Tesis validacion dayana (1)

RESUMEN

RESUMEN

RESUMEN

En el presente trabajo se realizó el estudio de validación de un método espectrofotométrico

Ultravioleta–Visible para la determinación de fenoles totales en el jarabe Vimang® 5 %.

Teniendo en cuenta que el método objeto de estudio se incluye en la Categoría I

correspondiente a métodos analíticos para la cuantificación de materias primas y/o

principios activos de medicamentos; se evaluaron los parámetros de linealidad, precisión

(expresada como repetibilidad y reproducibilidad), exactitud y selectividad.

Se demostró la proporcionalidad y linealidad del método en el intervalo estudiado. Los

coeficientes de variación obtenidos en los estudios de repetibilidad y reproducibilidad

estuvieron por debajo del límite máximo establecido (1,5 % y 2 %, respectivamente) y no

influyó en la precisión del método que el análisis se realizara en días distintos. El

porcentaje medio de recuperación no difirió significativamente del 100 % y no se detectó la

influencia estadística del factor concentración en la exactitud del método. Mediante la

comparación de los espectros obtenidos para jarabe recién preparado, jarabe degradado y

jarabe placebo, se determinó que el método es selectivo en la cuantificación de fenoles

totales presentes en el producto.

Considerando los resultados obtenidos, el método resultó válido; por lo que se puede

emplear en el control de calidad y estudios de estabilidad de esta formulación.

ÍNDICE

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 1

CAPITULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. ............................................................... 3 I.1 – Mangifera indica L. Generalidades. .......................................................................... 3

I.2 – Extracto acuoso de la corteza de Mangifera indica L. ............................................... 3

I.3– Línea de Productos Vimang®. .................................................................................... 5

I.4 – Aplicación de la Espectrofotometría Ultravioleta - Visible en el análisis cuantitativo

de fenoles. ........................................................................................................................... 6

I.5 – Validación de Métodos Analíticos. ............................................................................ 7

I.5.1 – Desarrollo de un método analítico. .................................................................. 7

1.5.2 – Validación. Aspectos Generales. ..................................................................... 8

I.6 – Selección de los Criterios de Validación.................................................................... 9

I.7 – Definición de los Parámetros. Metodología para su evaluación. ............................. 10

I.7.1 – Linealidad. ......................................................................................................... 10

1.7.1.1 – Análisis de regresión lineal. ...................................................................... 11

1.7.1.2 - Estimación de los parámetros. ................................................................... 11

a) Coeficientes de correlación (r) y determinación (r2). ................................... 11

b) Pendiente. ..................................................................................................... 12

c) Intercepto y prueba de proporcionalidad. ......................................................... 13

I.7.2 – Precisión. ........................................................................................................... 14

I.7.3 – Exactitud. .......................................................................................................... 15

1.7.3.1. – Comparación con un método oficial, validado o estandarizado. ............. 15

1.7.3.2 – Método de adición de patrón. .................................................................... 16

1.7.3.3 – Método de curvas de respuesta relativa. ................................................... 16

1.7.3.4 – Comparación de los resultados obtenidos de un estándar o material de

referencia certificado. .............................................................................................. 17

I.7.4 – Especificidad y Selectividad. .......................................................................... 17

CAPITULO II: MATERIALES Y MÉTODOS. ............................................................. 19 II.1 – Equipos. .................................................................................................................. 19

II.2 – Reactivos. ................................................................................................................ 19

II.3 – Método. ................................................................................................................... 19

II.4 – Preparación de las disoluciones para el estudio de validación. .............................. 20

II.4.1. – Disoluciones auxiliares para el análisis. ......................................................... 20

2.4.1.1. – Disolución de ácido sulfúrico 0,.01 mol/L. .............................................. 20

21.1.2 - Disolución de dicromato de potasio 0,065 g/L en ácido sulfúrico. ........... 21

2.4.1.3 – Disolución reactivo para taninos. ............................................................ 21

2.4.1.4 – Disolución madre de benzoato de sodio 1,5 mg/mL. ................................. 21

2.4.1.5 – Disolución de ácido tánico 6 μg/mL (estudio de exactitud). .................... 21

II.4.2. – Disoluciones para el estudio de validación. ................................................... 22

2.4.2.1 - Disolución de jarabe placebo. ................................................................... 22

2.4.2.2 –Disoluciones de jarabe Vimang. ................................................................. 22

2.4.2.2.1 – Disolución patrón de jarabe Vimang 25 mg/mL (50 %). .................... 22

2.4.2.2.2 – Disolución de jarabe Vimang 50 mg/mL (100 %). ............................. 23

2.4.2.2.3 – Disolución de jarabe Vimang 75mg/mL (150 %). .............................. 23

ÍNDICE

2.4.2.3 - Disolución de jarabe Vimang degradado. ................................................. 23

II.5 – Verificación, calibración y control del sistema instrumental de medida. .............. 24

II.6 – Estudio de validación. ............................................................................................. 24

II.6.1- Estudio de Linealidad. ....................................................................................... 24

II.6.2 – Estudio de Precisión. ........................................................................................ 26

II.6.3 - Estudio de Exactitud. ........................................................................................ 26

II.6.4 - Estudio de Selectividad. ................................................................................... 27

CAPITULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ......................................................... 28 III.1 – Cualificación del sistema instrumental de medida. .............................................. 28

III.2 – Estudio de Linealidad. ........................................................................................... 28

III.3 – Estudio de Precisión. ............................................................................................. 31

III.4 – Estudio de Exactitud. ............................................................................................. 33

III.5 – Estudio de Selectividad. ........................................................................................ 36

CONCLUSIONES. ............................................................................................................. 38

RECOMENDACIONES. ................................................................................................... 39

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

ANEXOS.

INTRODUCCIÓN

1

INTRODUCCIÓN

En las últimas décadas los fitofármacos han ido ganando terreno dentro del arsenal

terapéutico mundial, fundamentalmente por su escasa toxicidad, bajos costos y por utilizar

tecnologías de bajos niveles de inversión e insumos (Lastra et al., 2000). Todo esto se

refleja en el reconocimiento de la importancia de los programas nacionales de medicina

tradicional realizados por la Organización Mundial de la Salud (WHO, 1991) lo cual a su

vez ha incidido poderosamente en la expansión, desarrollo y consolidación de la

producción de dichos medicamentos. Baste saber que el 80 % de la población mundial

utiliza plantas para el tratamiento de las enfermedades y en los países industrializados el

35 % de los medicamentos prescritos contienen principios activos de origen natural

(Hostettman, 1994). Todo lo anterior da una medida de la importancia de los fitofármacos

para los países del tercer mundo; por su parte en Cuba se le ha dado una importancia

estratégica a los mismos, por lo que se vienen desarrollando diversos productos como parte

del programa de Medicina Natural Tradicional del Ministerio de Salud Pública.

Dentro de los fitofármacos en desarrollo, se encuentra el polvo Vimang® que proviene de la

corteza del árbol Mangifera indica L. (más comúnmente conocido como mango) y cuenta

con propiedades antioxidantes, antinflamatorias e inmunomoduladoras, contribuyendo a

mejorar la calidad de vida en pacientes con cáncer y SIDA, como lo confirman diversos

estudios realizados. Es por ello, que se ha incluido como principio activo en diversas

formulaciones líquidas, sólidas y semisólidas; entre las que se encuentra el jarabe al 5%

(nutracéutico) una nueva formulación de esta línea, la cual está en la etapa productiva y se

requiere un método analítico validado para el control de la calidad y estudios de estabilidad

de la forma terminada, tal y como lo establecen diferentes regulaciones nacionales e

internacionales para el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Manufactura.

El método analítico a aplicar consiste en la determinación cuantitativa de fenoles totales

(componentes mayoritarios del principio activo) mediante espectrofotometría Ultravioleta –

INTRODUCCIÓN

2

Visible (UV-VIS) y se basa en la reacción de los compuestos fenólicos con un reactivo

similar al de Folin-Ciocalteau. Esta metodología se ha empleado anteriormente en el

análisis cuantitativo de los fenoles en otras formulaciones como tabletas y crema; con

resultados satisfactorios que aportan confiabilidad al método.

