Tinción de Gram

PRINCIPIO:

La tinción diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos químicos que se aplican en secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es llamado tinción primaria o colorante primario. Su función es impartir color a todas las células. Con el objetivo de establecer un contraste de color, el segundo reactivo usado es un agente decolorante, el cual puede decolorar la célula completa o solo parte de ella. El reactivo final, el colorante de contraste, le da a las células decoloradas un color que contrasta con el del colorante primario. El colorante de contraste no puede ser absorbido por células que no han perdido el colorante primario. De esta manera, tipos de células o sus estructuras se pueden distinguir unas de otras en función del colorante que es absorbido.

El método de tinción diferencial más importante usado en bacteriología es la tinción de Gram, llamada así en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este método divide las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-positivas. Esto es esencial para la clasificación y diferenciación de microorganismos. La reacción a la tinción de Gram está basada en la diferencia en la composición química de la pared celular bacteriana. Las bacterias Grampositivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano o mureína, mientras que esta capa es más fina en las Gram-negativas y está rodeada por una bicapa lipídica externa. El Peptidoglicano es un polisacárido formado por dos subunidades químicas, N-acetilglucosamina y acido Nacetilmurámico.

Tinción Primaria: Se utiliza Cristal Violeta, que tiñe todas las células moradas.

Mordiente: Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la afinidad del colorante primario con la célula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta-yodo sirve para intensificar el color del tenido.

Agente decolorante: Se utiliza alcohol etílico al 95%. El etanol tiene doble función: deshidratante de proteínas y solvente de lípidos. El alcohol disuelve los lípidos de la parte externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo la pared más porosa. De esta manera, el complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa de mureina más fina de las bacterias Gramnegativas, mientras que la pared más gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en su interior.

Tinción de Contraste: Safranina. Este tinte se utiliza para teñir de rojo las células previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas.

PROCEDIMIENTO:

1. Obtenga 5 portaobjetos limpios.

2. Prepare un frotis de cada uno de los microorganismos y, en el portaobjetos prepare un frotis de una mezcla de cepas de cultivo bacteriológicos.

a. Colocar una gota de solución salina en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua, que es suficiente.

b. Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Nota: Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.

c. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el portaobjetos a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el portaobjetos pues las células pueden deformarse o romperse.

d. Para preparar el frotis de la mezcla, coloque una gota de agua en el portaobjetos, y luego transfiriendo cada organismo separadamente a la gota de agua usando un asa de siembra esterilizada y enfriada. Mezcle ambos microorganismos haciendo movimientos circulares con el asa.

3. Permita que los frotis se sequen al aire y luego fíjelos con calor.

4. Tiña con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que actúe durante 1 minuto.

5. Lave suavemente con agua.

6. Inunde suavemente con el mordiente, yodo de Gram, y deje actuar durante 1 minuto.

7. Lave suavemente con agua.

8. Decolore con alcohol etílico al 95%. Nota: no sobre decolore, agregue el alcohol gota a gota hasta que este salga casi claro, solo ligeramente azul.

9. Lave suavemente con agua.

10. Agregue la safranina para la tinción de contraste.

11. Lave suavemente con agua.

12. Seque la preparación.

13. Examine al microscopio con el objetivo 100X de inmersión de aceite.

CURVA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

Fase de latencia

Cuando una población bacteriana es inoculada en medio fresco, el crecimiento usualmente no comienza de inmediato sino después de un tiempo llamado de latencia, que puede ser corto o largo dependiendo de las condiciones.

La fase de latencia representa un periodo de transición para los microorganismos cuando son transferidos a una nueva condición. En esta fase se producen las enzimas necesarias para que ellos puedan crecer en un nuevo medio ambiente.

En esta fase no hay incremento en el número de células, pero hay gran actividad metabólica, aumento en el tamaño individual de las células, en el contenido proteico, ADN y peso seco de las células.

Si un cultivo que está creciendo en fase exponencial es inoculado al mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de latencia y el crecimiento exponencial sigue a la misma velocidad. Si el inóculo se toma de un cultivo viejo (fase estacionaria) y se inocula en el mismo medio, generalmente se presenta la fase de latencia esto se debe a que las células generalmente agotan una serie de coenzimas esenciales u otros constituyentes celulares y se requiere cierto tiempo para su resíntesis.

También se observa latencia cuando el inóculo está formado por células que han sido dañadas pero no muertas, bien sea por tratamiento con calor, radiaciones o sustancias químicas, puesto que requieren reparar dicho daño.

En el caso de que una población se transfiera de un medio de cultivo rico a un medio pobre, se observa latencia puesto que es necesario que las células para poder seguir creciendo tengan una serie de enzimas para poder sintetizar algunos metabolitos esenciales que no están presentes en el medio.

Fase exponencial o fase logarítmica

Es el período de la curva de crecimiento en el cual el microorganismo crece exponencialmente, es decir que cada vez que pasa un tiempo de generación la población se duplica. Bajo condiciones apropiadas la velocidad de crecimiento es máxima. Las condiciones ambientales (temperatura, composición del medio de cultivo, etc.) afectan a la velocidad de crecimiento exponencial.

Fase estacionaria

En cultivos en recipientes cerrados una población no puede crecer indefinidamente en forma exponencial. Las limitaciones del crecimiento ocurren ya sea por agotamiento de algún nutriente esencial, por acumulación de productos tóxicos, porque se alcance un número de células elevado para el espacio disponible o por una combinación de las causas anteriores. Este periodo durante el cual cesa el crecimiento se conoce como fase estacionaria.

Fase de muerte

Si la incubación continúa después de que una población microbiana alcanza la fase estacionaria, las células pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero va a comenzar una disminución progresiva en el número de células viables y cuando esto ocurre se dice que la población ha entrado en fase de muerte.

RELACION HUESPED - PARASITO

La mayor parte de los microorganismos que habitan en el cuerpo humano lo hacen porque se benefician de los nutrientes y del hábitat protegido que este cuerpo humano les provee. Pero desde el punto de vista del cuerpo humano esta relación puede ser mutualismo, comensalismo o parasitismo, según sea beneficiosa, neutral o perjudicial, respectivamente. Independientemente del tipo de relación, todas comienzan con el contacto, algunos microorganismos se establecen permanentemente colonizándolo (microbiota normal), otros desaparecen rápidamente y otros invaden los tejidos. Este contacto con los microorganismos conduce a la infección, condición en la cual el microorganismo patógeno elude las defensas del huésped, penetra en los tejidos y se multiplica. Cuando los efectos acumulativos de la infección dañan los tejidos se produce una enfermedad infecciosa. La relación huésped - parásito comienza con el contacto, progresa a la infección y finaliza en enfermedad. Cuando un microorganismo potencialmente infeccioso está presente en el cuerpo sin invadirlo todavía se le denomina contaminante, por lo que estar contaminado no es lo mismo que estar infectado ya que no todas las contaminaciones acaban en infección y no todas las infecciones acaban en enfermedad. De hecho, la contaminación sin infección y la infección sin enfermedad es la regla.