Tr R - CNBdrodrig/memorias CNB/memoria 2001-2002... · palmente a los efectos de posición,...

Lluís Montoliu

■ Modelos animales por manipulación genética

Mariano Esteban

■ Poxvirus y Vacunas

Dolores Rodríguez

■ Caracterización genética y funcional de torovirus

Luis Enjuanes

■ Replicación, transcripción e interacción virus hospedador

en coronavirus. Diseño de vectores virales

Jose Ramón Naranjo

■ Análisis funcional del represor transcripcional DREAM

Juan Ortín

■ Transcripción y replicación del RNA del virus de la gripe

Jose F. Rodríguez

■ Biología molecular de birnavirus

Línea de investigación

Lluís Montoliu

Modelos animales por manipulación genética

Resumen de Investigación

La experimentación con animales transgénicos vahabitualmente asociada a una variabilidad temporal yespacial en la expresión del transgén, debido princi-palmente a los efectos de posición, relacionados conel lugar de inserción del transgén en el genoma delhuésped. Por ello, el estudio de los mecanismos queregulan la adecuada expresión de los transgenes esfundamental para el desarrollo de modelos animalespor manipulación genética y, simultáneamente,

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permite incrementar nuestro conocimiento sobre la organización y estructura de los dominios deexpresión eucarióticos.

En nuestro laboratorio utilizamos dos modelos expe-rimentales para analizar elementos reguladores dedominios de expresión genómicos: el gen de la tirosi-nasa, específico de melanocitos y del epitelio pig-mentado de la retina, y el gen de la proteína ácida delsuero de la leche (WAP), específico de glándulamamaria durante la fase de lactación (en colabora-ción, éste último, con los laboratorios de la Dra. EveDevinoy, INRA, Jouy-en-Josas, France y del Prof.Mathias Müller, Veterinary University of Vienna,Austria). Hemos usado varios mutantes naturales delgen de la tirosinasa y generado diversos animalestransgénicos con fragmentos genómicos de ambosdominios para acotar los elementos reguladores másimportantes que restringen la expresión específica detejido e impiden su activación ectópica. Entre los ele-mentos que han sido identificados y se están carac-terizando estructural y funcionalmente se encuentrauna región controladora de locus (LCR), en el gen dela tirosinasa, y las denominadas fronteras génicas (oboundaries/insulators), en ambos sistemas experi-mentales. La función principal de estas últimas esdelimitar la zona de influencia de los reguladorestranscripcionales propios del dominio e impedir lainterferencia de activadores y represores de dominoscircundantes. Su presencia puede ponerse de manifies-to mediante experimentos realizados en organismostransgénicos en los que se evalúa la capacidad de

Línea de investigaciónLínea de investigación

PublicacionesPublicaciones

Proyectos financiadosProyectos financiados

Tesis doctoralesTesis doctorales

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Cursos y reunionesCursos y reuniones

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estas secuencias de proteger a un transgén heterólo-go frente a los efectos de posición. En colaboracióncon el laboratorio de la Dra. Ana Busturia, del CBMSOde Madrid, hemos generado y analizado múltipleslíneas de moscas Drosophila transgénicas portadorasde diferentes construcciones, con o sin fronteras.

El modelo experimental de la tirosinasa también losusamos en el laboratorio para investigar la función deesta proteína, enzima clave en la biosíntesis de mela-nina, en el desarrollo de la retina de mamíferos. Elalbinismo oculocutáneo de tipo I está causado pormutaciones en el gen de la tirosinasa. Este defectogenético, que afecta a 1:10000 Europeos, está carac-terizado por la hipopigmentación y por la presenciade múltiples anomalías en la retina y el sistemavisual. Todas esta anomalías desaparecen en ratonestransgénicos obtenidos con construcciones funciona-les de la tirosinasa. En nuestro laboratorio, en cola-boración con el laboratorio del Dr. Glen Jeffery(University College London, London, UK) estudiamosde qué forma, directa o indirecta, la tirosinasa afectaal desarrollo normal de la retina de mamíferos, utili-zando diversos modelos de ratones transgénicos.

El estudio de los mecanismos, funcionales y estructu-rales, implicados en la obtención de un adecuadopatrón de expresión del transgén trasciende al mode-lo de la tirosinasa y es de importancia capital en pro-yectos de biotecnología animal y terapia génica, enlos cuales se debe garantizar una expresión óptima.Por ello nuestro laboratorio ha desarrollado diversas

construcciones transgénicas basadas en cromosomasartificiales (BACs y YACs) con el objetivo de optimizarla expresión heteróloga en animales transgénicos.