Considerando los aspectos citados y la experiencia obtenida con otras formulaciones, se

proponen los siguientes objetivos:

Objetivo general.

Validar un método espectrofotométrico Ultravioleta –Visible para la determinación

de fenoles totales en el jarabe Vimang® 5 % para ser aplicado en el control de

calidad y estudios de estabilidad de esta formulación.

Objetivos específicos.

Evaluar los parámetros de validación atendiendo a la categoría de ensayo.

Realizar el análisis estadístico para cada parámetro para probar la confiabilidad del

método.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

3

CAPITULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.

I.1 – Mangifera indica L. Generalidades.

La Mangifera indica L., comúnmente conocida como mango, es una planta perteneciente a

la familia Anacardiaceae y es natural de la región indomalaya. Actualmente se cultiva en

regiones tropicales y subtropicales. Se introdujo en Cuba en 1782 y se cultiva extensamente

en toda la Isla. (Roig, 1988). Ha sido clasificada como una planta alimenticia, por sus frutos

y como planta medicinal debido al conocimiento etnomédico de varios países y en

particular de la experiencia cubana acumulada durante 20 años (NAPRALET, 2002).

Los estudios fitoquímicos reportados indican que la Mangifera indica L. presenta una gran

variedad de compuestos químicos que pueden ser clasificados como terpenoides, esteroides,

flavonoides (Khan y col, 1992), taninos (Lutete et al., 1994) y xantonas (Tap Chi Duoc

Hoc, 1991). La gran mayoría de estos compuestos se encuentran en la corteza de la planta a

la cual se le atribuyen diversos usos medicinales. Según lo reportado por la bases de datos

NAPRALET, ha sido utilizada en diferentes países para tratar diversas patologías como

diarrea, sífilis, problemas hepáticos, infecciones del tracto urinario, caries dentales,

diabetes, giardias intestinales, herpes virus tipo I, etc. En nuestro país ha sido utilizada

tradicionalmente para tratar problemas dermatológicos, así como para mejorar la calidad de

vida en pacientes con cáncer (Figueiras, 1999).

I.2 – Extracto acuoso de la corteza de Mangifera indica L.

A partir de la experiencia en el uso etnomédico en Cuba, el Centro de Química

Farmacéutica (CQF) ha venido desarrollando un nuevo producto obtenido del extracto

acuoso liofilizado de la corteza de esta planta que se comercializa bajo la marca registrada

de Vimang® (Garrido, 2005).

El extracto acuoso se ha elaborado a partir de 17 variedades del árbol Mangifera indica L.

de las 273 existentes en el país. En su composición se ha comprobado la presencia de nueve


4

compuestos fenólicos: catequina, epicatequina, ácido benzoico, ácido benzoico propiléster,

ácido 3,4 dihidroxibenzoico, ácido gálico, ácido gálico metiléster, ácido gálico propiléster y

mangiferina, este último como componente mayoritario del extracto. También se han

determinado terpenoides (ácido mangiferónico, β-elemeno, α-guaieno, etc.), azúcares libres

(galactosa, glucosa y arabinosa), ácidos grasos (mirístico, palmítico, linoleico, etc) y

microelementos (zinc, selenio, hierro) (ver composición en anexo 1) (Núñez et al. 2002;

Martínez et al., 2003).

El Vimang® posee un carácter antioxidante de amplio espectro, y aún a muy bajas

concentraciones, es capaz captar y secuestrar radicales libres (ácido hipocloroso, radical

hidroxilo, etc.), inhibir la peroxidación lipídica y proteger del daño oxidativo; además de no

presentar efecto pro-oxidante sobre el ADN, bajo condiciones experimentales determinadas

(Figueiras, 1999; Garrido, 2005). Dicha propiedad antioxidante ha sido fundamentada

mediante estudios in-vivo, entre los que se encuentran ensayos experimentales realizados

sobre gerbiles de Mongolia y ratas aterogénicas, al inhibir, respectivamente, daño neuronal

inducido por proceso de isquemia – reperfusión (Martínez et al., 2000) y peroxidación

lipídica en lipoproteínas de baja densidad (Loy et al., 2002). También se ha demostrado la

eficacia terapéutica de este extracto como antiinflamatorio y analgésico, debido a la

influencia de Vimang® sobre especies intermediarias de la reacción inflamatoria, como

citocinas pro-inflamatorias (TNFα), interleucinas (IL-1), enzimas (PLA2) y mediadores de

la cascada del ácido araquidónico (PGE2 y LTB4); que constituyen importantes señales de

la activación intercelular, asociadas a los procesos de daño tisular y activación celular que

producen la mayor parte de las especies reactivas (Martínez et al., 2003). En otra serie de

experimentos, el extracto Vimang® demostró su actividad como modulador del sistema

inmune, al estimular proceso de división y proliferación celular de linfocitos (Figueiras,

1999). Estudios toxicológicos realizados demostraron que se trata de un producto natural

que clasifica como no tóxico por vía oral y tópica; pero que resulta tóxico por vía

intraperitoneal en ensayos de toxicidad aguda realizados en ratas y ratones; pero con un

índice adecuado de seguridad terapéutica en relaciones dosis letal/dosis efectiva

(DL50:DE50 = 50 para ratones; 120 para ratas). No tiene actividad mutagénica o potencial

genotóxico y no induce daños al ADN (Martínez et al., 2003).


5

I.3– Línea de Productos Vimang®.

Desde el año 1999 el Vimang® forma parte del programa de Medicina Natural

Tradicional del Ministerio de Salud Pública (MNT–MINSAP) y se decide incluirlo como

ingrediente activo en diferentes formulaciones como suplemento nutricional antioxidante

por vía oral y para los procesos de envejecimiento por vía tópica; entre las que se

incluyen tabletas, cremas, jarabes, suspensiones, cápsulas, supositorios y óvulos (Núñez,

1999) (anexo 2). A esta línea de productos farmacéuticos se suman alimentos

enriquecidos con Vimang® (galletas, helados, jugos, etc.), lo cual amplía las

posibilidades de su consumo (Cabrera, 2003).

Actualmente, algunos de estos productos ya cuentan con ensayos clínicos (crema y

tabletas) que han demostrado su impacto positivo en la mayoría de las enfermedades

relacionadas con la inflamación, el dolor y la inmunosupresión, como el cáncer y el SIDA

(Martínez et al., 2003), contribuyendo a mejorar la calidad de vida de los pacientes. Ello,

unido a una etapa productiva donde se cuenta con técnicas debidamente validadas para

establecer la calidad del producto, ha hecho posible que ya se comercialicen en algunas

farmacias del programa MNT de las provincias de Ciudad de La Habana, Villa Clara,

Sancti Spíritus y Santiago de Cuba (Opciones, 2004). Otros, como es el caso del jarabe al

5 % (nutracéutico) se encuentra en proceso de desarrollo productivo y se requiere de una

metodología validada para ser aplicada en el control de la calidad del producto final. Por

tanto, a partir de la experiencia acumulada con los productos anteriores de la línea

Vimang®, y dada la presencia de un alto porcentaje de compuestos fenólicos en la

composición de la materia prima activa; se desarrolla un método espectrofotométrico

UV–VIS para cuantificar los fenoles totales en esta formulación; lo cual permitirá

establecer la calidad del producto a partir del criterio de que una alteración en la

composición pudiera tener un efecto terapéutico contrario al deseado.


6

I.4 – Aplicación de la Espectrofotometría Ultravioleta - Visible en el análisis

cuantitativo de fenoles.

