Tema Exposicion Biologia Molecular

7/23/2019 Tema Exposicion Biologia Molecular

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Revisin

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Cuad Med Forense 2010;16(1-2):5-18

ResumenCada vez ms, los avances en identificacin gentica permiten la aplicacin de estas tcnicas a reas muy di-ferentes. Los progresos cientficos y tecnolgicos en las herramientas utilizadas en gentica forense han permi-tido nuevas aplicaciones de este campo en otras disciplinas. En este trabajo se pretenden abordar algunas deesas nuevas alternativas. La primera de ellas es la creacin de bases de datos genticas civiles que ha permitidoel desarrollo de dos programas de identificacin de personas: programa FNIX de identificacin de cadveresy restos humanos desaparecidos y la iniciativa DNA-PROKIDS que lucha contra el trfico de seres humanos ypretende reunir a las vctimas con sus familias. En la ltima dcada, cada vez con ms frecuencia aparece elanlisis del ADN en proyectos de historia, paleontologa, Es en estos casos donde nos encontramos con mues-tras antiguas. Por tanto, una segunda aplicacin es el trabajo con aDNA, del que mostramos varios ejemplos.Gracias a estas nuevas tcnicas se han podido identificar los restos de varios personajes histricos, el Zar Ni-cols II de Rusia, Cristbal Coln y sus familiares, Blanca de Navarra y el Prncipe de Viana y el general Miranda;as como la recuperacin de especies en peligro de extincin y la caracterizacin de elementos histricos. Porltimo, tienen gran importancia sus aplicaciones en biomedicina, ya que cada da es ms frecuente la colabo-

racin entre grupos forenses y otras especialidades mdicas. Dos ejemplos de ello seran, la caracterizacin demuestras provenientes de tumores y en la asociacin de enfermedades a haplotipos genticos.

Palabras clave: aDNA. Cncer. Base de datos genticas.

Abstract

More now than ever, advances in genetic identification allow the application of these new techniques to diffe-rent fields. Scientific and technological progress in the tools used in forensic genetics has permitted new im-plementations of this field to others. In this paper, some of the newest alternatives will be tackled. Firstly, thecreation of a civil genetic database has allowed the development of programs for human identification. FENIX,program, to identify corpses and missing human remains and DNA-PROKIDS that fights against human traf-ficking and hopes to reunite victims with their families. In the last decade, it is becoming more common toencounter DNA analysis in history projects, paleontology and so on. It is in such cases that we find ancientsamples. So, another application is the work with aDNA of which we will show some examples. Thanks to

these new techniques some historical remains of important personages have been identified, Zar Nicols II ofRusia, Cristobal Colombus and his relatives, Blanca of Navarra, the Prince of Viana and the general Miranda;as well as the recovery of some species in danger of extinction and the characterization of some historical ele-ments. Lastly, it has also a great relevance the applications of these techniques to biomedicine, given than thecollaboration between forensic groups and other medical specialities is more and more frequent theses days.Two examples of this situation will be the characterization of tumor samples and the association of somediseases with genetic haplotypes.

Key words: aDNA. Cancer. Genetic database.

Nuevas aplicaciones en identificacin

genticaNew applications in genetic identification

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MJ. lvarez-Cubero1

LJ. Mtnez.-Gonzalez1M. Saiz1

JC. lvarez1,2

JA. Lorente1,2

1Laboratorio deIdentificacin Gen-tica, Departamento deMedicina Legal.Universidad deGranada.2GENyO - Pfizer.Universidad deGranada.Junta de Andaluca.Centro de Gentica yOncologa.Armilla (Granada).

Correspondencia:

Dr. Jos A. Lorente Acosta

Laboratorio de Identifica-

cin Gentica. Departa-

mento de Medicina Legal.Avda. Madrid 11

18012 - Granada.

E-mail:

[email protected]

Fecha de recepcin:8.MAR.2010Fecha de aceptacin:8.MAR.2010


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MJ. lvarez-Cubero et al.


Introduccin

Este ao se cumplen 25 aos desde que Alec J. Jeffreys,profesor de Gentica de la Universidad de Leicester,descubri el primer locus polimrfico. Para hallareste marcador se emple una sonda de ADN arbitra-ria. De este modo se observaron fragmentos de msde 15 longitudes diferentes. Posteriormente, se en-contraron otros loci hipervariables que constaban derepeticiones en tndem de una secuencia de oligonu-cletidos (11 a 60 pb), de manera que las diferenteslongitudes de los fragmentos originados dependandel nmero de dichas repeticiones y se les denominVNTR (Variable Number of Tandem Repeat). Trasel descubrimiento de los primeros VNTRs se vio questos podan ser aplicados a la medicina forense y

sustituir a los marcadores clsicos. En un principio lacantidad de ADN necesaria, as como, el estado delmismo era un requisito indispensable para poder uti-lizar estos marcadores. Todas estas limitaciones fue-ron superadas gracias a la aplicacin en GenticaForense de una tcnica, la Reaccin en Cadena de laPolimerasa (PCR), que supuso una revolucin enmuchos campos de la Biologa y de la Medicina. Estatcnica, ideada en 1989 por Kary B. Mullis, permitique se pudieran obtener resultados de muestras bio-lgicas con mnimas cantidades de ADN.

A finales de los 90 aparecen en nuestro pas nuevastecnologas que permiten acelerar el proceso de

anlisis de las muestras. As el procesamiento deun centenar de perfiles genticos se poda realizaren un par de das. La aparicin de los analizadoresgenticos rpidamente desplaz a los laboriososgeles de acrilamida, que limitaban en gran medidalos resultados de un laboratorio. La electroforesiscapilar ha sido, durante estos ltimos quince aos,la herramienta ms utilizada por los laboratorios degentica forense.

Durante estos aos, los grupos de investigacin eneste campo se han esforzado en descubrir nuevosmarcadores, en nuestro genoma, que faciliten la re-solucin de los casos forenses: marcadores autos-

micos, ADN mitocondrial y cromosoma Y. En estalnea muchos grupos siguen buscando marcadoresdel tipo SNPs (polimorfismos de un nico nucle-tido) que nos den informacin sobre el fenotipo y laprocedencia geogrfica de una muestra biolgica.Tambin se ha intentado unificar en todas las po-blaciones el tipo de marcador utilizado, siendo elsistema CODIS (Combined DNA Index System)desarrollado en Estados Unidos por el FBI, el queha conseguido una mayor difusin.