Corte histológico de un ojo de embrión de ratón a día11.5 de gestación. Se aprecia la aparición de melanina

en el epitelio pigmentado de la retina.





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En colaboración con el laboratorio del Profesor. F.Valdivieso del CBMSO de Madrid, estamos generandoun nuevo modelo animal de la enfermedad deAlzheimer mediante la preparación de un ratón trans-génico con un nuevo cromosoma artificial del gen APP.

Finalmente, en colaboración con una empresa far-macéutica nacional, hemos generado y estamos ana-lizando el fenotipo de un modelo animal realizadocon ratones knock-out que incorporan una mutación,generada por recombinación homóloga en células ESde ratón, en el gen que codifica para el receptorSigma de tipo I, implicado en fenómenos de analgesia,esquizofrenia y psicosis.

Microfotografía de una colonia de células ES de ratóncreciendo en cultivo sobre un césped de fibroblastosembrionarios. Estas células se usan para generar nuevos ratones mutantes.

Hibridación in situ sobre un embrión de ratón de día 12.5con una sonda específica del gen de la tirosinasa.

Solamente el epitelio pigmentado de la retina muestra unaseñal específica de la expresión del gen.





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Giménez, E. and Montoliu, L. (2001). A simple polymerase chain reaction assay for genotyping the reti-nal degeneration mutation (Pdeb(rd1)) in FVB/N-derived transgenic mice. Lab Anim. 35(2): 153-6.

Montoliu, L. (2001). Trabajando en las fronteras del ADN. Boletín de la SEBBM 132: 9-11.

Giménez, E., Giraldo, P., Jeffery, G. and Montoliu, L. (2001). Variegated expression and delayed reti-nal pigmentation during development in transgenic mice with a deletion in the locus control regionof the tyrosinase gene. Genesis. 30(1): 21-5.

Rikke, B.A., Simpson, V.J., Montoliu. L. and Johnson, T.E. (2001). No effect of albinism on sedative-hypnotic sensitivity to ethanol and anesthetics. Alcohol Clin Exp Res. 25(2): 171-6.

Montoliu, L. (2001). Animales transgénicos. En: Gafo J (Ed.), Aspectos científicos, jurídicos y éticos delos transgénicos. Colección Dilemas Éticos de la medicina actual-14, Publicaciones de la UniversidadPontificia Comillas, Madrid, 37: 49-67.

Giraldo, P. and Montoliu, L. (2001). Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals.Transgenic Res. 10(2): 83-103.

Langa, F., Lafon, I., Vandormael Pournin, S., Vidaud, M., Babinet, C. and Morello, D. (2001). Healthymice with an altered c-myc gene: role of the 3' untranslated region revisited. Oncogene 20(32): 4344-53.

Riu, E., Mas, A., Ferre, T., Pujol, A., Gros, L., Otaegui, P., Montoliu, L. and Bosch, F. (2002).Counteraction of type 1 diabetic alterations by engineering skeletal muscle to produce insulin:insights from transgenic mice. Diabetes 51(3): 704-11.

Montoliu, L., (2002). Gene transfer strategies in animal transgenesis. Cloning & Stem Cells 4(1): 39-46.

Giraldo, P. and Montoliu, L. (2002). Artificial chromosome transgenesis in pigmentary research.Pigment Cell Res 15(4): 258-64.

Publicaciones





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PersonalPersonal


Montoliu, L. (2002). Utilización responsable de animales modificados genéticamente en biología,biomedicina y biotecnología. En: Ferrer, J.J., Martínez, J.L. (Eds.), Bioética: un diálogo plural,Homenaje a Javier Gafo Fernández, Colección Dilemas Éticos de la medicina actual-14, Publicacionesde la Universidad Pontificia Comillas, Madrid, 285-292.

Montoliu, L. (2002). Clonación en mamíferos. En: De la Fuente J, Sáiz F (Eds.), XXV CursoInternacional de Reproducción Animal, Dpto. de Publicaciones de la E.U.I.T. Agrícolas, Madrid, 439-448.

Montoliu, L. (2002). Medicina genómica: la utilización de animales transgénicos en modelos deenfermedades genéticas humanas. En: Reol JM (Ed.) Genómica y farmacogenómica, Publicaciones dela Real Academia de Farmacia, Madrid, 55-74.

Montoliu, L. (2002). La investigación animal: historia y perspectiva futura. En: Lacadena JR (Ed.), Losderechos de los animales, Colección Dilemas Éticos de la medicina actual-15, Publicaciones de laUniversidad Pontificia Comillas/Editorial Desclée de Brouwer, S.A., Bilbao, 44: 15-29.