La espectrofotometría de absorción molecular es un método óptico instrumental basado en

la relación existente entre la concentración de las disoluciones y la intensidad de la banda

de absorción que estas presentan a una longitud de onda determinada (en la

espectrofotometría UV–VIS dicho rango de longitud de onda abarca las regiones

comprendidas entre 280 y 780 nm). Esta relación se expresa matemáticamente por la ley de

Lambert-Beer, según la expresión (Cabrera et al., 1988; British Pharmacopoeia [BP], 2000;

Skog et al., 2001; Remington, 2003):

A = log (I0/I) = ε c l (1)

donde: A: absorbancia de la disolución; I0 e I : intensidad de la luz incidente y transmitida,

respectivamente; c: concentración de la disolución (expresada en mol/L); l: longitud de

paso óptico o espesor del absorbente (cm) y ε: absortividad molar (antiguamente conocida

como coeficiente de extinción molar), cuando l es expresada en cm y c en mol/L y es

específica para cada sustancia.

La expresión anterior se corresponde a la ecuación de una línea recta con pendiente εl e

intercepto cero cuando se grafica A contra c.

La espectrofotometría UV–VIS ha sido utilizada frecuentemente en determinaciones

cuantitativas de compuestos fenólicos presentes en diferentes productos y especies de

origen vegetal tales como la guayaba (Rodríguez, 1997), la tintura de caléndula

(Kostennikova, 1983), el aceite de oliva (Tovar de Dios, 2001) y el extracto acuoso de

romerillo (Lastra et al., 2000). En la actualidad el método más empleado es una

modificación del método de Folin-Dennis: el método de Folin-Ciocalteau (Vázquez et al.,

1973; Waterman et al., 1994), que emplea como sustancia de referencia al ácido gálico y se

basa en la reducción de ácidos fosfomolíbdicos y fosfotúngsticos o fosfowolfrámicos


7

por los fenoles en medio líquido alcalino formando el complejo Molibdeno –Wolframio de

color azul con máximo de absorción alrededor de los 700 nm (Alnicolsa del Perú S.A.C.,

2006).

Para la determinación cuantitativa de fenoles totales en el jarabe Vimang®, en el

laboratorio de análisis del CQF se aplica un método similar al de Folin – Ciocalteau, donde

se utiliza como agente acomplejante una disolución nombrada “disolución reactivo para

taninos”; y ha sido utilizado anteriormente en el control de calidad de la crema Vimang®

(Figueiras, 1999).

I.5 – Validación de Métodos Analíticos.

Para asegurar la confiabilidad de las determinaciones experimentales, los métodos

analíticos se someten a un proceso de validación; mediante el cual se puede conocer

además si los resultados previstos se obtienen dentro de las condiciones prefijadas

(Calpena, 1990). Es por ello, que las buenas prácticas de laboratorio, consideran a la

validación como un requerimiento imprescindible establecido por agencias regulatorias y

por comisiones de Farmacopeas para el registro de nuevos medicamentos; con el fin de

adecuarlas a los requisitos que proporcionen la garantía de calidad del producto final

(Castillo et al., 1996). En Cuba, el Comité Estatal de Normalización en coordinación con el

MINSAP, elaboró y aprobó en 1992 una norma (Norma Cubana: NC: 26 – 211) con la

finalidad de asegurar ciertos niveles de calidad en los productos farmacéuticos.

Para validar cualquier método analítico es importante tener en cuenta características

inherentes al método y al propio proceso de validación por lo que a continuación se ofrece

una descripción detallada de tales aspectos.

I.5.1 – Desarrollo de un método analítico.

En el desarrollo de cualquier técnica analítica, es importante considerar los criterios de

funcionalidad que demuestre la aptitud de dicho método para el uso al que se destina.

Dichos criterios son: fiabilidad, como la capacidad del método analítico de mantener en el


8

tiempo los criterios de validación; la practicabilidad, como el grado de realización del

método en la práctica e incluye los parámetros de tiempo de ejecución, personal adiestrado,

tipo de instrumento, etc.; e idoneidad, como la capacidad del sistema analítico de

responder a los requisitos fijados en la validación del método (Calpena, 1990). Una vez

establecidos estos criterios, se procede a desarrollar el método analítico, el cual comprende

de las siguientes etapas:

Definición: se establecen las características y requerimientos que el método debe

satisfacer: precisión exigible, sensibilidad deseable, grado de selectividad, tiempo,

costo, tipo de instrumento necesario, entre otros (Crespillo, 1992).

Puesta a punto: incluye desde los primeros estudios de tanteo con patrones hasta la

utilización del método en muestras reales, pasando por la definición de los

parámetros de idoneidad que garanticen el buen funcionamiento del sistema en el

momento del análisis y la calidad de los resultados obtenidos (Crespillo, 1992).

Validación: permite conocer la fiabilidad del método para su aplicación rutinaria, y

en combinación con las etapas anteriores, sus características de funcionamiento

(Crespillo, 1992).

1.5.2 – Validación. Aspectos Generales.

El término validación ha sido definido de diferentes formas por varios autores; sin embargo

todos coinciden en un mismo punto y es que la validación de un método analítico es el

proceso mediante el cual queda establecido, por estudios experimentales que la

capacidad del método satisface los requerimientos para la aplicación analítica deseada

(Castañeira et al., 2002). Otras definiciones son:

Operación destinada a demostrar que todo proceso y procedimiento utilizado para

la producción y control de un producto conducirán efectivamente a los resultados

esperados (NC: 26 – 211).

Procedimiento para establecer mediante estudios de laboratorio que un método

analítico tiene las características de desempeño adecuadas para cumplir los


9

requerimientos de las aplicaciones analíticas que se pretenden. (United States

Pharmacopoeia [USP] 27, 2004; Guía de Validación de Métodos Analíticos, 2005).

No obstante a estas definiciones, la validación de métodos analíticos persigue un objetivo

único: producir los mejores resultados analíticos posibles con el fin de proporcionar

seguridad en el método, la calidad en los resultados; así como la disminución de fallos y

repeticiones. (Castro et al., 1989).

Existen tres tipos de validación (Castro et al., 1989):

Prospectiva, para metódicas nuevas.

Retrospectiva, para metódicas ya utilizadas, no validadas anteriormente y de las que

se tiene documentación suficiente para probar la bondad del método.

Revalidación, repetición parcial o total de una validación debido a cambios

efectuados que pueden afectar la bondad del método.

I.6 – Selección de los Criterios de Validación.

En materia de validación de métodos analíticos resulta imposible adoptar un criterio único

sobre muchos aspectos implicados debido a que: primero, no existe un acuerdo universal

sobre la definición (y consecuentemente sobre el cálculo) de algunos de los parámetros;

segundo, un mismo parámetro puede estimarse por diferentes métodos y tercero,

determinados métodos analíticos requieren de esquemas de validación particulares

(Franquesa, 1990). Unido a ello, los parámetros a evaluar varían de acuerdo los requisitos

legales exigidos por diferentes organizaciones (Food and Drug Administration, 1987;

European Community Information Service, 1990; Association of Official Analytical

Chemists [AOAC], 2002); todo lo cual trae consigo que resulte difícil para el analista

seleccionar los atributos que utilizará en la validación.

Considerando la variedad de ensayos y los diferentes esquemas de validación existentes, la

USP 27 ha establecido varias categorías para la validación de métodos analíticos, que

permitan al analista identificar los parámetros de validación que debe utilizar según el

objetivo final del ensayo. Dichas categorías son:


10

Categoría I: Métodos analíticos para la cuantificación de materias primas o

ingredientes activos (incluyendo preservantes) en productos farmacéuticos

terminados.

Categoría II: Métodos analíticos para la determinación de impurezas o

productos de degradación en productos farmacéuticos terminados.

Categoría III: Métodos analíticos para la determinación de características en

formas terminadas, tales como disolución o liberación de fármacos.

Categoría IV: Ensayos de identidad.

La validación del método aplicado a la determinación de fenoles totales en el jarabe

Vimang® 5 %, tiene carácter prospectivo y se corresponde con la categoría I de ensayo; y

teniendo en cuenta la bibliografía consultada, se evaluaron los parámetros linealidad,

precisión (como repetibilidad y reproducibilidad), exactitud y selectividad/especificidad.

I.7 – Definición de los Parámetros. Metodología para su evaluación.

