Tesis biologia 2011

1

UNIVERSIDAD DE PANAMÁ

CENTRO REGIONAL UNIVERSITARIO DE AZUERO

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y

TECNOLOGÍA

ESCUELA DE BIOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

TESIS

«« DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddee llaa CCaalliiddaadd MMiiccrroobbiioollóóggiiccaa ddee mmuueessttrraass

OObbtteenniiddaass eenn ssuuppeerrffiicciieess ((vviivvaass ee iinneerrtteess)) ddee 33 EExxppeennddiiooss DDee

CCoommiiddaa EEnn CChhiittrréé»»

PPOORR::

DDAARRIINNEELL MMUUDDAARRRRAA

CC..II..PP.. 66-- 771122-- 445522

YYIIHHAANNAA RRÍÍOOSS

CC..II..PP.. 66-- 770099--22440077

CCHHIITTRREE,, HHEERRRREERRAA,,

RREEPPÚÚBBLLIICCAA DDEE PPAANNAAMMÁÁ,,

AABBRRIILL,, 22001111..

2

UNIVERSIDAD DE PANAMÁ

CENTRO REGIONAL UNIVERSITARIO DE AZUERO

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y

TECNOLOGÍA

ESCUELA DE BIOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

TESIS

«« DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddee llaa CCaalliiddaadd MMiiccrroobbiioollóóggiiccaa ddee mmuueessttrraass

OObbtteenniiddaass eenn ssuuppeerrffiicciieess ((vviivvaass ee iinneerrtteess)) ddee 33 EExxppeennddiiooss DDee

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DDAARRIINNEELL MMUUDDAARRRRAA

CC..II..PP.. 66-- 771122-- 445522

YYIIHHAANNAA RRÍÍOOSS

CC..II..PP.. 66-- 770099--22440077

CCHHIITTRREE,, HHEERRRREERRAA,,

RREEPPÚÚBBLLIICCAA DDEE PPAANNAAMMÁÁ,,

AABBRRIILL,, 22001111..

Trabajo de Graduación,

como requisito parcial, para

optar por el Título de

Licenciatura en Biología con

orientación en Microbiología

y Parasitología.

3

Comité Asesor

Profesora: Martha Chaves de Von Chong MSc.

Facultad de Ciencias Naturales, Exactas

y Tecnología. Escuela de Biología.

Departamento de Microbiología y

Parasitología.

[email protected]. ___________________

Asesora Principal

Profesor: Alexis De La Cruz Lombardo MSc.

Facultad de Ciencias Naturales, Exactas

y Tecnología. Escuela de Biología.

Departamento de Microbiología y

Parasitología.

[email protected] __________________

Coasesor

mailto:[email protected]

4

DEDICATORIA

A Dios que es la razón de mi existir y me ha dado la fortaleza, paciencia y sabiduría durante la realización de mi trabajo.

A mis padres, en especial a mi madre María E. Ramos y a mis

hermanos Yeni María, Edinel y Yoel Mudarra quien me ha brindado su

amor, cariño y apoyo a través de los años.

A una persona especial, Estbeshlany Sánchez que me ha apoyado desinteresadamente para cumplir con esta etapa de mi vida.

A mi cuñado Farid Bobadilla que me ayudó de una forma u otra para la culminación de mi proyecto.

A mi abuela Lucia Quintero y a mis tíos que quienes con su amor y

oraciones me ha servido de inspiración y ayuda para culminar con este

estudio.

DARINEL

5

DEDICATORIA

Durante éstos últimos años de lucha y esfuerzo puedo decir con gran

orgullo, gracias a Dios por permitirme llegar casi a la cúspide de mis

más grandes y anhelados sueños; y por tal motivo, quiero dedicarte este trabajo.

A mi querida Madre y mi querido Padre, porque para mí son un

ejemplo, ya que con su ayuda sincera y desinteresada han sabido llevarme adelante, brindarme consejos y todo su apoyo.

A mi querido abuelo Pipo, que fue un ejemplo de Esposo, Padre,

Abuelo, Amigo. Permitiéndome ser una persona de bien, te dedico este

logro, ya que eres mi más grande inspiración.

A mis hermanas Yohany y Yohan por su apoyo sincero.

A una persona especial, Blin por su ayuda sincera y desinteresada.

A mis primitos José, Enrique, Juanky, porque me han servido de inspiración para culminar este trabajo de graduación.

A mis abuelos y tíos y demás familiares por sus sacrificios, esfuerzos y apoyo incondicional.

Los quiero a todos por su apoyo, su cariño y no duden que trataré de

avanzar sin temor frente a los obstáculos que se presentes en el camino y sabré sobrepasarlos por ustedes.

Los quiero con todo el corazón

Yihana

6

AGRADECIMIENTO

Primeramente le agradecemos a Dios por otorgarnos la sabiduría y la salud para lograrlo.

A los dueños de los expendios de comida y a sus empleados por permitirnos realizar ésta investigación.

A nuestros asesores de tesis, la profesora Marta de Von Chong, al

profesor Alexis de La Cruz; por darnos el apoyo y los conocimientos necesarios para lograr esta meta.

A la profesora Priscila González y al profesor Hernán Córdoba por su amabilidad, por facilitarnos sus conocimientos, tiempo e ideas.

Y por último, les agradecemos a todos los profesores de la Escuela de

Biología y a todos nuestros compañeros y amigos porque de una forma

u otra aportaron su granito de arena en esta investigación.

Darinel y Yihana

7

INDICE GENERAL

RESUMEN

INTRODUCCION

CAPITULO I

1. Alteración de los Alimentos…...………………………………………………….…5

2. Biofilm. Crecimiento sobre superficies……...……………………………………...5

2.1. Etapas en la Formación del Biofilms Bacterianos en Relación con los

Alimentos……………………………………………………………………………….5

2.2. Importancia del Control Higiénico en las Superficies

Alimentarias………………………………………………………………………….…6

2.2.1. Biofilm en superficies vivas……..……………………………………..6

2.2.2. Biofilm en superficies inertes………………..……………………..….7

2.3. Resistencia del Biofilm a los Diferentes Sistemas de Desinfección..………...7

3. Fuentes de Contaminación…………………………………..……………………...7

3.1. Principales Fuentes Contaminantes……..………………………………….....8

3.1.1. Ambiente……….………………………………………………………..8

3.1.2. Clientes…………..………………………………...………………….....8

3.1.3. Equipos (superficies inertes)……………….………………………..…8

4. Contaminación Cruzada de los Alimentos……………………………….…….….9

8

5. Microorganismos Patógenos en los Alimentos……………………….….….…...9

6. Generalidades de los Parámetros Microbiológicos Evaluados en la

Investigación…………………………………………………………………………10

6.1 Mesófilos aerobios……………….……………………………………………10

6.2. Coliformes totales...…………………………………………….…………....10

6.3. Escherichia coli……………………………………………………….……....11

6.4. Hongos…………………………………………………….…………………..11

6.4.1. Hongos filamentosos………………………………………………....12

6.4.2. Levaduras………………………………………………………...…..13

7. Características de los Medios de Cultivo y Pruebas Utilizadas para la

Investigación…………………………………………….………………………...…13

7.1. Medios de pre-enriquecimiento……………….…...……………………....13

7.1.1. Caldo Peptonado……………………...…………………………….13

7.2. Medios de enriquecimientos……….……………………………...……….14

7.2.1. Plate Count Agar (PCA)…………………………...……………....14

7.2.2. Agar Endo Less……………………………..……………………....14

7.2.3. Agar Papa Dextrosa (PDA)………………………………..………..14

8. Pruebas Realizadas para Caracterizar Microorganismos en el Estudio……...14

8.1. Tinción de Gram……………………………………………..………….….14

9

8.2. Catalasa………………………………………………………………...15

8.3. SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad)………………………………………15

8.4. Prueba del Citrato……………………………………………………..15

8.5. Prueba de Indol………………………………………………………..16

9. Normas Microbiológicas Internacionales para Expendios de Comida (Normas

peruanas y mexicanas)……………………………………………………………...17

9.1. Normas para superficies inertes…………………………………………….17

9.2. Normas para superficies vivas…………………………………….………...17

Capítulo II

1. Materiales, Equipos, Medios de Cultivos y Diseño Experimental……..….....20

1.1. Materiales y Equipos…………………………………………………….….20

1.2. Medios de Cultivos…………………………………………………………..20

2. Metodología…………………………………………………………………….21

2.1. Ubicación del Estudio………………………………………………………21

2.2. Diseño

Experimental………………………………………………………………….….21

2.3. Toma de Muestra……………………………………………………….….22

2.4. Procesamiento………………………………………………….…………...22

3. Pruebas Realizadas para Evaluar los Microorganismos Estudiados….23- 24

10

CAPITULO III (RESULTADO Y DISCUSIÓN)

RESULTADOS……………………………………………………………….……25-37

DISCUSIÓN………………………………………………………………………..38-40

CAPÍTULO IV (CONCLUSIONES, RECOMENDACIONES, BIBLIOGRAFÍA

Y ANEXOS).