Montoliu, L. (2002). Simple databases to monitor the generation and organisation of transgenicmouse colonies. Transgenic Res.: in press.Giraldo, P., Rival Gervier, S., Houdebine, L.M. and Montoliu, L. (2002). The potential benefits of insu-lators on heterologous constructs in transgenic animals. Transgenic Res.: in press.

García Díaz, A., Oya, R., Sánchez, A. and Luque, F. (2002). Effect of prolonged vegetative reproduc-tion of olive trees cultivars (Olea europaea L.) in mitochondrial homoplasmy and heteroplasmy(2002). Genome: in press.

Millot, B., Montoliu, L., Fontaine, M.L., Mata, T. and Devinoy, E. (2002). Hormone induced modifica-tions of the chromatin structure surrounding 5’ upstream regulatory regions conserved between themouse and rabbit WAP genes. Biochem J.: in press.

Giraldo, P., Martínez, A., Regales, L., Lavado, A., García Díaz, A., Alonso, A., Busturia, A. andMontoliu, L. (2002). Functional dissection of the mouse tyrosinase locus control region identifies anovel boundary activity. Nucleic Acids Res.: in revision.

Giménez, E., Lavado, A., Giraldo, P. and Montoliu, L. (2002). Tyrosinase is not expressed in mousebrain. Eur. J. Neurosci.: in revision.





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PersonalPersonal


Montoliu, L. Obtención de un ratón mutante para el gen del receptor Sigma de tipo I. Laboratorios del Dr. Esteve, S.A., 1998-2001.

Montoliu, L. Estrategias para desarrollar mutaciones inducibles en el ratón utilizando el sistemacre/LoxP. FEDER (FD97-2059), 2000-2001.

Montoliu L. Elementos aisladores en procesos de transferencia génica. Plan Nacional I+D+I/CICYT (Bio2000-1653), 2001-2003.

Montoliu, L. (subproyecto) Red “Modelos animales de enfermedades relacionadas con el sistema nervioso central”Dierssen M (coordinadora). DURSI/Generalitat de Catalunya, 2001-2002.

Montoliu, L. Artificial chromosomes in mammary gland transgenesis.Acción Integrada España-Austria (HU2001-0025), con Prof. M. Müller (Institute of AnimalBreeding and Genetics, Veterinary University of Vienna, Austria), 2002-2003.

Montoliu L. Evaluación del fenotipo de los ratones mutantes para el gen del receptor Sigma de tipo I.Laboratorios del Dr. Esteve, S.A., 2001-2004.

Montoliu, L. Utilización de secuencias aisladoras genómicas en vectores retrovirales.Genetrix, S. L., 2002-2003.

Montoliu, L. Evaluación de la actividad FSH en ratones.Bionostra, S. L., 2002.

Proyectos financiados





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Estela Giménez. (2002).Estudios funcionales de la tirosinasa en el desarrollo de la retina de mamíferos.Universidad Autónoma de Madrid, Sobresaliente cum laude.

Patricia Giraldo. (2002). Análisis funcional y estructural de la región controladora de locus del gen de la tirosinasa de ratón.Universidad Autónoma de Madrid, Sobresaliente cum laude.

Montoliu, L., Giraldo, P. y Busturia, A.Molécula de ADN con actividad aisladora de efectos de posición cromosomales en procesos detransferencia génica en células animales.CSIC, 18 de mayo de 2001.Todos los países de Europa, OEP: 200101133.

Zamanillo, D., Montoliu, L., Langa, F., Lavado, A.J. y Tovar, V.E. Mamíferos no humanos mutantes deficientes en receptores Sigma y sus aplicaciones.Laboratorios del Dr. Esteve, S.A., 9 de diciembre de 2002.Todos los países del mundo, OEP: P 200202815.

Tesis doctorales

Patentes





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PersonalPersonal


III Curso de Doctorado sobre "Transferencia Génica en Mamíferos" (Postgraduate course) Dpto. Biología Molecular UAM (curso 2000-2001)Montoliu, L. (coordinador).

Simposio sobre “Transgenic animal systems”X Congreso Europeo de Biotecnología ECB10 (Madrid, Julio 2001)Montoliu, L. (co-organizador).

II Reunión del Grupo de “Transgénesis en Mamíferos”XXIV Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y de Biología Molecular, Valencia (2001)Montoliu, L. (coordinador).