Su aplicacin ha hecho que poco a poco fuera ne-cesario el uso de bases de datos genticos que

permitieran la bsqueda y el rastreo de perfiles com-parados, lo que ha permitido la incorporacin de

bioinformticos y bioestadsticos en los grupos de in-vestigacin forense.

Las nuevas plataformas de secuenciacin, as como,los nuevos kits de extraccin y purificacin de lasmuestras, asociados a robot de extraccin, son eneste momento las nuevas tecnologas de las que losgrupos comenzarn a disponer en breve. Estas nue-vas herramientas permitirn un aumento exponencialdel nmero de datos generados. Con lo que los gru-pos podrn analizar miles de muestras a diario, ytendrn que ser los nuevos software, expert system,los que valoren los resultados.

Toda esta experiencia, en el campo de la gentica, noslo ha mejorado la resolucin de los casos de filia-cin y criminalstica, sino que ha permitido que losgrupos de gentica forense aborden nuevos camposde investigacin, y que colaboren con otros gruposampliando as las fronteras de nuestra comunidadcientfica. En este trabajo se presentan algunas estasnuevas aplicaciones, que abordan el mbito social,histrico y sobre todo la ayuda a todas las especia-lidades biomdicas.

Aplicaciones en bases de datos genticas

Los avances cientficos y tcnicos en las herramientasmoleculares empleadas en gentica han hecho posi-ble su aplicacin en el campo de la gentica forenseteniendo un gran impacto social. Gracias a ellos sehan generado una cantidad de informacin extraordi-naria que ha de almacenarse de modo racional y or-denado para su posterior uso. Surge as la necesidadde las denominadas bases de datos, lugares dondese almacena de modo ordenado y coherente cual-quier tipo de informacin, que luego es rescatada demodo automtico de acuerdo a parmetros previa-mente establecidos. El acceso a las mismas es mso menos restringido, dependiendo de la trascenden-cia de los datos almacenados, siendo los ms prote-gidos aqullos que contienen informacin sobre laidentidad de las personas1-3.

Las bases de datos de identificacin gentica con-tienen nmeros y letras asociados al cdigo deidentificacin de una persona. Su acceso a losdatos debe de estar perfectamente controlado, y lasconclusiones que se pueden obtener de los mismosvan a depender de los programas informticos quese autoricen por las diferentes legislaciones. Depen-diendo del contenido de estas bases de datos sepueden diferenciar:

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Nuevas aplicaciones en identificacin gentica


Bases de datos forenses criminales: almacenandatos procedentes de personas que han sido

procesadas o condenadas, as como de indiciosbiolgicos encontrados en la escena del crimen.En algunos casos pueden considerarse perfilesde vctimas conocidas, con objeto de facilitar laresolucin de delitos. Su caracterstica principales que algunas de las muestras y datos consi-derados se obtienen sin el consentimiento delas personas implicadas.

Bases de datos forenses civiles: su nico fin esla identificacin de personas desaparecidas, locual se hace comparando el ADN de las perso-nas no identificadas con el de los familiares.Por sus caractersticas humanitarias, se re-quiere que los familiares colaboren de modo vo-luntario y tras firmar un consentimientoinformado, cosa que las diferencia de las basesde datos criminales siguiendo las consideracio-nes del protocolo de Helsinki.

Actualmente, la creacin de bases de datos forenseciviles permite el uso de stas con fines humanita-rios. ste es el caso de los proyectos que se desarro-llan actualmente en el Laboratorio de IdentificacinGentica de la Universidad de Granada; el programaFNIX y la iniciativa DNA-PROKIDS.

Programa FNIX

Se han hecho grandes esfuerzos en la identificacinde cadveres y restos humanos tras guerras, proble-mas socio-polticos y desastres en masa. En muchosde estos casos, el uso de la identificacin a travsde ADN ha ofrecido una respuesta definitiva en laidentificacin de las vctimas. La creacin de unabase de datos civil de personas desaparecidas nocompromete los derechos de los individuos ya quela donacin de las muestras incluidas en ella es vo-luntaria. Espaa fue el primer pas en establecer unabase de datos forenses civil. Debido a la dinmicade las sociedades modernas, constantemente se pre-sentan denuncias de personas desaparecidas ascomo se encuentran cadveres y restos humanos. Setrata de un problema universal, una situacin comnque no solo est relacionada con guerras o catstro-fes naturales. Es obvio que muchos de los cadveresy restos encontrados correspondern con personasdesaparecidas denunciadas.

En 1998, el grupo de investigacin del Departa-mento de Medicina Legal y Toxicologa de la Univer-sidad de Granada ide un programa de identificacingentica de personas desaparecidas (ProgramaFNIX) para la identificacin de cadveres o restos ca-davricos que no se pudiesen identificar empleando

mtodos tradicionales. Su finalidad era prestar ayudaa los familiares de las personas desaparecidas. ste

programa fue pionero en el mundo entero ya que an-teriormente no exista ni existe ninguna base dedatos con estos fines. sta iniciativa fue apoyadapor la Guardia Civil y el Ministerio del Interior2,3, loque permiti la creacin de un programa nacionalde identificacin de cadveres y restos de personasdesaparecidas.

El programa FNIX contiene dos bases de datos in-dependientes donde se pueden comparar automti-camente secuencias de ADN para identificar perfilesrelacionados entre s. Una se conoce como Base deDatos de Referencia que contiene informacin demicrosattiles de ADN nuclear y cromosoma Y as

como de secuencias de ADN mitocondrial de parien-tes que provienen de la lnea materna. Debido a queesta base de datos es una base no criminal, slo seencuentran en ella aquellos individuos que donan suADN de forma voluntaria y siempre tras firmar undocumento de consentimiento informado. La otrabase de datos se denomina Base de Datos Dubitaday contiene todos los perfiles de restos encontradosque no han podido ser identificados por mtodos cl-sicos como son, identificacin de huellas dactilares,parmetros antropolgicos, odontologa, rayos XActualmente, 800 familias de personas desapareci-das participan en el programa FNIX y se han lo-grado 350 identificaciones de restos encontrados3

(http://www.guardiacivil.es/prensa/actividades/FNIX/presentacion.jsp) (Figura 1).

