadas Seguimiento Anamnesis para posibles factores de WB indeterminado Anamnesis para posibles factores de riesgo. Seguimiento a los 7-15 días

Más de una banda del core o bandas no víricas

Posible causa Multitransfundidos Enfermedades autoinmunes Seguimiento Anamnesis para posibles factores de riesgo Seguimiento hasta 3-6 meses para ver evolución

Puede persistir años en pacientes seronegativos VIH.

En nuestra experiencia el empleo de dos técnicas de cribado de anticuerpos, una de cuarta generación y otra de tercera basada en otro principio técnico, permiten descartar razonablemente un falso positivo. Si a estas pruebas añadimos la realización de un WB se puede eliminar la posibilidad de falsos positivos casi en su totalidad. A lo largo de más de tres años de uso de una prueba de cuarta generación, los falsos positivos pueden llegar a suponer entre un 1 y 1,5% del total de las solicitudes. Sin embargo, en las condiciones actuales de los laboratorios españoles el porcentaje respecto a las muestras positivas puede alcanzar cifras cercanas al 10% .Como ya se ha comentado, este hecho se debe al incremento de la demanda diagnóstica y a un descenso del número de muestras positivas. En este contexto, un falso positivo genera muchos más problemas que hace unos años, pues obliga a realizar confirmaciones con una mayor frecuencia, o a la cuantificación de la antigenemia p24, pruebas que habían sido abandonadas o sustituidas por otras como la PCR.

5.3FalsosnegativosenladeterminacióndeanticuerposVIH

Es necesario alertar sobre la posibilidad de falsos negativos en el diagnóstico y determinación de anticuerpos anti-VIH. La frecuencia de falsos negativos es menor que la de falsos positivos y ello es debido al principio, generalmente admitido, por el que los resultados negativos no son reconfirmados si no existe una indicación clínica precisa. Las causas de negatividad en esta determinación son también variadas (Tabla 3). Los falsos negativos pueden constituir sólo una rareza o excepción entre los infectados por el VIH y existen pacientes infectados por este virus, pero seronegativos, debido a causas orgánicas derivadas de una respuesta aberrante o anormal a la infección. En la actualidad, la evolución técnica de las pruebas diagnósticas ha reducido considerablemente la


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probabilidad de falsos negativos en este diagnóstico. Así, los métodos comerciales modernos permiten hacer frente a los problemas de detección planteados por la aparición de infecciones por subtipos o grupos marginales del VIH que producían una respuesta de anticuerpos subóptima. A pesar de las mejoras evidentes, no debe minusvalorarse esta posibilidad, especialmente en los laboratorios que trabajen o reciban muestras de pacientes africanos, de individuos con permanencia prolongada en este continente o de comunidades de inmigrantes.

Determinadas circunstancias inherentes a la evolución serológica de la infección pueden condicionar la aparición de resultados erróneos. Este es el caso de los estadios iniciales y finales de la infección. En estos últimos, pueden desaparecer los anticuerpos contra algunas de las proteínas estructurales internas del virus (p24, p17, p55, etc.). En algunos individuos se ha comunicado la ausencia de criterios diagnósticos de positividad mediante Western-Blot (WB) en los meses finales de la enfermedad, como consecuencia del intenso deterioro inmunitario. En el otro extremo, tras la primoinfección, se sucede un lapso de tiempo conocido como periodo ventana de dos a cuatro semanas de duración, caracterizado serológicamente por la ausencia de anticuerpos y la presencia de antígeno p24, proteína mayoritaria del core del VIH. Es necesario desarrollar protocolos que permitan el diagnostico en el momento de la infección aguda, ya que este periodo se relaciona con la máxima infectividad y, además, la actitud terapéutica va a ser clave en la evolución de la enfermedad. Es muy apropiado la adopción de técnicas EIA/ELFA para detección simultánea de anticuerpos y antígeno p24 cuando se trabaje en situaciones clínicas con una alta probabilidad de detectar seroconversiones (clínicas de desintoxicación, centros de metadona), o en aquellos casos en los que exista riesgo de transfundir o donar un órgano de un paciente que pueda encontrarse en este período. Por otro lado, este tipo de técnicas permiten el diagnóstico de la infección con alrededor de una semana a semana y media de adelanto respecto a las que sólo detectan anticuerpos.

Tabla 3. Causas de falsos negativos en la detección de anticuerpos anti-VIH.

- Fallos en el principio técnico - Fallos en el proceso de fabricación del equipo diagnóstico - Infección por tipos de VIH no detectables - Inmunosupresión - Periodo "ventana" - Respuestas anómalas ante la infección VIH - Terapia inmunosupresora prolongada - Trasplante de médula ósea - Disfunciones de linfocitos B - Plasmaféresis, exanguinotransfusión - Neoplasias - Errores de extracción o identificación


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Algunas de estas situaciones provocan la alarma cuando el objetivo perseguido en la determinación de anticuerpos frente al VIH es la seguridad biológica (bancos de sangre, hemoderivados, donaciones). Por ello la adopción de técnicas de EIA/ELFA de cuarta generación debe utilizarse para minimizar al máximo el periodo ventana; por otra parte, aunque el valor predictivo negativo sea elevado, se debe insistir en descartar el diagnóstico de infección por el VIH mediante pruebas complementarias cuando la anamnesis revele factores de riesgo, síntomas u otros datos de laboratorio o indicaciones clínicas sugestivas de infección por el VIH. El algoritmo de decisiones propuesto para la serología VIH (Figura 1) pretende tener en cuenta las diferentes situaciones y contexto clínico en los que se produce generalmente la demanda de una prueba de detección de anticuerpos frente al VIH y las consecuencias que los resultados y el informe de la misma deben tener en la manera de proceder.

El cribado de anticuerpos frente al VIH desborda en el momento actual por su trascendencia la mera oferta diagnóstica. Las aplicaciones hospitalarias de esta prueba han hecho que en la mayoría de los hospitales las peticiones de esta analítica hayan crecido de forma exponencial en los últimos años. Como consecuencia del aumento de peticiones y del descenso consiguiente de los porcentajes de positividad se producen resultados falsos positivos en situaciones de difícil manejo clínico (candidatos a trasplantes, pacientes hemodializados, mujeres embarazadas) que obligan a una diversificación de las estrategias diagnósticas y de los métodos de cribado. En este contexto es aconsejable disponer al menos de dos técnicas de cribado de anticuerpos frente al VIH que empleen un principio técnico distinto de detección (por ejemplo un EIA o ELFA y una prueba rápida de inmunocromatografía) y utilizar cuando ello sea posible un método de confirmación con muestras del mismo paciente tomadas en momentos diferentes.

La colaboración entre laboratorios de un mismo hospital que realicen pruebas de detección de anticuerpos frente al VIH con distintos objetivos (por ejemplo, Virología y Hematología) o de una misma área sanitaria puede minimizar el coste y facilitar la implantación de estas recomendaciones, coordinando las técnicas que cada laboratorio asume y organizándose en protocolos de actuación concretos.En el momento actual pueden producirse situaciones clínicas que den lugar a la necesidad de seguimiento serológico del paciente al menos durante dos o tres semanas y a la utilización de otros marcadores serológicos de infección por el VIH (antígeno p24, detección de ARN vírico). A pesar de la sensibilidad de estas pruebas, el diagnóstico definitivo deberá confirmarse con el suero cuando tenga lugar la seroconversión; por eso es altamente recomendable la adopción de pruebas EIA/ELFA para detección simultánea de anticuerpos y antígeno p24 del VIH cuando se trabaje en situaciones clínicas que prevean un alto riesgo de detectar seroconversiones (clínicas de desintoxicación, centros de metadona, etc.) o en aquellos casos en los que exista riesgo de donar un órgano de un paciente en el período de seroconversión. Finalmente, cuando el objetivo de las pruebas sea el diagnóstico, se debe tener en cuenta que los pacientes rara vez entienden, como lo hacen los profesionales, expresiones tales como: "falso positivo", "indeterminado", "positivo dudoso", etc. y en consecuencia, se debe extremar el cuidado al emitir los informes del laboratorio, estableciendo informes claros. Del conjunto de pruebas realizadas deberá resultar un diagnóstico claro y concluyente o bien la formulación de recomendaciones precisas para el seguimiento y el diagnóstico definitivo


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5.4AlgoritmodedecisiónenlaserologíadelVIHFigura 1. Algoritmo de decisión en serología del VIH

5.5Casopráctico

Hombre de 26 años, heterosexual, casado, laboralmente activo, que consultó por cuadro de diarrea, pérdida de peso y fiebre subjetiva de cinco meses de evolución. Al interrogatorio se encuentra como factor de riesgo para la infección por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) promiscuidad con un número aproximado de 15 parejas sexuales, asociado al uso ocasional de preservativo. Además, hace cuatro años recibió una transfusión posterior a una herida por arma de fuego. Examen físico sin hallazgos relevantes. Teniendo en cuenta los antecedentes personales, se ordenó una prueba presuntiva para la infección por el VIH. La prueba utilizada, un ensayo inmunoenzimático (EIA), detecta anticuerpos totales y/o antígeno p24, y fue positiva el 19 de septiembre de 2002. Se realizó la prueba confirmatoria Western Blot cuyo resultado fue indeterminado.


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5.5.1Preguntas:

1- Como TEL del laboratorio de Virología ¿Qué haría si se encuentra con este resultado?

2- ¿Cuales son las principales causas de resultados indeterminados en el WB?

3- Explique brevemente el algoritmo diagnóstico en la serología de VIH.

5.6ResumendelaUnidadDidácticaV

En el laboratorio de virología tienden a preocupar más los resultados falsos positivos, tanto en las pruebas de cribado como en las de confirmación (menos frecuente), sobre todo cuando éstos se producen en personas sin ningún factor de riesgo como ocurre generalmente. Las causas de falsos positivos son variadas y dependen básicamente de dos elementos, la técnica (antígenos y principio técnico empleado) y las condiciones derivadas del paciente.

Hay causas de falsos positivos relativos a la extracción, conservación y procesamiento del suero, otros están relacionados con las condiciones del paciente, sobre todo a las reactividades por autoanticuerpos.

En el momento actual de la demanda analítica de VIH pueden producirse situaciones clínicas que den lugar a la necesidad de seguimiento serológico del paciente, al menos durante dos o tres semanas y a la utilización de otros marcadores serológicos de infección VIH (antígeno y anticuerpos anti-p24) ante resultados positivos débiles. Aunque se disponga de técnicas sensibles de biología molecular (PCR) será necesario confirmar el status de infección de un paciente mediante WB u otras pruebas serológicas de confirmación.

También es necesario alertar sobre la posibilidad de falsos negativos en el diagnóstico y determinación de anticuerpos anti-VIH. Este es el caso de los estadios iniciales y fianales de la infección. En estos últimos, pueden desaparecer los anticuerpos contra algunas de las proteínas estructurales internas del virus (p24, p17, p55, etc). En el otro extremo, tras la primoinfección, se sucede un lapso de tiempo conocido como periodo ventana de dos a cuatro semanas de duración caracterizado serologicamente por la ausencia de anticuerpos y la presencia de antígeno p24, proteína mayoritaria del core del VIH.

Es muy importante trabajar con un algoritmo de decisión en la serología del VIH para que nuestros resultados sean emitidos con la máxima fiabilidad para el paciente.

5.7Glosario

Sensibilidad de una prueba: es la proporción de individuos realmente enfermos que dan la prueba positiva.

Especificidad: es la proporción de individuos realmente sanos que dan la prueba negativa.


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Valor predictivo positivo (VPP): es la proporción de enfermos que dan la prueba positiva (verdaderos positivos) con relación a la cantidad total de los que dan la prueba positiva (verdaderos + falsos positivos).

Valor predictivo negativo (VPN): es la proporción de individuos sanos que dan la prueba negativa (verdaderos negativos) con relación al total de los que dan la prueba negativa (verdaderos + falsos negativos).

Falsos positivos: proporción de individuos sanos que dan la prueba positiva.

Falsos negativos: proporción de individuos enfermos que dan la prueba negativa.

Pruebas de screening: pruebas de detección o cribado

Cut-off: punto de corte de una determinada prueba diagnóstica.

UNIDADDIDÁCTICAVIDIAGNOSTICOMOLECULARDELVIH


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6.1Introducción:LaBiologíaMoleculardelVIHyotrosmétodosdediagnósticodirecto

Las pruebas de diagnóstico directo (cultivo viral, antigenemia p24 y detección de ácidos nucleicos) de la infección VIH proporcionan mayor certeza que las pruebas indirectas.

6.1.1Cultivoviral

El aislamiento del VIH sigue siendo hoy en día una técnica de referencia, aunque su empleo quede restringido a laboratorios bien equipados.

Supone el cultivo del virus a partir de muestras clínicas que contengan virus libres o células infectadas. En la mayoría de los casos se utilizan linfocitos de sangre periférica separados mediante centrifugación en gradiente de Ficoll. Los linfocitos del paciente se cultivan a 37ºC en atmósfera de 5% de CO² en medios ordinarios (RPMI 1640 y 20% de suero de ternera fetal) adicionados de interleucina-2 junto con linfocitos de donante sano previamente estimulados con un mitógeno (fitohemaglutinina). Semanalmente se añaden linfocitos estimulados de donante, manteniendo estas condiciones de cultivo durante 4 semanas. La detección del crecimiento vírico se puede realizar midiendo la actividad retrotranscriptasa en los sobrenadantes, por detección de antígenos específicos del virus (p24 principalmente) o bien mediante la demostración del efecto citopático en forma de sincitios o células gigantes formadas por la fusión de células infectadas; que tienen glucoproteína de la envoltura del VIH en su superficie; con otras células contiguas.

A pesar de que las muestras más comunes para aislamiento son linfocitos de sangre periférica y líquido cefalorraquídeo (LCR), el VIH ha podido aislarse de gran número de humores orgánicos entre los que se incluyen el plasma, suero, secreciones cervicales, semen, saliva, leche materna, lágrimas, orina, líquido alveolar, órganos de trasplante y tejido cerebral.