IV Curso de Doctorado sobre "Transferencia Génica en Mamíferos" (Postgraduate course) Dpto. Biología Molecular UAM (curso 2001-2002)Naranjo, J.R., Montoliu, L. (coordinadores).

Simposio sobre "Modelos Animales y Nuevas Estrategias Terapéuticas"XXV Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y de Biología Molecular, León (2002)Lucas, J.J., Montoliu, L. (coordinadores).

Cursos y reuniones

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Jefe de Línea Lluís Montoliu

Personal Investigador Estela Giménez (hasta 28-02-2002)Patricia GiraldoAlfonso LavadoFrancina Langa (hasta 31-01-2001)Lucía Regales Ángel García Díaz (desde 01-04-02)Victoria Tovar (desde 01-06-2002)Patricia Cozar (desde 16-02-2001)Marta Cantero (desde 01-12-2001)

Visitantes Miguel Angel Chinchetru (desde 01-10-2001 hasta 31-09-2002)Sabbatical, Universidad de León

Julio Pozueta (desde 15-10-2001)CBMSO-UAM/CSIC, Madrid

Mª Teresa Mata Gónzalez (desde 01-11-2001 hasta 31-12-2002)CINVESTAV, Mexico DF

Glen Jeffery (Mayo 2001) Institute of Ophthalmology, UCL, London, UK

Marc Tibber (Junio 2002) Institute of Ophthalmology, UCL, London, UK

Elisa Jiménez Desde 01-10-2002UAM, Madrid

PersonalLínea de investigaciónLínea de investigación




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Mariano Esteban

Poxvirus y Vacunas


Los objetivos fundamentales de nuestro laboratoriovan dirigidos a comprender las bases moleculares enla patogenia de agentes infecciosos y su relación conel huesped, así como utilizar estos conocimientospara desarrollar vacunas que puedan ser efectivas enel control de enfermedades como Sida, Malaria yLeishmaniasis. Como sistema modelo de agenteinfeccioso y como vector de expresión, utilizamos elvirus vaccinia que pertenece a la familia de los pox-virus. Las líneas de investigación son:





Premios y distincionesPremios y distinciones

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1. Mecanismo de ensamblaje del virus vaccinia

El ensamblaje del virus vaccinia, y en general de lospoxvirus, es un proceso complejo en el que intervie-nen mas de 100 proteínas y cuyo estudio puede apor-tar conocimientos relevantes en biología. Nuestrostrabajos van dirigidos a conocer a nivel molecular ycelular cómo se forman las membranas y los coresvirales para dar lugar a partículas infectivas.Utilizando mutantes condicionales para determina-dos genes virales y su estudio ultraestructural pormicroscopía electrónica de células infectadas, llevadoa cabo en colaboración con C. Risco y J.L. Carrascosa(CNB), hemos demostrado el papel que distintas pro-teínas del core (A4L, A10L) y de la membrana (A14L,A17L, A27L) viral ejercen en los procesos morfogené-ticos. El objetivo a largo plazo es identificar todos losestadios de morfogénesis, el papel de las proteínas demembrana en ensamblaje, su modo de interacción ydefinir por técnicas de alta resolución la organizaciónestructural del virion y la estructura tridimensional dealgunas de estas proteínas.

Producción de colas de acti-na y viriones en células Helainfectadas con el virus vacci-nia (estirpe WR) y su ausen-cia durante la infección conel mutante atenuado MVA.

2. Mecanismos de acción antiviral yantitumoral de los interferones

Durante años, nuestro grupo viene trabajando sobreel mecanismo de acción de los interferones (IFN),debido al papel tan importante que este tipo demoléculas biológicas juegan como primera línea dedefensa del organismo frente a infecciones, comoinhibidores del crecimiento celular con efecto antitu-moral y como reguladores del sistema inmune.Hemos estudiado, en sistemas inducibles, el papélque enzimas inducidas por IFN pueden tener comoantivirales y antitumorales: proteínas 2-5A sinteta-sa/RNasa L, óxido nítrico sintetasa (iNOS) y proteinaquinasa p68 (PKR). Nuestros estudios futuros van






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dirigidos a conocer el receptor que activa la señaliza-ción de PKR, todas las proteínas con las que interac-ciona formando un complejo, su papel en la regula-ción de la síntesis de proteínas, así como los genescelulares que son activados, aplicando las tecnologíasde genómica, proteómica y modelos celulares y ani-males. También estamos estudiando el papel devarios genes virales (E3L de VV, MC159L de mollus-cum contagiosum, sigma 2 de reovirus aviar, LANA3de herpesvirus 8 y E2-NS5A de HCV), así como celu-lares (PACT, p67, NF90) como reguladores del proce-so antiviral y de apoptosis inducido por IFN. Estainvestigación puede beneficiar la aplicación clínicadel IFN en terapia antiviral y antitumoral.