Estrategias similares se estn implantando cada vezms en todo el mundo. En Brasil, donde en 2007se determin que existan 7287 cadveres y res-tos humanos sin identificar, se ha desarrolladouna herramienta bioinformtica para registrar ycomparar la informacin gentica y no gentica delas personas desaparecidas, sus familiares y cad-veres no identificados, Missing person Database-

gen4. Tras la guerra de la antigua Yugoslavia, el ICMP(International Commission of Missing Persons) des-arroll un programa de recogida de muestras de fa-miliares de personas desaparecidas para laidentificacin de todos aquellos cadveres y restosdesconocidos5.

Desde los primeros pasos del programa FNIX diver-sos pases del rea iberoamericana se mostraron in-teresados en su desarrollo. Algunos, incluso,pretenden poner en marcha un programa similar,dndose el caso de que, como en Colombia, se pre-tende que se denomine "FNIX-Colombia". En estepas, responsables del Laboratorio de Gentica delCTI (Centro Tcnico de Investigacin), adscrito a la

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Fiscala General de la Nacin, pretenden instaurarun sistema de identificacin gentica de personasdesaparecidas para paliar el gravsimo problema queen este sentido genera el elevado ndice de violenciaproducido tanto por la actuacin de la guerrilla comopor otras bandas de delincuencia organizada funda-mentalmente relacionadas con el narcotrfico. EnChile, el Servicio Mdico Legal, por orden del Parla-mento de este pas, pondr en marcha una base dedatos de muestras de detenidos-desaparecidos, ha-bindose solicitado la colaboracin del ProgramaFNIX. En USA, el UNT Health Science Center creel Texas Missing Persons DNA Database en 2001,una base de datos similar a FNIX espaola.

Iniciativa DNA-PROKIDS

Esta iniciativa, quiere ser una herramienta para lu-char contra el trfico de seres humanos, en especialde los ms dbiles, los nios. Segn la UNODC, Portrata de personas se entender la captacin, eltransporte, el traslado, la acogida o la recepcin de

personas, recurriendo a la amenaza o al uso de lafuerza u otras formas de coaccin, al rapto, alfraude, al engao, al abuso de poder o de una situa-cin de vulnerabilidad o a la concesin o recepcin

de pagos o beneficios para obtener el consenti-miento de una persona que tenga autoridad sobreotra, con fines de explotacin6-8.

Los nios, los individuos ms inocentes y frgiles dela sociedad, pueden ser sujeto de muchos tipos deabusos. Uno de stos es el trfico humano que se haconvertido en una actividad criminal lucrativa. SegnUNICEF, 300 millones de nios en todo el mundosufren violencia, explotacin y abusos incluyendo laspeores formas de explotacin laboral infantil, conflic-tos armados y prcticas dainas. En los EstadosUnidos se denuncian 800000 desapariciones denios al ao. De stos, aproximadamente 360000

se escapan, 340000 se clasifican como desapari-ciones sin explicacin plausible y unos 100000 sonsecuestrados por miembros de su familia u otros in-dividuos conocidos o han sufrido algn dao6,8.

Los gobiernos son conscientes de que el problemadel trfico humano es real y que se han de tomarmedidas inmediatas. Sin embargo, es convenientellegar a acuerdos internacionales para identificar lasposibles vctimas y los responsables de estos delitos.Pero las dificultades legales y sociales que existenralentizan el proceso de implementar un sistemacontra el trfico humano. Esto puede ser muy frus-

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Figura 1.

Identificacin de

cadveres y restos

humanos en el programa

FNIX


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trante para los cientficos que quieran ayudar desdeuna perspectiva humanitaria y disponen de las apli-

caciones tcnicas necesarias para asistir en la iden-tificacin de personas desaparecidas. Aunque lasinfraestructuras legales se desarrollen de forma lenta,no hay razn alguna para no implementar las herra-mientas analticas y las bases de datos para la iden-tificacin de los nios desaparecidos6,7.

DNA-PROKIDS es un proyecto internacional cen-trado en la lucha contra el trfico de seres humanosa travs de la identificacin gentica de las vctimasy sus familiares, especialmente en nios. Su metano se centra nicamente en la resolucin de crmenesdomsticos sino que se pretende extender los resul-tados a nivel mundial con el objetivo de estimular lalucha contra el trfico de seres humanos y ayudar aprevenir la misma, http://www.dna-prokids.org/9.

El proyecto DNA-PROKIDS se inici en 2004 a tra-vs del Laboratorio de Identificacin Gentica de laUniversidad de Granada. Tras un estudio piloto conpases de Centroamrica y Asia llevado a caboentre 2006 y 2008, se decidi la ampliacin defi-nitiva con alcance mundial. En 2009, con la cola-boracin de los Profs. Bruce Budowle y ArthurEisenberg del Centro de Identificacin Humana dela Universidad del Norte de Texas (UNT-HIC) y conla financiacin de BBVA, Caja Granada, FundacinMarcelino Botn (Banco Santander) y Life Tecnolo-

gies (EEUU) comenz la expansin internacionaldel proyecto. Actualmente se ha ampliado la cola-boracin inicio de la expansin mundial aChina, India, Indonesia, Filipinas, Nepal, SriLanka, Tailandia, Brasil, Guatemala y Mxico.

La principal misin de DNA-PROKIDS es identificara las vctimas y devolverlas a su familia (reunifica-cin); dificultar el trfico de seres humanos, inclu-yendo las adopciones ilegales, gracias a laidentificacin de las vctimas (prevencin); y obtenerinformacin sobre los orgenes, las rutas y los mediosde comisin del delito, claves para el trabajo de lasfuerzas policiales y judiciales (inteligencia policial).

Por otro lado, los objetivos de la iniciativa DNA-PROKIDS son:

Promover una colaboracin internacional siste-mtica y automtica a travs de la integracinen una misma base de datos mundial de datosgenticos para lograr:

Reintegrar a estos nios desaparecidos ensus familias gracias a la comparacin de suADN con el de los familiares de personasdesaparecidas susceptibles de haber sidovctimas de trfico de seres humanos.