I.7.1 – Linealidad.

La linealidad de un método analítico es la capacidad de obtener resultados lineales y

proporcionales a la concentración de analito de una muestra en un rango definido (USP 27,

2004). En su estudio, se puede emplear principio activo, materia prima o productos

terminados que contengan concentraciones crecientes de analito; para lo cual se construyen

curvas de calibrado de concentración contra respuesta analítica utilizando como mínimo

tres disoluciones patrón con cinco concentraciones de analito en un rango entre 50 y 150 %

con respecto al valor teórico. Con los resultados primarios de respuesta analítica medida

(y), se debe determinar homogeneidad de la varianza; a través de pruebas estadísticas. Las

más empleadas son el test de Bartlet y el test de Cochran; siendo esta última la utilizada en

el presente trabajo y se define según la expresión (Departamento de Estadísticas de la

Universidad Nacional de Colombia, 2004) (2):


11

(2), donde:1

)( 2

2

n

yyS (3)

donde: cexp: valor de Cochram experimental; (m): número de valores de x; i -1: grados de

libertad para cada varianza en el grupo x; (S2): varianza, (y): respuesta analítica medida

para cada valor de concentración; ( y ): respuesta analítica media y (n): número de

determinaciones. Si se demuestra que las varianzas son homogéneas (cexp menor que

ctabulado), se puede afirmar que para un valor de significación (α) determinado, no existe

influencia de la concentración del analito en la varianza de las respuestas. Por tanto, los

parámetros del análisis de regresión pueden calcularse por el método de los mínimos

cuadrados ordinarios.

1.7.1.1 – Análisis de regresión lineal.

El objeto de un análisis de regresión es investigar y modelar la relación estadística que

existe entre una variable dependiente (y) y una o más variables independientes (x) (Cole,

2002; Departamento de Estadísticas de la Universidad Nacional de Colombia, 2004). Para

una línea recta donde sólo existe una variable independiente, viene dada por la expresión: y

= bx + a (4); donde: (a) y (b): intercepto y pendiente de la recta de regresión,

respectivamente.

En el análisis de regresión de una línea recta, el método que habitualmente se aplica es el de

los mínimos cuadrados, el cual toma la suma de las desviaciones estándar al cuadrado de

cada punto de la línea (Remington, 2003) para minimizar el error y así obtener la línea de

mejor ajuste.

1.7.1.2 - Estimación de los parámetros1.

a) Coeficientes de correlación (r) y determinación (r2).

Los coeficientes de correlación y determinación permiten, respectivamente, determinar si

existe relación directa entre las variables dependiente (y) e independiente (x) y si la

1 En la práctica estos parámetros se estiman mediante programas estadísticos computacionales, por lo cual en

este epígrafe se ofrecen las ecuaciones más representativas de cada parámetro.

m

i

iS

mayorSc

1

2

2

exp

../../../../Dayana/lo%20que%20habia%20en%20la%20memoria/version%20completa/www.virtual.unal.co


12

variación de (x) permite explicar la variación total en (y). El coeficiente de correlación se

define según la expresión (5):

donde: (x), ( x ): concentración, concentración media, respectivamente; (y), ( y ): respuesta

analítica, respuesta analítica media, respectivamente. El coeficiente de determinación es el

cuadrado del coeficiente de correlación.

El valor de r puede variar entre -1 y +1 (Red Creativa de Ciencias, 2002; Remington,

2003).Si r es próximo a 1, el modelo lineal es adecuado para describir los datos

experimentales; pero cuando se aparta de estos extremos, la expresión lineal no es una

buena descripción de los datos. El valor de r2

debe ser mayor que 98%.

Otros autores (Quatrocchi et al., 1992) consideran que la mejor forma de indicar la

linealidad del método es realizar un test t - Student en el cual se calcular la correlación

lineal significativa (tr) a partir de la hipótesis nula de no correlación entre las magnitudes

“x” y “y”. Este test involucra los parámetros r y r2 y se define según la expresión (6):

donde: n es el número de réplicas. El valor tr obtenido se compara con el de t - Student

tabulado para el nivel de significación utilizado y con n - 2 grados de libertad (donde n

corresponde al número total de determinaciones de “y” (Castillo et al., 1996).

b) Pendiente.

Definida también como “coeficiente de regresión” y se expresa en unidades de respuesta

sobre unidades de concentración o cantidad del analito y se calcula mediante la ecuación

(7):

22 )()(

))((

yyxx

yyxxr

2

1 2

n

r

rtr

(5)

(6)


13

En el análisis de la pendiente también debe considerarse la prueba hipótesis nula

Ho: β1 = 0, que permite verificar a partir del valor de F – Snedecor (relación entre la

varianza de la regresión y la varianza “residual2”), que la pendiente es diferente de cero. Si

el valor calculado es mayor que el tabulado para el nivel de significación elegido, se

rechaza la hipótesis nula y se acepta que la pendiente difiere significativamente de la

horizontal y por tanto, se acepta que el modelo lineal permite explicar variaciones en la

variable dependiente (Figueiras, 1999).

c) Intercepto y prueba de proporcionalidad.

El intercepto se relaciona con la presencia de interferencias o errores sistemáticos y se

expresa según la ecuación (8):

a = y - b x (8)

donde: (a): intercepto, ( y ): respuesta analítica media, (b): pendiente y ( x ): concentración

media. El intervalo de confianza del intercepto debe incluir el cero para cumplir con el

requisito de proporcionalidad, como se exige para el cumplimiento de la ley de Lambert –

Beer para métodos espectrofotométricos (Castillo et al., 1996). La prueba de

proporcionalidad además se puede determinar mediante una prueba de t considerando que

el intercepto tienen que ser cero, utilizando la expresión (9):

donde: (a): valor del intercepto, Sa: desviación estándar del intercepto y debe ser menor

que el valor tabulado de t - Student para el nivel de significación dado y n – 2 grados de

libertad.

2 diferencia entre el valor observado iY y el valor estimado (o ajustado) iY

.

2)(

/(

xx

nyyxb

i

iii

(7)

Sa

at exp (9)


14

I.7.2 – Precisión.

La precisión de un método analítico refleja la concordancia (grado de dispersión) entre los

valores repetidos de una serie de ensayos sobre una misma muestra homogénea bajo

condiciones establecidas (BP, 2000; Guía de Validación de Métodos Analíticos, 2005); e

indica la medida del error aleatorio o indeterminando de un análisis (Skog y col, 2001).

Generalmente, se expresa en términos de repetibilidad y reproducibilidad, donde la

repetibilidad refleja la precisión de un método cuando se desarrolla bajo las mismas

condiciones: utilizando una misma muestra homogénea, analizada por un mismo analista,

en el mismo laboratorio, con los mismos reactivos y equipos y durante un período de

tiempo corto (Calpena, 1990; BP, 2000; Guía de Validación de Métodos Analíticos, 2005);

mientras que la reproducibilidad (expresado por algunos autores en términos de precisión

intermedia), es la medida de la precisión de los resultados de los ensayos realizados sobre la

misma muestra homogénea, pero ejecutados en condiciones diferentes: diferentes

analistas, días diferentes, diferentes equipos, etc. (Calpena, 1990).

Los parámetros estadísticos que caracterizan al estudio de precisión son la desviación

estándar (S) y/o preferiblemente la desviación estándar relativa o coeficiente de variación

(CV) de la respuesta analítica medida (y); el cual permite evaluar la incertidumbre en la

estimación de la media, es decir, el error aleatorio que se corresponde con la dispersión

ddelos datos alrededor de la media (Castillo et al., 1996). Dichos parámetros se calculan

según las expresiones (10) y (11):

2SS (10) y y

SCV (%) 100 (11)

donde: (S2): varianza y ( y ): respuesta analítica media.