CONCLUSIONES…………………………………………………………………….42

RECOMENDACIONES……………………………………………………….....43-44

BIBLIOGRAFÍAS………………………………………………………………...45-47

ANEXOS……………………………………………………………………….….48-58

11

INDICE DE CUADROS

Cuadro N° 1. Límites microbiológicos aceptables para coliformes totales, E coli y

patógenos en superficies inertes según las normas peruanas……………..………17


patógenos en superficies vivas según las normas peruanas……………...………17

Cuadro N° 3. Límites microbiológicos aceptables según las normas mexicanas para

superficies vivas e inertes…………………………………………….……...………18

Cuadro N0 4. Análisis de Varianza para Mesófilos Aerobios entre los tres

expendios de comida…………………………………...……………………..………26

Cuadro N0 5. Prueba de rangos múltiples de Duncan para mesófilos aerobios entre

los tres expendios de comida………………………………………………….….…..26

Cuadro N0 6. Análisis de Varianza para coliformes totales entre expendios de

comida……………………………………………………………………………..…27

Cuadro N0 7. Análisis de Varianza para E. coli entre los tres expendios de

comida……………………………………………….…………………………….....28

Cuadro Nº 8. Análisis de Varianza para mesófilos aerobios entre las superficies

vivas e inertes (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de comida…….……29

12

Cuadro Nº 9. Prueba del rango múltiple de Duncan para Mesófilos aerobios entre

las superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida…………………...29

Cuadro Nº 10. Análisis de Varianza para Coliformes Totales entre las superficies

vivas e inertes (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de

comida………………………………………………………………………………..30

Cuadro Nº 11. Prueba del rango múltiple de Duncan para Coliformes Totales

entre las superficies vivas e inertes de los tres expendios de

comida…………………………………………………………………………….….31

Cuadro Nº 12. Análisis de Varianza para E. coli entre las superficies vivas e

inertes (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de comida………………..….31

Cuadro Nº 13. Prueba del rango múltiple de Duncan para E. coli entre las

superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida………………..….….32

Cuadro Nº14. Muestreo N°1 en los tres expendios de comidas………………..…50

Cuadro Nº15. Muestreo N°2 en los tres expendios de comida……………………51

Cuadro Nº16. Muestreo N°3 en los tres expendios de comidas...…………………52

Cuadro Nº17. Muestreo N°4 en los tres expendios de comida………………........53

13

Cuadro Nº18. Muestreo N°5 en los tres expendios de comidas………………….....54

Cuadro Nº19. Muestreo N°6 en los tres expendios de comidas…….....……………55

14

INDICE DE GRÁFICAS

Grafica N01. Porcentaje de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en cm

2de

mesófilos aerobios entre los tres expendios de comida…………...…………………27

Grafica N0 2. Promedios de recuento total (UFC/cm

2) para Coliformes Totales y E.

coli entre los tres expendios de comida………………………….……….…………28

Gráfica N0

3. Promedio de recuento total (UFC/cm2) para

mesófilos aerobios en

superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida……………………..…30

Grafica N 0

4. Promedio de recuento total (UFC/cm2)

para Coliformes Totales y E.

coli entre las superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida….…..….32

Gráfica Nº 5. Comparación de los niveles de UFC/cm2 de mesófilos aerobios en las

superficies inertes (mesa y tabla) con las normas mexicanas………………….…..33

Gráfica Nº 6. Comparación de los niveles de UFC/cm2 de coliformes totales y E.

coli de las superficies inertes (mesa y tabla) con las normas peruanas………….34

Gráfica Nº 7. Comparación de los niveles de UFC/ ml para mesófilos aerobios en

las superficies vivas (manos) con la normas mexicanas……………………….….35

Gráfica Nº 8. Comparación de los niveles de UFC/ ml para coliformes totales y E. coli en

las superficies vivas (manos) con la normas peruanas……………………….……..36

15

Gráfica Nº 9. Porcentaje de hongos y levaduras en los tres expendios de

comida…………………………...……………………………………………………..37

16

INDICE DE ANEXOS

Fig. 1. Flujograma para el procesamiento de las muestras en el Laboratorio….…49

Fig. Nº 2. Técnica de hisopado que se utilizó para la recolección de la muestra en

superficie inerte, en cada uno de los expendios de comida. (Mesa)………….…….56

Fig. Nº 3. Técnica de hisopado en la tabla (superficie inerte) de cada expendio de

comida………………………………………………………………………….….….56

Fig. Nº 4. Toma de muestras en las manos de la persona que manipula los

alimentos……………………………………………….……………………..………56

Fig. Nº 5. Técnica utilizada para el cultivo de las muestras…………………...…..57

Fig. Nº6. Platos con cultivos positivos de coliformes……………………………….57

Fig.Nº7. Morfología de los microorganismos aislados de los diferentes

expendios…………………………………………………………………………..…57

Fig. Nº 8. Prueba de catalasa negativa aplicada a una colonia bacteriana............58

Fig.Nº10, 11,12. Pruebas bioquímicas para determinar microorganismos en

estudio...........................................................................................................................58

17

RESUMEN

Esta investigación se realizó en la provincia de Herrera, específicamente en el

Distrito de Chitré con el objetivo de determinar la calidad microbiológica de muestras

obtenidas en superficies vivas e inertes de tres expendios de comida, tomando las

debidas precauciones para el desarrollo del proyecto, ya que se utilizó una metodología

que consistió en el hisopado de superficies inertes (mesa y tabla) y enjuague en

superficies vivas (manos). Estas muestras fueron depositadas en recipientes estériles y

transportados adecuadamente para luego realizar el análisis en el laboratorio; para el

cual se utilizó la técnica de esparcido superficial que consistió en depositar 0.1 ml de

cada dilución en un platos Petri con el medio de cultivo para cada microorganismo; se

incubó por 24 horas resultando gran prevalencia de estos microorganismos, incluso

algunas superaron las normas microbiológicas Internacionales (México y Perú).

La evaluación nos permitió conocer la calidad microbiológica en las superficies

estudiadas, destacando la importancia de una buena higiene en las personas que tienen

contacto directo con los alimentos, al igual que los expendios en general para evitar

enfermedades transmitidas por alimentos contaminados.

18

1. INTRODUCCIÓN

De acuerdo a la definición aprobada por la Cumbre Mundial sobre la Alimentación,

existe seguridad alimentaria cuando todas las personas tienen en todo momento acceso

físico y económico a suficientes alimentos inocuos y nutritivos para satisfacer sus

necesidades alimenticias y sus preferencias en cuanto a los alimentos a fin de llevar una

vida activa y sana. La seguridad alimentaria se ha conseguido cuando se garantiza la

disponibilidad de alimentos, el suministro es estable y todas las personas los tienen a su

alcance. (León, 2004).

La contaminación implica la presencia de sustancias indeseables. En la inmensa

mayoría de los casos, los alimentos no cambian su aspecto u otras de sus características

por lo que la contaminación no puede reconocerse a simple vista y pasa inadvertida.