Interacciónvirus-célula einducción de distintas proteínas. Señales en la activación de apoptosis por PKR.






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3. Interacción virus-célula

Por microarrays de DNA estamos identificando genescelulares inducidos en respuesta a la infección por VV(estirpe salvaje y mutantes) y por acción de estímulosapoptóticos. Nuestro objetivo es identificar genescelulares importantes en el proceso infectivo y apop-tótico y desarrollar modelos celulares y animales parasu estudio funcional.

4. Desarrollo de vacunas contra sida, malaria y leishmania

Nuestro laboratorio está desarrollando estrategias deinmunización contra VIH, malaria y leishmania basa-das en la utilización de VV recombinantes. Nuestrogrupo ha sido pionero en el establecimiento de pro-tocolos de inmunización combinada de vectores queinducen una fuerte respuesta inmune y protección

frente a patógenos en modelo murino de malaria(Plasmodium yoelii) y leishmania (L. major y L.infan-tum). Estos estudios han permitido definir paráme-tros básicos para conseguir la inducción primaria delinfocitos T CD8+ y las condiciones para generar unafuerte respuesta secundaria, lo que puede tener inte-rés para el desarrollo de estrategias profilácticas yterapéuticas para prevenir enfermedades infecciosasy tumorales. Con el fin de modular la respuesta inmu-ne frente a antígenos de interés, estamos evaluandoel efecto sobre dicha respuesta (sistémica y de muco-sas) de la coexpresión de diversas citoquinas (IL-12,IFN-g, GM-CSF, IL-18, IL-15). En colaboración conotros grupos, hemos iniciado con alguna de las vacu-nas generadas por nosotros, ensayos de protecciónen perro frente a leishmaniasis y frente al SIV enmacacos. También formamos parte del grupo euro-peo de desarrollo de una vacuna contra HIV, y pron-to se iniciarán los ensayos clínicos en fase I.

Estadios en la mor-fogénesis del virusvaccinia.






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Zavala, F., Rodrígues, M., Rodríguez, D., Rodríguez, J.R., Nussenzweig, R.S. and Esteban, M. (2001).A striking property of vaccinia viruses: efficient inducers of in vivo expansion of primed CD8+ Tcells. Virology 280: 155-159.

Gonzalo, R.M., Rodríguez, J.R., Rodríguez, D., González Aseguinolaza, G., Larraga, V. and Esteban,M. (2001). Protective immune response against cutaneous leishmaniasis by prime/booster immu-nisation regimes with vaccinia virus recombinant expressing Leishmania infantum p36/LACK incombination with purified p36. Microbes and Infection 3: 701-711.

Gil, J., Rullas, J., Alcami, J. and Esteban, M. (2001). The catalytic activity of dsRNA-dependent pro-tein kinase, PKR, is required for NF-kB activation. Oncogene 20: 385-394.

Heljasvaara, R., Rodríguez, D., Risco, C., Carrascosa, J.L., Esteban, M. and Rodríguez, J.R. (2001).The major core protein P4a (A10L gene) of vaccinia virus is essential for correct assembly of viralDNA into the nucleoprotein complex to form immature viral particles. J. Virol 75: 5778-5795.

Gil, J. y Esteban, M. (2001). Mecanismo de acción de los interferones. Investigación y Ciencia 299:44-51.

Gherardi, M.M., Ramírez, J.C. and Esteban, M. (2001). Towards a new generation of vaccines: thecytokine IL-12 as an adjuvant to enhance cellular immune responses to pathogens during prime-booster vaccination regimens. Histology and Histopathology 16: 655-667.

Gil, J. and Esteban, M. (2001). Antiviral role of the dsRNA-dependent protein kinase, PKR. Recent Res.Devel. Virol. 3: 13-27.

Gómez, C.E. and Esteban, M. (2001). Recombinant proteins produced by vaccinia virus vectors canbe incorporated within the virion (IMV form) into different compartments. Arch.Virol. 146: 875-892.

Publicaciones






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Wallengreen, K., Risco, C., Krinse Locker, J., Esteban, M. and Rodríguez, D. (2001). The A17L geneproduct of vaccinia virus is exposed on the surface of IMV. Virology 290: 143-152.

