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ANTECEDENTES

Acuicultura

La palabra acuicultura significa "cultivo en el agua". Designa a todas las actividades que involucren el cultivar plantas o animales en el agua, tomando al agua como soporte y medio nutricio. Esta actividad agrupa el cultivo de organismos tanto de agua dulce como de agua salada (Hispanica, 1990).

Desde tiempos muy remotos han sido muchos los pueblos interesados en el cultivo de animales acuticos, sin embargo slo recientemente se ha valorado en su justa medida la importancia de la acuicultura, tanto desde el punto de vista econmico como del alimentario. El hombre, agricultor y ganadero desde hace miles de aos se ha desempeado en el medio terrestre, sin embargo en las ultimas dcadas ha iniciado el cultivo en los ocanos y las costas (Hotsman, 1985).

La acuicultura intensiva, pretende obtener una gran produccin en un espacio reducido, para lo cual dispone de mltiples recursos tecnolgicos. En el desarrollo de la acuicultura se requiere prestar atencin a los costos de produccin, donde el sector alimenticio es lo ms importante.

Los requerimientos nutricios de los animales han de conocerse a la perfeccin, para que la alimentacin sea la adecuada y el crecimiento resulte ptimo. (Hispanica 1990; Sukenik y Col., 1991; Carie' y Col., 1993).

El cultivo de las algas constituye potencialmente la forma ms interesante de acuicultura ya que pueden sintetizar sus propios alimentos de manera similar a las plantas de origen terrestre y adems son la fuente primaria de alimentacin de la mayora de los organismos marinos (Dawes, 1986; Marshall, 1987).

Las algas microscpicas se desarrollan en tanques de distinta capacidad, a los que se aaden todas las sustancias inorgnicas y orgnicas requeridas por el vegetal. En estos tanques se controla la luz, el pH, la salinidad, la temperatura y el resto de los factores vitales que intervienen en el proceso. Parece imposible controlar la totalidad de los factores que rigen el desarrollo de una especie, pero cuanto ms se controlen, ms se acerca al ideal. (Cousteau, 1982; Hispanica, 1990).

Generalidades de las Microalgas

Las microalgas son organismos que pueden vivir en estado libre, y pueden formar agregados y colonias en lo que constituye un rudimentario principio de organizacin superior (Marshall, 1987).

Son plantas microscpicas fotosintticas, no vasculares que contienen clorofila "a"; poseen estructuras reproductoras simples y flotan libremente, pero con movilidad limitada (Cousteau, 1982; Dawes, 1986; Marshall, 1987 e Hispanica, 1990).

Las microalgas pueden ser: auttrofas, auxtrofas y hetertrofas de acuerdo a la obtencin de sus nutrimentos. Se denominan auttrofas cuando son capaces de satisfacer sus requerimientos nutricios solo de fuentes inorgnicas y de luz como fuente de energa para su desarrollo. Auxtrofas son aquellas incapaces de crecer sin un suministro de compuestos orgnicos especficos que no pueden sintetizar por ellas mismas como las vitaminas por ejemplo la vitamina Bn. Hetertrofas son aquellas que obtienen el carbono y tal vez el nitrgeno, el fsforo y el azufre que requieren a partir de fuentes orgnicas disueltas. Pueden ser fagocticas, absorbiendo partculas enteras de comida por medio de visceras para la digestin o pueden ser osmotrficas absorbiendo sustancias solubles a travs de la membrana plasmtica, son saprfitas si lo obtienen del material muerto y parsitas si lo obtienen a expensas de otro (Rost y Col., 1985; Dawes, 1986).

La reproduccin de las algas puede ser asexual, por divisin longitudinal o transversal, o por medio de esporas, como ocurre en las algas unicelulares; sexual, en la que dos clulas, o gametos,

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procedentes de individuos distintos se unen para dar una clula huevo (Campbell, 1992).

Clasificacin de Algas

La primera clasificacin de algas se bas en la pigmentacin. Su importancia an se considera cuando se habla de los distintos tipos de algas verdes o pardas. Actualmente se consideran las siguientes caractersticas para definir los principales grupos de algas: presencia o ausencia de flagelos, caractersticas de los flagelos (nmero, longitud, punto de insercin, presencia o ausencia de pelos o escamas), composicin de la pared celular, tipo de producto sinttico almacenado y el tipo de clorofila (Rost y Col., 1985; Marshall, 1987).