Cualquiera que sea el parámetro evaluado, debe determinarse analizando un número

suficiente de alícuotas; por lo que se recomienda llevar a cabo un total de nueve

determinaciones que cubran el intervalo especificado en el procedimiento; para lo cual

puede trabajarse:


15

analizando seis muestras independientes a la concentración normal de trabajo o

100 % (USP 27, Guía de Validación de Métodos Analíticos, 2005).

a tres niveles de concentración (próxima al límite inferior, medio y próxima al

límite superior del rango lineal definido) por triplicado en cada nivel (USP 27,

2004; Guía de Validación de Métodos Analíticos, 2005). Este método suele

utilizarse cuando se cuenta con poca cantidad de muestra, donde resulta conveniente

realizar un test de Cochran de homogeneidad de varianza para estimar si el factor

cantidad o concentración influye en la determinación analítica (Castillo et al.,

1996).

Los criterios de aceptación son diversos, pero en términos generales para evaluar la

precisión del sistema o del método, la desviación estándar relativa debe ser menor que

1,5 % en estudios de repetibilidad, mientras que en estudios de reproducibilidad debe ser

menor al 2 %.

I.7.3 – Exactitud.

La exactitud indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más

próximo posibles al valor considerado como verdadero (Calpena, 1990; USP 27, 2004). A

diferencia de la precisión que indica el error aleatorio, la exactitud refleja el error

sistemático o la tendencia a él (NC 26 – 211). Según la literatura consultada, existen

diferentes métodos para evaluar la exactitud:

1.7.3.1. – Comparación con un método oficial, validado o estandarizado.

La muestra se analiza utilizando el método a validar y un segundo método bien

caracterizado, el cual debe tener una exactitud bien definida y establecida. Se analizan 6

muestras por duplicado a la concentración normal de trabajo por ambos métodos y se lleva

a cabo un análisis de varianza ANOVA del porcentaje de recuperación o del error relativo

en porcentaje para determinar si existe o no diferencias significativas entre la exactitud de

los métodos comparados (Guía de Validación de Métodos Analíticos, 2005).


16

1.7.3.2 – Método de adición de patrón.

Se puede realizar con placebo enriquecido con un patrón o con muestra enriquecida con el

patrón, de no contarse con el placebo. En ambos casos, se preparan disoluciones a tres

niveles de concentraciones diferentes de la concentración teórica (Guía de Validación de

Métodos Analíticos, 2005). La ICH (International Conference Harmonization) recomienda

preparar muestras por triplicado para cada nivel de concentración (USP 27, 2004; Guía de

Validación de Métodos Analíticos, 2005). En el caso del trabajo con muestras enriquecidas,

si se desea calcular el porcentaje de recuperación, debe conocerse el contenido de principio

activo en la muestra antes de la adición del patrón.

Los criterios de aceptación según el tipo de ensayo se reportan en la tabla I.

Tabla I: Criterios de aceptación para el método de adición del patrón.

Ensayo Criterio de Aceptación

Placebo enriquecido

Porcentaje (%) de recuperación esperado: 98 – 102%.

Al graficar ctdad. añadida vs. ctdad. recuperada, debe

obtenerse: r = 1,00; a = 0,00 y b = 1,00. Lo cual debe ser

corroborado estadísticamente.

Muestra enriquecida

Los porcentajes (%) de recuperación obtenidos deben

encontrarse dentro del rango del 100% 4S

Al graficar ctdad. total encontrada vs. ctdad. de analito

adicionada, a = a la concentración inicial y b = 0.95.

leyenda: ctdad.:cantidad; r: coeficiente de correlación; S: desviación estándar obtenida en la determinación

del método o del sistema; a y b: intercepto y pendiente de la curva de calibración, respectivamente. (Fuente:

Guía de Validación de Métodos Analíticos, 2005).

1.7.3.3 – Método de curvas de respuesta relativa.

Es una modificación del método de adición de patrón a placebo y consiste en la

comparación de las curvas de regresión lineal de patrones con curvas de regresión lineal de

placebos enriquecidos. Para realizarlo, se preparan disoluciones a tres niveles diferentes de


17

concentración para el placebo enriquecido y las disoluciones patrón; utilizando los mismos

niveles en cada caso. Se construyen curvas de calibrado de cantidades añadidas vs.

cantidades recuperadas y se evalúa la regresión lineal para ambos grupos para comparar

fundamentalmente, los valores de las pendientes y los interceptos (Guía de Validación de

Métodos Analíticos, 2005).

1.7.3.4 – Comparación de los resultados obtenidos de un estándar o material de referencia

certificado.

Se analiza por duplicado el material de referencia por el método a validar y se compara el

resultado obtenido con el valor verdadero declarado. Las principales limitantes de este

método consisten en la disponibilidad y estabilidad de dicho material, así como el grado de

certidumbre que se tenga del valor verdadero de la concentración de dicho material. El

criterio de aceptación se encuentra entre el 98 – 102 % de la cantidad declarada o el 2 % del

error relativo (Guía de Validación de Métodos Analíticos, 2005).

Un método se considera exacto si a través de un test t – Student se demuestra que el valor

medio de recuperación no difiere del 100 % o si el valor hallado no difiere del valor

teórico; utilizando la expresión (Castillo et al., 1996):

donde: texp: valor experimental de t; m: valor considerado verdadero; n: número de

determinaciones; S: desviación estándar; R: porcentaje de recobrado y CV: coeficiente de

variación. El valor de texp debe ser menor que el valor tabulado de t para afirmar que ambos

valores no difieren significativamente para α = 0.05 y n – 1 grados de libertad.

I.7.4 – Especificidad y Selectividad.

Los términos especificidad y selectividad se consideran equivalentes por algunos autores y

se definen como la capacidad de un método analítico para medir exacta y específicamente

el analito sin interferencias de impurezas, productos de degradación o excipientes que

S

nxm

CV

nRt

100exp

(12)


18

pueden estar presentes en una muestra (Calpena, 1990).Otros autores (DeSain, 1992) los

diferencian, considerando la selectividad como la capacidad del método de detectar

simultáneamente o separadamente sustancias químicas diferentes presentes en una misma

muestra y a especificidad como la capacidad de detectar el analito sin interferencias de

otros compuestos.

Los estudios de selectividad varían según el tipo de método analítico:

1. pruebas de identificación (USP 27, 2004).

2. ensayos de pureza (USP 27, 2004).

3. determinación cuantitativa de un componente (materia prima, o principio activo o

excipiente en producto terminado (Figueiras, 1999).

En el tercer caso, el estudio de selectividad se determina comparando los resultados del las

muestras en presencia de productos relacionados (Calpena, 1990) como excipientes,

impurezas o productos de degradación. Si se desconocen las impurezas o productos de

degradación, la muestra debe someterse a condiciones de envejecimiento acelerado

(ejemplo: temperatura, luz, humedad, hidrólisis ácido/base, oxidación) y compararse con

una muestra en condiciones normales. El método resultará selectivo si se confirma que es

capaz de separar y determinar las sustancias de interés en presencia de cualquier

interferencia presente (Castañeira et al., 2002).

MATERIALES Y MÉTODOS

19

CAPITULO II: MATERIALES Y MÉTODOS.

II.1 – Equipos.

Balanza analítica Mettler, modelo H6, precisión ± 0,05 mg, mínimo: 10 mg.

Espectrofotómetro UV – VIS Pharmacia LKB Biochrom, England.

II.2 – Reactivos.

Polvo Vimang®, lote 0403 (ver informe analítico en anexo 3).

Jarabe Vimang® 5%, lote 50601 – 6 proveniente de la Empresa de Farmacia de

Camagüey (ver informe analítico en anexo 4).

Tungstato de sodio dihidratado p.a, Carlos Erba.

Ácido fosfomolíbdico p.a, Merck.

Ácido fosfórico 85 % p.a, Merck.

Carbonato de sodio p.a, Fluka.

Ácido tánico p.a., Fluka.

Azúcar, comercial.

Extracto de menta, comercial.

Dicromato de potasio, p.a, Merck (desecado a 130 C, durante 30 minutos).

Ácido sulfúrico, p.a (densidad = 1,83 g/L).

Agua destilada.

II.3 – Método.