Luchar contra las adopciones ilegales alcomprobar si las personas que entregan a

un menor en adopcin son los verdaderosfamiliares biolgicos (madre, padre, abue-los), para evitar que menores procedentesde raptos, robos o trfico de personas pue-dan ser dados en adopciones presunta-mente legales.

Estudiar y aplicar mejoras a los sistemas poli-ciales y judiciales de todo el mundo para queluchen ms eficazmente contra el trfico deseres humanos, especialmente de nios y mu-jeres.

Analizar y proponer una base legislativa comnpara la resolucin de este problema.

Evaluar e intentar solventar los problemas so-ciales y de comunicacin que impiden unalucha ms eficaz contra el trfico de seres hu-manos.

Ofrecer colaboracin para la coordinacin y laformacin de especialistas en identificacin delos diferentes pases.

DNA-PROKIDS emplea mtodos acreditados y acep-tados por la comunidad cientfica internacional parala identificacin gentica de las personas desapare-cidas. Los marcadores genticos de rutina que se es-tudian son aquellos STR incluidos en sistemas como

CODIS, ADN mitocondrial para confirmar la lneamaterna y STR del cromosoma Y para establecer re-laciones de tipo paterno-filial. Actualmente, se estndesarrollando paneles de SNPs (Single NucleotidePolymorphism) que nos van a permitir determinarcaractersticas fenotpicas de los individuos as comosu procedencia geogrfica y tnica. Con toda estagran cantidad de informacin se podrn crear basesde datos que nos permitirn la identificacin de losmenores vctimas de trfico humano y la reunifica-cin de stos con sus familias (Figura 2).

Desde 2005, el Laboratorio de Identificacin Gen-tica de la Universidad de Granada ha procesadoaproximadamente unas 1200 muestras dentro delprograma DNA-PROKIDS. En 2008 y 2009 se re-gistraron 107 casos englobados en el programa pro-cedentes de Guatemala. Por otro lado, durante estemismo tiempo el Centro de Identificacin Humanade la Universidad del Norte de Texas tambin ha lle-vado a cabo la identificacin de menores vctimasdel trfico humano. Desde principios de 2009, gra-cias al programa DNA-PROKIDS se han podido iden-tificar a 230 menores en 12 pases de todo elmundo. Durante el mes de Octubre de 2009 se ce-lebr en Granada la primera reunin cientfica DNA-PROKIDS donde expertos en identificacin gentica

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Figura 2.

Esquema de actuacin a

seguir por la iniciativa DNA-

PROKIDS

de todo el mundo se reunieron para elaborar un plande actuacin conjunto frente a casos de trfico hu-mano. En Enero de 2010, se reunieron en Filipinasel Dr. Jos Antonio Lorente y el Prof. Arthur Eisenbergcon los expertos del DNA Analysis Laboratory of theNatural Sciences Research Institute y del Philip-pine Council for Advanced Science and TechnologyResearch and Development con el fin de informar yasesorar a estos organismos sobre esta iniciativa. Elda 01 de Febrero de 2010 se present en Madrid enuna rueda de prensa organizada por la AECID y elMinisterio de Asuntos Exteriores la oferta formal delGobierno espaol al de Hait para que se desarrollede modo urgente y especial el programa DNA-PRO-

KIDS, tratando de detener el trfico ilegal de meno-res (incluidas adopciones ilegales) y el apoyo a lareunificacin familiar en este pas tras el terremotodel 12 de Enero de 2010.

Aplicaciones en muestras antiguas

Las tcnicas empleadas en gentica forense estnprincipalmente basadas en la determinacin de frag-mentos y secuencias de ADN. Las muestras que nor-malmente se encuentran en el campo de la

criminalstica no suelen ser el material idneo paratrabajar con las tcnicas clsicas de biologa molecu-lar. Con mucha frecuencia el ADN que se consiguede estas muestras tiene unas caractersticas quehacen necesario el desarrollo de nuevos protocolos ytecnologas para obtener resultados.

Las caractersticas del ADN en los casos de crimi-nalstica son: su bajo nmero de copias (materialbiolgico en escasa cantidad y daado), fragmenta-cin (segmentacin del ADN en distintos tamaosinferiores al inicial), inhibicin (aparicin de partcu-las que dificultan hacer copias del contenido gen-tico) y modificaciones estructurales en la secuencia

de bases del ADN10.

Los grupos de investigacin que se enfrentan a estetipo de ADN solucionan las dificultades empleandonuevos procedimientos y tecnologas para solventarlos problemas citados anteriormente.

Obtener la mxima cantidad de ADN posible:Es fundamental en este tipo de casos no per-der ADN de la muestra de partida11, ajus-tando los protocolos de extraccin hasta elpunto de finalizar este tratamiento obteniendo unaconcentracin de ADN similar a la de partida.


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Esto se realiza mediante el uso de filtros con-centradores o diseando Kits especficos paracada muestra de partida.

Disear estrategias que reduzcan el tamao delADN problema: eliminando los problemas defragmentacin del ADN, utilizando primers den-tro de un pequeo rango en pares de bases odiseando parejas de primers o kit multiplexcon rangos de amplificacin no mayores a los250pb12,13.

Purificar el extracto de ADN: mediante deter-gentes, agentes quelantes, lavados con solucio-nes hipotnicas, materiales absorbentes,Dependiendo del tipo de iones o molculas quenos impidan que la amplificacin del ADN de

nuestra muestra, se proceder al tratamientoadecuado con una tcnica u otra14-16.

Conocer los procesos que ocurren en el ADNantiguo y degradado10,17-19: las reacciones deoxidacin (cambios en los azcares de lasbases), la radiacin, las reacciones hidrolticas,los procesos de degradacin enzimtica,... Re-sultados que pueden aparecer en este tipo deADN: mezclas o contaminacin con otros ADN,prdida de la heterozigosidad, uniones cruza-das de fragmentos o fragmentos y primer, intro-duccin de bases errneas,... Este ltimo puntoha hecho que se estudien de manera exhaus-tiva los protocolos de amplificacin y secuen-

ciacin, nmero de ciclos, temperaturas, diseode primers; caractersticas que debe de tenerun laboratorio forense y qu criterios de calidaddebe seguir, as como, qu tipo de ADN y zonasde ste, de toda nuestra dotacin gentica, sonms tiles para la realizacin de un estudio de-terminado.