El aislamiento es la técnica de referencia final para cualquier otra técnica y es obligado cuando se pretende establecer el fenotipo de VIH (cepas inductoras de sincitio o no; IS/NIS), la actividad in vitro de antivíricos y puede servir de referencia de la cantidad de virus presente en la muestra del paciente. Sin embargo, el aislamiento de VIH presenta, como principal inconveniente, la necesidad de laboratorios con complejos sistemas de contención biológica (nivel P3), pero además, podría plantear la dificultad de seleccionar tan sólo aquellas, con mayor capacidad para su crecimiento in vitro, disminuyendo, por tanto, su posible importancia como marcador de eficacia terapéutica o como técnica de monitorización de la aparición de variantes del virus resistentes a los antirretrovirales.

6.1.2DeteccióndeantígenoP24

La detección del antígeno del VIH-1, usualmente la proteína p24, es un marcador directo de la presencia del virus en el organismo a diferencia de las pruebas de detección de anticuerpos.

Aunque teóricamente el antígeno debería detectarse en cualquier fase de la infección la presencia de anticuerpos anti-p24 con los que forma inmunocomplejos suele enmascarlo, por lo que su utilidad ha quedado reducida a unas cuantas situaciones entre


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las que destaca la detección de la infección antes de la seroconversión. Con los datos disponibles parece que su detección no ofrece una ventaja sustancial para minimizar el periodo ventana de la fase aguda de la infección, antes de la seroconversión y la aparición de anticuerpos, y aunque la proteína p24 es el primer marcador serológico que se positiviza después de la infección posiblemente lo hace durante un periodo breve, que puede ser mayor en los sujetos cuyas manifestaciones clínicas de primoinfección obedecen a cuadros más graves reflejados en sus niveles altos de viremia y antigenemia.

Por lo tanto en el diagnóstico de una posible infección VIH tras una exposición, una determinación con un resultado negativo para el antígeno del VIH-1 no excluye la posibilidad de estar infectado y puede resultar más fiable la detección de anticuerpos dentro de los seis meses que siguen a la exposición.

Disponibles diferentes pruebas comerciales desde 1.987, en la actualidad el empleo de la carga viral como marcador de progresión y control de los tratamientos ha relegado su utilización al diagnóstico precoz de la infección VIH y en algunos casos al reconocimiento de la replicación viral en cultivos celulares; prácticamente no se utiliza como monitorización de la respuesta a los antirretrovirales ni para establecer el valor predictivo de la evolución clínica de la infección en los pacientes asintomáticos. Igualmente su utilidad es dudosa para el reconocimiento de los sujetos seropositivos con alta infectividad y en el diagnóstico de la infección vertical.

Los métodos de detección del antígeno p24 del VIH-1 son fundamentalmente técnicas ELISA con anticuerpos específicos fijados en su fase sólida y con sensibilidades diferentes. En algunas pruebas comerciales se realiza una disociación (de carácter ácido o básico) que busca la liberalización del antígeno p24 de los inmunocomplejos formados con su anticuerpo y que ofrece buenos resultados, fundamentalmente con las muestras de pacientes asintomáticos con altos niveles de anti p24.

Entre los factores que se ha visto que pueden condicionar la detección de antígeno p24 se encuentran la sensibilidad de las diferentes pruebas comerciales, el estadio evolutivo de la infección, así como la presencia de infecciones oportunistas que indirectamente condicionan una mayor replicación viral, y la administración de antirretrovirales. No se sabe por qué pero en sujetos de raza negra se presenta antigenemia con menor frecuencia que en los de raza blanca. En general solo es posible detectar antígeno p24 entre el 10-25% de los pacientes seropositivos asintomáticos y en el 70% de los pacientes con SIDA. En la primoinfección no se detecta en más del 25% de los casos.

6.1.3Biologíamolecular(PCR)

Los avances producidos en el campo de la biología molecular se han aplicado al desarrollo de métodos que cuantifican VIH en el plasma de pacientes infectados.

La carga viral en plasma es el número de copias de ARN del VIH. Cada virión contiene dos copias de ARN viral, por lo que se conoce el número de viriones circulantes en plasma dividiendo el número de copias de ARN viral por dos. Los resultados de la carga viral pueden expresarse de diferentes formas, de tal manera que el aumento o el descenso de la carga viral se informa bien en copias por mililitro, en logaritmo en base 10, en cambios en el porcentaje o bien en el número de veces que se incrementa o reduce la


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carga viral. El método bDNA de Chiron presenta los resultados en Eq/ml, donde un equivalente equivale a una copia de ARN vírico.

Figura 1: Esquema de una PCR

6.1.4Basesmolecularesdelasdistintastécnicasdecargaviral

Clásicamente se utilizan tres métodos para medir la carga viral.

6.1.4.1MétododelARNramificado(bDNA)

Esta técnica se basa en una serie de hibridaciones tipo sándwich. El primer paso de la técnica consiste en concentrar los viriones a partir de 1ml de plasma centrifugándolo a 23500g durante 1 hora. El precipitado viral se resuspende en un tampón que contiene proteinasa K, sulfato de litio y oligonucleótidos complementarios al gen pol del VIH-1 y se reincuba a 53ºC durante 20 minutos. A continuación la resuspensión se centrifuga a 23500g durante 15 minutos transfiriéndose el producto a una microplaca de 96 pocillos que contiene las sondas de captura. El complejo muestra-sonda se une a una segunda sonda de captura durante una incubación de 24 horas. Seguidamente, a la muestra ya inmovilizada se le une un gran número de sondas iguales marcadas con fosfatasa alcalina e incubadas posteriormente con un sustrato quimioluminiscente (dioxetano). Por último, la luz que emite se mide con un luminómetro y los resultados se comparan con los datos obtenidos con los controles. Esta muestra requiere un volumen de muestra mayor (2ml) que la RT-PCR.


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6.1.4.2AmplicorHIV‐1Monitor(retrotranscripciónyamplificaciónoRT‐PCR).

Es un método cuantitativo que combina la retrotranscripción y la amplificación de un fragmento concreto de un gen viral (gag) utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La muestra (suero o plasma) se procesa utilizando altas concentraciones de isotiocianato de guanidinio, permitiendo estos reactivos liberar al ARN del VIH-1.

En la PCR se utiliza como enzima la rTh-ADN polimerasa de Thermus thermophilus, que se caracteriza por tener simultáneamente actividad retrotranscriptasa y polimerasa. La utilización de rTh permite la incorporación de Uracil-N-glucosilasa evitando asi la contaminación por ADN amplificado. Con el empleo de cebadores biotinilados (SK431 y SK462) se amplifica por PCR una secuencia de 142 pares de bases del gen gag del VIH-1. El producto final de la PCR se añade a una microplaca de 96 pocillos en que los amplicones biotinilados son capturados por sondas complementarias a la muestra que deben estudiarse o bien al control estándar interno. Un conjugado de avidita proporciona el color que se valorará por un lector de densidades ópticas (DO) en los pocillos. La relación entre las densidades ópticas del control estándar interno y la muestra se utiliza para calcular el número de copias de ARN que contiene la muestra. El ensayo permite detectar niveles de ARN en la mayoría de individuos incluyendo pacientes asintomáticos.

6.1.4.3Replicaciónsecuencialdeácidosnucleicos(NASBA)

La amplificación exponencial de determinados fragmentos de ácidos nucleicos puede realizarse mediante la utilización de tres enzimas: retrotranscriptasa, ARNasa y una polimerasa de ARN dependiente de ADN. Esta estrategia mimetiza el ciclo real de replicación viral. El resultado final de la reacción da lugar a una acumulación de copias de ADN y ARN que se forman a partir de la muestra a analizar (muestra problema). El ensayo comienza con el aislamiento del ácido ribonucleico mediante lisis y unión a partículas de sílica, seguido por una amplificación isotérmica del ARN. A continuación, la reacción enzimática se inicia con la hibridación de uno de los cebadores, que contiene un promotor T7, a la secuencia diana de la muestra problema y continua con la elongación del cebador mediante la actividad enzimática de la retrotranscriptasa. La cadena de ARN en la molécula híbrida de ADN-ARN se degrada por la actividad de la ARNasa H. Acto seguido se forma una segunda cadena de ADN mediante la actividad de la polimerasa del ADN dependiente de ADN de la retrotranscriptasa. La molécula de ADN de doble cadena incluye una secuencia promotor T7 ARN polimerasa. La polimerasa T7 del ARN es capaz de producir entre 100 y 1000 copias de ARN a partir de una moléculas de ADN de doble cadena. Cada molécula de ARN sintetizada sirve como molde para la síntesis de una copia de ADN y subsiguiente síntesis de ARN en un segundo ciclo de multiplicación. La posibilidad de cuantificar el número de copias de ARN se debe a la introducción de tres niveles de calibradores y a un sistema de detección electroquimioluminiscente.

6.2Detección de la Viremia Plasmática del VIH (Carga VíricaPlasmática–CVP–)

6.2.1Técnicasdisponibles

Todas las técnicas para la determinación de CVP del VIH-1 están aprobadas para su uso en la Unión Europea (marcado CE) y permiten la detección hasta un nivel de 50 copias


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de VIH por mililitro de plasma utilizando entre 500 µL y 1 mL de plasma (Tabla 1). Las diferencias técnicas fundamentales radican en los formatos, tiempos y capacidad de procesamiento. Las nuevas técnicas de RT-PCR en tiempo real basadas en sondas fluorescentes son en general más rápidas y permiten rangos dinámicos más amplios (40-107 copias/mL). La reciente introducción de la extracción automática de ácidos nucleicos supone un considerable ahorro de trabajo manual y reduce las posibilidades de variabilidad relacionadas con una de las fases más críticas del procedimiento. Todas las técnicas detectan y cuantifican el mayoritario subtipo B y algunos otros subtipos circulantes (A, C, D, F, G) aunque se han comunicado diferencias entre técnicas para algunos de estos subtipos no-B. El procedimiento de Abbott es el que tiene el rango más amplio de detección de subtipos y es el único que cuantifica el grupo O. Ninguna de las técnicas licenciadas detecta el VIH-2.

Tabla 1: Técnicas disponibles más frecuentes para la detección de la carga vírica plasmática

Nombre (Compañía) Técnica Comentarios

Monitor (Roche) RT-PCR Extracción automática disponible Subtipos A-G

Taqman (Roche) RT-PCR tiempo real

Extracción automática disponible Subtipos A-G

Abbott Real Time (Abbott) RT-PCR tiempo real

Extracción automática disponible Subtipos A-K y grupo O

Versant (Bayer) bADN Subtipos A-G

NucliSens (BioMerieux) NASBA Extracción automática disponible Subtipos A-G

Figura 2: El analizador COBAS AMPLICOR® fue el primer sistema de sobremesa para automatizar los pasos de amplificación y detección de los ensayos basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en un único aparato. Combina cinco aparatos en uno (termociclador, pipeteador automático, incubador, lavador y lector). En estos momentos existen mas de 4000 Analizadores COBAS AMPLICOR® en centros clínicos por todo el mundo.


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Figura 3: Analizador COBAS Taiman (PCR a tiempo real).

6.2.2Indicaciones

6.2.2.1Monitorizacióndeltratamientoantirretroviral(ARV)

Es el uso más habitual que se le da a la determinación de la CVP. Una vez instaurado el tratamiento antirretroviral la CVP disminuye rápidamente en las primeras semanas y algo más lentamente a partir del primer mes de tratamiento. Se recomienda una determinación basal y al menos una evaluación en las semanas 4, 12 y 24 de tratamiento, para continuar posteriormente el seguimiento cada 3-4 meses. En general se espera una reducción de un log10 en la primera semana, 2 log10 en la semana 4 y dependiendo del nivel basal la CVP debería ser indetectable (<50 copias/mL) entre las 16-24 semanas del inicio de tratamiento. Los cambios mayores de 0,3 log10 entre dos determinaciones (cambios mayores del doble o la mitad) se consideran como significativos.

6.2.2.2Prediccióndeprogresiónenpacientescrónicamenteinfectadoseiniciodeltratamiento

La recomendación actual para el inicio del tratamiento ARV se establece según la clínica y el nivel de CD4. Se inicia tratamiento en todos los pacientes sintomáticos y en aquellos con CD4 < 200/µL; en pacientes con CD4 entre 200 y 350/µL se recomienda en general iniciar tratamiento aunque en aquellos con cifras más cercanas a 350 y CVP bajas (<20.000 cp/mL) podría diferirse la iniciación, así mismo por encima de 350 CD4/µL podría considerarse el inicio de tratamiento ARV en aquellos pacientes con CD4 más bajos y CVP >100.000 cp/mL por su riesgo de progresión más rápida.

6.2.2.3.Valoracióndelriesgodetransmisión

La CVP se correlaciona con riesgo de transmisión del VIH por cualquiera de las vías por las que se transmite el virus. De esta manera, cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisión. Aunque no puede excluirse completamente, la transmisión del VIH tanto por contacto sexual como por punciones accidentales con agujas, es poco probable por debajo de 1500 cp/mL y esta cifra, junto con las características de la exposición forma parte de los condicionantes que establecen diferentes pautas de profilaxis post-exposición.


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6.2.2.4.Diagnósticodeinfecciónaguda

Durante las primeras semanas de infección los anticuerpos específicos anti-VIH no son detectables por las técnicas diagnósticas rutinarias. Sin embargo la replicación del virus es muy activa en ese momento y alcanza su máximo alrededor de los 10 días post-infección, lo que a menudo coincide con la fase sintomática. Para cubrir este periodo alguna técnica de cribado combina la detección conjunta de anticuerpos y antígeno (p24) específicos. En la actualidad no existe ninguna técnica comercial disponible para detección cualitativa del VIH asociado a células (ADN provírico). Aunque formalmente las técnicas para la determinación de CVP del VIH no tienen un diseño cualitativo (positivo-negativo), dada su sensibilidad se utilizan frecuentemente para cubrir el diagnóstico de una posible infección aguda por el VIH. Si bien la sensibilidad de la técnica para este propósito es excelente, conviene tener en cuenta la eventualidad de resultados falsamente positivos. Generalmente la viremia durante las primeras semanas de la infección es muy elevada, en general >100.000 cp/mL, por lo que deben interpretarse con muchas reservas los resultados con valores bajos (<10.000 cp/mL).