(Ortega, et al., 2002).

El sector alimentario ha tenido un sin número de problemas de índole higiénico

sanitario con consecuencias económicas para el productor como de salud para el

consumidor, lo que lleva a la necesidad de controlar las diferentes etapas desde la

producción hasta que llega al consumidor, esto refiriéndose al alimento como tal. Sin

embargo, el alimento es susceptible de contaminarse de manera física y química,

además de sufrir deterioro microbiano causado por bacterias y otros microorganismos,

lo que lleva a la necesidad de controlar las diferentes etapas desde la producción

agrícola y pecuaria hasta la última donde finalmente llega al consumidor.

Las enfermedades transmitidas por alimentos se conocen como ETAS y se originan por

el consumo de alimentos que contienen agentes contaminantes en cantidades suficientes

19

para afectar la salud del consumidor. Los alimentos involucrados pueden ser preparados

o naturales, sólidos o bebidas simples como el agua. Los agentes contaminantes pueden

ser patógenos como bacterias, virus, hongos, parásitos, o componentes químicos

(toxinas) que se encuentran en el alimento. (Lozada, 2007).

Entre las principales causas de brotes epidémicos de ETAS se encuentran el

entrecruzamiento de productos crudos listos para el consumo, manipulaciones

descuidadas o sin el lavado correcto de las manos, contaminaciones por contacto con

superficies mal higienizadas o vectores, cocción insuficiente de los alimentos,

exposición de los alimentos a temperaturas que favorecen el crecimiento de los

microorganismos, así como el tiempo prolongado entre la elaboración y el consumo.

(Lengomín et at., 1997).

Los brotes a causa de enfermedades transmitidas por los alimentos pueden dañar el

comercio y el turismo, y conducir a la pérdida de ganancias, al desempleo y demandas

legales. Por lo tanto, un control eficaz de la higiene de vital importancia para evitar las

consecuencias adversas a la salud humana y a la economía por las toxiinfecciones

alimentarias. (Salas, 2007).

Este trabajo es importante porque nos permite evaluar la calidad sanitaria en diferentes

expendios de comida utilizadas por cientos de personas cada día. Además les brinda a

los manipuladores de alimentos información necesaria para una mejor asepsia y darle al

consumidor un alimento más seguro, libre de partículas extrañas y evitar

toxiinfecciones.

20

CAPITULO 1

MARCO TEÓRICO

21

1. ALTERACIÓN DE LOS ALIMENTOS

Se entiende por alteración de los alimentos al cambio de las características

organolépticas, en aspectos como apariencia, olor o sabor que los hace inaceptables para

el consumo. Las alteraciones pueden ser por: descomposición natural, el biodeterioro, la

contaminación por microorganismos y prácticas culinarias incorrectas. Una de las

principales fuentes de contaminación es el ser humano; ya que es el portador de

microorganismos que pueden llegar a los alimentos y causar alteraciones. De allí que

durante el proceso de manufactura el personal debe pasar por una higiene adecuada,

sobre todo aquellos que se encargan de prepararlos. Es importante limpiar y desinfectar

todos los enseres que tienen contacto con los alimentos, ya que son el principal vehículo

de contaminación. (Zavala, 1999; Madigan, et al., 2010).

2. BIOFILMS: CRECIMIENTO MICROBIANO SOBRE LAS SUPERFICIES

Los biofilms son comunidades complejas de microorganismos y polímeros

extracelulares, y tienen la capacidad para comunicarse con las bacterias circundantes y

posteriormente fijarse y desarrollarse sobre superficies hidrófobas o hidrófilas, bióticas

o abióticas. Se pueden encontrar en todos los medios donde existan bacterias: en el

medio natural, clínico o industrial puesto que solo necesitan un entorno hidratado y una

mínima presencia de nutrientes para desarrollarse. (Fuster, 1996).

2.1 ETAPAS EN LA FORMACIÓN DE BIOFILMS BACTERIANOS EN

RELACION CON ALIMENTOS

a). Adherencia: Se da por medio de flagelos y fimbrias, la motilidad ayuda a la bacteria

a alcanzar la superficie.

b). División de los microorganismos: la bacteria comienza a dividirse y las células hijas

se extiende alrededor del sitio de unión formando microcolonias.

22

c). Formación de la matriz: las bacterias empiezan a secretar un exopolisacárido que

contribuye a la matriz del biofilm y forma canales.

d). Liberación: algunas bacterias de la matriz del biofilm se liberan para poder colonizar

nuevas superficies, cerrando el proceso de formación del biofilm. (Medina y Rendón,

1998).

2.2 IMPORTANCIA DEL CONTROL HIGIÉNICO EN LAS SUPERFICIES

ALIMENTARIAS

La capacidad de las bacterias para adherirse a las superficies con las que entran en

contacto con los alimentos, conlleva serios problemas higiénicos y numerosas pérdidas

económicas por los productos que se llegan a desechar. Por este motivo, es preciso

eliminar todos los microorganismos de las superficies en contacto con los alimentos,

antes de que los contaminen y establezcan un biofilm que serviría de reservorio.

(Escobar y Melillo, 2009).

2.2.1 Biofilm en Superficies Vivas

Las bacterias pueden adherirse a cualquier parte del cuerpo humano solo basta con

encontrar un nutriente de su preferencia en un lugar húmedo para adherirse. Los lugares

más frecuentes donde se encuentra biofilms en superficies vivas pueden ser: en las

superficies de los dientes, manos, uñas, vagina de la mujer, etc. Los manipuladores de

alimentos deben evitar hablar en el momento que manipulan los alimentos, lavarse las

manos constantemente y utilizar la ropa apropiada. Estas recomendaciones son

necesarias para brindar un alimento más seguro al consumidor. (Serrano y Herrera,

2005).

23

2.2.2 Biofilm en Superficies Inertes

Las bacterias son capaces de adherirse fuertemente a una gran variedad de materiales

utilizados en la industria alimentaria, tales como: mesa, tabla, pisos, paredes, plástico,

etc. Una vez adheridas, las bacterias se reproducen rápidamente y se vuelven muy

difíciles de remover, formando una comunidad microbiana denominada "Biopelícula" o

biofilm, afectando a los alimentos que están en contacto con ellas. (Olave, 2001).

2.3 RESISTENCIA DEL BIOFILM A LOS DIFERENTES SISTEMAS DE

DESINFECCIÓN

El exopolímero protege a los habitantes del biofilm de la dispersión de sustancias

nutritivas, del acceso de los biocidas y de la desecación. Un proceso de limpieza puede

llegar a eliminar el 90% de los microorganismos de una superficie con detergentes

alcalinos formulados con quelantes, ya que resulta efectiva en la eliminación del

biofilms. La principal limitación de los sistemas de limpieza reside en los problemas de

acceso a diversas zonas como ranuras, grietas, etc. La resistencia a los antimicrobianos

parece depender de la estructura tridimensional que presenta el biofilm; cuanto más

viejo y grueso sea, más resistencia le da, si se desmonta la estructura se pierde la

resistencia; en consecuencia la eficacia de la desinfección estará directamente

relacionada con la capacidad de la limpieza previa que resulta la mejor prevención.

(Pinto, 2010).

3. FUENTES DE CONTAMINACION

La contaminación de los productos alimenticios puede ser afectada por peligros físicos,

químicos y biológicos. Los físicos son cualquier materia extraña presente en el

alimento, ejemplos: metales, plástico, vidrio, entre otros. Los químicos son sustancia

24

presente en el alimento en forma natural, intencional o accidental, que resulte

perjudicial a mediano o largo plazo, ejemplos: Lubricantes, limpiadores, desinfectantes,

etc. Y los biológicos que son agente o esporas, que puedan representar un peligro

potencial para el consumidor del alimento preparado. Ejemplos: bacterias, virus y

hongos. (Mora, 2007).

3.1. Entre las principales fuentes contaminantes podemos encontrar:

3.1.1. Ambiente:

Los sitios que con mayor frecuencia presentan proliferación de microorganismos son los

drenajes, trampas de grasas, pisos, paredes, respiradores. (Superficies inertes).