El conocimiento y puesta a punto de estos protocolosy tcnicas, as como la investigacin en cada uno delos campos citados, ha permitido a nuestro grupo eldesarrollo de multitud de proyectos y colaboracionescon otros grupos en este campo.

Cuando se tiene la capacidad de hacer anlisis deADN antiguo, se abre un nuevo campo de accin. Aligual que en el campo de la criminalstica, el estudiodel ADN en casos antiguos puede hacer cambiar unadecisin judicial. El estudio de ste en nuevos pro-yectos con tejidos biolgicos antiguos puede cambiarla historia de un personaje, de una especie La his-toria es una ciencia que ha sabido aprovechar lasnuevas tecnologas para aumentar el nmero de ele-mentos que apoyen una teora. El ADN no es la pri-mera, se ha utilizado el carbono 14 desde hace aospara datar piezas y as recomponer hiptesis en in-vestigaciones de sucesos histricos. Dentro de las

metodologas de la historia, el ADN no es una herra-mienta para reinterpretarla, sino un instrumento ms

para ayudar al resto de las fuentes de trabajo clsi-cas (textos, grabados, materiales,).

Estos proyectos, como vemos, no estn incluidosdentro del campo forense, pero hacen de sta cien-cia, cada da ms, una herramienta multidisciplinar.

Identificacin de personajes histricos

Uno de los primeros casos histricos donde la iden-tificacin gentica se ha convertido en una herra-mienta decisiva ha sido en el caso del Zar Nicols IIde Rusia. El ADN mitocondrial y el cromosoma Ypermitieron confirmar el fallecimiento del Zar NicolsII Rusia y de sus familiares, siendo este el fin de sudinasta20-22.

Pocos aos despus se comenz desde la Universi-dad de Granada el proyecto de identificacin de al-gunos de los personajes ms importantes de lahistoria de nuestro pas, Blanca de Navarra y el Prn-cipe de Viana. El estudio puso de manifiesto que nin-guno de los restos encontrados en la momia que seasuma como el cuerpo del Prncipe de Viana coinci-da con los de Blanca de Navarra, madre del prn-cipe. Todas las secuencias de ADN mitocondrialeditadas pertenecan a individuos distintos. Se en-contraron hasta tres huesos con distinta procedenciaen la momia del Prncipe de Viana. Estos resultadosse pueden explicar debido a que en el sepulcro dePoblet exista un caos de huesos, fruto de los distin-tos saqueos que haba sufrido. Estudios realizadosen el ao 2008 por otros grupos corroboran los datosque se obtuvieron en nuestro laboratorio a finales dela dcada de los 90 confirmando la existencia dems de un individuo en la momia del Prncipe.

Adems del citado, uno de los proyectos ms tras-cendentes y de mayor repercusin fue la identifica-cin gentica de Cristbal Coln y sus familiares, unproyecto internacional y multidisciplinar con el obje-tivo de descifrar algunos de los enigmas del famosoAlmirante. El objetivo principal de este proyecto fuedeterminar el lugar donde se encontraban sus restos,Repblica Dominicana y/o Sevilla.

El estado de los huesos, de Cristbal Coln y de suhermano Diego, era mucho peor del esperado por eltiempo trascurrido, los distintos viajes del fretro deColn y la poca cantidad de material encontrado enla tumba de la Catedral de Sevilla. Igualmente losrestos de Diego, debido a las filtraciones de agua, seencontraban en un estado muy deteriorado. De todoslos laboratorios participantes en el proyecto, solo enalgunos se obtuvieron resultados. Se encontraron


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coincidencia en los resultados, pero los fragmentosde ADN mitocondrial obtenidos fueron muy peque-

os, con lo que fue difcil afirmar una inclusin. Lasuma de los datos obtenidos por todos los partici-pantes antroplogos, historiadores, fueron los quenos permitieron afirmar que los restos encontradosen la catedral de Sevilla, pertenecan al almirante.De todas formas este proyecto no se finalizar hastaque las autoridades de la Repblica Dominicana nopermitan contrastar estos datos con los restos delmausoleo levantado en Santo Domingo. La cantidadde huesos encontrados en la catedral de Sevilla nodescarta que ambas tumbas compartieran la pose-sin del los restos de Coln, algo que suceda fre-cuentemente en los traslados de cadveres depersonajes famosos y reliquias.

En este momento, nuestro grupo de investigacin rea-liza, en esta misma lnea, la identificacin de los restosde El Primer Venezolano Universal, Francisco de Mi-randa. El general Venezolano, S. Francisco de MirandaRodrguez (Caracas, 1750 San Fernando (Cdiz),1816) se considera como el precursor de la indepen-dencia americana del Imperio espaol. Particip entres de las guerras ms importantes a favor de la de-mocracia: la Independencia de los Estados Unidos,la Revolucin francesa y las Guerras de Independen-cia Hispanoamericana. Francisco de Miranda debidoa la firma de un acuerdo con los espaoles, temiendouna derrota en una de sus batallas, fue traicionado

y entregado a las autoridades espaolas, por lo queestuvo apresado hasta el da de su muerte, en La Ca-rraca, prisin en San Fernando, Cdiz. Sus restoshan compartido un osario comn con otros muchosrestos de esos mismos aos. Estudios preliminaresde antropologa fsica han delimitado el nmero derestos ha clasificar.

Hasta ahora, se han podido obtener los perfiles deADN mitocondrial de muchos de estos restos al igualque de algunos de los familiares del panten comnde sus descendientes. Pero an queda un largo ca-mino hasta finalizar este estudio. Son muchos losrestos encontrados en ambos lugares y existe incer-

tidumbre tanto en la muestra problema como en lade los familiares de referencia.

Biorrecuperacin de especies

Uno de los problemas que se estn ocasionando enla sociedad actual es la prdida de biodiversidad. Laextincin de muchas de las especies, que hace solounas dcadas habitaban nuestros bosques y ros, esalgo que ocurre cada vez con ms frecuencia.

Una de las especies con mayor peligro de extincines el esturin. Gracias a la colaboracin con el

Departamento de Gentica, se ha podido participaren un proyecto para la recuperacin de esta especie

en el ro Guadalquivir.Los esturiones (FamiliaAcipenseridae) se distribu-yen exclusivamente en el hemisferio Norte. Estnconsiderados fsiles vivientes, existiendo actual-mente una disminucin continua de estos peces enlas poblaciones, hasta el punto de ser consideradasespecies en peligro de extincin.