Hasta la fecha debido a los diferentes factores que afectan la clasificacin de microalgas como son su bioqumica, citologa y hbitat, ha constituido un tema de discusin ya que existen casi tantos esquemas de clasificacin como autores sobre el tema (Sumich, 1982; Rost y Col., 1985; Dawes, 1986 e Hispanica, 1990). En la Figura 1 se muestra la divisin, clase y orden a la cual pertenece la especie de Isochrysis.

En general, las clases de algas que ms se utilizan en el campo de la acuicultura son las diatomeas (Chaetoceros gracilis, Skeletonema costatum, Phaeodactylum tricomutum), Cloroficeas (Dunaliella tertiolecta,

Figura 1Divisin, clase y orden a la cual pertenece la especie de Isochrysis sp.#

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Tetraselmis chuii) y Haptoficeas (Pavlova lutheri, Isochrysis galbana) (Voltolina y Col., 1991).

Generalidades de Isochn/sis sp.

Isochrysis sp. pertenece a la clase Prymnesiophyceae (Haptoficeas), la cual es comnmente cultivada como fuente de alimento para la produccin comercial en acuicultura. Es un fitoflagelado de color amarillo, de alto valor nutricio; su tamao va desde 6 a 8 mieras. Como se aprecia en la Figura 2 consta de dos flagelos mviles y de dos cloroplastos laminados por clula. Posee escamas orgnicas. Su rgano ms importante es el haptonema circundado por pequeos microtbulos. Habita en climas templados, su crecimiento ptimo esta dentro de un rango de temperatura de 16 a 20C, a una salinidad de 25 a 28% y una iluminacin de 4000 lux aproximadamente. Esta alga ha sido utilizada por muchos investigadores en estudios de cintica, nutricin, bioqumica y en acuicultura como alimento para adultos y estadios larvarios de moluscos, principalmente ostiones, ya que es fcilmente digestible debido a que es un flagelado desnudo y a que su tamao es pequeo (Voltolina y Col, 1991; Dawes, 1986 y Sukenik y Col, 1991).

Figura 2.- Dibujo simplificado de una Isochrysis.Usos de las Microalgas

Desde la antigedad se utilizan las microalgas como parte de la alimentacin humana y como medicina en varias partes del mundo. Los aztecas en Mxico utilizaban las microalgas para enriquecer sus dietas. Los japoneses la consumen desde el ao 274 a.C. como un complemento saludable y sabroso de su dieta a base de arroz. En China desde hace miles de aos que emplean varios tipos de algas como alimento. Hoy se usan las microalgas como complementos alimenticios aceptados ampliamente por los naturistas (Rost, 1985; Dawes, 1986).

En los ltimos aos se ha promovido el cultivo de algas unicelulares, cuyas aplicaciones son mltiples, tanto como alimento de crustceos, moluscos y peces herbvoros como para la obtencin de metano y otras sustancias qumicas importantes, por ejemplo a nivel industrial para la obtencin de ficocoloides, como cido alginico, carragenina, agar, laminarina y alginato entre otros y en la agricultura es utilizado para la produccin de forrajes para la alimentacin animal, otra aplicacin es la obtencin de inculos de suelos como son acondicionadores y fertilizantes (Hortsman, 1985; Rost, 1985 e Hispanica 1990).

El rea donde la utilizacin de las microalgas ha alcanzado mayor auge es en la acuicultura en la produccin de alimentos para organismos marinos principalmente en estadios larvario (Hortsman, 1985; Ben-Amotz y Col., 1987; Carie', y Col., 1992; O'Connor, y Col., 1992; Wikfors, y Col., 1992; Csavas, 1993). En la Figura 3 se puede apreciar un esquema sobre el uso de las microalgas en la alimentacin de diferentes organismos acuticos. Actualmente se han hecho trabajos experimentales donde ha tenido xito el utilizar dietas artificiales en forma de microencapsulados proteicos para soportar el crecimiento de larvas de ostin, pero hasta el momento no se ha logrado reemplazar comercialmente a las microalgas por alimento artificial ya que este ltimo carece de flotabilidad, y debe tener una relacin adecuada de nutrientes, siendo por esta razn que la acuicultura a nivel comercial depende de la produccin y uso de algas unicelulares como alimento de larvas de crustceos y moluscos bivalvos. (Jones y Col., 1975; Chu y Col., 1982; Millamena y Col., 1988 y Epifanio, 1983; Walford, 1991).Microalgas

Microalgas

Figura 3.- Esquema sobre el uso de microalgas.#

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Composicin Qumica de las Microalgas

La composicin qumica de las microalgas es muy variable debido a factores tales como especie, poca del ao, nutrimentos, temperatura, fotoperiodo, salinidad, fuente de carbono, intensidad y color de la luz entre otros (Fabregas y Col., 1987 y Sukenik y Col., 1993).