3.1.2. Clientes:

Las manos, pies y ropa de los empleados, clientes y vendedores externos también

pueden estar contaminados con microorganismos patógenos; esto permite la

contaminación de los pisos y cualquier artículo utilizado por los empleados, mediante la

contaminación cruzada.

3.1.3. Equipos: (superficies inertes)

Utilizados para el transporte, almacén o preparación de los alimentos son fuentes de

contaminación; son más aquellos que presentan dificultades para la limpieza, como lo

son las ruedas de carritos que transportan los alimentos, las rebanadoras entre otras;

luego que se da la contaminación por las fuentes antes mencionada, es importante

conocer los factores que permiten a los microorganismos contaminar, crecer y

dispersarse. (Escobar y Melillo, 2009).

La falta de higiene del personal de los preparadores de alimentos, el lavado inadecuado

de las manos o superficies de los utensilios, son factores que pueden favorecer que no se

eliminen completamente los organismos de origen fecal y éstos pueden contaminar los

25

alimentos que se manejan o consumen y ser una posible causa de diarrea. (Salomón, et

al., 2006).

4. CONTAMINACIÓN CRUZADA DE LOS ALIMENTOS

La contaminación cruzada es el proceso mediante el cual los alimentos entran en

contacto con sustancias ajenas, generalmente nocivas para la salud. Aunque es fácil de

prevenir, es una de las principales causas de intoxicación alimentaria.

La misma puede ser: directa e indirecta. La contaminación cruzada directa ocurre

cuando un alimento limpio entra en contacto directo con un alimento contaminado. Y la

contaminación cruzada indirecta se da cuando un alimento limpio tiene contacto con

una superficie contaminada previamente por otro alimento u otra fuente. (Casonu,

2009).

5. COMO AFECTAN LOS MICROORGANISMOS PATÓGENOS EN LOS

ALIMENTOS

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs), son originadas por la ingestión de

alimentos o agua que contiene distintos agentes patógenos que afectan la salud del

consumidor en forma individual o colectiva. Con la globalización, cambios en los

estilos de vida de los consumidores y las preferencias alimentaria, se han producido

cambios en la formulación, manufactura y distribución de alimentos con el propósito de

disminuir estas enfermedades (Garay, 2002).

Patógenos asociados a los alimentos: Salmonella, Shigella, Staphylococcus aereus,

Listeria, E. coli O157:H7 entre otras; estas pueden estar asociados con condiciones

sanitarias deficientes, agua y alimentos contaminados, al igual que condiciones de vida

en hacinamiento. (Goldberg, et al., 2007).

26

Las personas que tienen algunas de estas enfermedades o presenten síntomas no deberían

preparar alimentos o servir agua a otros hasta que se haya demostrado que no son

portadores de alguna bacteria y deben ser vigilados por el MINSA. (CDC, 2005).

6. GENERALIDADES DE LOS PARÁMETROS MICROBIOLÓGICOS

EVALUADOS EN LA INVESTIGACIÓN

6.1 Mesófilos aerobios

En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras cuya temperatura

óptima de crecimiento está entre 25 – 45º C.

En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos.

Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las

condiciones higiénicas de la materia prima, la limpieza, desinfección y control de la

temperatura durante los procesos de tratamiento industrial, transporte y almacenamiento

si se han realizado de forma adecuada.

Para identificarlos se utiliza la técnica de Recuento en placa de mesófilos. La mayoría

de los alimentos (excepto los fermentados como quesos, embutidos, etc.) se consideran

no aptos para el consumo cuando contienen un gran número de microorganismos aun

cuando se sepa que estos no son patógenos y que no hayan llegado a modificar

considerablemente los caracteres organolépticos del alimento. (Benítez, 2009).

6.2 Coliformes Totales

Constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal para la

mayoría de las especies que involucra. Son bacilos Gramnegativos aerobios o

anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas

en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros

principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. (Camacho, et al.,

27

2009). Su presencia en alimentos es signo de mala calidad higiénica en el proceso, falta

de higiene de los manipuladores, recontaminación después del proceso o contaminación

procedente del suelo. (Lozada, 2007).

6.3 Escherichia coli

Está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con

producción de gas a las 48 h. de incubación a 44.5 ± 0.1°C.Es productora de diarrea con

características de virulencia que le permite lesionar las células intestinales o alterar la

función del intestino. El contacto humano durante el procesamiento del alimento puede

introducir la infección al igual que el contacto con las superficies, ya que es un

indicador de contaminación fecal o con excretas. (Fernández, et al., 2003).

6.4 Hongos

Son una clase distinta de microorganismos, la mayoría de las cuales vive en libertad en

la naturaleza, donde funcionan como desintegradores en el ciclo de energía.

Los hongos son eucariota con un nivel más alto de complejidad biológica que las

bacterias. Pueden ser unicelulares o diferenciarse y convertirse en pluricelulares

mediante el desarrollo de filamentos ramificantes. La mayoría de los hongos se

reproducen por esporas, diminutas partículas de protoplasma rodeado de pared celular.

La mayoría de los hongos están constituidos por filamentos tubulares que reciben el

nombre de hifas. Cada hifa está rodeada por una pared celular que normalmente

contiene quitina, un material que también forma parte del exoesqueleto de los insectos.

La mayoría de las hifas no están divididas en células separadas y los núcleos y

orgánulos están esparcidos por todo el citoplasma. Sin embargo, algunas hifas pueden

estar divididas por tabiques llamados septos, pero, incluso en estas hifas, los septos

28

poseen unos poros que permiten el movimiento de orgánulos dentro de la hifa. (Ryan y

Ray, 1998).

Las hifas crecen por alargamiento de las puntas y también por ramificación. La

proliferación de hifas, resultante de este crecimiento, se llama micelio. Cuando el

micelio se desarrolla puede llegar a formar grandes cuerpos fructíferos, tales como las

setas u otras estructuras que contienen esporas reproductoras. Normalmente, los cuerpos

fructíferos son la parte más visible del hongo y suelen crecer por encima del suelo o de

otras superficies, de manera que las esporas pueden ser dispersadas por las corrientes de

aire o mediante otros mecanismos. Por el contrario, el micelio normalmente permanece

enterrado.

El metabolismo micótico es heterotrófico y requiere carbono exógeno para el

crecimiento. Existe una gran diversidad metabólica, pero la mayoría de los hongos

crecen con tan solo una fuente de carbono orgánico e iones de amonio o nitrato como

fuente de nitrógeno. En la naturaleza, los nutrimentos para los hongos libres provienen

de la materia orgánica en descomposición. No existen hongos que sean anaerobios

estrictos. (Ryan y Ray, 1998).

Entre los tipos más comunes de hongos en alimentos tenemos:

6.4.1 Hongos Filamentosos: Están naturalmente adaptados al crecimiento sobre

superficies, ya que requieren de un contacto cercano con el sustrato debido a su

nutrición heterótrofa, secreciones de enzimas extracelulares, absorción de nutrientes a

través de la pared celular y el crecimiento apical de sus hifas. Los hongos que crecen

sobre superficies constituyen biopelículas, a diferencia de las biopelículas bacterianas,

las biopelículas fúngicas han recibido menor atención, aunque recientemente están

29

cobrando mayor relevancia por ser causante de infecciones alimentarias. (Villenas y

Gutiérrez, 2003).

6.4.2 Levaduras: Las levaduras alteradoras de alimentos, se definen como especies

particulares capaces de causar deterioro en alimentos y bebidas. Su papel es secundario

en la contaminación microbiana de alimentos, las condiciones ambientales de

preservación de estos, que tienden a inhibir el crecimiento de bacterias, han favorecido

la aparición de levaduras contaminantes, causantes igualmente de afectaciones en los

parámetros organolépticos de buena calidad en alimentos frescos, semi-elaborados y

elaborados. (Orberá, 2004). Las biopelículas están constituidas por microcolonias

incluidas dentro de una matriz polimérica y representan una forma de crecimiento

microbiano. Las levaduras pueden colonizar las superficies en contacto con alimento

formando biopelículas que son resistentes a muchos desinfectantes. (Durán, et al.,

2007).

7. CARACTERÍSTICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y PRUEBAS

UTILIZADAS PARA LA INVESTIGACIÓN

7.1 Medios de pre-enriquecimiento

7.1.1 Caldo peptonado

Para el enriquecimiento preliminar, poco selectivo de bacterias, particularmente

Enterobacteriaceas patógenas. Es recomendado para ser utilizado en lugar de solución

fisiológica para recuperar células de enterobacterias dañadas por procesos

fisicoquímicos, a los que ha sido sometido el alimento. Si es utilizado como medio base

para la fermentación de hidratos de carbono, se debe adicionar el indicador de Andrade

y el hidrato de carbono en cuestión.

30

7.2 Medios de enriquecimientos

7.2.1 Plate Count Agar (PCA)

Este medio no contiene ningún supresor de indicadores. Es primordialmente usado para

determinar el contenido microbiano total. Controla el crecimiento de bacterias viables

de una muestra.

7.2.2. Agar Endo Less

Medio de cultivo utilizado para el crecimiento de coliformes totales y E. coli en la que

se diferencia por su coloración en las colonias de las bacterias (color verde brillante E.

coli, color rojo con aspecto mucoso Klebsiella y colonias rojo intenso Enterobacter).

7.2.3 Agar Papa Dextrosa (PDA)

Medio para el cultivo y enumeración de levaduras y mohos a partir de alimentos y otros

materiales. Los hidratos de carbono y la infusión de papa favorecen el crecimiento de

levaduras y hongos, en tanto que por el bajo rango de pH, la flora acompañante se

reduce significativamente. (Gutiérrez, 2000).

8. PRUEBAS REALIZADAS PARA CARACTERIZAR MICROORGANISMOS

EN EL ESTUDIO.

8.1 Tinción de Gram:

Las tinciones que tiñen de diferente color a células que son de diferentes morfologías se

llaman tinciones diferenciales. Una tinción diferencial muy importante y ampliamente

usada en microbiología es la Tinción de Gram. Dependiendo del resultado de esta

tinción las bacterias pueden dividirse en dos grandes grupos: las grampositivas aparecen

31

de color morado y las gram negativas de color rosa. Esta diferencia en la respuesta a la

tinción de gram se debe a diferencias en la estructura de la pared celular de las células

grampositivas y gramnegativo. (Madigan, et al., 2009).

8.2 Catalasa:

Se utiliza para comprobar la presencia de la enzima catalasa que se encuentra en la

mayoría de las bacterias aeróbicas y anaeróbicas facultativas que contienen citocromos.

Originalmente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:

Streptococcus spp. (-) de Micrococcus spp. (+) y/o Staphylococcus spp. (+), Listeria

monocytogenes (+), y los entéricos (-). (Cedeño y Poveda, 2009).

8.3 SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad)

Los medios para detectar motilidad son semisólidos, presentan una concentración de

agar de 7,5g / 1000 ml o menor ya que concentraciones elevadas harían al medio

demasiado firme para permitir la libre diseminación de los microorganismos.

Este medio contiene triptófano. Las bacterias que tienen la enzima triptofanasa son

capaces de hidrolizar y desaminar triptófano con la producción de indol, ácido pirúvico

y amoniaco.

El medio de cultivo posee también tiosulfato de sodio como fuente de azufre y hierro

peptonizado como indicador de sulfuro. (López y Carola, 2006).

8.4 Prueba de Citrato:

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como

única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en

32

su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las Enterobacterias

estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia,

Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella,

Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato

de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y

azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el

citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la

eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será,

aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul. (Cortés, 2001).

8.5 Prueba de Indol

Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha

liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima

triptofanasa.

Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo

de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano).

Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamente a esta

mezcla el ácido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos

conocidos. Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas del

reactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la

prueba será considerada positiva (Cortés. 2001).

33

9. NORMAS MICROBIOLÓGICAS INTERNACIONALES PARA

SUPERFICIES EN CONTACTO CON ALIMENTOS ESPECÍFICAS PARA

EXPENDIOS DE COMIDA. (PERUANAS Y MEXICANA).

9.1 Normas para Superficies Inertes

Son las superficies externas o internas de los utensilios que estén en contacto directa o

indirectamente con el alimento. Ejemplo: mesa, tabla de picar.

9.2 Normas para Superficies Vivas

Son las partes externas del cuerpo humano que entran en contacto con los utensilios y

alimentos durante su manipulación y consumo.


patógenos para superficies inertes según las normas peruanas.

Coliformes totales

< 200 UFC/ cm2

E. coli

0 UFC/ cm2

Patógenos

0 UFC/ cm2


patógenos para superficies vivas según las normas peruanas.

Coliformes totales

100 UFC/ cm2

E. coli

0 UFC/ cm2

Patógenos

0 UFC/ cm2

Fuente: (Guía técnica para el análisis microbiológico de superficies en contacto con alimentos y

bebidas, 2007).

34

Cuadro N° 3. Límites microbiológicos aceptables para Mesófilos aerobios según las

normas mexicanas para superficies vivas e inertes.

Fuente: (Normas Mexicanas, 1994).

Para superficies inertes

< 400 UFC/ cm2

Para superficies vivas como las manos

< 3000 UFC/ ml

35

CAPITULO II

MATERIALES Y MÉTODOS

36

1. MATERIALES, EQUIPOS, MEDIOS DE CULTIVOS Y DISEÑO

EXPERIMENTAL.

1.1 MATERIALES Y EQUIPOS

Autoclave

Incubadora

Balanza

Guantes

Papel toalla

Alcohol al 70 – 95%

Jabón líquido

Mascarilla

Bata

Caja de porta objetos

Hisopos

Papel parafina

Mechero de alcohol

Nevera

Bolsas estériles

Vasos químicos

Tijeras

Probeta

Espátula

Erlermeyer

Puntas estériles de 100 – 1000 µl

Micro pipetas

Refrigeradora

Bolsas de hielo

Agitador magnético

Cinta adhesiva

Cámara de flujo laminar

Papel Manila

1.2 MEDIOS DE CULTIVOS

Caldo Peptonado

Agar Papa Dextrosa (hongos y levaduras)

Agar Endo Less (Coliformes totales y E. coli)

Agar para mesófilos (PCA)

37

2. METODOLOGÍA

2.1 Ubicación del Estudio

Esta investigación fue llevada a cabo en tres expendios de comida llamados:

Restaurante Panamá, Restaurante La Central, Restaurante La Estrella; ubicados en la

central de Chitré, Provincia de Herrera. Los mismos fueron muestreados durante los

meses de abril a mayo del 2010.

2. 2 Diseño Experimental

Esta investigación es de carácter descriptivo expofacto con un diseño completamente al

azar y se basó en clasificar el área estudiada en superficies inertes, como la tabla y la

mesa y superficies vivas como las manos.

El área seleccionada para el muestreo en este caso, las superficies inertes fueron: el

centro de la tabla de picar (en la parte superior) y el borde de la mesa utilizando hisopos

para el muestreo. Para superficies vivas se tomó muestras de enjuague de ambas manos

de la mesera por toda la superficie, dentro de una bolsa plástica con caldo peptonado.

(Guía técnica, 2007).

Se tomaron tres muestras de cada expendio (mesa, tabla y mano), siendo evaluados tres

expendios de comida haciendo un total de nueve muestras por semana, dando como

resultado, cincuenta y cuatro muestras por seis semanas con sus respectivas réplicas.

38

2.3 Toma de la muestra

Las muestras fueron tomadas de los siguientes sitios: en las superficies inertes (mesa y

tabla), tomando un área plana de 8 cm x 8 cm marcado con una platina delimitada

estéril, la cual consistió en frotar un hisopo tres veces en sentido diagonal, horizontal y

vertical en el área marcada por la platina durante 20 segundos (Escobar y Melillo,

2009).