6.3Obtenciónymanejodelasmuestras

La muestra necesaria para la determinación de la CVP es un tubo de sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) de 5-10 mL. No son aceptables los tubos con heparina, que interfiere con algunas técnicas moleculares, ni el suero porque los resultados son menos consistentes. Los tubos con EDTA son los más ampliamente recomendados y aunque el ACD es también aceptable presenta el inconveniente de contener un mayor volumen de sustancia en el tubo de tal forma que puede ser un factor de dilución en tubos solo parcialmente llenos. El plasma se separa por centrifugación a 1000-1500 g (2000-2500 rpm en las centrífugas más habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Existe un tubo especial para técnicas de biología molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la parte celular. Este tubo PPT es práctico para transportar el plasma sin manipular la muestra, sin embargo no se debe congelar porque aumenta artefactualmente el número de muestras con viremia de bajo nivel. Es importante considerar la estabilidad de la sangre total y el plasma separado para las determinaciones de CVP del VIH. En general la sangre completa se debe centrifugar y separar el plasma dentro de las primeras 4-6 horas inmediatas a la extracción. En la Tabla 2 se muestra la estabilidad del VIH-1 para la determinación de la CVP según su forma de almacenamiento.

Tabla 2: Estabilidad del VIH-1 para la determinación de la carga vírica plasmática

Sangre completa 6 horas

Plasma separado temperatura ambiente 24 horas

Plasma separado 4º C 6 días

Plasma separado -20ºC Variable (no recomendado para almacenamiento a largo plazo)

Plasma separado -80ºC Meses


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6.4CargavíricaenLCR,semenyotrosfluidosAunque la determinación de la CVP del VIH en estas muestras no esta estandarizada,

en ocasiones es necesaria su realización en el contexto de estudios de investigación o bajo petición expresa y puntual del clínico responsable.

El LCR se puede procesar por la mayoría de los procedimientos de manera similar al plasma, conviene centrifugarlo en las mismas condiciones que la sangre total para separar células inflamatorias y hematíes. El VIH es un agente con marcado neurotropismo, su presencia en LCR es frecuente y nunca se produce de manera aislada. La concentración de virus en el SNC se correlaciona solo indirectamente con daño neurológico y su determinación raramente tiene interés diagnóstico. Respecto al semen y otros fluidos es posible adaptar las técnicas para la determinación de la CVP tanto en el propio semen como en muestras cervico-vaginales e incluso tejidos. En estos casos es necesario realizar la extracción previa de ácidos nucleicos ya que la viscosidad de las muestras impide el procesamiento automático por algunos de los sistemas. Se trata igualmente de procedimientos experimentales que se realizan en estudios de investigación y la interpretación de los resultados adquiere significado únicamente para el contexto en el que se realiza.

6.5Interpretacióndelosresultados

6.5.1Resultadosyvariabilidad

En virología es tradicional utilizar escalas logarítmicas para expresar información cuantitativa tal como concentraciones de virus o potencia infectiva de inóculos. El rango dinámico en el que se produce la replicación de la mayoría de los virus se traduce en resultados que generalmente comprenden varios órdenes de magnitud por lo que las escalas logarítmicas se utilizan con frecuencia. La mayoría de las técnicas expresan los datos en escala lineal y logarítmica. La variabilidad de las técnicas para la determinación de la CVP es menor de 0,3 log10, por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor se considera significativo. La mayoría de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CPV detectable en rango muy amplio que puede llegar a más de 10 millones de copias/mL. Por el contrario los pacientes en tratamiento antirretroviral y después de las primeras 16-24 semanas, se espera que tengan una CVP menor de 50 cp/mL. Si la CVP es detectable durante el seguimiento obliga a considerar falta de adherencia al tratamiento o desarrollo de mutaciones de resistencias a los fármacos ARV.

6.5.2FactoresqueaumentanlaCVP

Aparte de la progresión natural de la infección, la CVP puede aumentar rápidamente en situaciones en las que se produce un estímulo inmunológico que aumenta la producción de partículas víricas por los linfocitos infectados. Estos episodios se han descrito en infecciones activas (tales como tuberculosis, neumonía por Pneumocystis jiroveci, etc.) y tras la administración de vacunas.

6.5.3EpisodioscortosdeaumentodelaCVP(blips)

Un 10-15% de pacientes con tratamiento ARV y buen control virológico, que mantienen CVP indetectable por periodos prolongados de tiempo, presentan


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ocasionalmente viremia detectable de bajo nivel. Estos episodios conocidos como blips, que aparecen en determinaciones aisladas y parecen limitarse sin cambios en el tratamiento, han sido motivo de intenso estudio. Los blips no parecen relacionados con falta de cumplimiento ni peor pronóstico a largo plazo. La opinión actual más amplia es que se trata de pequeñas fluctuaciones de la viremia e incluso de errores en el procesamiento de las muestras que resultan en CVP de bajo nivel. Esta consideración está apoyada por el hecho de que muchos de estos blips no son reproducibles en laboratorios diferentes. Para que un incremento no esperado de la CVP pueda ser considerado como blip debería ser inferior a 500-1.000 cp/mL y en la siguiente determinación debería producirse de nuevo la indetectabilidad.

6.5.4CVPindetectableenpacientesinfectadosperosintratamiento

Un porcentaje pequeño (5-7%) de pacientes infectados, después del pico de viremia intensa correspondiente a la infección aguda, pueden mantener la replicación del virus controlada por periodos prolongados en ausencia de tratamiento antirretroviral. En estos casos, la CVP puede ser indetectable durante meses. Esta situación, aunque poco frecuente, es normal y suele ocurrir en pacientes con diagnóstico de certeza de infección, que se encuentren asintomáticos y con cifras de linfocitos CD4 normales. En un paciente con infección por el VIH diagnosticada por ELISA, que está sintomático o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral, una CVP indetectable debe hacer sospechar una variante no detectada por la técnica generalmente frente al VIH-1 grupo O ó VIH-2; esta situación se debe resolver por técnicas serológicas específicas y por técnicas moleculares

6.5.5Viremiadetectablepordebajodelumbralde50copias/ml

En una proporción importante de pacientes con tratamiento ARV y buen control virológico que mantienen CVP < 50 cp/mL de forma estable, es posible detectar viremia de muy bajo nivel (2-40 cp/mL) utilizando modificaciones de las técnicas convencionales que consisten generalmente en concentrar por centrifugación partículas víricas a partir de mayores volúmenes de plasma (2-10 mL). La evidencia de esta viremia de bajo nivel por debajo del umbral de 50 cp/mL ha sido objeto de intenso debate. Actualmente la mayoría de los estudios sugieren que estas partículas no son producto de replicación de bajo nivel del VIH que no se suprime completamente por las drogas ARV, más bien se tiende a considerar que representan virus liberados por el reservorio celular latente bajo estímulos de activación que no son bien conocidos por el momento y por tanto no suponen, en la mayoría de los casos, una indicación de fracaso terapéutico.

6.6ResumendelaUnidadDidácticaVI

La carga viral en plasma es el número de copias de ARN del VIH.

Clásicamente se utilizan tres métodos para medir la carga viral: Método del ARN ramificado (bDNA), retrotranscripción y amplificación o RT-PCR y replicación secuencial de ácidos nucleicos (NASBA).

La monitorización del tratamiento antirretroviral (ARV) es el uso más habitual que se le da a la determinación de la CVP.


82

La muestra necesaria para la determinación de la CVP es un tubo de sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) de 5-10 mL.

Aparte de la progresión natural de la infección, la CVP puede aumentar rápidamente en situaciones en las que se produce un estímulo inmunológico que aumenta la producción de partículas víricas por los linfocitos infectados. Estos episodios se han descrito en infecciones activas (tales como tuberculosis, neumonía por Pneumocystis jiroveci, etc.) y tras la administración de vacunas.

Para que un incremento no esperado de la CVP pueda ser considerado como blip (episodio corto de aumento de la CVP) debería ser inferior a 500-1.000 cp/mL y en la siguiente determinación debería producirse de nuevo la indetectabilidad.

En una proporción importante de pacientes con tratamiento ARV y buen control virológico que mantienen CVP < 50 cp/mL de forma estable, es posible detectar viremia de muy bajo nivel (2-40 cp/mL) utilizando modificaciones de las técnicas convencionales que consisten generalmente en concentrar por centrifugación partículas víricas a partir de mayores volúmenes de plasma (2-10 mL).

6.7Glosario

PCR: siglas de reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction)

Reacción en cadena de la polimerasa: Procedimiento que genera millones de copias de un segmento corto de ADN mediante ciclos repetidos de: 1) desnaturalización del ADN, 2) acoplamiento de los cebadores (oligonucleótidos sintéticos) y 3) extensión mediante la acción de la ADN polimerasa.

PCR cuantitativa: uso de la PCR para cuantificar la cantidad de ADN o ARN de una muestra.

Quimioluminiscencia: La Quimioluminiscencia es la reacción química que produce luz. Típicamente produce una emisión de unos pocos segundos.

Mitógeno: sustancia que induce la división celular.

Amplicón: Conjunto de moléculas de ADN idénticas que resulta de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Es esencialmente un clon molecular.

Isotiocianato de guanidinio: es un agente caotrópico (favorece la disolución en agua de compuestos insolubles) que inhibe las RNasas y conserva el ARN

CVP: siglas de carga vírica plasmática.

NASBA: Nucleic Acid Sequence Based Amplification

6.8Casopractico

Se realiza una PCR para determiner la carga viral de VIH a 16 pacientes.En la realizacion de esta tecnica con los 16 pacientes tanto el control positivo como el control


83

negativo de la atecnica obtienen unos resultados correctos con los establecidos en la prueba

En 8 de las muestras el control interno de la PCR sale positivo.

Determinar la forma de proceder con estas ocho muestras y cuales son las posibles causas para que un control interno en una PCR salga positivo

UNIDADDIDÁCTICAVIITÉCNICASDEDETECCIONDERESISTENCIAS

DELVIHALOSANTIRRETROVIRALES


87

7.1DetecciónderesistenciasLas pruebas para la detección de resistencias a antirretrovirales pueden clasificarse

en dos tipos: genotípicas o fenotípicas. La pruebas de detección de resistencias genotípicas determinan las mutaciones en la secuencia primaria de nucleótidos de la transcriptasa inversa (TI) y de la proteasa (PR) y, recientemente, de la envoltura, comparándola con la secuencia de una cepa salvaje. Las pruebas de detección de resistencias fenotípicas se expresan en términos de concentración de droga necesaria para inhibir la replicación vírica en cultivo celular. Generalmente se expresa en términos de CI50, indicando la concentración de fármaco requerida para reducir al 50% la producción vírica in vitro. La interpretación de estos valores es diferente dependiendo del fármaco implicado.

7.1.1Técnicasgenotípicas

7.1.1.1Secuenciacióndeácidosnucleicos

Es el método genotípico de referencia para la determinación de la resistencia del VIH a los fármacos antirretrovirales. Se obtiene información completa de la secuencia de la región del genoma vírico amplificada previamente por PCR, empleando primers o dideoxinucleótidos marcados de forma diferente para poder distinguirlos entre sí. Para ello, el método más utilizado es el método enzimático, también llamado de síntesis abortiva o de los dideoxinucleótidos. En él se emplea una ADN-polimerasa para sintetizar cadenas complementarias de una de las hebras del ADN problema en cuatro reacciones enzimáticas diferentes. En cada una de ellas junto con el oligonucleótido usado como cebador y la mezcla de los cuatro nucleótidos (dATP + dCTP + dGTP + dTTP) hay una concentración limitante del 2´-3´dideoxinucleótido (ddNTPs), que al no tener radical hidroxilo en la posición 3´ no permite la adición de otro nucleótido parando la extensión de la cadena de ADN. La polimerización a partir del cebador ocurre en sentido 5´-3´ hasta que la incorporación de uno de los ddNTPs induce la terminación de la cadena en ese nucleótido. Debe calcularse bien tanto la cantidad de dNTP como la del ddNTP correspondiente para que puedan obtenerse todos los posibles fragmentos que terminan en un nucleótido determinado, que posteriormente se separarán mediante electroforesis. Junto con la aparición de las polimerasas termoestables, se han desarrollado también moléculas químicas que muestran fluorescencia inducida por láser y al unirse a los ddNTPs finalizadores de la reacción permiten la detección del fragmento mediante la emisión de fluorescencia a una cierta longitud de onda. Actualmente se han diseñado cuatro de estas moléculas con emisión de fluorescencia a longitudes de onda diferentes, y así unidas a cada uno de los cuatro ddNTPs, permiten realizar las cuatro reacciones de secuencia en un mismo tubo y pueden cargarse en el mismo pocillo del gel, ya que las bandas de cada nucleótido podrán reconocerse por su color de fluorescencia. Este método se denomina secuenciación unidireccional. Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y hablamos entonces de secuenciación bidireccional.

Los productos de las reacciones de secuenciación se someten a electroforesis (en gel o en capilares) y las bandas que se obtienen (cada una representando uno de los cuatro nucleótidos A, T, G o C) se leen por el secuenciador. El resultado es una secuencia de nucleótidos que, una vez editada, se traduce en una secuencia de aminoácidos. Esta secuencia de aminoácidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH (llamada cepa consenso) con el fin de determinar si existen mutaciones. Así se analizan las


88

secuencias de la transcriptasa inversa (TI) y la proteasa (PR) en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento. En la actualidad hay equipos de secuenciación asistidos por ordenador, que automatizan los pasos de electroforesis, detección y análisis de las bandas de secuenciación (patrones de picos llamados electroferogramas), y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados. Dicha automatización ha permitido:

Obtener una mayor sensibilidad de detección

Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares de bases (en el caso que nos ocupa esto es insuficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciación para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resistencia)

Menor cantidad de paradas inespecíficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde.

Análisis de los resultados más rápido y menor tiempo de procesamiento de las muestras.

Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la técnica en concreto para la detección de mutaciones de resistencia a fármacos, en éste caso frente a antirretrovirales.

Los ensayos de secuenciación comerciales más utilizados son TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Bayer NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics). El primero utiliza la secuenciación bidireccional y la electroforesis en gel; el segundo emplea el método unidireccional y la electroforesis capilar. Ambos sistemas ofrecen un software para la edición de las secuencias y un algoritmo propio de interpretación. Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes diferencias en cuanto a ambas técnicas.

Figura 1: TRUGENE HIV-I Genotyping.

También existen otros ensayos de secuenciación disponibles. Algunos de ellos (Virco GEN II, Virco; HIV-1 GenotypR PLUS, Specialty Laboratories; GeneSeq, Virologic; GenoSure, LabCorp) sólo están disponibles para su realización en los laboratorios de las casas comerciales que los ofrecen. Otros ensayos comercializados son HIV-1 Mutation Analysis, Focus Technologies; HIV ViroTYPE, Rheumatology Diagnostics Laboratory; y HIV-1 Genotype, Quest Diagnostics.


89 Figura 2: Ejemplo de informe tras realizar una técnica de genotipado para la detección de genes del resistencia a fármacos antirretrovirales.


90

7.1.1.2Otrosensayosgenotípicos

Como consecuencia de que sólo una parte minoritaria de los codones que se amplifican por PCR son posiciones de resistencia y que la gran mayoría son polimorfismos, se han diseñado una serie de alternativas a la secuenciación en las que se detectan codones específicos, aunque ninguna de ellas aporta grandes ventajas con respecto a esta. Las que más se han utilizado son: VERSANT® HIV-1 RT Resistance Assay y VERSANT® HIV-1 Protease Resistance Assay (LIPA), que se basan en la hibridación de productos amplificados mediante PCR con sondas específicas distribuidas a lo largo de una tira de nitrocelulosa; el método Affimetrix® , que se basa en la hibridación de productos de RT-PCR utilizando oligonucleótidos inmovilizados sobre una microplaca o chip, que permiten la identificación del nucleótido presente en cada posición; la PCR selectiva, mediante la cual se detectan mutaciones de resistencia concretas asociadas con determinados codones de la transcriptasa inversa o la proteasa del VIH; y la hibridación diferencial, también denominada "Point mutation assay".

7.1.1.3Interpretacióndelgenotipo

Debido a que es difícil tener un profundo conocimiento de la significación clínica de todas las mutaciones, los ensayos genotípicos se suelen acompañar de una interpretación de las mutaciones encontradas. Es en este punto, en la interpretación, cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio. El elevado número de mutaciones de resistencia y la existencia de interacciones entre ellas son algunas de las causas responsables de los problemas en la interpretación. Afortunadamente, el modelo para la interpretación de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado, porque los resultados de las pruebas genotípicas se obtienen en formato de texto (una lista de nucleótidos) y porque las reglas de interpretación son fácilmente computarizables. Por esto, hoy en día la interpretación de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informáticos, en los que se introduce la secuencia nucleotídica de la proteasa y retrotranscriptasa del VIH y se compara con la secuencia de una cepa patrón sin ninguna mutación (cepa salvaje o "wild type), reconociendo entonces las mutaciones de resistencia. De hecho, el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software, predice la evolución virológica cuando se complementa con la información clínica como base para realizar un cambio de tratamiento. Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciación: se han desarrollado más de 25 sistemas de interpretación con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base científica, validación clínica etc... Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros están disponibles en Internet, como la página de la Sociedad Internacional de SIDA de los EEUU (http://www.iasusa.org/), o la base de datos para secuencias de proteasa y transcriptasa inversa de la Universidad de Stanford (http://hivdb.stanford.edu/). Todos son fácilmente accesibles, y presentan sistemas de interpretación sencillos para todas las drogas disponibles. Sin embargo, en ninguno de los documentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuál debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotípicas. Es más, cuando se comparan los algoritmos entre sí existen serias discrepancias entre ellos, en especial para algunos análogos de nucleósidos como estavudina, abacavir, tenofovir y didanosina.

La realidad es que no todos los sistemas aportan la misma calidad a la interpretación. Para la elección del que vayamos a utilizar debemos valorar, entre otros, la fecha de la última actualización (en este sentido, los de la Red de Investigación en SIDA de


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España y los de la ANRS francesa–Julio 2005- son los de una actualización más reciente) y existen datos clínicos que avalan que ese algoritmo es capaz de predecir la eficacia virológica. La tendencia actual es la elaboración de reglas de interpretación a partir de series de pacientes en los que se incluye el fármaco a estudiar en el régimen terapéutico, relacionando las mutaciones basales con la eficacia virológica en términos de descenso de carga vírica a los tres meses. En este sentido existen datos publicados para tenofovir, didanosina, abacavir, saquinavir, atazanavir, fosamprenavir, lopinavir, y tipranavir. Además parece claro que la interpretación del genotipo debe estar avalada por un experto en la materia.

Finalmente, hay que destacar que es importante interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y, en su caso, estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente.

7.1.2Técnicasfenotípicas

Los estudios fenotípicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada fármaco, y según este grado de sensibilidad se podría valorar en un futuro la posibilidad de sobrepasar la resistencia aumentando los niveles plasmáticos del fármaco. Sin embargo, los estudios fenotípicos deben considerarse por el momento como poco viables, principalmente por la complejidad, laboriosidad de la técnica, y el tiempo necesario para la emisión de resultados

7.1.2.1Métododesensibilidaddelvirusencélulasmononucleadasdesangreperiférica(CMSP).El análisis de resistencias fenotípicas puede hacerse a partir del aislamiento del virus

del paciente procedente de CMSP. Para ello se estimulan las CMSP del paciente con fitohemaglutinina (PHA) y se co-cultivan en presencia de CMSP de donantes no infectados también estimuladas con PHA, todo ello en presencia de distintas concentraciones del antirretroviral. Semanalmente se renuevan las CMSPs de los donantes y en un tiempo aproximado de 4 semanas se evalúa la producción de nuevos virus. Como ventaja frente a la tecnología de virus recombinantes que veremos a continuación, hay que destacar que se estima la sensibilidad del virus completo, pudiéndose reflejar el efecto de partes del genoma que se pueden subestimar al estudiar sólo el gen pol

7.1.2.2TécnicasconvirusrecombinantesEn 1994 Kellam y Larder publicaron un ensayo en el que se amplificaban mediante

PCR la transcriptasa inversa y la proteasa (fragmento PR-TI) directamente a partir de muestras de plasma del enfermo y se transfectan en células huésped conjuntamente a un plásmido linearizado que codifica para una cepa de VIH de laboratorio en la que se ha eliminado esta secuencia. En la célula huésped tiene lugar un proceso de recombinación homóloga cuyo resultado es un VIH recombinante que porta las secuencias del gen pol del paciente y que además se puede cultivar con facilidad en el laboratorio. Este ensayo inicial se caracterizaba por una mayor rapidez y una mayor reproducibilidad en los resultados que el cultivo de CMSPs. Las posteriores modificaciones a este ensayo inicial han contribuido a mejorar aún más estos aspectos y han dado lugar a los tres ensayos de virus recombinantes que podemos solicitar a las casas que los comercializan: Antivirogram (Tibotec-Virco), PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS).


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En el método Antivirogram® (Virco) los virus recombinantes se preparan mediante transfección de células MT-4 con el producto amplificado PR-TI y con un plásmido que contiene el genoma completo del VIH salvo la región gag-pro-RT. La CI50 del virus recombinante se determina en cultivos, midiendo la viabilidad de células MT4 infectadas con el virus recombinante en presencia de diluciones de cada antirretroviral.

Figura 3: Ejemplo de informe tras realizar una técnica de fenotipado para la detección de genes del resistencia a fármacos antirretrovirales.


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El método Phenosense (ViroLogic), a diferencia del antivirograma, es un ensayo de un solo ciclo de replicación vírica, lo que reduce el tiempo para los resultados. Utiliza un proceso de ligación, más que de recombinación homóloga, para introducir el fragmento amplificado mediante RT-PCR en el genoma de una partícula de VIH en la que el gen env ha sido sustituido por un gen productor de luciferasa. En un ciclo de replicación este virus es capaz de producir todas las proteínas del VIH a excepción de las de envoltura y, en su lugar, se expresa el gen de la luciferasa. La CI50 del virus recombinante se determina cuantificando la expresión del gen de la luciferasa en cultivos de células infectadas con el virus recombinante en presencia de antirretrovirales.

Figura 4: Método Phenosense (ViroLogic),

El método Phenoscript (Viralliance), combina aspectos de los dos anteriores: un proceso de recombinación homóloga, como en el antivirograma, con un sólo ciclo de replicación vírica, como en el Phenosense.

Las células diana (P4) contienen el gen de la beta-galactosidasa controlado por la LTR del VIH de modo que cuando se acumulan suficientes productos del gen tat en la célula infectada, se expresa el gen de la beta-galactosidasa y su producto se puede medir mediante colorimetría o fluorimetría.

Figura 5: Método Phenoscript.


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7.1.3Interpretacióndelfenotipo

Las técnicas fenotípicas se basan en la capacidad de los virus aislados del paciente de infectar células frescas en presencia de varias diluciones del antirretroviral a ensayar. La producción de nuevos virus se monitoriza mediante diversos métodos (cuantificando la generación de antígeno p24 o la actividad de la TI) y se puede calcular la cantidad de fármaco necesaria para que el crecimiento de virus se inhiba en un 50% o en un 90% (CI50 y CI90 respectivamente). El mismo procedimiento realizado en cepas sin mutaciones de resistencia (cepas de referencia o cepas salvajes), permitirá conocer el número de veces que la CI50 de la cepa en estudio está aumentada con respecto a la de referencia para así poder estimar la sensibilidad o resistencia a esa droga. Para ello se definirá un punto de corte (cut-off), que es distinto para cada antirretroviral en estudio. --Existen distintos puntos de corte: técnico, biológico y clínico.

El punto de corte técnico se establece en base a la reproducibilidad del ensayo: sólo informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patrón; por lo tanto no proporciona información sobre la relación existente con la posibilidad o no de una respuesta clínica al antiretroviral en estudio. El punto de corte biológico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naïve y para cada antirretroviral, este punto de corte se estableció en dos desviaciones estándar por encima de la media de CI50 de dichas cepas; este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad del virus a los antivíricos en estudio con respecto a los que circulan en la población no tratada e infectada por el VIH pero tampoco proporciona ninguna medida en relación con si un tratamiento será efectivo o no. Por último, el punto de corte clínico se establece en base a la correlación de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta clínica medida en términos de descenso de la carga vírica en un determinado período de tiempo; es el punto de corte ideal, pero la realidad es que no siempre existe una relación binaria resistencia-falta de respuesta, si no que esto más bien es un fenómeno continuo, por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias posibilidades de respuesta. En esta línea están trabajando los laboratorios que ofertan los ensayos fenotípicos.

La dificultad de la interpretación de las pruebas fenotípicas radica en la dificultad de diseñar ensayos clínicos que avalen los puntos de corte clínicos de cada antirretroviral. Además, un problema añadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotípico que se realice.

7.2 Predicción del fenotipo a partir del genotipo: Fenotipovirtual

El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo. Ha sido diseñado por Virco, que ha desarrollado una base de datos con información alrededor de 100.000 genotipos y fenotipos. En su versión inicial, existían unos 30.000 emparejamientos genotipo-fenotipo de las mismas muestras clínicas, que se utilizaban para generar un fenotipo virtual: cuando se obtiene el genotipo de la muestra de un paciente, el código genético de las regiones de la proteasa y TI es analizado por el software propio del sistema, que identifica todas las mutaciones que pueden afectar a la resistencia de cada droga y busca en la base de datos de Virco genotipos de muestras previas que presentan el mismo patrón de mutaciones. Cuando ya se han identificado todas ellas, el software recupera los fenotipos de esas muestras y para cada antiretroviral, hace un promedio de


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los datos. Esto produce el fenotipo virtual, con los cambios en la CI50 para cada antirretroviral, basado en los datos de cientos o miles de fenotipos reales con el mismo patrón de mutaciones.

Esta técnica ha sufrido diversas modificaciones/actualizaciones. En Julio 2004 se incorporó información importante sobre tenofovir y a partir de 2005 se ha redefinido, recibiendo la nueva actualización el nombre de vircoType HIV-1. Su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte, que en esta versión son clínicos, y además define la resistencia a un fármaco de un modo continuo, en vez de hacer una interpretación dual. Asimismo, incorpora información sobre la resistencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y, en determinados casos, incluye el consejo de expertos en la interpretación final. La potencia de esta herramienta para la interpretación viene avalada por el número de series genotipo-fenotipo-respuesta virológica de que dispone.

El fenotipo virtual de Virco no es el único disponible y existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo, como geno2pheno (http//www.geno2pheno.de).

7.3Indicacionesdelaspruebasderesistencia

En este apartado se expondrán las recomendaciones más recientes a nivel nacional (Gesida/Plan Nacional del SIDA e internacional (Department of Health and Human Services, DHHS) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una optima utilización de las pruebas de resistencia. Los escenarios para la utilización de las pruebas de resistencia son:

a) Pacientes sin tratamiento previo:

Infección aguda por el VIH: ambas guías recomiendan su empleo si se decide iniciar tratamiento, con el objeto de detectar la posible transmisión de cepas resistentes y modificar el régimen antes de que este fracase, evitando de este modo la terapia subóptima y una consecuente acumulación de resistencias. Las guías de la DHHS recomiendan extender este período hasta 1-3 años de la seroconversión, debido a que determinadas mutaciones pueden llegar a detectarse durante este tiempo incluso en ausencia de presión farmacológica.

Infección crónica por el VIH: según la DHHS, debe considerarse su empleo antes de iniciar tratamiento sólo en aquellos pacientes en los que exista una elevada sospecha de haber sido infectados por una persona en tratamiento antirretroviral. Estas guías comentan un estudio en que la detección de resistencias en pacientes naïve es coste-eficaz cuando la prevalencia de resistencia en esta población es superior al 5%. Recientemente se ha publicado un nuevo estudio en que se demuestra que es coste-eficaz por encima del 1%.