En el trabajo hecho por Ben-Amotz y Col. (1987) se estudiaron 5 diferentes microalgas y su composicin qumica fue en promedio para protena 30 %, carbohidratos 25 %, Lpidos 21 % y el resto de otros compuestos no clasificados. En particular la composicin qumica de Isochrysis galbana es para protena 34.9 %, carbohidratos 11.0 % lpidos 20.1 % y de otros compuestos 34 %.

Protenas

Los aminocidos constituyen un 90-98% del total de protena. El valor nutricio de la protena esta determinado por su contenido y disponibilidad de aminocidos. Las proporciones de aminocidos individuales no varan entre las diferentes especies de algas. (Webb y Col., 1983 y Dortch y Col., 1981; citado en Brown y Col., 1989).

La composicin de aminocidos del alga es totalmente similar a la protena del huevo de gallina (la que es considerada de alta calidad nutricio para el humano), sin embargo este ltimo es rico en metionina y bajo en arginina. (Teshima y Col., 1986).

Algunos aminocidos pueden ser indisponibles en la digestin animal, ya que la seccin de absorcin de la molcula puede estar enlazada por otra molcula. Por ejemplo el grupo de aminocidos libres de lisina puede algunas veces estar enlazado con carbohidratos. Esto ocurre comnmente en el secado de algas y debe ser tomado en cuenta cuando se utilizan algas secas como alimento animal (Walford, 1990).

La produccin de protenas depende de los requerimientos de la especie en particular y se ve afectado conforme aumenta o disminuye la cantidad de nitrgeno en el medio de cultivo, debido a la relacin nitrgeno:fsforo (N:P) (Fabregas y Col., 1989). El contenido de protenas de la microalgas decrece tambin proporcionalmente con el incremento de la edad del cultivo (Mykelestad y Huag, 1972).

La protena en la especie Isochrysis galbana no se ve afectada por la intensidad de luz, permanece estable en un rango de 6.9 pg de protena/clula en un rango entero de irradiacin (Sukenik y Col., 1991).

Carbohidratos

La composicin de carbohidratos en las especies de algas no es muy detallado (Chu, 1982; Whyte, 1990). Los monosacridos y oligosacridos constituyen del 45-90% de la fraccin total de carbohidratos. Los principales azcares son glucosa, galactosa, maosa, y ribosa, con otros azcares en proporciones variables. El perfil de carbohidratos vara grandemente en las diferentes especies de algas (Whyte, 1990).

Los carbohidratos presentes en clulas de diatomeas son reservas de polisacridos y constituyentes de la pared celular (Myklestad y Haug, 1972).

Fabregas y Col., (1989), encontraron que la fuente y concentracin de nitrgeno, afectan el contenido de carbohidratos por clula. Cuando las concentraciones de nitrgeno se incrementan, el contenido total de carbohidratos de los cultivos se incrementa proporcionalmente a la concentracin de nitrgeno.

La intensidad de luz es otro factor que afecta la composicin bioqumica de las algas, se ha observado que la produccin de carbohidratos se incrementa de manera proporcional a la intensidad de la luz (Bustillos-Hurtado, 1992).

Lpidos

Gran parte de los lpidos de las microalgas son steres de glicerol y cidos grasos. La composicin de los lpidos puede variar por diversos factores como son la combinacin de luz, nutrientes, nitrgeno (nitratos) y temperatura (Sukenik y Wahnon, 1991). En estudios realizados al respecto, se han encontrado que las deficiencias de nitratos y fosfatos afecta directamente el contenido de este componente (Bustillos- Hurtado, 1992).

La fraccin de lpidos puede ser dividida en dos categoras: lpidos polares (los cuales incluyen los fosfolpidos y fracciones glicolpidas) y los lpidos neutrales (los cuales incluyen los triglicridos, diglicridos, hidrocarburos, alquenones, esterles y pigmentos) (Brown y Col., 1989).