Se conoce la existencia de la especieA. sturio en lapennsula Ibrica, pero hasta hace poco se crea quela especieA. naccarii era endmica del Mar Adri-tico, y que no formaba parte de las especies carac-tersticas en la pennsula Ibrica.

Al estar extinguidas estas especies en el Guadalqui-vir, se recurri a piezas de museo disecadas o guar-dadas en formol. Se analizaron tres especiescapturadas en el ro Guadalquivir de mediados de los70 y principios de los 80, conservadas en la EstacinBiolgica de Doana, una del ro Ebro, del InstitutoBotnico de Barcelona y uno ms del Departamentode Zoologa de la Universidad de Granada.

Se cre un protocolo especfico para la extraccin deADN de estos esturiones, consiguiendo resultados entodos ellos. As, dos de ellos fueron A. naccarii,otros dosA. sturio y el quinto un hbrido de ambos.Con lo que se concluy que la especieA. naccariicoexista en Espaa con laA. sturio.

Estos datos permitieron comenzar la recuperacin dela especie en el Guadalquivir con la especieA. naccarii.En este momento se est trabajando con xito en cau-tividad en la piscifactora Sierra Nevada.

Tras estos primeros xitos, durante este ltimo ao seha comenzado una nueva lnea de investigacin a par-tir de restos fsiles de esturiones encontrados en yaci-mientos arqueolgicos. De esta manera se intentaresolver la disyuntiva de cul de las especies actualesera la autctona de la pennsula Ibrica (Figura 3).

Caracterizacin de elementos histricos

Gracias a la colaboracin con el Departamento dePintura de la Universidad de Granada se ha podidotrabajar con uno de los dos ejemplares del Cornms antiguos que se conservan en Espaa. Se tratade la edicin facsmil de un Corn Andalus delsiglo XIII, recuperado en un hallazgo fortuito en lalocalidad malaguea de Ctar.

El trabajo de nuestro grupo ha consistido en la carac-terizacin del pergamino en el que estaba editadoeste ejemplar y determinar el origen de la piel con elque se haba realizado la edicin del Corn.

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El pergamino es un material hecho a partir de la pielde una res u otros animales, fabricado para poder

escribir sobre l, mediante un proceso de eliminacindel velln, adobado, blanqueado y tras un estira-miento final se consiguen las lminas con las que seelabora el libro.

La antigedad y el valor de ste no permitan tomarun fragmento completo de una hoja del Corn, asque, utilizando las tcnicas ms avanzadas dentrodel campo de la gentica forense, se tomaron comomuestras de partida los pelos del animal que subsis-tan sobre el pellejo manufacturado.

Se ajustaron los protocolos de extraccin de pelos23

adaptndolos a este tipo de material tan manipu-lado. An ms crtico fue el diseo de primers24, se

escogi el ADN mitocondrial de las distintas especiescandidatas Ovis aries, Bos taurus, Sus scrofa do-mestica y Capra aegagru. El tamao del amplicnescogido fue menor a las 200pb. Se ajustaron todoslos protocolos de amplificacin y secuenciacin. Unavez obtenida la secuencia del material amplificado,se introdujo el resultado obtenido en BLAST (NCBI),Basic Local Alignment Search Tool, una herramientagratuita que permite comparar las secuencias pro-blema con una base de datos que contiene todas lasespecies caracterizadas hasta la fecha. Las secuen-cias obtenidas a partir de los pelos del pergaminoprodujeron una homologa del 100% con la especieBos taurus. Estos resultados nos permitieron carac-terizar el tejido y determinar la especie con la quese haba producido el soporte de esta edicin delCorn.

Los resultados obtenidos han proporcionando el co-nocimiento necesario para ubicar su elaboracin y eltratamiento de los materiales, tanto en este ejemplarcomo en otros que se elaboraron en torno al siglo XIII(Figura 4).

Aplicaciones en biomedicina

En el seno de las ciencias biomdicas, se vea a la

medicina Legal como un campo poco relacionadocon el resto, sin embargo, disciplinas como la gen-tica han conseguido aunar y cooperar con el resto.Dentro del campo forense, uno de los pilares ms re-levantes y determinantes en ciertos casos y tipos demuestras es la gentica. Si bien, en el campo de labiomedicina, se han observado tambin cada vezms tipos de enfermedades en las que juega unpapel fundamental y pueden ser explicadas por estaciencia. Ejemplos de esto son, enfermedades comola diabetes, el cncer, la esquizofrenia Gracias aque en el campo de la gentica forense se trabaja con

muestras en pequea cantidad y normalmente encondiciones poco ptimas, se han conseguido opti-mizar al mximo las tcnicas de extraccin y proce-samiento de las muestras forenses para obtener unmayor rendimiento de las mismas. Estas tcnicas taneficientes pueden extrapolarse en los casos mscomplejos de muestras biomdicas (como por ejem-plo en cncer), obteniendo unos resultados con unacalidad muy elevada, difcil de igualar con otras tc-

nicas de extraccin o procesamiento. Sin embargo,no slo nos valdremos de las tcnicas mediante lasque tratamos las muestras para la obtencin de lainformacin gentica, sino que tambin se emplea-rn las mismas regiones del ADN. Los STRs (ShortTandem Repeats), o microsatlites, que se hanusado en medicina forense por mostrar elevados ni-veles de polimorfismos a nivel poblacional, no obs-tante el anlisis de los STRs es tambinampliamente usado en el mapeado de enfermedadesgenticas o en estudios de inestabilidad gentica detumores25.


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Figura 3.

Tcnicas empleadas para el

corte y limpieza de un

escudete dorsal de esturin

Figura 4.

Detalle de un fragmento del

Corn Andalus


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Figura 5.