Esteban, M. (2001). Retos de la biotecnología en la I+D+I en el siglo XXI. En Notas de Opinión, RealAcademia de Ciencias Morales y Políticas, p155-161.

Esteban, M. (2001). The human genome and biomedicine: future goals. Editorial. Rev. Oncología3: 119-120.

Gil, J., Rullas, J., Alcami, J. and Esteban, M. (2001). MC159L protein from the poxvirus Molluscumcontagiosum inhibits NF-kB activation and apoptosis induced by PKR. J. Gen. Virol. 82: 3027-3034.

Risco, C., Rodríguez, J.R., López Iglesias, C., Carrascosa, J.L., Esteban, M. and Rodríguez, D. (2002).ERGIC membranes and vimentin filaments participate in vaccinia virus assembly. J. Virol. 76: 1839-1856.

Gómez, C.E., Rodríguez, D., Rodríguez, J.R., Abaitua, F., Duarte, C. and Esteban, M. (2002).Enhanced CD8+ T cell immune response against a V3 loop multi-epitope polypeptide (TAB13) ofHIV-1 Env after priming with purified fusion protein and booster with modified virus Ankara (MVA-TAB) recombinant: a comparison of humoral and cellular immune responses with the vaccinia virusWestern Reserve (WR) vector. Vaccine 20: 961-971.

Gonzalo, R.M., del Real, G., Rodríguez, J.R., Rodríguez, D., Heljasvaara, R., Lucas, P. and Esteban, M.(2002). A heterologous prime-boost regime using DNA and recombinant VV expressing Leishmaniainfantum-P36 antigen protects Balb/c mice from cutaneous leishmaniasis. Vaccine 20: 1226-1231.

Ramírez, J.C., Tapia, E. and Esteban, M. (2002). Administration to mice of a monoclonal antibodythat neutralizes the intracellular mature virus form of vaccinia virus limits virus replication efficient-ly under prophylactic and therapeutic conditions. J. Gen. Virol. 83: 1059-1067.

Agromayor, M., Ortiz, P., López Estebaranz, J.L., González Nicolas, J., Esteban, M. and MartínGallardo, A. (2002). Molecular epidemiology of molluscum contagiosum virus and analysis of thehost-serum antibody response in Spanish HIV-negative patients. J. Med. Virol. 66: 151-158.






PersonalPersonal


Humlova, Z., Vokurka, M., Esteban, M. and Melkova, Z. (2002). Vaccinia virus induces apoptosis ofinfected macrophages. J. Gen. Virol. 83: 2821-2832.

Tapia, E., Pérez Jiménez, E., López Fuertes, L., Gonzalo, R. and Esteban, M. (2003). Protective immu-nity against cutaneous Leishmaniasis by priming with DNA vectors expressing p36/LACK of L. infan-tum and the cytokines IL-12 and IL-18 followed by a booster with a vaccinia virus recombinantexpressing p36/LACK. Microbes and Infection 5: 73-84.

López Fuertes, L., Pérez Jiménez, E., Vila Coro, A.J., Sack, F., Moreno, S., Konig, S.A., Junghams, C.,Wittig, B., Timon, M, and Esteban, M. (2002). DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vec-tors confers protection against Leishmania major infection in mice. Vaccine 21: 247-257.

Gherardi, M.M., Ramírez, J.C. and Esteban, M. (2002). Interleukin-12 (IL-12) and IL-18 synergize toclear vaccinia virus infection: involvement of innate and adaptive components of the immune sys-tem. J. Gen. Virol. 84: 1961-1972.

García, M.A., Guerra, S., Gil, J., Jiménez, J. and Esteban, M. (2002). Antiapoptotic properties of thedsRNA-binding protein of vaccinia virus, E3L. Oncogene 21: 8379-8387.

Gil, J., García, M.A. and Esteban, M. (2002). Caspase 9 activation by the dsRNA-dependent proteinkinase, PKR: molecular mechanism and relevance. FEBS Letters 529: 249-255.

Sánchez, A.B., Rodríguez, D., Garzón, A., Amorena, B., Esteban, M. and Rodríguez, J.R. (2002). VisnaMaedi virus Env protein expressed by a vacccinia virus recombinant induces cell-to-cell fusion in cellsof different origins in the apparent absence of Env proteolytic processing. Arch. Virol 147: 2377-2392.

Ramirez, J.C., Finke, D., Esteban, M., Kraehenbuhl, J.P, and Acha-Orbea, H (2003). Tissue distribu-tion of Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) after mucosal or systemic administration. Arch. Virol.148: 827-839.