Pigmentos

Los pigmentos mayoritarios de muchas algas son la clorofila verde y amarilla y los carotenoides anaranjados o rojos, los cuales contribuyen entre 0.5-5% del peso seco de la clula (Ben-Amotz y Col., 1985; Fabregas y Col., 1986; citado en Brown y Col., 1989).

La clorofila "a" es el principal pigmento fotosinttico en todas las algas, su complemento es la clorofila "b" que es fundamental junto con la clorofila "a" en las algas verdes, la clorofila "c" junto con la clorofila "a" se encuentran en las algas cafs. El pigmento celular contenido en la especie Isochtysis galbana decrece en forma exponencial al incrementar la intensidad de luz (Sukenik y Wahnon, 1991).

Minerales

La fraccin mineral del alga puede constituir una proporcin del peso seco, en un rango del 6 al 39%. Las algas proporcionan una fuente de minerales a los animales de cultivo, aunque tambin contienen trazas y iones de metales pesados, los cuales pueden tener desventajas si estos metales son txicos. Entre los iones de mayor importancia bioqumica que se encuentran en las microalgas son el fsforo, slica (diatomeas) magnesio, calcio, sodio, potasio, cloro, fierro y zinc, manganeso, cobre y cobalto se presenta en cantidades traza (Lee y Col., 1982; Kanazawa, 1983; Nose, 1972; Stowe, 1987; citado en Brown y Col., 1989).

Vitaminas

Las algas son fuente significativa de casi todas las vitaminas. Las vitaminas que generalmente contienen las microalgas son tiamina (Bi), riboflavina (B2), piridoxina (B), cobalamina (B12), biotina, cido ascrbico (C), cido nicotnico, cido pantotnico, colina, inositol, tocoferol (E), y /Carotenos (provitamina A). La vitamina K ha sido detectada en cantidades traza. Los precursores de la vitamina D tambin han sido aislados de las algas (Hollick, 1984; citado en Brown y Col., 1989).

Muchas algas requieren vitaminas, particularmente tiamina, cianocobalamina y biotina (Valenzuela-Gomez y Ocao-Fuentes, 1993). En la especie Isochrysis galbana las vitaminas son un factor clave para su crecimiento (Anaya y Gmez; 1993).

Condiciones de Extraccin de Protenas

Todos los mtodos espectrofotomtricos necesitan una extraccin previa de la protena a partir del paquete celular de las algas, lo cual es #

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comnmente llevado a cabo mediante el tratamiento de las muestras con hidrxido de sodio diluido durante un rango de tiempo y a temperatura constante. Normalmente se observa que todos los procedimientos son reproducibles manteniendo constantes la temperatura, tiempo de extraccin y la normalidad del hidrxido de sodio. En la prctica, se ha comprobado que cada especie requiere de condiciones especficas de extraccin debido a sus caractersticas morfolgicas en especial a los componentes de la pared celular en las diversas clases de algas.

En trabajos anteriores se intent cuantificar protenas, pero el contenido determinado fue reducido debido a los extensivos pretratamientos y al largo tiempo de extraccin (Raush, 1981).

En la Tabla 1 se muestran las diferentes condiciones ptimas de extraccin para algunas microalgas.

Mtodos de Determinacin de Protenas

Existen cuatro opciones para la determinacin del contenido de protena en algas: 1) Ensayo fluoromtrico, 2) La estimacin por alfa- aminocido-nitrgeno despus de una hidrlisis cida, 3) La evaluacin por el contenido total de nitrgeno despus de la digestin Kjeldahl, 4) La medicin espectrofotomtrica de protena. Esta ltima posibilidad es

Tabla 1.-Diferentes condiciones de extraccin de varios tipos de microalgas.

Especie de alga

NaOH (N)

Condiciones de Extraccin Temperatura (C) Tiempo (min)

Euglens gractlis

0.1

55

3

Seenedesmus spee

1.5

100

20

Calorella ellipsoldes

1.0

37

18h

Cydotella ame

0.1

100

60

Aphartizomenon bloom

1.0

100

3

Thallassiosire pseudo

0.1

55

100

Oscillatoria redekei

0.1

100

10

Skeletonema costatum

0.2

100

30

Chaetoceros sp.

0.1

100

10

Tricornutum

0.1

100

20

Pavlova lutheri

0.1

80

10

Tetraselmis sp.