Observamos el fenmeno de

LOH en el marcador D5S818

y la aparicin de mayor

nmero de alelos en la

imagen inferior

Caracterizacin de muestras provenientes detumores

En las muestras tomadas a partir de tejidos cancer-genos o muestras oncolgicas se pueden destacardos tipos de alteraciones frecuentes. Una de las al-teraciones genticas ms comnmente encontradasen los tejidos cancerosos son las LOH (prdida deheterocigosidad, del ingls Loss of heterocigosity) y

las MSI (inestabilidad de microsatlites, del inglsMicrosatellite inestability). Como se sabe, los micro-satlites son repeticiones mltiples de 1 a 5 nucle-tidos que estn distribuidas por todo el genoma.Debido a su estructura repetitiva, son susceptibles aerrores durante el proceso de replicacin. La inesta-bilidad en microsatlites (MSI) se origina por unmecanismo de reparacin postreplicativo errneo.Se caracteriza por una contraccin o expansin enla longitud de los STR. Hoy en da, se conocen va-rios genes cuyos productos estn involucrados eneste mecanismo y que estn mutados en determi-nados tumores, como es el caso del cncer colo-rrectal hereditario no polipoide. En clnica, se handiferenciado ya dos tipos de MSI, MSI-low (MSI-L)y MSI-high (MSI-H), segn la incidencia del lociinestable26.

El fenmeno de LOH es relativamente frecuente entejidos tumorales, y est ocasionado por delecionesque causan inestabilidad cromosmica manifestadaen el desarrollo de tumores con aneuploida y prdi-das frecuentes de heterocigosidad (LOH) en mlti-ples locus, as como mutaciones que activanoncogenes e inactivan o bloquean genes supresores(Figura 5).

Todo esto es interesante conocerlo ya que va a su-poner un problema a la hora de intentar obtener in-formacin gentica del tejido o muestra encuestin. Si se analizan los STRs tpicamente estu-diados en gentica forense, nos podemos encontrarante la situacin de que algunos de ellos se veanafectados por el proceso de LOH, y por tanto obte-ner falsos homocigticos o heterocigticos para de-terminados marcadores.

Gracias a que se ha ampliado el anlisis y uso de losSTRs al mapeado gentico de enfermedades y al es-tudio gentico de inestabilidad en tumores, se hacomprobado que la incidencia de inestabilidad ge-ntica afecta al conjunto de STRs que se usan co-mnmente en identificacin forense Esto se hacorroborado con varios estudios en muestras depacientes con cncer27. De hecho, se han encon-trado alteraciones en STRs en los que existe un ta-mao de nuevos STRs que oscila entre -4 y +4unidades de repeticin, y otras muestras en las quese han encontrado alelos intermedios en determina-dos marcadores. Incluso el marcador de la ameloge-

nina, se ha hallado alterado en determinadassituaciones, encontrndose casos en los que determi-nados varones se han genotipado como XX. Este l-timo ejemplo, ocurre en situaciones en las que laaltura del cromosoma Y desciende por debajo de un20% con respecto al alelo correspondiente al cromo-soma X, por lo que si se analiza la muestra con unrango del filtro elevado, perderamos el cromosoma Yobteniendo un genotipo errneo en ese marcador.Vemos que hay que mantener precauciones tantoen el filtrado como en la eliminacin de extrapicosen los casos de muestras oncolgicas ya que


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vamos a encontrar con una mayor asiduidad degra-daciones de la muestra en gran cantidad de marca-

dores allicos25

.En estudios de caracterizacin realizados por nuestrogrupo de investigacin en colaboracin con la red deBancos de Tumores de la Junta de Andaluca, se haobservado la aparicin de los fenmenos anterior-mente citados al estudiar las lneas tumorales. El ge-notipado de cada una de las distintas muestras deestas lneas ofrece un perfil caracterstico. Se com-prueba la aparicin de gran cantidad de extrapicos,que no alcanzan una altura muy elevada, pero queno deben excluirse puesto que son los que nos in-dican de la presencia de fenmenos tumorales enesa muestra, manifestada por la alteracin de lasregiones de ADN analizadas.

Un segundo fenmeno que puede aparecer en estasmuestras es la alteracin en sus genotipos. En loscasos de LOH, no se han detectado, hasta el mo-mento, que ambos alelos se delecionen, pero enMSI, ambos alelos pueden verse afectados. Depen-diendo de la etapa de expansin del tumor, los alelosoriginales pueden perderse y el tumor puede originarun nuevo genotipo.

Se han descrito, otro tipo de alteraciones al trabajarcon muestras tumorales. Existen casos en los que,al tratar un tumor y suministrar al paciente inmuno-supresores, esta situacin de disminucin de clulas

linfocticas hace que un tumor inactivo se manifieste.Con este proceso observamos dos situaciones; unade ellas, es la importante presin selectiva que rea-liza el sistema inmune evitando que se active unapoblacin celular tumoral existente en un individuo.Otra, es la problemtica al realizar un genotipado delindividuo, pues se ha comprobado en un caso detumor renal que determinados alelos del individuoafectado se ven alterados, dificultando por tanto ob-tener un genotipo fiable. Sin embargo, esta situacinse puede complicar ms, se ha comprobado que trasun periodo de trasplante y tratamiento con inmuno-depresores, el perfil gentico que se obtiene del in-dividuo trasplantado, coincide con el donante en

determinadas regiones allicas y en determinados te-jidos28. Otro fenmeno similar se ha detectado al re-alizar la caracterizacin de una biopsia en ellaboratorio de identificacin gentica de la Universi-dad de Granada. Desde la unidad de Gentica, delhospital Infanta Cristina, se enviaron muestras debiopsias fijadas en parafina. Se recibieron estasmuestras de las que existan sospechas previas deque un paciente trasplantado hubiese podido des-arrollar un tumor proveniente de un tumor inicial-mente del donante. Los estudios previos realizados alanalizar la biopsia del tejido tumoral del paciente

trasplantado revelaron que el tumor de este no eraun tumor primario. El anlisis realizado en Badajoz

indic de igual manera que su origen era embriona-rio. Los anlisis realizados en nuestro laboratoriomanifestaron que la muestra cancergena del pa-ciente posea un perfil que presentaba un cambiocon respecto a la muestra del paciente. En estamuestra de la biopsia aparecieron nuevos picos queno se podan explicar con los fenmenos descritosanteriormente (LOH y MSI). La muestra una vez ex-trada ofreci un perfil de mezcla. El trabajo forensehabitual del grupo, al estar acostumbrados a mani-pular muestras con mezclas ms o menos equilibra-das, nos hizo ver que en la muestra de la biopsiaapareca el perfil de otro individuo. Este perfil coin-cida con el perfil gentico del rgano trasplantado