Para superficies vivas (manos) se utilizó el método de enjuague usando bolsas plásticas

con caldo peptonado, adaptándolo a la unidad experimental y siguiendo las normas

microbiológicas recomendada para la toma de la muestra. (Guía técnica, 2007).

2.4 Procesamiento

Las muestras fueron llevadas a la unidad de Investigación del Centro Regional

Universitario de Azuero (C.R.U.A.) donde se procedió a realizar el análisis

microbiológico. En las superficies inertes (tabla y mesa), las muestras (hisopos) fueron

transportados dentro de los tubos de ensayo que contenían 3 ml de caldo peptonado.

Para superficies vivas (manos), se depositó 100 ml de caldo peptonado en una bolsa

plástica estéril, se introdujo las manos del manipulador hasta la altura de la muñeca.

Luego se le solicitó al manipulador que realizara un frotado de los dedos y

particularmente alrededor de las uñas y en la palma de las manos, durante un minuto

aproximadamente.

Al llegar al laboratorio, se agregó 1 ml de cada muestra en 9 ml de agua peptonada

estéril, siendo ésta la dilución madre (10-1

). Las diluciones se realizaron hasta llegar a

10 -3

para después tomar 0.1 ml y sembrarlo por esparcido en PCA (mesófilos aerobios),

Endo Less (coliformes) y PDA (hongos). Luego se incubó a 37 °C por 24 horas y

procedimos a contar colonias. El total de colonias obtenidas se multiplicó por el factor

39

de dilución, teniendo así la cantidad de UFC/cm2. Para calcular los resultados se utilizó

la fórmula: nc x fd x Ud/ cm2. (Escobar y Melillo, 2009).

3. PRUEBAS REALIZADAS PARA EVALUAR LOS MICROORGANISMOS

ESTUDIADOS:

3.1 Tinción de Gram

Realizamos un frotis fijándolo con calor, luego se tiñó por 1 minuto con Violeta

Cristal, se lavó con agua y se cubrió con solución Yodada durante 1 min, se lavó

nuevamente con agua, se decoloró con mezcla alcohol etílico/acetona. Después se

escurrió y lo cubrimos con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Por último se

lavó y secó para observar la morfología en el microscopio.

3.2 Pruebas Bioquímicas

De las colonias encontradas en los medios de cultivos, procedimos a realizar pruebas

bioquímicas para su confirmación las cuales detallamos a continuación:

3.2.1 Prueba de catalasa

Con la ayuda de un asa, colocamos una colonia al azar sobre un porta objeto estéril y se

añadimos una gota de peróxido de hidrógeno. Es positiva si se observa la formación de

burbujas indicando la liberación de oxígeno.

3.2.2 Prueba de SIM

Se Siembra con un asa recta, por picadura central hasta llegar al fondo del tubo. Luego

se incuba a 370C por 24 horas, se observa la producción de sulfuro, motilidad y para

verificar el indol, se le adiciona 2 o 3 gotas del reactivo Kovacs.

3.2.3 Prueba del citrato

Se inocula con el asa recta hasta el fondo, luego se incuba a 24 horas a 370C. Solo las

bacterias capaces de metabolizar el citrato podrían multiplicarse en este medio y liberan

40

iones de amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte

basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de

verde a azul. Por el indicador de Bromotimol.

3.3 Análisis Estadísticos

Nuestros datos fueron analizados mediante el Análisis de Varianza (ANOVA) para

determinar la diferencia significativa en cada prueba.

41

CAPITULO III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

42

RESULTADOS

El estudio arrojó que existieron diferencias significativas entre los tres expendios de

comida para mesófilos aerobios, datos que se muestra en el cuadro Nº 4.

Cuadro N0 4. Análisis de Varianza para Mesófilos Aerobios entre los tres

expendios de comida

Fuente DF Suma de

cuadrados

Cuadrado

de la

media

Coeficiente

de

Variación

Media F-Valor Pr > F

Modelo 2 2.765 1.382 74.90893 0.843 3.46 0.039*

Error 51 20.383 0.399

Total 53 23.149

*: Existen diferencias significativas

**: Existen diferencias altamente significativas

ns: No existen diferencias significativas

La prueba de rangos múltiples de Duncan muestra que el Restaurante la Estrella

presentó mayor nivel de mesófilos aerobios en comparación con los otros dos

expendios, como lo muestra el cuadro Nº 5.

Cuadro N0 5. Prueba de rangos múltiples de Duncan para mesófilos aerobios entre

los tres expendios de comida

Duncan Agrupamiento

Media N Expendios de Comida

A 1.087 54 Restaurante La Estrella

A 0.902 54 Restaurante Panamá

B 0.542 54 Restaurante La Central

43

El Restaurante la Estrella presentó mayor porcentaje de mesófilos aerobios (UFC/cm2)

en comparación con los otros dos expendios, como lo muestra la gráfica Nº 1.

Grafica N01. Porcentaje encontrado de Unidades Formadoras de Colonias

(UFC) / cm2

de mesófilos aerobios entre los tres expendios de comida.

36%

20%

44% Restaurante Panamá

Restaurante La Central

Restaurante La Estrella

No hubo diferencias significativas en el Análisis de Varianza para Coliformes totales

entre los tres expendios de comida, datos que se muestran en el cuadro Nº 6.

Cuadro N0 6. Análisis de Varianza para coliformes totales entre expendios de

comida

Fuente DF Suma de

cuadrados

Cuadrado

de la media

Coeficiente de

Variación


Modelo 2 1.464 0.732 124.480 0.481 2.04 0.1404ns

Error 51 18.303 0.358

Total 53 19.767




44

El cuadro N° 7 muestra que no hay diferencias significativas en el Análisis de

Varianza para E. coli entre los tres expendios de comida.

Cuadro N0 7. Análisis de Varianza para E. coli entre los tres expendios de comida

Fuente DF Suma de

cuadrados

Cuadrado de

la media

Coeficient

e de

Variación

Media F-

Valor

Pr > F

Modelo 2 0.582 0.291 115.459 0.379 1.52 0.228ns

Error 51 9.776 0.191

Total 53 10.359




El Restaurantes Panamá presentó mayor promedio del recuento total de coliformes

totales y E. coli en comparación con los otros dos expendios. Datos que se muestran en

la Gráfica Nº 2.

Grafica N0 2. Promedios del recuento total (UFC/cm

2) para Coliformes Totales y

E. coli entre los tres expendios de comida.

0

5

10

15

20

25

Restaurante

Panamá

Restaurante La

Central

Restaurante La

Estrella

Expendios de Comida

UF

C C

oli

form

es

/ cm

2

Coliformes totales

E. coli

45

El análisis de varianza realizado a la prevalencia de mesófilos aerobios en las

superficies vivas e inertes, se encontraron diferencias altamente significativas de los

tres expendios de comida. Datos mostrados en el cuadro Nº 8:

Cuadro Nº 8. Análisis de Varianza para mesófilos aerobios entre las superficies

vivas e inertes (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de comida.

Fuente DF Suma de

cuadrados

Cuadrado

de la

media

Coeficiente

de

Variación


Modelo 2 9.081 4.540 82.082 0.780 11.06 <.0001**

Error 159 65.251 0.410 Total 161 74.332




La prueba de rangos múltiples de Duncan mostró diferencias altamente significativas

entre las superficies estudiadas, con un mayor recuento en la tabla, datos que se

muestran en el cuadro Nº 9.

Cuadro Nº 9. Prueba del rango múltiple de Duncan para Mesófilos aerobios entre

las superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida.

Duncan Agrupamiento

Media

N

Superficies

A 0.806 54 Mesa

B 1.057 54 Tabla

C 0.478 54 Manos

46

La tabla obtuvo mayor promedio en UFC de mesófilos aerobios en comparación con las

demás superficies (mesa y manos). Como se muestra en la gráfica N°3.

Gráfica N0

3. Promedio del recuento total (UFC/cm2) para

Mesófilos aerobios en

superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida.