Para la determinación de fenoles, en el laboratorio de análisis del CQF se empleó un

método similar al de Folin - Ciocalteau. Teniendo en cuenta que el método a validar

pertenece a la categoría I de ensayo para la cuantificación de materias primas y/o principios

activos en formulaciones, se realizaron los experimentos de linealidad, precisión (como

repetibilidad y reproducibilidad), exactitud y selectividad.

Las disoluciones de jarabe Vimang® y de placebo, se prepararon teniendo en cuenta las

proporciones de los componentes en la formulación, como se reporta en la tabla II. Se


20

utilizaron además muestras de jarabe Vimang® 5 %(lote 50601 – 6); la cual se analizó antes

y después de 15 días de almacenamiento a 40 ºC en el estudio de selectividad.

Tabla II: Composición del jarabe Vimang® 5%.

Ingredientes Formulación para 100 mL

Vimang 4,995 g

Azúcar refino 55,50 g

Benzoato de sodio 0,150 g

Extracto de menta 0,010 mL

Agua suavizada csp 100 mL

leyenda: csp: cantidad suficiente para.

Para el desarrollo del color, se utilizó la disolución tungsto- fosfomolíbdico (más conocida

en el CQF como disolución reactivo para taninos), la cual cuando reacciona con los fenoles

en medio alcalino forma un complejo de color azul cuyo máximo de absorción se puede

leer a 700 nm. Para la medida de la absorbancia se utilizó como blanco una disolución cuya

composición es similar a la disolución placebo. Las condiciones del análisis fueron:

Temperatura: 27 ± 2 C.

Cubetas de 1 cm de paso óptico.

No menos de dos lecturas por disolución.

Los parámetros de validación se procesaron matemáticamente utilizando el paquete

estadístico STATGRAPHIC Plus y el sistema instrumental de medida fue verificado según

la metodología establecida en el CQF.

II.4 – Preparación de las disoluciones para el estudio de validación.

II.4.1. – Disoluciones auxiliares para el análisis.

2.4.1.1. – Disolución de ácido sulfúrico 0,.01 mol/L.


21

Se tomaron 107 μL de ácido sulfúrico con micropipeta graduada de 200 μL y se añadieron

a un vaso precipitado que contenía alrededor de 50 mL de agua destilada, se agitó

circularmente y posteriormente, la disolución se trasvasó a matraz aforado de 200 mL, se

enrasó con agua destilada y homogeneizó. Se identificó.

2.1.1.2 - Disolución de dicromato de potasio 0,065 g/L en ácido sulfúrico.

Se pesaron en balanza analítica 0,0735 g de dicromato de potasio y se desecaron a 130 ºC

durante 30 minutos. Posteriormente, se trasvasaron a matraz aforado de 25 mL con la

disolución de ácido sulfúrico anteriormente preparada, se enrasó y homogeneizó. Con una

pipeta de 5 mL se tomaron 2,2 mL de esta disolución y se trasvasaron cuantitativamente a

matraz aforado de 100 mL, se enrasó con la disolución de ácido sulfúrico y se

homogeneizó. Se identificó.

2.4.1.3 – Disolución reactivo para taninos.

Se pesaron en balanza analítica 50 g de tungstato de sodio dihidratado y 1 g de ácido

fosfomolíbdico en balón de destilación de 1000 mL. Se adicionaron 25 mL de ácido

fosfórico 85 % y 375 mL de agua destilada, y se agitó hasta total disolución.

Posteriormente, la disolución obtenida se reflujó durante dos horas, tras las cuales se dejó

reposar hasta alcanzar la temperatura ambiente. Se trasvasó cuantitativamente a matraz

aforado de 500 mL y se enrasó con agua destilada. El reactivo se envasó en frasco color

ámbar y se identificó.

2.4.1.4 – Disolución madre de benzoato de sodio 1,5 mg/mL.

Se pesaron en balanza analítica 0.0375 g de benzoato de sodio en vaso de precipitado de

25 mL y se trasvasaron cuantitativamente con agua destilada a un matraz

aforado de 25 mL. Se enrasó con agua destilada y se homogeneizó. El reactivo se trasvasó a

frasco color ámbar y se identificó.

2.4.1.5 – Disolución de ácido tánico 6 μg/mL (estudio de exactitud).


22

Se pesaron 0,025 g de ácido tánico en vaso de precipitado de 25 mL y se trasvasaron

cuantitativamente con agua destilada a matraz aforado de 100 mL. Se enrasó con agua

destilada y homogenizó. De esta disolución se tomaron 20 mL y se trasvasaron a matraz

aforado de 100 mL, se enrasó con agua destilada y homogeneizó. Se identificó (disolución

de ácido tánico 0,05 mg/mL).

De la disolución anterior, se tomó una alícuota de 1mL y se trasvasó a matraz aforado de

25 mL. Se añadieron 2 mL de disolución tungsto- fosfomolíbdico, se agitó circularmente y

se dejó reposar durante 5 minutos, al cabo de los cuales se añadió 1 mL de disolución de

carbonato de sodio 20 %. Se enrasó y homogeneizó.

II.4.2. – Disoluciones para el estudio de validación.

2.4.2.1 - Disolución de jarabe placebo.

Se pesaron en balanza analítica 0,28 g de azúcar en un vaso de precipitado de 25 mL. Se

añadieron alrededor de 0,1 mL de extracto de menta con ayuda de la micropipeta, 1 mL de

benzoato de sodio y alrededor de 10 mL de agua destilada; y se sometió a agitación hasta

total disolución. Posteriormente, 1 mL de dicha la disolución se trasvasó cuantitativamente

a un matraz aforado de 25 mL y se adicionaron 2 mL de disolución tungsto-

fosfomolíbdico, se agitó circularmente y se dejó reposar durante 5 minutos, tras los cuales

se adicionó 1 mL de disolución de carbonato de sodio 20 %, se agitó y se enrasó con agua

destilada.

2.4.2.2 –Disoluciones de jarabe Vimang.

2.4.2.2.1 – Disolución patrón de jarabe Vimang 25 mg/mL (50 %).

Se pesaron 0,025 g de Vimang y 0,28 g de azúcar en vaso de precipitado de 50 mL. Se

añadieron alrededor de 25 mL de agua destilada, 1 mL de benzoato de sodio de la

disolución madre preparada (según epígrafe 2.4.1.4) y 0,1 mL de extracto de menta y se

agitó hasta total disolución. Posteriormente, se trasvasó cuantitativamente a matraz aforado

de 100 mL, se enrasó con agua destilada y se homogeneizó.


23

2.4.2.2.2 – Disolución de jarabe Vimang 50 mg/mL (100 %).





de 100 mL, se enrasó con agua destilada y se homogeneizó. Posteriormente, 1 mL de dicha

la disolución se trasvasó cuantitativamente a un matraz aforado de 25 mL y se adicionaron

2 mL de disolución tungsto- fosfomolíbdico, se agitó circularmente y se dejó reposar

durante 5 minutos, tras los cuales se adicionó 1 mL de disolución de carbonato de sodio

20 %, se agitó y se enrasó con agua destilada.

2.4.2.2.3 – Disolución de jarabe Vimang 75mg/mL (150 %).





de 100 mL, se enrasó con agua destilada y se homogeneizó. Posteriormente, 1 mL de dicha

la disolución se trasvasó cuantitativamente a un matraz aforado de 25 mL y se adicionaron

2 mL de disolución tungsto- fosfomolíbdico, se agitó circularmente y se dejó reposar

durante 5 minutos, tras los cuales se adicionó 1 mL de disolución de carbonato de sodio

20 %, se agitó y se enrasó con agua destilada.

2.4.2.3 - Disolución de jarabe Vimang degradado.

Se pesó en balanza analítica la cantidad equivalente a 1g de jarabe en un vaso de

precipitado y se trasvasó cuantitativamente con agua destilada a un matraz aforado de


24

25 mL. Posteriormente se adicionaron 2 mL de disolución tungsto- fosfomolíbdico, se agitó

circularmente y se dejó reposar durante 5 minutos, tras los cuales se adicionó 1 mL de

disolución de carbonato de sodio 20 %, se agitó y se enrasó con agua destilada.