Embarazo: la guía nacional las recomienda para todas las mujeres embarazadas. Las de la DHHS consideran que para las mujeres embarazadas se deben hacer las mismas recomendaciones que para el resto de pacientes.


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Profilaxis postexposición (PPE) ocupacional: Gesida/PNS recomiendan considerar su utilización en el caso fuente.

b) Paciente con tratamiento antirretroviral: recomendar en todo fracaso al TAR para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y diseñar un nuevo régimen con el mayor número de fármacos activos.

Las guías de la DHHS recomiendan además la realización de las pruebas de determinación de resistencias en los casos en los que la supresión virológica tras iniciar tratamiento es subóptima. Finalmente desaconsejan su empleo en pacientes con carga vírica <1000 copias/ml, por el escaso rendimiento de la prueba, y después de suspender un tratamiento, por la reversión de la mayoría de las mutaciones que no se detectarían al ser subpoblaciones minoritarias.

7.4Limitacionesdelaspruebasderesistencia

En la actualidad, la mayoría de las pruebas genotípicas o fenotípicas incluyen durante su realización la extracción del ARN vírico y su posterior retrotranscripción en ADN. De este ADN se amplifica la región genómica que se desea investigar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los procedimientos de extracción y amplificación son cruciales para el posterior análisis del amplificado y la calidad de los resultados dependerá directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso. En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican el gen de la proteasa y parte de la TI del VIH y, en algunos se amplifica también un fragmento del gen gag. Las técnicas de las que disponemos aseguran un 98-100 % de éxito en la amplificación en muestras con una carga vírica superior a 500-1000 copias/ml. No obstante, con las adecuadas modificaciones es posible amplificar prácticamente cualquier muestra con carga vírica detectable, es decir, con más de 50 copias/ml. Por otra parte, ninguno de los métodos genotípicos o fenotípicos asegura la detección de todas las variantes o cuasiespecies víricas que infectan al paciente. La mayoría de las técnicas sólo detectan una variante si esta representa más del 20% del total de la población. Para asegurar la detección de las variantes que representan menos del 20%, también llamadas variantes minoritarias, es necesario recurrir a técnicas especiales (clonación de los productos de amplificación, PCR mediante diluciones al límite, o PCR a tiempo real) que no son aplicables hoy por hoy a la rutina del laboratorio de secuenciación del VIH. Este hecho explica por qué los métodos que se utilizan predicen el fracaso de un fármaco pero no aseguran el éxito ya que las variantes minoritarias pueden ser portadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese fármaco en concreto. Finalmente, los ensayos de que disponemos están por lo general bien diseñados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B, ya sean URFs (Unique Recombinant Forms ) o CRFs (Circulating Recombinant Forms).


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Tabla 1. Principales ventajas e inconvenientes de los métodos genotípicos y fenotípicos

Métodos genotípicos: ventajas

Rapidez

Dificultad técnica media: realizable en laboratorios hospitalarios

Menor coste económico

Las mutaciones pueden preceder a las resistencias fenotípicas

Métodos genotípicos: desventajas

Algunos no detectan variantes minoritarias (han de constituir al menos un 20% de la población vírica)

Puede no existir correlación con el análisis fenotípico

Desconocimiento de mutaciones que ofrecen resistencia a diferentes inhibidores

Desconocimiento del efecto de las resistencias cruzadas

Respuesta variable de los pacientes a un fármaco

Marcador indirecto de la sensibilidad del VIH a los antirretrovirales

Requieren la interpretación por un experto

No son válidos para nuevas drogas hasta que se diseñan los algoritmos de interpretación y se validan clínicamente.

Métodos fenotípicos: ventajas

Reflejan el efecto de todas las mutaciones presentes, incluso las que no se han descrito

Medida directa de la sensibilidad del VIH a los antirretrovirales

Se puede utilizar para cualquier tipo de fármaco

Información útil acerca de las resistencias cruzadas

Los resultados son fáciles de interpretar

Potencial medida de "fitness" vírico y tropismo

Métodos fenotípicos: desventajas

No detecta variantes minoritarias

Lento, laborioso y de elevado coste

Falta de estandarización

No están validados o no se han descrito todos los puntos de corte clínicos

Medidas de contención biológica

Posible selección de variantes víricas mejor adaptadas al cultivo celular


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7.5Casoclínico

Paciente VIH con terapia TARGA que no responde adecuadamente al tratamiento.

Se solicita al laboratorio de Virología la detección de genes de resistencia a fármacos antirretrovirales. El TEL realiza la técnica de secuenciación de acidos nucleicos y 3 meses después del envío del resultado el infectólogo solicita del mismo paciente la detección de variantes minoritarias pues el paciente sigue evolucionando mal.

7.5.1Preguntas:

¿Qué técnicas habría que realizar para procesar adecuadamente esa petición?

¿Están estas técnicas disponibles en cualquier laboratorio de rutina?

7.6ResumendelaUnidadDidácticaVII

Las pruebas para la detección de resistencias a antirretrovirales pueden clasificarse en dos tipos: genotípicas y fenotípicas.

De entre las técnicas genotípicas, la secuenciación de ácidos nucleicos es el método de referencia.

Los ensayos de secuenciación comerciales más utilizados son TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test y ViroSeqTM HIV genotyping system.

Otros ensayos genotípicos alternativos a la secuenciación son VERSANT® HIV-1 RT Resistance Assay y VERSANT® HIV-1 Protease Resistance Assay (LIPA), que se basan en la hibridación de productos amplificados mediante PCR con sondas específicas distribuidas a lo largo de una tira de nitrocelulosa; el método Affimetrix® , que se basa en la hibridación de productos de RT-PCR utilizando oligonucleótidos inmovilizados sobre una microplaca o chip, que permiten la identificación del nucleótido presente en cada posición.

Las técnicas fenotípicas aunque valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada fármaco son poco viables principalmente por la complejidad, la laboriosidad de la técnica y el tiempo necesario para la emisión de resultados.

7.7Glosario

Resistencia: disminución o desaparición de la sensibilidad de una cepa bacteriana un antimicrobiano.

Sensibilidad: actividad de un antibiótico frente a un microorganismo que indica que puede ser usado para tratar una infección causada por él.

TI: enzima transcriptasa inversa.

PR: enzima proteasa.

CI50: concentración inhibitoria 50, que es la concentración del fármaco requerida para reducir al 50% la producción vírica in vitro.


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PCR: reacción en cadena de la polimerasa.

dNTP: dinucleótido.

ddNTP: dideoxinucleótido.

A: adenina (nucleótido).

G: guanina (nucleótido).

C: citosina (nucleótido).

U: uracilo (nucleótido).

CMSP: células mononucleares de sangre periférica.

PPE: profilaxis postexposición

UNIDADDIDÁCTICAVIIINORMASDEBIOSEGURIDADYPRECUACIONES

CONELMANEJODELASMUESTRAS


103

8.1Áreasdetrabajoenellaboratorio

8.1.1Barrerassecundariasynivelesdecontención

Acontecimientos mundiales recientes han puesto de relieve la necesidad de proteger los laboratorios y los materiales que contienen de acciones que puedan perjudicar a las personas. Antes de definir las necesidades de un laboratorio o un programa en materia de bioprotección, es preciso definir claramente la distinción entre "seguridad biológica" y "protección biológica":

"Seguridad biológica" (o “bioseguridad") es el término utilizado para referirse a los principios, técnicas y prácticas aplicadas con el fin de evitar la exposición no intencional a patógenos y toxinas, o su liberación accidental.

"Protección biológica" (o "bioprotección") se refiere a las medidas de protección de la institución y del personal destinadas a reducir el riesgo de pérdida, robo, uso incorrecto, desviaciones o liberación intencional de patógenos o toxinas.

El término contención se emplea para describir los métodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos en el laboratorio. El propósito de la contención es reducir al mínimo la exposición del personal de los laboratorios, del resto del personal y del entorno a agentes potencialmente infecciosos. Se habla de contención primaria o barreras primarias para referirse a aquellas que protegen al trabajador y a su entorno inmediato (técnicas microbiológicas y equipos de protección).

Las barreras secundarias se refieren al diseño y construcción de un laboratorio que contribuyen a la protección del propio personal del laboratorio, proporciona una barrera para proteger a las personas que se localizan fuera del y protege a laboratorio las personas frente a posibles escapes accidentales de agentes infecciosos. El director o jefe del laboratorio es el responsable de la seguridad, siendo obligación de la gerencia del centro la provisión de la dotación necesaria.

La normativa en España está regida por el Real Decreto 664/97 y la adaptación contenida en la Orden del 25 de marzo de 1998.

Los niveles de contención o bioseguridad son cuatro y se designan en orden ascendente según el grado de protección del personal, del ambiente y de la comunidad que proveen.

8.1.1.1Barrerassecundariasenlaboratoriosdebioseguridad1

Los laboratorios deben tener puertas para el control de acceso.

Se debe colocar una señal de advertencia de riesgo biológico en la entrada del laboratorio cuando se encuentren presentes agentes biológicos.

Deben tener piletas para el lavado de manos.

Han de estar diseñados de forma que la limpieza de los mismos sea sencilla. No se permiten alfombras.


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La iluminación será adecuada para todas las actividades. Se evitarán los reflejos y brillos molestos.

Los suelos serán antideslizantes.

El mobiliario debe ser fuerte y resistente. Los espacios entre mesas, cabinas y equipo han de ser de fácil acceso para la limpieza.

o Las superficies de las mesas de trabajo han de ser impermeables al agua y resistentes al calor moderado, solventes orgánicos, ácidos, álcalis, y otros productos químicos.

o Las sillas que se usen en el laboratorio deben estar cubiertas por otro material que no sea tela, que se pueda limpiar fácilmente.

Si el laboratorio tiene ventanas que se abren al exterior deben estar provistas de mosquiteras.


Además de las mencionadas en los laboratorios de bioseguridad 1:

Las puertas deben cerrarse automáticamente y han de tener cerraduras de acuerdo con las directrices de la institución. Además, deben llevar las debidas señales de riesgo biológico.

Considerar la ubicación de nuevos laboratorios lejos de áreas públicas.

Deben tener piletas para el lavado de manos, se recomiendan las controladas con los pies, las rodillas o las que operan automáticamente. Deben localizarse cerca de las puertas de salida.

El diseño ha de facilitar la limpieza y descontaminación.

El mobiliario debe ser capaz de soportar cargas y usos anticipados. Su superficie impermeable y resistente al calor, solventes orgánicos, ácidos, álcalis y otros productos químicos.

No se recomiendan ventanas que puedan abrirse al exterior. No existen requisitos de ventilación específicos. Sin embargo, cuando se planifique una nueva instalación, habrá que prever un sistema mecánico de ventilación que introduzca aire del exterior sin recirculación a espacios fuera del laboratorio. Cuando no se disponga de ventilación mecánica, las ventanas deberán poder abrirse, y deberán estar provistas de mosquiteras.

Deben tener Cabinas de Seguridad Biológica (CSB), situadas lejos de posibles alteraciones del flujo aéreo (como son: puertas, ventanas, áreas de gran flujo de trabajo).

Las CSB deben tener un sistema de filtrado y recirculación de aire verificado.

Las líneas de vacío deben estar protegidas con filtros HEPA (High Efficiency Particulate Airborne) o equivalentes.


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Se debe disponer de una estación para el lavado de ojos, así como duchas para casos de emergencia.

Se debe disponer de un sistema de descontaminación de deshechos (por ejemplo: autoclave, desinfección química, incineración, u otro método validado)


Además de las mencionadas en los laboratorios de bioseguridad 2:

El laboratorio está separado de otras áreas abiertas al flujo de tráfico irrestricto dentro del edificio, y el acceso al laboratorio está restringido.

El pasaje a través de una serie de puertas que se cierran automáticamente es el requisito básico de ingreso al laboratorio desde los corredores de acceso. Se debe incluir un vestuario en el camino entre las dos puertas de cerrado automático.

Las puertas se pueden cerrar con llave.

Deben tener piletas para el lavado de manos que se operan automáticamente o sin manos, ubicadas cerca de la puerta de salida. Si el laboratorio está dividido en pequeños laboratorios, debe disponerse de una pileta por zona.

Las superficies interiores de paredes, pisos y techos han de ser fáciles de limpiar y descontaminar. Los bordes y penetraciones deben sellarse. Las superficies han de ser lisas, impermeables a los líquidos y resistentes a sustancias químicas y desinfectantes. Los suelos deben ser monolíticos (sin fisuras) y antideslizantes.

Todas las ventanas son cerradas y selladas.

Las CSB deben situarse lejos de las puertas, rejillas de ventilación y áreas muy transitadas.

Se deben proteger las líneas de vacío con trampas de desinfectante líquido y filtros HEPA o equivalentes.

Estación para lavado de ojos dentro del laboratorio.

Sistema de ventilación de aire de escape por conductos. Este sistema crea un flujo de aire direccional que toma el aire para el laboratorio de áreas "limpias" y lo elimina en áreas "contaminadas". El aire de escape no se recircula a ninguna otra parte del edificio.

o El personal debe ser capaz de verificar la dirección del flujo de aire. Se recomiendan sistemas de monitorización visual en la entrada. Se deben considerar alarmas audibles.

o La salida del aire del laboratorio en el edificio debe estar localizada lejos de zonas ocupadas y de zonas de toma de aire del edificio o el aire de salida debe estar filtrado por filtros HEPA.


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El aire filtrado con HEPA de las CSB clase II puede ser recirculado en el ambiente del laboratorio siempre y cuando la cabina esté revisada de acuerdo con las instrucciones del fabricante y al menos una vez al año. Las CSB clase III, deben estar directamente conectadas con el segundo sistema de escape con filtros HEPA de la cabina. El suministro de aire se debe realizar de forma que se prevenga la presión positiva de la cabina.

Se debe disponer de un método de descontaminación de los residuos, preferentemente dentro del laboratorio (por ejemplo: autoclave, desinfección química, incineración, u otro método validado).