Hubo diferencias significativas en el Análisis de Varianza para Coliformes Totales

entre las superficies (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de comida, como se

muestra en el cuadro Nº 10.

Cuadro Nº 10. Análisis de Varianza para Coliformes Totales entre las superficies

vivas e inertes (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de comida.




Fuente DF Suma de

cuadrados

Cuadrado

de la

media

Coeficiente

de

Variación

Media F-

Valor

Pr > F

Modelo 2 4.124 2.062 127.450 0.444 6.43 0.0021*

Error 159 50.952 0.320

Total 161 55.076

47

La prueba de rangos múltiples de Duncan muestra que hay diferencias significativas en

las superficies inertes (tabla) con respecto a las demás superficies en estudio. Datos

mostrados en el cuadro Nº 11.

Cuadro Nº 11. Prueba del rango múltiple de Duncan para Coliformes Totales

entre las superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida.

Duncan Agrupamiento

Media

N

Superficies

B 0.335 54 Mesa

A 0.670 54 Tabla

B 0.328 54 Manos

El Análisis de Varianza para E. coli entre las superficies vivas e inertes de los tres

expendios de comida muestra que existieron diferencias significativas. Los datos se

observan en el cuadro Nº 12.

Cuadro Nº 12. Análisis de Varianza para E. coli entre las superficies vivas e

inertes (mesa, tabla y manos) de los tres expendios de comida.




Fuente DF Suma de

cuadrados

Cuadrado

de la

media

Coeficiente

de

Variación

Media F-

Valor

Pr > F

Modelo 2 1.459 0.729 120.609 0.345 4.20 0.0167*

Error 159 27.605 0.174

Total 161 29.064

48

Según la prueba de rangos múltiples de Duncan hubo diferencias significativas entre las

superficies inertes (tabla) con respecto a las demás superficies estudiadas. Datos

mostrados en el cuadro Nº 13

Cuadro Nº 13. Prueba del rango múltiple de Duncan para E. coli entre las

superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida.

Existió mayor promedio de UFC/ cm2

de coliformes totales y E. coli en las superficies

inertes (tabla) con relación a las otras dos superficies (mesa y manos). Datos mostrados

en la gráfica N° 4.

Grafica N 0

4. Promedio del recuento total (UFC/cm2)

para Coliformes Totales y E.

coli entre las superficies vivas e inertes de los tres expendios de comida.

Duncan Agrupamiento Media N Superficies

B 0.297 54 Mesa

A 0.478 54 Tabla

B 0.262 54 Manos

49

Entre las superficies inertes estudiadas, la tabla no cumplió con las normas

internacionales utilizadas en esta investigación para mesófilos aerobios. Los valores se

observan en la gráfica Nº 5.

Gráfica Nº 5. Evaluación de los niveles de UFC/cm2 de mesófilos aerobios en las

superficies inertes (mesa y tabla) comparándolas con las normas mexicanas.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Mesa Tabla

Superficies Inertes

UF

C/c

m2

Mesófilos encontrados

Norma Mexicana

50

Para superficies inertes, solo la tabla no cumplió con las normas internacionales para

coliformes totales, datos que se muestran en la gráfica Nº 6.

Gráfica Nº 6. Evaluación de los niveles de UFC/cm2 de coliformes totales y E. coli

de las superficies inertes (mesa y tabla) versus las normas peruanas.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Mesa Tabla

Superficies Inertes

UF

C/c

m2 Coliformes totales

E. coli

Normas peruanas

51

Los niveles de UFC/ml de mesófilos aerobios cumplieron con las normas

internacionales (normas mexicanas) para superficies vivas (manos). Datos mostrados

en la gráfica Nº 7.

Gráfica Nº 7. Evaluación de los niveles de UFC/ ml para mesófilos aerobios en las

superficies vivas (manos) comparándolas con la normas mexicanas.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Manos Norma mexicana

Superficies vivas

UF

C/m

l

52

Para superficies vivas (manos), cumplieron con las normas internacionales (normas

peruanas) para coliformes totales y E. coli. Datos que se muestran en la gráfica Nº 8.

Gráfica Nº 8. Evaluación de los niveles de UFC/ ml para coliformes totales y E. coli

en las superficies vivas (manos) comparándolas con la normas peruanas.

0

20

40

60

80

100

120

Manos

Superficies Vivas

UF

C/m

l Coliformes totales

E. coli

Normas peruanas

53

El estudio arrojó niveles altos de levaduras entre los tres expendios de comida. Datos

mostrados en la gráfica Nº 9.

Gráfica Nº 9. Porcentaje detectado de hongos y levaduras en los tres expendios de

comida.

50%

22%

19%

9%

Levadura

Aspergilus

Penicillium

Fusarium

54

DISCUSIÓN

Esta investigación tiene como objetivo determinar la calidad microbiológica en las

superficies vivas e inertes de tres expendios de comida en Chitré, dando como resultado

lo siguiente: existieron diferencias significativas en el análisis de varianza para

mesófilos aerobios entre los tres expendios de comida (ver cuadro Nº 1). Se

comprobó mediante la Prueba de Rangos Múltiples de Duncan que hubo diferencias

significativas entre el Restaurante La Estrella y Restaurante La Central, entre el

Restaurante Panamá y Restaurante La Central; sin embargo, entre el restaurante que La

Estrella y Restaurante Panamá no existieron diferencias significativas, comprobando

así, que algunos expendios presenta mejor desinfección que otros, datos que se

muestran en el cuadro N° 2. La elaboración de comidas preparadas es una actividad de

elevado riesgo sanitario, ya que en ella se registra el mayor número de brotes de

enfermedad de transmisión alimentaria (Malo y Prior, 2004). Para coliformes totales y

E. coli no existieron diferencias significativas entre los tres expendios de comida (ver

cuadro N° 3, 4). El restaurante La Estrella obtuvo mayor cantidad de mesófilos

aerobios en las superficies vivas e inertes (mesa, tabla y manos) con un porcentaje de 44

%, seguido del restaurante Panamá con un porcentaje de 36 % y por último, el

restaurante La Central con 20 % (ver Grafica Nº1). Para Coliformes totales y E. coli, el

restaurante Panamá es el más alto con un promedio de 20UFC/cm2 para coliformes

totales y 7 UFC/cm2 para E. coli en los seis muestreos realizados. El restaurante La

Estrella va precedido del restaurante Panamá con un promedio de 18 UFC/cm2 de

coliformes totales y 5 UFC/cm2 para E. coli. Y por último, el restaurante La Central

con 9 UFC/cm2 para coliformes totales y 3 UFC/cm

2 para E. coli. Datos que se pueden

observar en la Gráfica Nº2.

55

En el caso de las superficies vivas e inertes, existieron diferencias altamente

significativas para mesófilos aerobios (ver cuadro N° 5); siendo la tabla la que

presentó mayor promedio con 46 UFC/cm2. (Ver gráfica Nº3). La producción de

alimentos libres de contaminantes no solo depende del lugar de su producción sino

también del proceso de elaboración y de las personas que están en contacto con ellos

(Rembado y Aluffi, 2009). Para coliformes totales y E coli existieron diferencias

significativas, mostrando que hubo contaminación de origen fecal por una mala higiene

personal (ver cuadro N° 7 y 9). Los coliformes totales tienen un promedio de 28

UFC/cm2 y E. coli 8 UFC/cm

2 en la tabla. En segundo lugar, se encuentra la mesa con

12 UFC/cm2 de coliformes totales y 6 UFC para E. coli. En último lugar se encuentra

las manos con 7 UFC para coliformes totales y 2 UFC para E. coli. (Ver gráfica Nº 4).

En la tabla existió una alta contaminación de mesófilos aerobios, coliformes totales y E.

coli superando las normas mexicanas y peruana. En la mesa no se encontró

contaminación para mesófilos aerobios y coliformes totales ni E. coli, basándose en la

norma mexicana para mesófilos aerobios y la norma peruana para coliformes totales y

E. coli. (Ver gráfica 5y6). En las superficies vivas (manos) no superaron las normas

internacionales para mesófilos aerobios y coliformes totales y E. coli. (Ver gráfica Nº7

y 8).