(el perfil del donante). Las sospechas de nuestroequipo y de la unidad de Gentica se hicieron firmesal ver los perfiles de la biopsia del tumor, del rganotrasplantado y del paciente, poniendo de manifiestoque el tumor que sufra el paciente provena de untumor metastsico del donante. Este caso alerta de lanecesidad de nuevas metodologas para el cribado derganos trasplantados, para poder asegurarnos quejunto con el rgano no exista ningn tipo de clula ma-ligna acompaante, ya que el rgano del donantehaba pasado los protocolos previos necesarios parael trasplante. En los casos de determinadas muestrasoncolgicas el procedimiento de anlisis de las mis-mas es muy similar al usado con muestras de mez-

clas, tpicas de agresiones sexuales. En estos casos,tambin vamos a encontrar mezcla de varios perfilesgenticos y debemos de ser precavidos a la hora derealizar un filtrado al analizar la muestra, pues pode-mos eliminar el perfil que est presente en un menorporcentaje y por tanto perder informacin gentica derelevante importancia. Situaciones anlogas las en-contramos en los casos en que tratemos con muestrasoncolgicas similares a las descritas con anterioridad.

En el caso del cncer, el ejemplo anterior no es elnico donde se ha demostrado la existencia de clu-las tumorales circulantes. Varios estudios presentanresultados que apoyan la hiptesis de la existencia de

clulas tumorales circulantes en sangre perifrica omdula sea en pacientes con cncer de mama que seencuentran en la fase previa a la manifestacin de me-tstasis29. Esto puede complicar un proceso de iden-tificacin gentica cuando se recurra a una muestrade sangre y se obtenga informacin gentica afectadapor este fenmeno patolgico, donde se pueden en-contrar poblaciones de clulas afectadas por el tumory poblaciones inalteradas. Integrantes de nuestrogrupo de investigacin en colaboracin con investiga-dores del centro GENyO estn desarrollando con xitouna lnea de investigacin en esta materia, consi-guiendo caracterizar clulas tumorales circulantes.

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Como vemos, ante muestras procedentes de indivi-duos con cncer debemos de tomar muchas precau-

ciones a la hora de interpretar los resultadosgenticos. Esto se agrava sabiendo que esta patolo-ga ocupa un porcentaje elevado en la poblacin, y sise recurre al genotipado en el caso en el que el indi-viduo desconoce estar afectado. Otros de los factoresa tener en cuenta es la posible problemtica a lahora de la repeticin de la muestra, ya que tal vez elmaterial afectado puede ser limitado. Si bien, en loscasos en los que se trabaja con muestras cancero-sas, se recomienda el cotejado de los resultados conms de una extraccin para evitar dar informacingentica errnea, en estos casos en los que la inter-pretacin de los perfiles genticos de un individuopuede ser muy compleja.

Asociacin de enfermedades a haplotiposgenticos

En determinadas patologas, como en la diabetestipo-2, se han encontrado mutaciones puntuales queparecen jugar un papel principal en el desarrollo dela enfermedad. As mediante la bsqueda y caracte-rizacin de SNPs, podemos realizar un estudio deta-llado de la enfermedad al comparar individuoscontrol con pacientes afectados30. Casos similares sehan reportado en un estudio de esquizofrenia en losque cuatro SNPs y haplotipos determinados se handemostrado que generan un aumento en la asocia-

cin con esquizofrenia31. El papel de los haplogru-pos (grupos poblacionales relacionados con elADNmt) ha servido como clave para eventos comoel origen del hombre moderno. A su vez, nos daidea de las similitudes entre unas poblaciones yotras por compartir haplogrupos mitocondriales.Actualmente, aunque siguen teniendo gran impor-tancia en el campo de la gentica de poblaciones,estn ganando relevancia en el rea de la biome-dicina, ya que se ha visto que determinadas en-fermedades tienen una mayor prevalencia enalgunos haplogrupos.

Estudios enfocados con este nuevo punto de vista seestn llevando a cabo con el cncer de prstata en

el Laboratorio de Identificacin Gentica de la Uni-versidad de Granada en colaboracin con LORGENG.P. Se poseen muestras de saliva y de sangre de in-dividuos controles y de individuos afectados por estapatologa, intentando realizar un estudio para sealarlos SNPs ms predominantes entre la poblacinafectada. Gracias a este estudio, se podr realizar unpanel de SNPs muy til para prevenir y diagnosticarprecozmente el cncer de prstata familiar, sustitu-yendo el uso actual del PSA como predictor de estapatologa (Figura 6).

Agradecimientos

Todos estos proyectos no podran haber sido reali-zados sin las personas que han trabajado, y actual-mente siguen colaborando con nuestro equipo entodos y cada uno de los estudios e investigacionescitados anteriormente:

Ramn Corts Mrquez, Teniente coronel, Jefede la Comandancia de la Guardia Civil de Ceutay Jos A. Garca Snchez-Molero, Jefe del Ser-vicio de Criminalstica.

Profs. Bruce Budowle y Arthur Eisenberg, Cen-tro de Identificacin Humana de la Universidad

del Norte de Texas. Marcial Castro y Sergio Algarrada, Impulsores

del proyecto Coln.

Miguel Botella, e Inmaculada Alemn del Labo-ratorio de Antropologa Fsica.

Francisca Robles y Manuel Ruiz Rejn, Depar-tamento de Gentica de la Universidad deGranada.

Teresa Espejo Arias, Departamento de Pinturade la Universidad de Granada.

Raquel Rodrguez Lpez. Unidad de Gentica

del Hospital Infanta Cristina, Badajoz.

Jos Manuel Czar. Hospital Universitario Vir-gen de las Nieves. Granada.

Mara Jos Serrano y Ana Fernndez. GENyO -Pfizer-Universidad de Granada-Junta de Anda-luca Centro de Genmica y Oncologa.

Y especialmente a nuestros compaeros Car-men Entrala Bernal, Francisco Fernando Ro-sado, Encarnacin Garca Ruz y EstherMartnez Espn. LORGEN GP.

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Figura 6.

Distinta prevalencia de los

SNPs en la regin D541E

en poblacin andaluza y

finlandesa


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