Los equipos que puedan producir aerosoles deben estar contenidos en dispositivos cuyo aire de salida se filtre por filtros HEPA u otra tecnología equivalente.

El diseño de las instalaciones ha de tener en consideración la descontaminación de grandes piezas de equipo antes de sacarlas del laboratorio.

Se requerirá la inclusión de protección ambiental adicional, por ejemplo, una o más de las siguientes:

o Una antesala para limpieza de material y suministros con vestidor y duchas.

o Filtración HEPA de aire de escape.

o Contención de otros servicios entubados (cañerías, etc.).

o Provisión de descontaminación de efluentes (drenajes de baños, lavabos, cámaras de autoclave, etc.).

El diseño, los parámetros y los procedimientos deben ser verificados y documentados antes del funcionamiento. Las instalaciones deben re-verificarse anualmente como mínimo.


Hay dos modelos para los laboratorios de nivel de bioseguridad 4:

1) El laboratorio con gabinete: donde toda manipulación del agente se realiza en un gabinete de seguridad biológica clase III.

2) El laboratorio en el que se requiere el uso de trajes especiales de seguridad, donde el personal utiliza un traje de protección.

Los laboratorios de nivel de bioseguridad 4 pueden estar basados en uno de estos modelos o en la combinación de ambos en el mismo establecimiento. Si se utiliza una combinación, cada tipo debe cumplir todos los requerimientos necesarios.


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8.2Laboratoriodevirología

En España, la mayoría de los virus que se aíslan en los laboratorios de virología clínica son agentes biológicos del grupo 2. Muy pocos virus aislados en estos laboratorios son del grupo 3 y hasta el momento actual no se ha aislado ninguno del grupo 4 en nuestro país. Por este motivo, en general, hoy día se considera suficiente que el diseño de los laboratorios de virología para diagnóstico clínico cumpla con las medidas de protección mínimas correspondientes a un nivel de contención 2. El diseño dotado con medidas de contención 3 o 4 sería necesario para laboratorios concretos que por ser centros de referencia o de investigación puedan realizar trabajos que impliquen la manipulación de virus de estos grupos. Sin embargo el aumento de intercambio de población por turismo o por inmigración puede hacer recomendable que todos los laboratorios de virología dispusieran por lo menos de un área o de todo el laboratorio diseñado con medidas de contención 3.

Ubicaciónydimensiones.

La ubicación indicada para el laboratorio de virus depende del nivel de contención requerido. Aún con un nivel de contención 2, es recomendable que esté separado físicamente de otras áreas de trabajo del laboratorio, fundamentalmente por las condiciones de mínima contaminación que requiere la manipulación de los cultivos.

El acceso siempre debe estar restringido, con señalización de "RIESGO BIOLÓGICO. ACCESO RESTRINGIDO. SÓLO PERSONAL AUTORIZADO". Para un nivel de contención 3 la puerta de acceso debe ser doble. Se exige un acceso con exclusa de aire para el nivel de contención 4.

No existen recomendaciones de tamaño específicas por lo que se deben asumir las generales para un laboratorio (14-18 m2 por trabajador).

Diseño,instalacionesyequipos.

El diseño, instalaciones y equipos de los laboratorios de virus deben cumplir con las características correspondientes a su nivel de contención, 2, 3 o 4.

Como características específicas del laboratorio de virus, se deben destacar las siguientes:

El aire acondicionado debe ser específico para el laboratorio de virología y disponer de filtros HEPA (a la entrada es suficiente para un nivel de contención 2 y a la entrada y salida para niveles 3 y 4).

El laboratorio de virología debe contar con cabinas de seguridad biológica clase II o III. En los laboratorios de virología, independientemente de su nivel de contención, no son adecuadas las de clase I, porque no protege a los cultivos celulares de la contaminación externa a la que son tan susceptibles.

Las cabinas de flujo laminar, que no son recomendables en general para los laboratorios de microbiología por no proteger al trabajador, pueden utilizarse en los laboratorios de virología sólo como zona limpia para la preparación de medios para cultivo y mantenimiento de las líneas celulares.


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8.3LaboratoriodeserologíaEn los laboratorios de microbiología clínica la mayoría de ensayos o pruebas

serológicas se realizan con muestras clínicas en las que potencialmente existen agentes biológicos pertenecientes a los grupos 2 y 3. Por tanto, sería recomendable que el diseño del laboratorio de serología se dote, al menos, de las medidas correspondientes a un nivel de contención 2, siendo aconsejable para los laboratorios de nueva instalación un nivel de contención 3.


Para un nivel de contención 2, es aconsejable que el laboratorio de serología se encuentre separado de otras áreas de trabajo del laboratorio, así como, de otras zonas de actividad que se desarrollen en el mismo edificio. El tamaño y distribución dependerá, fundamentalmente, del número de autoanalizadores, sistemas robotizados, equipos y puestos de trabajo del mismo, en función de la cartera de servicios. Al ser estos más numerosos y voluminosos que en otras áreas del laboratorio de microbiología, no son del todo aceptables las recomendaciones de tamaño general dadas para otras áreas. Una forma de cálculo de la superficie total podría ser la basada en la experiencia de 177 proyectos de organización de laboratorios altamente automatizados efectuados en los últimos 9 años (datos no publicados y proporcionados por Javier Barreiro, comunicación personal). Consiste en multiplicar la superficie del mobiliario y los equipos por un factor de entre 1,7 y 2,0. También se podría aplicar la normativa general que aconseja 2 m2 libres por trabajador. A la hora de establecer el tamaño del laboratorio es importante tener en cuenta que algunos grandes equipos no se pueden mover, por lo que se recomienda una separación entre equipos suficiente que permita un fácil acceso a los mismos para funciones de mantenimiento y reparación, además de permitir la limpieza general del laboratorio.

Al igual que en otras zonas de trabajo del laboratorio, la puerta de acceso debe permanecer cerrada. En los puntos de acceso a esta zona de trabajo se aconseja que exista la indicación "RIESGO BIOLÓGICO. ACCESO RESTRINGIDO. SÓLO PERSONAL AUTORIZADO".


Como instalación de nivel 2, se recomienda disponer de un sistema de ventilación que proporcione una entrada de aire sin recirculación a otras áreas del laboratorio/edificio. Se aconseja, para los laboratorios de nueva instalación, la utilización de filtros HEPA o similar, en la filtración del aire extraído del área de trabajo, así como para la protección de las líneas de vacío.

Para algunos procedimientos es conveniente disponer de una cabina de seguridad de clase II, en este caso, el aire filtrado por las mismas, podrá recircular en el laboratorio, sólo si se verifica y certifica periódicamente su buen funcionamiento.

Debe existir, al menos, un lavabo en el laboratorio de serología dotado de grifos que puedan activarse o accionarse de forma automática, con píe/codo. También, se debe disponer de una estación de lavado de ojos.

Se aconseja que los suelos, paredes y techos sean impermeables al agua y resistentes a diferentes productos químicos (desinfectantes, disolventes, etc.), de forma que permitan una fácil limpieza y una posterior descontaminación.


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Las mesas y bancos de trabajo deben ser resistentes al calor, a disolventes orgánicos, ácidos y álcalis y detergentes desinfectantes. Deben existir procedimientos de desinfección específicos.

El laboratorio de serología por ser una zona con tecnología y reactivos específicos es aconsejable que disponga de una zona de almacenamiento para reactivos y muestras (cámara fría, congeladores), así como de armarios de seguridad para determinados reactivos productos químicos y tóxicos.

Se debe disponer de un método validado de descontaminación y eliminación de los residuos específicos del laboratorio de serología.

Todas las áreas de trabajo del laboratorio de serología deben disponer de la señalización adecuada indicando su nivel de riesgo biológico y contención.

8.4Laboratoriodemicrobiologíamolecular

En la mayoría de los laboratorios de microbiología molecular de nuestro país, se realizan, fundamentalmente, técnicas de amplificación, detección y secuenciación de ácidos nucleicos de agentes biológicos clasificados en los grupos 2 y 3. En los laboratorios de referencia existe la posibilidad de detección, mediante métodos moleculares, de agentes del grupo 4. En general, se recomienda que el diseño del laboratorio de microbiología molecular para el diagnóstico clínico cumpla con las medidas de protección mínimas correspondientes a un nivel de contención 3. Las medidas de contención 4 son necesarias exclusivamente en los centros de referencia e investigación donde se manipulan agentes biológicos del grupo 4. En el diseño del laboratorio de microbiología molecular no sólo se ha de tener en cuenta la protección del operador frente a los agentes biológicos, otro aspecto fundamental que debe cuidarse también es la protección de la muestra frente a contaminantes (ácidos nucleicos) exógenos, que afectaría de forma negativa el desarrollo de las técnicas moleculares.

Para algunos procedimientos (área de preparación de muestras y extracción de ácidos nucleicos, área de amplificación) se debe disponer de cabinas de seguridad de clase II, siendo aconsejable la utilización de cabinas de clase III para el estudio de agentes biológicos de los grupos 3 y 4.


Se aconseja que el laboratorio se sitúe en una zona cerrada al transito y con una doble puerta de acceso (sala vestuario).

El tamaño y distribución de las áreas de trabajo está en función de la disponibilidad de sistemas robotizados (preparación de muestras) número de termocicladores (amplificación), equipos de detección (por ejemplo, secuenciadores) y puestos de trabajo de cada área (>10 m2 por trabajador) de acuerdo con la cartera de servicios del laboratorio. También se podría aplicar la regla descrita en el apartado anterior (laboratorio de serología), principalmente si se realiza un diseño como un laboratorio con cabinas y sin compartimentos.

Se aconseja que el laboratorio se encuentre separado de otras áreas de trabajo del laboratorio, así como, de otras zonas de actividad que se desarrollen en el mismo edificio.


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En el diseño ideal de un laboratorio de microbiología molecular se especifican cuatro áreas de trabajo: área de preparación de reactivos, área de preparación de muestras y extracción de ácidos nucleicos, área de amplificación y área de detección de productos amplificados. Se recomienda que exista un flujo de trabajo unidireccional, desde la primera área a la última. La exigencia de las cuatro áreas se puede reducir dependiendo del grado de automatización de las fases de extracción, amplificación y detección. La introducción de técnicas de PCR a tiempo real al eliminar pasos críticos de la técnica (como por ejemplo, la apertura de tubos con amplicones) hace menos necesaria la separación física de áreas. Los laboratorios que sólo realizan técnicas de PCR a tiempo real y con extracción automática de ácidos nucleicos, podrían simplificar su diseño a un laboratorio espacioso con cabinas clase II para la preparación de reactivos y preparación de las muestras. Cualquier laboratorio se encontrará entre estos dos supuestos extremos, teniendo en cuenta el grado de automatización de las distintas técnicas y la cartera de servicios (tipos de PCR, otros tipos de técnicas de amplificación, secuenciación, etc.).

Se recomienda, también, una separación entre equipos suficiente que permita un fácil acceso a los mismos (mantenimiento) y limpieza o descontaminación.

Debe existir un acceso controlado y la puerta de acceso debe permanecer cerrada. En los puntos de acceso a las diferentes áreas de trabajo del laboratorio de microbiología molecular se aconseja que exista la indicación "RIESGO BIOLÓGICO. ACCESO RESTRINGIDO. SÓLO PERSONAL AUTORIZADO".


El diseño del laboratorio de microbiología molecular debe cumplir con las normas correspondientes a un nivel de contención 3 o 4 en función de su cartera de servicios y características del laboratorio. Todas las áreas de trabajo del laboratorio deben disponer de la señalización adecuada indicando su nivel de riesgo biológico y contención.

Se debe disponer de un sistema de ventilación que proporcione una entrada de aire sin recirculación a otras áreas del laboratorio/edificio. Un sistema de ventilación direccional desde las áreas limpias a las potencialmente contaminadas. Se recomienda disponer de sistemas para monitorizar el flujo del aire, así como de alarmas que detecten su incorrecto funcionamiento. Se aconseja, la utilización de filtros HEPA en la filtración del aire extraído de cada área de trabajo, así como la protección de las líneas de vacío mediante trampas-desinfectantes o filtros HEPA o similar.

La utilización de cabinas de seguridad biológica de clase II permite que el aire filtrado por HEPA, pueda recircular en el laboratorio, siempre que se verifique y certifique periódicamente el buen funcionamiento de la cabina. En la cabina de clase III el aire filtrado es expulsado al exterior a través de dos filtros HEPA.

Deben existir, al menos, dos lavabos, uno en el área de preparación de reactivos y amplificación y otro, en el área de detección, estando dotados de grifos que puedan activarse de forma automática, con pie/codo. También, debe disponer de una estación de lavado de ojos.

Los suelos, paredes y techos deben ser impermeables al agua y resistentes a diferentes productos químicos (desinfectantes, disolventes, etc.), de forma que permitan su fácil limpieza y posterior descontaminación. Debe existir la posibilidad de sellado del laboratorio para su descontaminación.


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Las mesas y bancos de trabajo deben ser resistentes al calor, a disolventes orgánicos, ácidos y álcalis y detergentes desinfectantes. Además, deben existir procedimientos de desinfección específicos en cada una de las áreas del laboratorio de microbiología molecular, así como para la descontaminación de grandes equipos (equipos de extracción de ácidos nucleicos, secuenciadotes, etc.), y su retirada del laboratorio.

Se debe disponer de métodos validados y verificados de descontaminación y eliminación de los residuos específicos, en las distintas áreas de trabajo, del laboratorio de microbiología molecular.

Al ser un laboratorio de técnicas muy específicas se debe de disponer de una zona de almacenamiento de seguridad para muestras, ácidos nucleicos y productos de amplificación (neveras, congeladores). Su tamaño y distribución dependerá de la carga de trabajo del laboratorio. Así mismo, contará con armarios de seguridad para determinados reactivos, productos químicos y sustancias tóxicas. Sería aconsejable ubicar los congeladores de -80ºC en una sala específica para este tipo de aparatos ya que generan mucho ruido y calor. Además, su duración es mayor cuando la temperatura de trabajo es baja (inferior a la aconsejada para el personal).