II.5 – Verificación, calibración y control del sistema instrumental de

medida.

Se evaluó el control de la absorbancia a 235,0; 257,0; 313,0 y 350 nm utilizando la

disolución de dicromato de potasio 0,065 g/L contra la disolución de ácido sulfúrico

0,01 mol/L (sustancia de referencia). Con los valores de absorbancia obtenidos se calcula la

absorbancia específica según la expresión (13):

A (1%, 1cm) = A / cd (13)

donde: A (1%, 1cm): absorbancia específica experimental; A: absorbancia de la disolución

de dicromato de potasio; c: concentración expresada en porcentaje m/v = 0,0065 y d: paso

óptico de la cubeta = 1cm. Los valores de absorbancia específica deben encontrarse en el

rango de aceptación establecido por el fabricante para considerar al equipo apto para su

uso.

II.6 – Estudio de validación.

II.6.1- Estudio de Linealidad.

Se prepararon cinco disoluciones patrón de jarabe Vimang 25 mg/mL por triplicado según

la metodología descrita en el (epígrafe 2.4.2.2.1) con concentraciones de principio activo

comprendidas en el rango de 50 – 150 %. Para ello, se tomaron alícuotas de 1,0; 1,5; 2,0;

2,5 y 3,0 mL correspondientes, respectivamente, a 10, 15, 20, 25 y 30 μg/mL, siendo

20 μg/mL la que se corresponde con el 100 %.

Para probar la linealidad del método se construyeron tres curvas de calibración de

concentración de analito vs. respuesta medida (absorbancia). Se calcularon la recta de


25

regresión y sus parámetros y se determinó mediante un test de Cochran si la concentración

del analito influye en los resultados.


26

II.6.2 – Estudio de Precisión.

El estudio de repetibilidad se llevó a cabo utilizando tres concentraciones (próximas al

límite inferior, medio y superior del intervalo de linealidad), para un total de seis réplicas

por concentración en un mismo día de trabajo. Se trabajó con placebo al cual se le añadió

concentraciones conocidas de Vimang materia prima correspondientes al 50 % (10 μg/mL),

100 % (20 μg/mL) y 150 % (30 μg/mL) de la cantidad teórica. Para el análisis de

reproducibilidad, se realizaron seis réplicas de ensayo para la concentración

correspondiente con el de 100 % (20 μg/mL). El análisis se realizó en días diferentes para

comprobar la influencia del factor tiempo en los resultados.

Para comprobar la precisión del método, se calculó el valor medio de absorbancia, la

desviación estándar (S) y el coeficiente de variación (CV) en porcentaje, para cada

concentración en ambos estudios. Se compararon además los CV del estudio de

reproducibilidad con los del estudio de repetibilidad. El criterio de aceptación incluye

valores de coeficiente de variación inferiores al 1,5 % y al 2 % para los estudios de

repetibilidad y reproducibilidad, respectivamente. A través de los test F y t – Student se

determinó la influencia del factor tiempo en la reproducibilidad del método analítico;

mientras que el test de Cochran se utilizó para determinar la influencia de la concentración

en la repetibilidad.

II.6.3 - Estudio de Exactitud.

El estudio se realizó con placebo al cual se le añadieron concentraciones conocidas de

Vimang principio activo, utilizando como referencia al ácido tánico. El análisis se realizó

utilizando tres concentraciones: próxima al límite inferior, media y próxima al límite

superior del intervalo de linealidad, cada una por sextuplicado, el mismo día. Se utilizaron

los valores experimentales obtenidos en el estudio de repetibilidad. Además se obtuvo una

curva de cantidades añadidas vs. cantidades recuperadas para las tres concentraciones

estudiadas en el estudio de repetibilidad.


27

Se calculó el porcentaje de fenoles totales en el jarabe respecto al ácido tánico según la

expresión (14):

donde: Am: absorbancia de la muestra; Aat: absorbancia del ácido tánico; Pm: peso de la

muestra en gramos y Pat: peso del ácido tánico en gramos.

El método se considera exacto si la recta de calibrado obtenida en el análisis de cantidades

añadidas vs. recuperadas tiene un coeficiente de correlación mayor que 0,99; los intervalos

de confianza de la pendiente y el intercepto incluyen al 1 y al cero respectivamente para un

nivel de significación de 0,05. Se calculó la recuperación media ( R ) o porcentaje de

recuperación de la cantidad de analito presente en la muestra, y mediante la aplicación de

mediante la aplicación del test t - Student se determinó si existen diferencias significativas

entre R y el 100 %; mientras que el test de Cochran, se utilizó para determinar la

influencia de la concentración en los resultados obtenidos.

II.6.4 - Estudio de Selectividad.

Se determinó mediante la comparación de los espectros obtenidos de disoluciones de jarabe

Vimang, de jarabe placebo y de jarabe Vimang degradado en un rango de longitud de onda

comprendido entre los 400 y 700 nm. Para considerar que el método es selectivo, los

nuevos máximos de absorción de los espectros de las muestras degradadas no deben

coincidir con los máximos de absorción de las muestras de jarabe no degradado. Además,

debe observarse una ligera disminución de la absorbancia a 700 nm.

% de fenoles totales = Am . Pat . 20

Aat . Pm (14)

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

28

CAPITULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

III.1 – Cualificación del sistema instrumental de medida.

En la tabla III se reportan los resultados obtenidos en el control de la absorbancia, donde se

puede apreciar que los valores experimentales obtenidos se encuentran dentro del rango de

aceptación establecido por el fabricante. Por tanto, el sistema instrumental de medida se

encuentra apto para el uso.

Tabla III: Resultados obtenidos en el control de la absorbancia.

No. de

determinaciones

Absorbancia

λ = 235,0 nm λ = 257,0 nm λ = 313, 0 nm λ = 350, 0 nm

1 0,813 0,936 0,311 0,681

2 0,796 0,935 0,311 0,680

3 0,808 0,941 0,313 0,684

4 0,836 0,937 0,317 0,683

5 0,794 0,932 0,319 0,687

6 0,798 0,936 0,312 0,689

Media 0,808 0,936 0,314 0,683

A(1%,1cm) exp. 124,2 144,0 48,3 105,0

A(1%,1cm) rep. 129,9 - 126,2 142,4 - 145,7 47,0 -50,3 104,9 - 108,2

leyenda: A (1%,1cm) exp. y A (1%,1cm) rep.: absorbancia específica experimental y absorbancia específica

reportada, respectivamente.

III.2 – Estudio de Linealidad.

En la tabla IV se reportan los valores medios de absorbancia para las tres curvas de

calibración en tres días diferentes.


29

Tabla IV: Valores medios de absorbancia de las disoluciones patrón jarabe

Vimang® 5%.

Concentración

(g/mL)

Curva 1

Curva 2

Curva 3

10 0,120 0,121 0,124

15 0,183 0,185 0,186

20 0,254 0,256 0,253

25 0,302 0,303 0,302

30 0,351 0,354 0,352

A partir del tratamiento estadístico de los resultados de la tabla IV, se comprobó que no

existe influencia de la concentración en la varianza de la respuesta, ya que el valor de la

C- Cochran experimental (cexp =0,37) es menor que el tabulado (ctab = 0,68) para un nivel

de significación α = 0.05. Por tanto, el ajuste del modelo lineal y = bx + a y sus parámetros

estadísticos se determinaron por el método de los mínimos cuadrados ordinarios.