PersonalPersonal


Gherardi, M.M., Nájera, J.L., Pérez-Jiménez, E., Guerra, S., García-Sastre, A, and Esteban, M. (2003).Prime/boost immunization schedules based on influenza and vaccinia virus (VV) vectors (MVA andWR) potentiate cellular immune responses against HIV-env protein systemically and in the genito-rectal draining lymph nodes. J. Virol 77: 7048-7057.

Ramiro, M.J., Zárate, J.J., Hanke, T., Rodriguez, D., Rodríguez, J.R., Esteban, M., Lucientes, J., Castillo,J.A, and Larraga, V. (2003). Protection against Leishmania infantum visceral leihsmaniasis in dogs isachieved by immunization with heterologous prime-booster regime using LACK-expressing DNA andrecombinant vaccinia virus. Vaccine 21: 2471-2484.

Guerra, S., López Fernández, L., Pascual Montano, A., Muñoz, M., Harsman, K, and Esteban, M.(2003). Cellular gene expression survey upon vaccinia virus infection of human HeLa cells. J. Virol77: 6493-6506.

Esteban, M., García, M.A., Domingo Gil, E., Arroyo, J., Nombela, C. and Rivas, C. (2003). The laten-cy protein LANA 2 from Kaposi´s sarcoma associated herpesvirus (KSHV) inhibits apoptosis inducedby PKR but not RNase L activation. J. Gen.Virol 84: 1463-1470.

González López, C., Martínez Costas, J., Esteban, M. and Benavente, J. (2003). Avian reovirus sA pro-tein is an inhibitor of the double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR. J. Gen. Virol. 84:1629-1639.

Gallego Gómez, J.C., Risco, C., Rodríguez, D., Cabezas, P., Guerra, S., Carrascosa, J.L. and Esteban, M.(2003). Differences in virus-induced cell morphology and in virus maturation between the MVA andother strains (WR, Ankara, NYCBH) of vaccinia virus in infected human cells. J. Virol 77: 10606-10622.

González Aseguinolaza, G., Nakaya, Y., Molano, A., Dy, E., Esteban, M., Rodríguez, D., Rodríguez,J.R., Palese, P., García Sastre, A. and Nussenzweig, R.S. (2003). Induction of protective immunityagainst malaria by prime/boost immunization with recombinant cold- adapted influenza and mod-ified vaccinia virus Ankara viruses expressing a CD8+ T cell epitope derived from the cincum-sporozoite protein of Plasmodium yoelii. J. Virol 77: 11859-11866.






PersonalPersonal


Esteban, M.Development of immunogenic and safe vaccinia virus vaccines.European Union, BIOTECH Program, PL970456, 1998-2001, ECUS, 165,000.

Esteban, M.Malaria vaccine: attenuated influenza and vaccinia vectors.National Institutes of Health (NIH), USA, 2RO1 AI36526-05, 1998-2002, US $ 150,000.

Esteban, M.Effector and memory anti-malaria CD8+ cell responses.National Institutes of Health (NIH), 1 RO1 AI44375-01, 1999-2003, US $165.000.

Esteban, M.Desarrollo de una vacuna contra leishmaniasis.Comunidad Autónoma de Madrid (CAM), 08.2/0057/2000-2001, 3 M Ptas.

Esteban, M.Mecanismo de inducción de apoptosis por los interferones: papel de las enzimas proteina quinasa(PKR) y sistema 2-5A sintetasa/RnasaL.Ministerio de Educación y Cultura, PM-98-0112, 1999-2002, 19 M Ptas.

Esteban, M.Modulación de la respuesta inmune frente a antígenos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnologia (CICYT), SAF98-0056, 1998-2001, 26 M Ptas.







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Esteban, M.Visceral Leishmaniasis vaccine: murine model studies.National Institute of Health (NIH), USA, RO1 AI45044. 2000-2003.US $ 50.000.

Esteban, M.Project Leader of the EuroVac Cluster, European Vaccine Effort Against HIV/AIDS, FifthFramework Programme, QLRT-PL1999-01321, Euros 329.065, 2000-2003.

Esteban, M.Concerted Action, Fifth Framework Programme, European Vaccine against Aids (EVA) CFAR,QLRT-PL1999-00609, 2000-2003.

Esteban, M.Industrial Contract with MOLOGEN, Germany, 2000-2001.

Esteban, M.Industrial Contract with ITALFARMACO, Spain, 2001.

Esteban, M.Industrial Contract with GRIFOLS, Spain, 2002.