Tabla 1: Resumen de los niveles de bioseguridad y barreras primarias y secundarias

BSL* Agentes Prácticas

Equipos de Seguridad (Barreras Primarias)

Instalaciones (Barreras

Secundarias)

1 No se ha comprobado que produzcan enfermedad en adultos sanos

Prácticas microbiológicas estándar

No se exige ninguna

Se exigen mesas abiertas con pileta(s) en el laboratorio

2 Asociado con la enfermedad humana, riesgo igual a daño percutáneo, ingestión, exposición de la membrana mucosa

Práctica BSL-1 más: · Acceso restringido · Señales de advertencia de riesgo biológico · Precauciones para "objetos punzantes" · Manual de bioseguridad debe definir la descontaminación de los desechos o las políticas de control médico

CSB Clase I o II, u otros dispositivos de contención física para todas las manipulaciones de muestras o agentes que generen salpicaduras o aerosoles de materiales infecciosos. Delantal de laboratorio, guantes, protección del rostro cuando sea necesario

BSL-1 más autoclave


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3 Agentes autóctonos o exóticos con potencial de transmisión por aerosol,enfermedad que puede derivar en consecuencias graves o letales

Práctica BSL-2 más: · Acceso controlado · Descontaminación de todos los desechos · Descontaminación de la ropa de laboratorio antes del lavado. · Muestras de suero base a todos los funcionarios del laboratorio y se almacenan

CSB Clase II, u otros dispositivos de contención física para todas las manipulaciones abiertas con las muestras o agentes. Delantal de laboratorio, guantes, Protección respiratoria necesaria

BSL-2 más: · Separación física de los corredores de acceso · Acceso de cierre automático con doble puerta · No se recircula el aire de escape · Flujo de aire negativo dentro del laboratorio

4 Agentes peligrosos/exóticos que presentan un alto riesgo de enfermedad, que pone en riesgo la vida, infecciones de laboratorio de transmisión por aerosol o agentes relacionados con riesgos de transmisión desconocidos y por los cuales no existe tratamiento ni vacunación

Prácticas BSL-3 más: · Cambio de ropa antes de ingresar · Ducha al salir · Descontaminación de todos los materiales a la salida de las instalaciones

Todos los procedimientos deben de realizarse en CSB III o de Clase I o II en combinación con un equipo de cuerpo entero con presión positiva y suministro de aire

BSL-3 más: · Edificio separado o zona aislada · Sistema de alimentación y escape, vacío y descontaminación exclusivos.

*BSL: biosecurity level (nivel de bioseguridad)

8.4.1Precaucionesconelmanejodelasmuestras

La sangre y otros líquidos corporales de todos los pacientes se considerarán potencialmente infecciosos. De forma complementaria a las precauciones universales se recomiendan una serie de precauciones a los profesionales de laboratorios clínicos:

1) Todas las muestras de sangre y líquidos corporales se colocarán en contenedores adecuados con un cierre de seguridad para prevenir un derrame durante el transporte. Hay que tener cuidado al depositar cada muestra en el contenedor, para evitar la contaminación de su parte externa, así como de la petición de examen para el laboratorio que acompañará a la muestra.


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2) Todas las personas involucradas en el procesamiento de sangre y líquidos corporales utilizarán guantes. La mascarilla y las gafas protectoras se utilizarán si es previsible un posible contacto con mucosas. Después de completar el procesamiento de la muestra, deben cambiarse los guantes y lavarse las manos.

3) Para las técnicas habituales como estudios microbiológicos, no es necesaria la cabina de seguridad biológica (CSB). No obstante, esta puede usarse cuando las técnicas presentan una alta probabilidad de generar salpicaduras.

4) Siempre que sea necesario, el pipeteado de muestras se realizará de forma mecánica, nunca con la boca.

5) La utilización de agujas y jeringas debe limitarse siempre a casos en que no haya alternativa. Para estos casos deben seguirse las precauciones universales.

6) Las superficies de trabajo en el laboratorio deben de ser descontaminadas con el germicida químico apropiado, siempre que se contamine con sangre u otro líquido corporal y cuando se finalice el trabajo.

7) El material contaminado utilizado en el laboratorio será descontaminado antes de ser reutilizado o colocado en bolsas especiales al respecto para ser procesado como residuo sanitario.

8) En caso de que se produzca algún desperfecto en el material científico que pueda haberse contaminado con sangre u otros líquidos corporales, debe limpiarse y descontaminarse antes de proceder a su reparación en el propio laboratorio o de ser transportado.

9) Después de completar su actividad en el laboratorio, todas las personas deben lavarse las manos y quitarse todo el material protector antes de salir del laboratorio.

8.5Casopráctico

Usted es entrevistado por un laboratorio privado que va incluir en su cartera de servicios determinaciones serológicas víricas, entre ellas VIH. Le piden consejo sobre la ubicación e instalaciones para la realización de estas técnicas.

8.5.1Preguntas:

¿Cómo respondería?

¿Quién será el reponsable de la seguridad dentro del laboratorio donde usted va a trabajar?

¿Cómo actuará si durante su primer día de trabajo se le derrama un suero de un paciente en la superficie de trabajo?


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8.6ResumendelaUnidadDidácticaVIII El término contención se emplea para describir los métodos que hacen seguro el

manejo de materiales infecciosos en el laboratorio. El propósito de la contención es reducir al mínimo la exposición del personal de los laboratorios, del resto del personal y del entorno a agentes potencialmente infecciosos.

Se habla de contención primaria o barreras primarias para referirse a aquellas que protegen al trabajador y a su entorno inmediato (técnicas microbiológicas y equipos de protección).

Las barreras secundarias se refieren al diseño y construcción de un laboratorio que contribuyen a la protección del propio personal del laboratorio, proporciona una barrera para proteger a las personas que se localizan fuera del laboratorio y protege a las personas frente a posibles escapes accidentales de agentes infecciosos. El director o jefe del laboratorio es el responsable de la seguridad, siendo obligación de la gerencia del centro la provisión de la dotación necesaria.

Los niveles de contención o bioseguridad son cuatro (I, II, III y IV) y se designan en orden ascendente según el grado de protección del personal, del ambiente y de la comunidad que proveen.

8.7GlosarioCabinas de seguridad biológica (CSB): son cámaras de circulación forzada que,

según especificaciones y diseño, proporcionan diferentes niveles de protecció. Se clasifican según el nivel y el tipo de protección en clase I, II y II.

Agente biológico (según el RD 664/97): microorganismos con inclusión de los geneticamente modificados, cultivos celulares y endoparásitos susceptibles de originar cualquier tipo de infección.

Agente biológico del grupo I: aquel que resulta poco probable que cause una enfermedad en el hombre.

Agente biológico del grupo II: aquel que puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.

Agente biológico del grupo III: aquel que puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo frente a él generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.

Agente biológico del grupo III: aquel que puede causar una enfermedad grave en el hombre y supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente frente a él profilaxis o tratamiento eficaz.

Barreras primarias (equipos de seguridad): se incluyen en este apartado tanto dispositivos o aparatos que garantizan la seguridad (por ejemplo, las CSB), como las prendas de protección personal (bata, mascarilla….)

HEPA: Filtro de alta eficacia para partículas en el aire.

BSL: nivel de seguridad (I, II, III o IV)

ANEXOSOLUCIÓNALOSCASOSPRÁCTICOS


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Respuestasalcasopráctico

UnidadDidácticaII

_El resultado negativo en la detección de anticuerpos VIH indica que el paciente se encuentra en el “periodo ventana” que corresponde a la fase de primoinfección.

Primoinfección: tras el contacto con el VIH se produce un periodo ventana de 4-12 semanas, que corresponde a la fase de la primoinfección y durante el cual no es posible detectar la presencia de anticuerpos específicos frente al VIH a pesar de existir niveles de viremia muy elevados. Durante este periodo “ventana” es posible detectar actividad citotóxica frente al VIH mediante la caracterización clonal de los linfocitos CD8 del paciente. La detección de actividad antiviral celular en ausencia de anticuerpos sugiere que la respuesta celular es más precoz e importante en el control inicial de la replicación viral que la síntesis de anticuerpos. Probablemente, ambos brazos de la inmunidad (humoral y celular) son importantes en el control de la replicación viral tras la primoinfección. Este control es el resultado del equilibrio entre los dos factores: la virulencia de las cepas infectantes y la intensidad de la respuesta antiviral generada por el huésped. La resultante de estos dos factores se refleja en la carga viral basal del paciente tras la primoinfección, que representa un dato de enorme valor pronóstico den la evolución de la infección, ya que indica el equilibrio alcanzado en un sujeto determinado entre el virus y su sistema inmunitario. En cualquier caso, esta respuesta antiviral es incapaz de erradicar el virus ya que se ha acantonado en las primeras horas de la infección en el organismo y se limita a contener (aunque sea en una proporción importante) la replicación viral. Se establece así una infección crónica persistente en el sujeto infectado.

UnidadDidácticaIII

_Esto es un ensayo de Western blot (WB) mostrando tres muestras de pacientes. El paciente B tiene un HIV positivo. El paciente C es negativo para HIV , y el paciente A tiene un resultado indeterminado para HIV que requiere seguimiento con tests posteriores para confirmar o descartar la infección.

El WB sirve como método confirmatorio del test de ELISA que se lleva a cabo inicialmente. El WB indeterminado puede ser el resultado de ELISA verdadero positivo que son no concluyentes en el WB en estadios iniciales de la enfermedad. Cerca del 10 a 20% de los ELISA positivos repetidos tienen un WB indeterminado. WB indeterminado pueden ser consecuencia de reacción cruzada por infección por HIV 2, o en estadios muy avanzados de SIDA donde la competencia inmunológico es baja. También pueden verse WB indeterminados en pacientes sin HIV por proteínas contaminantes, en embarazo, malaria, CMV y hepatitis virales. Alrededor de 3% de las personas con WB indeterminado se positivizarán y se demostrará la infección por HIV.

UnidadDidácticaIV

_En primer lugar si la herida sangra, debe permitirse el sangrado de forma profusa, eliminar posibles cuerpos extraños y lavarla con agua y jabón, no debiendo retrasarse esta maniobra para utilizar antisépticos, cuyo papel no ha sido demostrado y evitando maniobras agresivas (frotar bruscamente la zona lesionada) para evitar producir erosiones


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que favoreciesen la infección. Si se contamina piel no intacta, hay que lavarla con agua y jabón; Si lo hace la mucosa oral, se han de hacer irrigaciones con agua estéril. Ante una exposición accidental (pinchazo, etc.) de un profesional sanitario con una persona afectada de SIDA, VIH positiva o que rechace el estudio de su estatus serológico para el VIH, hay que informar al trabajador de los riesgos de infección y proceder a una valoración clínico-serológica lo más pronto posible, con el fin de descartar o confirmar la infección por VIH y valorar la indicación de profilaxis postexposición. Se le indicará que comunique cualquier episodio febril que suceda en las 12 semanas siguientes. Después de la valoración inicial, a los trabajadores seronegativos, se les repetirán las pruebas a las 6 semanas, a las 12 semanas y a los 6 meses para determinar si han sufrido la infección-algunos autores recomiendan prolongar el seguimiento hasta 12 meses dado que se han descrito seroconversiones tardías. Durante este periodo, sobre todo durante las 12 primeras semanas, deberán seguirse las recomendaciones para evitar una posible transmisión secundaria del VIH, como evitar donar sangre y utilizar preservativos en sus relaciones sexuales. Es vital mantener la confidencialidad profesional, si el accidente sucedió a partir de una persona seronegativa para el VIH, la evaluación basal y a las 12 semanas no será obligatoria, pero puede llevarse a cabo si el trabajador lo desea o el médico encargado lo aconseja.

Si la persona es seronegativa, pero lleva a cabo una conducta de riesgo para el VIH o el accidente sucede en una zona de alta prevalencia para el VIH, sería aconsejable efectuar la valoración clínica serológica, tal y como se indicó anteriormente. Hay casos descritos de infección por VIH en personal sanitario tras pinchazo accidental, a partir de una aguja utilizada en un usuario de drogas por via parenteral seronegativo para el VIH en el momento del accidente, pero con Ag p24 del VIH positivo. Si el status serológico no puede determinarse, las decisiones deben individualizarse de común acuerdo entre el trabajador accidentado y el médico encargado. Siempre que sea posible, es aconsejable almacenar suero en el momento del accidente, tanto del paciente como del personal sanitario, por si es preciso reanalizarlo en el futuro.

UnidadDidácticaV

_Dependiendo de las bandas que encontremos en el WB:

1- Una glicoproteína gp160, 120 o 41 con o sin bandas core: Informar indeterminado y solicitar un nuevo suero para descartar una seroconversión. Valorar pruebas complementarias (p24, PCR…).

2- Bandas core p17, 31, 24 y 55 u otras aisladas: informar indeterminado con informe final para la detección de anticuerpos VIH negativos y recomendar seguimiento entre 0,5-1 y 3 meses. Si hay reactividad de gp36 de VIH-2, descartar infección mediante pruebas de péptidos sintéticos para VIH1 y VIH2

_Los resultados indeterminados con el WB son la mayor fuente de ansiedad en los pacientes y desconcierto en los responsables del diagnóstico. Las causas de reactividades anormales en WB son muy variadas y aún no están totalmente esclarecidas. Se han descrito WB indeterminados en personas con factor reumatoide en suero, lupus eritematoso, hiperbilirrubinemias, infección por otros retrovirus, parasitosis y por otras causas. Si tenemos en cuenta que en la cubierta del VIH están presentes antígenos HLA


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podemos entender que hasta el 30% de los individuos multitransfundidos presenten reactividades en la prueba WB y se han descrito falsos positivos por dicha técnica.

Un resultado indeterminado en el WB del VIH-1 puede corresponder, por lo menos a 6 situaciones distintas:

1- Infección por VIH-2 u otros retrovirus próximos.

2- Seroconversión para el VIH-1, periodo en que, de modo progresivo, aparece cada una de las bandas del perfil completo de anticuerpos anti-VIH.