0.1

100

10

FUENTE: Rausch, 1981; Lopez-Elas, 1990yLpez-Elas, 1992.

la ms utilizada ea acuicultura y puede referirse al mtodo de Lowry, de Bradford o a la medicin por la reaccin de Biuret (Dorsey, 1977; Peterson, 1979; Harrison y Col., 1988).

Mtodo de Kjeldahl

El mtodo Kjeldahl es el ms aceptado para la determinacin de protenas. En este el nitrgeno de las protenas y de otros compuestos orgnicos, se convierten a sulfato de amonio por medio de la digestin con cido sulfrico en ebullicin en presencia de un ion metlico como catalizador (cobre o mercurio). El residuo de la digestin se enfra, se diluye con agua y se le agrega hidrxido de sodio. El amonio presente se desprende y a la vez se destila y se recibe en una solucin de cido brico que luego se valora con una solucin cida estandarizada (Coombs, y Col. 1988).

Mtodo de Lowry

Este es el mtodo ms utilizado para la determinacin de protenas debido a su simplicidad, sensibilidad y precisin. La principal desventaja de ste mtodo es la falta de especificidad ya que existen sustancias que pueden interferir con la reaccin al momento de la determinacin, aunque son pocas las que se encuentran al realizar el mtodo; otras desventajas menos serias incluye el rango relativamente lento de reaccin y la no linealidad de la curva estndar a ms de 100 microgramos (Peterson, 1979; Peterson, 1983; Harrison y Col., 1988).

El mtodo de Lowry y Col. est basado en el reactivo Folin-Fenol propuesto por Folin y Ciocalteau. El constituyente activo es la mezcla de cido fosfomolbdico-tungstnico que es una mezcla cromgena.

La reaccin se fundamenta en la reduccin que efectan las protenas del cido perdiendo 1, 2 3 tomos de oxgeno con lo cual se produce una o varias especies reducidas del cido las cuales tienen un color caracterstico azul (con una longitud de onda mxima de 745-750 nm y una mnima de 405 nm). El cobre es agente quelante en la estructura peptdica y facilita la transferencia de electrones a la mezcla de cidos cromognicos, particularmente en la vecindad de los grupos de aminocidos esenciales, por eso se incrementa la sensibilidad de la protena (Peterson, 1979; Coombs y Col., 1988).

Los grupos cromognicos en la protena para los cuales el mtodo de Lowry y Col. es sensible fue estudiado por Chow Goldstein (citado en Malara y Charra, 1972). Los principales aminocidos cromognicos son tirosina y triptfano y un poco menos utilizados cisterna, cistina e histidina. El color desarrollado por la protena en este mtodo por la protena en este mtodo depender de tirosina y triptfano (Malara y Charra, 1972; Peterson, 1979).

Aunque la valoracin del color de la mezcla de los aminocidos libres es aditiva, el color producido en los pptidos puede ser ms o menos que la suma de los componentes de aminocidos libres dependiendo de la secuencia, largo de la cadena y la disposicin del grupo funcional (Peterson, 1979).

Mtodo de Biuret

En solucin fuertemente alcalina todos los compuestos que contienen dos o ms enlaces pptidos reaccionan con sales de cobre para dar un color violeta. Esta reaccin se utiliza para un ensayo cualitativo de protena. Cuando se cuantifica proporciona una medicin colorimtrica til de la protena (Coombs y Col., 1988).

Mtodo de Biuret-Folin

Este mtodo es simple, combina el Mtodo de Biuret y el reactivo de Folin para dar la especificidad del mtodo de Biuret y la sensibilidad del mtodo de Lowry y tiene la caracterstica de ser igualmente cromognico con el nitrgeno de las diferentes protenas. Tiene la

desventaja de no tener una linealidad absoluta cuando se emplean rangos grandes de absorbancia y de que los resultados no se obtienen rpidamente ya que requiere de un calentamiento de 100 min. (Dorsey y Col., 1978).

Mtodo de Bradford

En este mtodo la protena es teida con el colorante Coomasie azul brillante. Se basa en que el pico de absorcin mxima de este colorante se encuentra entre los 465 a 595 nm cuando el colorante se encuentra unido a la protena. Es un mtodo muy sencillo y tiene una gran sensibilidad (aproximadamente cuatro veces el mtodo de Lowry), la desventaja que presenta este mtodo es que no da una respuesta lineal con las diferentes protenas, especialmente cuando la concentracin de stas es mayor a 60 mg (Harrison y Thomas, 1988).