En el caso de los hongos y levaduras, aún no se han establecido normas para superficies

que indiquen dentro de qué rango se encuentran, más sin embargo, estos son

microorganismos de origen ambiental que disminuye la vida útil del producto y se

asocian con materia prima contaminada o ambiente contaminado. (Escobar y Melillo,

2009). Para hongos se encontró gran cantidad de levadura en los expendios de comida,

encontrado en mayor proporción en la mesa y en las manos. En segundo lugar se

encuentra los hongos del género Aspergillus seguido del género Penicillium. El hongo

56

que se encontró en menor proporción fue el género Fusarium. (Ver gráfica Nº9). La

alteración por levaduras no constituye un peligro para la salud del consumidor, más sin

embargo, indica que hubo deficiencia en los procesos de sanitización. (Escobar y

Melillo, 2009).

57

CAPITULO IV

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

58

CONCLUSIONES

1. Tanto en superficies vivas como inertes los niveles de E. coli, estuvieron por encima

de las normas.

2. Los mesófilos aerobios y coliformes totales en la mesa se mantuvieron por debajo de

las normas.

3. La superficie de mayor prevalencia de microorganismos fue la tabla, superando las

normas internacionales.

4. El restaurante La Estrella presentó mayor cantidad de mesófilos aerobios.

5. Para Coliformes totales y E. coli el restaurante Panamá fue el que presentó mayor

cantidad en ambos microorganismos.

6. Según ésta investigación el restaurante La Central presentó mejor calidad

microbiológica.

7. La bacteria que se encontró con mayor frecuencia fue E. coli.

8. Las levaduras se encontraron con mayor prevalencia.

9. En algunos manipuladores de alimentos obtuvimos niveles altos de coliformes,

incluso E. coli.

59

RECOMENDACIONES

1. Vigilar más de cerca la calidad microbiológica de superficies en cada expendio

por parte de los dueños del establecimiento.

2. Se recomienda que en los expendios de comida evaluados sean procesados por

separado las carnes de los vegetales, por ejemplo la tabla de picar en cada

expendio debe desinfectarse cada vez que se utilice para preparar la comida.

3. En cada expendio de comida debe existir una desinfección por cada preparación

de alimentos, ya que los mismos son fuente de contaminación prolongada.

4. El personal que labora en cada expendio de comida debe ser capacitado sobre la

posible contaminación a la que pueden estar expuestos los alimentos y las

consecuencias de los mismos.

5. Los uniformes y demás utensilios deben ser lavados correctamente para evitar

contaminación.

6. Las mesas deben desinfectarse con mayor frecuencia para evitar contaminación

entre una comida y otra.

7. Se debe realizar supervisión por parte del Ministerio de Salud en los expendios

de comida, para asegurar que no se presente ninguna contaminación que pueda

afectar al consumidor.

60

BIBLIOGRÁFIA

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63

ANEXOS

64

Fig. 1 Flujograma para el procesamiento de las muestras en el Laboratorio.

PCA Endo Less PDA

Se realizaron diluciones hasta llegar a 10-3

. Luego se procedió a sembrar por esparcido

0.1 ml de la última dilución en los platos que contenía PCA, Endo Less y PDA con sus

respectivas réplicas.

65

Cuadro Nº14. Conteo de colonias bacterianas y hongos en el primer muestreo del estudio.

.

Expendios de comida Sitios de

muestreos

Réplicas Mesófilos

aerobios

Coliformes

totales

E.

coli

Hongos

Restaurante Panamá Mesa 1 1 0 0 Aspergillus

Restaurante Panamá Mesa 2 0 0 0 Aspergillus

Restaurante Panamá Mesa 3 0 0 0 0

Restaurante La Central Mesa 1 0 0 0 0



Restaurante La Estrella Mesa 1 0 0 0 0



Restaurante Panamá Tabla 1 0 0 0 Levadura

Restaurante Panamá Tabla 2 0 0 0 0


Restaurante La Central Tabla 1 65 34 14 Levadura



Restaurante La Estrella Tabla 1 0 0 0 Aspergillus

Restaurante La Estrella Tabla 2 3 0 0 Levadura

Restaurante La Estrella Tabla 3 2 0 0 levadura

Restaurante Panamá Manos 1 10 0 0 0



Restaurante La Central Manos 1 1 0 0 0



Restaurante La Estrella Manos 1 0 0 0 Levadura

Restaurante La Estrella Manos 2 0 0 0 Penicillium

Restaurante La Estrella Manos 3 1 0 0 Penicillium

66

Cuadro Nº15. Conteo de colonias bacterianas y hongos en el segundo muestreo del estudio.

Expendios Sitios de

muestreos


aerobios

Coliformes

totales

E.

coli

Hongos

Restaurante Panamá Mesa 1 298 243 100 Levadura









Restaurante Panamá Tabla 1 4 0 0 Aspergillus


Restaurante Panamá Tabla 3 3 0 0 Aspergillus

Restaurante La Central Tabla 1 25 0 0 0

Restaurante La Central Tabla 2 36 0 0 Aspergillus


Restaurante La Estrella Tabla 1 138 15 6 Penicillium



Restaurante Panamá Manos 1 16 0 0 Fusarium





Restaurante La Central Manos 3 1 0 0 Levadura

Restaurante La Estrella Manos 1 84 2 1 Aspergillus


Restaurante La Estrella Manos 3 13 2 1 Aspergillus

67

Cuadro Nº16. Conteo de colonias bacterianas y hongos en el tercer muestreo del estudio.

Expendios Sitios de

muestreos


aerobios

Coliformes

totales

E.

coli

Hongos
















Restaurante La Estrella Tabla 1 0 0 0 0



Restaurante Panamá Manos 1 1 1 1 Levadura



Restaurante La Central Manos 1 0 0 0 Levadura



Restaurante La Estrella Manos 1 0 0 0 0



68

Cuadro Nº17. Conteo de colonias bacterianas y hongos en el cuarto muestreo del estudio.

Expendios Sitios de

muestreos


aerobios

Coliformes

totales

E.

coli

Hongos



















Restaurante Panamá Manos 1 6 1 1 Aspergillus









69

Cuadro Nº18. Conteo de colonias bacterianas y hongos en el quinto muestreo del estudio.

Expendios Sitios de

muestreos


aerobios

Coliformes

totales

E.

coli

Hongos



























Restaurante La Estrella Manos 3 44 0 0 Fusarium

70

Cuadro Nº19. Conteo de colonias bacterianas y hongos en el sexto muestreo del estudio.

Expendios Sitios de

muestreos


aerobios

Coliformes

totales

E.

coli

Hongos










Restaurante Panamá Tabla 1 77 30 3 Penicillium

Restaurante Panamá Tabla 2 300 54 5 Penicillium








Restaurante Panamá Manos 1 10 0 0 aspergillus

Restaurante Panamá Manos 2 5 0 0 aspergillus








71

Toma de la muestra

Fig. Nº 2. Técnica de hisopado que se

utilizó para la recolección de la muestra

en superficie inerte, en cada uno de los

expendios de comida. (Mesa).

Fig. Nº 3. Técnica de hisopado en la tabla

(superficie inerte) de cada expendio de

comida.

Fig. Nº 4. Toma de muestras en las manos

de la persona que manipula los alimentos.

72

Procesamiento de las muestras en el laboratorio

Fig. Nº 5. Técnica utilizada para el

cultivo de las muestras.

Fig. Nº6. Platos con cultivos positivos de

coliformes.

73

Pruebas Bioquímicas

Fig. Nº8. Prueba de catalasa negativa

aplicada a una colonia bacteriana

Fig.Nº9. Prueba de SIM con resultado

positivo de motilidad

Fig.Nº7. Morfología de los

microorganismos aislados de los

diferentes expendios.

74

Fig.10. Prueba de indol utilizando el

reactivo de Kovac`s

Fig. 11. Realización de la prueba de

citrato.

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