3- Enfermedad avanzada, cuando el deterioro inmunológico grave y la presencia de inmunocomplejos pueden reducir el título de anticuerpos anti-VIH-1 circulantes.

4- Niños nacidos de madres seropositivas, tanto si se trata de niños verdaderamente infectados como de portadores pasivos de anticuerpos maternos durante el primer año de vida.

5- Individuos africanos, quizás en relación con la mayor divergencia genética de las cepas africanas del VIH-1 en comparación con las americanas y/o europeas aunque la hipergammaglobulinemia secundaria a la hiperestimulación antigénica, frecuente en muchos africanos, también puede explicar el perfil atípico de bandas y la mayor frecuencia de falsos positivos en esta población.

6- Reactividad inespecífica o cruzada con anticuerpos tal y como se ha descrito en donantes de sangre.


120

_Algoritmo diagnóstico en la serología VIH

UnidadDidácticaVI

En la PCR además de los controles positivos y negativos se introduce un control interno en cada una de las muestras que se procesan para comprobar que todas las faese de la PCR (extracción de ácidos nucléicos ,amplificación y detección )

Si el control positivo o negativo no saliera dentro de los rangos establecidos se invalidarían los resultados de todas las muestras

Si es el control interno el que no está dentro de los rangos se invalidaría únicamente la muestra o muestras cuyo valor de control interno no sea correcto.


121

UnidadDidácticaVII

_ Habría que realizar alguna de las siguientes técnicas: clonación de los productos de amplificación, PCR mediante diluciones al límite, o PCR a tiempo real)

_Hoy por hoy estás técnicas no son aplicables a la rutina de un laboratorio de VIH por lo habría que enviar la muestra a un laboratorio de referencia.

Ninguno de los métodos genotípicos o fenotípicos asegura la detección de todas las variantes o cuasiespecies víricas que infectan al paciente. La mayoría de las técnicas sólo detectan una variante si esta representa más del 20% del total de la población. Para asegurar la detección de las variantes que representan menos del 20%, también llamadas variantes minoritarias, es necesario recurrir a técnicas especiales (clonación de los productos de amplificación, PCR mediante diluciones al límite, o PCR a tiempo real) que no son aplicables hoy por hoy a la rutina del laboratorio de secuenciación del VIH. Este hecho explica por qué los métodos que se utilizan predicen el fracaso de un fármaco pero no aseguran el éxito ya que las variantes minoritarias pueden ser portadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese fármaco en concreto.

UnidadDidácticaVIII

_En los laboratorios de microbiología clínica la mayoría de ensayos o pruebas serológicas se realizan con muestras clínicas en las que potencialmente existen agentes biológicos pertenecientes a los grupos 2 y 3. Por tanto, sería recomendable que el diseño del laboratorio de serología se dote, al menos, de las medidas correspondientes a un nivel de contención 2, siendo aconsejable para los laboratorios de nueva instalación un nivel de contención 3.

a)Ubicaciónydimensiones.

Para un nivel de contención 2, es aconsejable que el laboratorio de serología se encuentre separado de otras áreas de trabajo del laboratorio, así como, de otras zonas de actividad que se desarrollen en el mismo edificio. El tamaño y distribución dependerá, fundamentalmente, del número de autoanalizadores, sistemas robotizados, equipos y puestos de trabajo del mismo, en función de la cartera de servicios. Al ser estos más numerosos y voluminosos que en otras áreas del laboratorio de microbiología, no son del todo aceptables las recomendaciones de tamaño general dadas para otras áreas. Una forma de cálculo de la superficie total podría ser la basada en la experiencia de 177 proyectos de organización de laboratorios altamente automatizados efectuados en los últimos 9 años (datos no publicados y proporcionados por Javier Barreiro, comunicación personal). Consiste en multiplicar la superficie del mobiliario y los equipos por un factor de entre 1,7 y 2,0. También se podría aplicar la normativa general que aconseja 2 m2 libres por trabajador. A la hora de establecer el tamaño del laboratorio es importante tener en cuenta que algunos grandes equipos no se pueden mover, por lo que se recomienda una separación entre equipos suficiente que permita un fácil acceso a los mismos para funciones de mantenimiento y reparación, además de permitir la limpieza general del laboratorio.

Al igual que en otras zonas de trabajo del laboratorio, la puerta de acceso debe permanecer cerrada. En los puntos de acceso a esta zona de trabajo se aconseja que exista


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la indicación "RIESGO BIOLÓGICO. ACCESO RESTRINGIDO. SÓLO PERSONAL AUTORIZADO".

b)Diseño,instalacionesyequipos.

Como instalación de nivel 2, se recomienda disponer de un sistema de ventilación que proporcione una entrada de aire sin recirculación a otras áreas del laboratorio/edificio. Se aconseja, para los laboratorios de nueva instalación, la utilización de filtros HEPA o similar, en la filtración del aire extraído del área de trabajo, así como para la protección de las líneas de vacío.

Para algunos procedimientos es conveniente disponer de una cabina de seguridad de clase II, en este caso, el aire filtrado por las mismas, podrá recircular en el laboratorio, sólo si se verifica y certifica periódicamente su buen funcionamiento.

Debe existir, al menos, un lavabo en el laboratorio de serología dotado de grifos que puedan activarse o accionarse de forma automática, con píe/codo. También, se debe disponer de una estación de lavado de ojos.

Se aconseja que los suelos, paredes y techos sean impermeables al agua y resistentes a diferentes productos químicos (desinfectantes, disolventes, etc.), de forma que permitan una fácil limpieza y una posterior descontaminación.

Las mesas y bancos de trabajo deben ser resistentes al calor, a disolventes orgánicos, ácidos y álcalis y detergentes desinfectantes. Deben existir procedimientos de desinfección específicos.

El laboratorio de serología por ser una zona con tecnología y reactivos específicos es aconsejable que disponga de una zona de almacenamiento para reactivos y muestras (cámara fría, congeladores), así como de armarios de seguridad para determinados reactivos productos químicos y tóxicos.

Se debe disponer de un método validado de descontaminación y eliminación de los residuos específicos del laboratorio de serología.

Todas las áreas de trabajo del laboratorio de serología deben disponer de la señalización adecuada indicando su nivel de riesgo biológico y contención.

_ El director o jefe del laboratorio es el responsable de la seguridad, siendo obligación de la gerencia del centro la provisión de la dotación necesaria.

_ Las superficies de trabajo en el laboratorio deben de ser descontaminadas con el germicida químico apropiado, siempre que se contamine con sangre u otro líquido corporal y cuando se finalice el trabajo.

DERRAMESYSALPICADURAS

Es uno de los apartados más importantes por su frecuencia y porque las medidas a tomar son responsabilidad exclusiva del Laboratorio de Microbiología y bajo ningún concepto del personal de limpieza. El procedimiento empleado, bien protocolizado, debe estar contemplado en el Manual de Seguridad. Los derrames y salpicaduras pueden ser de muchos tipos: por pérdida de los diferentes envases, generalmente porque estén mal cerrados (ya que se supone que son los adecuados), por rotura de los mismos, vuelco, etc.


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y son muy frecuentes en la zona de recepción de muestras. Para actuar correctamente son muy recomendables las Estaciones de Seguridad.

Lavado. Primero se eliminan los restos groseros de cristal, plástico, agar, etc., después se lava con abundante agua y un detergente acuoso y a continuación se inicia la desinfección. Hay que tener en cuenta que cualquier sustancia orgánica (agar sangre, restos de peptona, etc.) es extraordinariamente bloqueante de la capacidad oxidativa del hipoclorito sódico y de la capacidad de actuación de los iodóforos; por ello, la norma es primero limpiar y después desinfectar.

Desinfección. Se empleará un desinfectante preferentemente líquido. Los más útiles en el laboratorio son:

1- Hipoclorito sódico. De elección para suelos, cerámica, etc. No debe usarse en superficies metálicas. Se utiliza a la dilución pertinente para conseguir 50000 p.p.m. de cloro libre. Se vierte haciendo un círculo alrededor del derrame, o mejor sobre papel absorbente, y se deja actuar 20 minutos.

2- Iodóforo. Se utiliza a la dilución indicada por el fabricante. Adecuado en superficies metálicas.

3- Alcohol etílico al 70%.

4- Productos detergentes desinfectantes. Agentes como Virkon® (peróxido tamponado con surfactante), de fácil manejo, no corrosivo, no irritante, especialmente activo en presencia de materia orgánica y que cambia de color cuando deja de ser activo.

BIBLIOGRAFIA


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Murray. Microbiología Médica. Ed Elsevier, 5ª Edición

CUESTIONARIO


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Cuestionario

1. Las fuentes de infección VIH son:

a) Sangre y tejidos b) Líquidos corporales c) A y B son correctas

2. Los tres genes principales del VIH son:

a) pol, gag y env. b) env , rev y gag c) env, pol y tat

3. Genes que codifican proteínas reguladoras del virus:

a) gag , pol, env b) tat, rev, nef c) vif, vpr, vpu

4. ¿Cuál de los siguientes virus no es un retrovirus?:

a) VIH 1 b) CMV (citomegalovirus) c) VIH-2

5. El genoma del VIH es:

a) ARN de cadena única. b) ARN de doble cadena. c) ADN de doble cadena.


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6. ¿Cuál de las siguientes no es una prueba de confirmación del VIH?

a) EIA b) RIPA c) IFI

7. La técnica de screening para la detección del VIH es fundamentalmente:

a) Inmunofluorescencia directa b) ELISA c) Cultivo viral

8. Las pruebas diagnósticas indirectas del VIH detectan:

a. ADN b. ARN c. Anticuerpos

9. El diagnóstico microbiológico indirecto se basa en la:

a) Respuesta inmune del huésped frente al microorganismo. b) Identificación del agente infectante en el producto patológico. c) Identificación de antígenos específicos en la muestra del microorganismo.

10. El riesgo de infección por VIH a partir de una punción con aguja contaminada con sangre de persona infectada con el VIH es del:

a) 0,3-0,5%. b) 0,09%. c) 1-2%.

11. De las siguientes afirmaciones, ¿Cuál es la falsa?:

a) Es frecuente la coinfección VIH y VHC por compartir las mismas vías de transmisión.

b) Infección por VIH es igual a SIDA. c) SIDA es igual a infección por VIH más enfermedad oportunista

12. La toxoplasmosis cerebral está clasificado según la OMS en:

a) El estadio 2 b) El estadio 3 c) El estadio 4

13. La evolución de las técnicas y antígenos utilizados ha reducido la aparición de falsos positivos al:

a) 2% b) 1% c) <1%


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14. Son causas de falsos positivos en pruebas séricas de detección de anticuerpos frente al VIH todas excepto:

a) Terapia inmunosupresora prolongada. b) Multitransfundidos. c) Multíparas.

15. Son causa de falsos negativos en la detección de anticuerpos VIH:

a) Cirrosis biliar primaria b) Neoplasias c) Lupus eritematoso sistémico.

16. El hallazgo de la p24 aislada en WB:

a) Puede persistir años en pacientes seronegativos VIH. b) Requiere seguimiento 3-6 meses para ver evolución. c) Repetir el WB 7 días más tarde.

17. Si obtenemos un resultado positivo con un EIA de 4ª generación en un segundo suero de un paciente (1º suero positivo) y un resultado negativo en el WB:

a) Se informará como negativo y recomendar nuevo análisis si persiste la indicación clínica.

b) Se informará como dudoso y se pedirá nueva muestra. c) Se repite el WB con ese mismo suero.

18. La PCR es una técnica:

a) Cromatografica b) Colorimetrica. c) Biologia molecular

19. La carga viral es:

a) El número de copias de ARN b) El número de virones circulantes en plasma. c) El número de copias de ARN multiplicado por dos

20. Un terrmociclador es un aparato empleado en la PCR para:

a) Medir el número de copias de ARN b) Medir la cantidad de plasma necesario para llevar a cabo la CVP c) Realizar los ciclos de temperatura necesarios para que se realice la PCR


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21. Los controles internos que se introducen en las muestras cuando se realiza una PCR tienen como objetivo:

a) Comprobar la estabilidad del reactivo utilizado en la técnica b) Comprobar el funcionamiento de los equipos utilizados c) Comprobar la correcta realización del proceso en todas sus fases/extracción,

amplificación y detección)

22. El llamado punto de corte clínico:

a) Se establece en base a la reproducibilidad del ensayo. b) Es el punto de corte ideal. c) Es una buena medida de la sensibilidad del virus a los antivíricos en estudio

con respecto a los que circulan en la población no tratada e infectada por el VIH.

23. ¿Está indicada la realización de las pruebas de resistencia en pacientes con infección aguda VIH sin tratamiento previo?

a) Siempre. b) Dependiendo del paciente. c) Sólo si anteriormente ha recibido algún tratamiento antirretroviral.

24. Las técnicas con virus recombinantes son:

a) Métodos genotípicos b) Métodos fenotípicos. c) Métodos de cultivo viral

25. En el método Phenosense:

a) El gen env se sustituye por un gen productor de luciferasa. b) El gen pol se sustituye por un gen productor de luciferasa c) El gen env se sustituye por un enzima productor de luciferasa.

26. ¿Cuántos niveles de contención hay en términos de bioseguridad en el laboratorio?

a) 2 b) 3 c) 4

27. Las cabinas de flujo laminar, ¿pueden utilizarse en el laboratorio de virología?

a) No pueden utilizarse pues no protegen al trabajador. b) Solo como zona limpia. c) Igual que en un laboratorio general de microbiología.

28. El acceso a un laboratorio con BSL 2 es:

a) Controlado con señal de advertencia de riesgo biológico. b) Restringido c) Restringido con señal de advertencia de riesgo biológico


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29. ¿Cuándo utilizaremos la CSB al manipular muestras enviadas para determinaciones de VIH?

a) Siempre. b) Cuando la técnica que estemos realizando tenga una alta probabilidad de

generar salpicaduras. c) Solamente se utilizará al realizar biología molecular (PCR)

30. Las muestras para estudio microbiológico deben obtenerse utilizando medidas barrera:

a. En enfermos con SIDA b. En enfermos con tuberculosis. c. En cualquier tipo de muestra.

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