Como se observa en la figura 1, la ecuación del modelo lineal ajustado es:

Absorbancia = 0,0114667 + 0,01158*concentración y los puntos representados se acercan a

dicho modelo. El coeficiente de correlación del ajuste cercano a 1, indica que existe una

fuerte correlación lineal positiva (Departamento de Estadísticas de la Universidad de

Colombia, 2004) entre las variables “x” (concentración del analito) y “y” (absorbancia). El

coeficiente de determinación (99,32 %) mayor que un 98%, refleja que las variaciones en

“y” pueden ser explicadas por variaciones en “x”. Por otro lado, el test F de la regresión,

prueba que la pendiente difiere de la horizontal al rechazarse la hipótesis nula (H0 = 0), ya

que el valor obtenido (2066,66) es mayor que cero; mientras que en la determinación de tr

mediante un test t – Student, el valor experimental (43,8) es mayor al tabulado (2,16) por lo

que se rechazó la hipótesis nula de no correlación entre las magnitud “x” y “y”. Estas dos

últimas pruebas confirman la correlación entre las variables “x” y “y”.

El valor del intercepto no difiere significativamente de cero. El valor de t calculado (2,12)

es menor que valor tabulado (2,16), por lo que el método (a diferencia del desarrollado por

Figueiras) cumple con la condición de proporcionalidad Este resultado indica desde el

punto de vista teórico que el método cumple con la ley de Lambert – Beer.


30

Figura 1: Resultados de la regresión lineal simple del estudio de linealidad. FV: Fuente

de Variación; GL: Grados de Libertad. (Fuente: STATGRAPHICS Plus 1994 – 2000)


31

Todos los resultados obtenidos, demuestran la linealidad del método en el intervalo de

concentraciones estudiado (10 -30 μg/mL).

III.3 – Estudio de Precisión.

En las tablas VI y VII se muestran los valores de absorbancia obtenidos para cada

concentración y los parámetros estadísticos correspondientes a los estudios de repetibilidad

y reproducibilidad, respectivamente.

Tabla VI: Resultados obtenidos en el estudio de repetibilidad.

No. de determinaciones Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3

1 0,121 0,243 0,361

2 0,123 0,246 0,366

3 0,120 0,243 0,366

4 0,122 0,245 0,363

5 0,120 0,242 0,359

6 0,120 0,241 0,358

Media 0,121 0,243 0,362

S 0,0013 0,0019 0,0034

CV(%) 1,07 0,78 0,94

Tabla VII: Resultados obtenidos en el estudio de reproducibilidad.

Día 1

Analista A

Día 2

Analista B

Réplicas 100 %

1 0,243 0,240

2 0,246 0,247

3 0,243 0,246

4 0,245 0,240

5 0,242 0,248

6 0,241 0,242

Media 0,243 0,244

S 0,0019 0,0036

CV (%) 0,78 1,5


32

Mediante el test de Cochran se demuestra que la concentración no influye en la

repetibilidad de los resultados obtenidos; ya que el valor de la C - experimental igual a 0,69

es menor que el tabulado para una probabilidad de 0,05. Además los valores obtenidos en el

estudio de reproducibilidad se compararon estadísticamente a través de un test - F y un test

t - Student (figura 2), no existiendo diferencias significativas entre sus varianzas y sus

medias respectivamente, lo que demuestra la reproducibilidad del método. Los coeficientes

de variación inferiores al 1,5 % en el estudio de repetibilidad y al 2 % en el estudio de

reproducibilidad, indican la precisión del método.

Figura 2: Test t-Student y test – F para el estudio de reproducibilidad. (Fuente:

STATGRAPHICS Plus 1994 – 2000)


33

III.4 – Estudio de Exactitud.

En la tabla VIII se reportan los porcentajes de fenoles totales calculados utilizando como

referencia al ácido tánico, cuyo valor medio de absorbancia fue 0.0455. A partir de estos

valores se construyó una curva de calibrado de cantidades añadidas vs. cantidades

recuperadas y cuyo análisis de regresión lineal se reporta en la figura 3.

Tabla VIII: Porcentaje de fenoles totales calculados con respecto al ácido tánico.

Réplicas 50 % 100 % 150 %

1 49,73 99,87 148,37

2 50,55 101,10 150,42

3 49,32 99,87 150,42

4 50,14 100,69 149,19

5 49,32 99,46 147,55

6 49,32 99,05 147,13

Media 49,73 99,87 148,37

S 0,5198 0,7652 0,3124

CV (%) 1,05 0,77 0,21

Como se observa, para el modelo lineal ajustado el valor del coeficiente de correlación

(0,997) fue cercano a 1, el intervalo de confianza de la pendiente (0,978; 1,03) incluyó al

1 y el del intercepto (-0,921; 1,743) incluyó al cero; lo que demuestra la exactitud del

método.


34

Figura 3: Análisis de regresión lineal para la curva de calibración de cantidades

añadidas vs. cantidades recuperadas del estudio de exactitud (Fuente:


35

STATGRAPHICS Plus 1994 – 2000).

A partir de los resultados obtenidos en el cálculo de los fenoles totales (Tabla VIII), se

calculó el porcentaje de recuperación o recobrado (R) para cada concentración (tabla IX)

según la expresión (15):

100Teórica

Práctica

C

CR (15)

donde: CPráctica y CTeórica; concentraciones práctica y teórica (100%) respectivamente.

Tabla IX: Porcentaje de recobrado.

Réplicas 50 % 100 % 150 %

1 99,46 99,87 98,91

2 101,10 101,10 100,28

3 98,64 99,87 100,28

4 100,28 100,69 99,46

5 98,64 99,46 98,36

6 98,64 99,05 98,09

Media 99,46 100,01 99,23

S 1,040 0,765 0,940

CV (%) 1,04 0,70 0,95

Se realizó un test de homogeneidad de varianza (test de Cochran), donde se demostró que

el factor concentración no influye en la exactitud del método ya que el valor experimental

(0,42) es menor que el tabulado (0,71) para α = 0,05. A partir de aquí, se calculó el valor

de R media total ( R ) igual a 99,60 %. Este valor se encontró dentro de los límites de

aceptación (98 – 102 %) y su coeficiente de variación (0,93) fue menor que el 3 %, por lo

que el método es exacto según lo reportado por Castañeira et al. para formulaciones

líquidas. Se realizó además un test t – Student y se encontró que la t-experimental (1,38)

fue menor que la t-tabulada (2,11), lo que confirma la exactitud del método.


36

III.5 – Estudio de Selectividad.

Los espectros más representativos del estudio de selectividad se muestran en la figura 4;

donde se puede apreciar que el espectro de la muestra placebo no mostró ninguna banda de

absorción, lo cual indica que los excipientes de la formulación no interfieren en la

selectividad del método analítico.

Por otra parte, los espectros correspondientes al jarabe Vimang® recién preparado y al

jarabe Vimang® degradado, no varían notablemente. No obstante, se observa una ligera

disminución en la absorbancia, lo cual indica que ha ocurrido degradación tras someter el

producto a condiciones de envejecimiento acelerado durante 15 días a 40 ºC. De esta forma

queda demostrado que los posibles productos de degradación formados no absorben a la

longitud de onda de 700 nm, y por tanto no interfieren en la selectividad del método.

Los resultados obtenidos demuestran que el método aplicado es selectivo.


37

Figura 4. Espectros del Jarabe Vimang. a: Placebo. b: Jarabe Vimang almacenado a 40 C durante 15 días. c:

Jarabe Vimang recién preparado.

CONCLUSIONES

38

CONCLUSIONES

Se evaluaron los parámetros de linealidad, precisión y exactitud para la validación

del método de acuerdo a la categoría I de ensayo para cuantificación de materias

primas y/o principios activos en formulaciones.

El método espectrofotométrico propuesto para la determinación cuantitativa de los

fenoles totales en el jarabe Vimang® 5 % es confiable para obtener resultados

satisfactorios dentro de los intervalos definidos; tal y como lo demuestran el análisis

estadístico de los ensayos realizados.

La metódica es sencilla, económica y está validada, por lo que puede ser utilizada

en el control de la calidad y estudios de estabilidad del jarabe Vimang® 5 %.

RECOMENDACIONES

39

RECOMENDACIONES

Proponer a la Empresa de Farmacia de Camagüey la aplicación del método para el

control de la calidad y estudios de estabilidad de dichas formulaciones.

Realizar estudios de estabilidad para establecer el tiempo de vida útil del producto.

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