Esteban, M.Desarrollo de nuevas herramientas moleculares para el estudio del virus de la hepatitis C y su apli-cación a morfogénesis, estructura, resistencia del virus a interferon y caracterización de la respues-ta inmune al virus.BIO2000-0340-P4, 2001-2003, 171.649 Euros.

Esteban, M.Diseño y utilización del virus vaccinia como vacuna contra distintas enfermedades: análisis de lainteracción virus-célula y modulación de la respuesta inmune.BIO2001-2269, 2001-2003, 170.000 Euros.






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Esteban, M.Analysis of the molecular mechanism of hepatitis C virus (HCV) resistance to antiviral therapy.EU QLK2-CT-2002-00954, 2002-2005, 124.313 Euros.

Esteban, M. (Coordinator).Increasing the potency of vaccinia MVA vaccines.EU QLK2-CT-2002-01867, 2002-2005, 220.000 Euros.

Abaitúa, Fernando. (2001).Potenciación de la respuesta inmune frente al antígeno de la envuelta del virus de la inmunodefi-ciencia humana (VIH-1) por recombinantes atenuados del virus vaccinia que expressan citoquinas Itipo Th1 (FN-gamma e IL-12).Universidad Autónoma de Madrid, sobresaliente cum laude.

Premio IBERDROLA de Ciencia y Tecnología, Profesores Visitantes, 2000-2003.

Premios y distinciones

Tesis doctorales






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Jefe de Línea Mariano Esteban

Personal Investigador Juan Carlos RamírezMagdalena GherardiIván VentosoSusana GuerraFernando AbaituaMª Ángeles GarcíaElena Domingo

María Victoria Jiménez

Visitantes Rostom Bablanian Professor State University of New York, USA

Robert M. FriedmanProfessorUniformed ServicesUniversityy of Health, Bethesda, USA

Bertram JacobsProfessor Arizona University, USA

Alejandro AdánCarolina fellow, Cuba

Eva Pérez Jiménez Soledad BlancoJuan Carlos GallegoCarmen GómezJosé Luis Nájera

Personal

Silvina V. MasciotraCarolina fellow, Argentina

Andrea VandermeerenLovaine University, Belgium

Raquel CondeNavarra University, Spain

David CiraudMontpellier University, France

Sonja WelshEMBL, Germany





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Dolores Rodríguez

Caracterización genética y funcionalde torovirus


Recientemente hemos iniciado un nuevo proyectocentrado en el estudio de la biología molecular de torovirus, que será la principal línea de investigaciónen el laboratorio. Los torovirus han sido descritoscomo agentes causantes de infecciones entéricas ydiarrea en animales y humanos. Son virus conenvuelta, y con un genoma RNA de polaridad positi-va, y han sido incluidos como un nuevo género den-tro de la familia Coronaviridae.

En concreto, nos proponemos amplificar y secuen-ciar distintos fragmentos de genoma viral. La identifi-cación de las secuencias que codifican las proteínasestructurales del virus nos permitirá expresarlas ensistemas heterólogos con el fin de realizar estudios defuncionalidad de las mismas, así como, preparar anti-cuerpos que sirvan como herramientas para el diag-nóstico. Además, el conocimiento de la secuencia delgenoma del virus permitirá elaborar un test de diag-nóstico basado en la tecnología de RT-PCR con el quese podrán abordar estudios epidemiológicos que ayu-darán a esclarecer la importancia de este virus comoagente causal de episodios de gastroenteritis en lapoblación humana. Otro objetivo que nos plantea-mos es encontrar las condiciones que permitan cre-cer el virus in vitro, para abordar, entre otros, estu-dios sobre el proceso de morfogénesis, así comosobre la estructura de las partículas de torovirus.

Las factorías vira-les (sitios deensamblaje) delvirus vacciniaaparecen rodea-das por la proteí-na celular vimen-tina, componen-te de los filamen-tos intemedios.





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Asimismo, durante parte del periodo contemplado enesta memoria hemos participado en el equipo inves-tigador del Dr. M. Esteban, colaborando en dos de laslíneas de investigación que se llevan a cabo en sulaboratorio, y que se resumen a continuación.

1. Vacunas basadas en recombinantes delvirus vaccinia

El desarrollo de la tecnología que permite modificarel genoma del virus vaccinia abrió la posibilidad deutilizar este virus como vector de expresión. En lasúltimas décadas se han generado recombinantes delvirus vaccinia que expresan proteínas de muy diver-sos orígenes, y que se han utilizado para distintosfines, siendo probablemente el que ha despertado unmayor interés su posible uso como vacunas.

Como colaboradores en la línea de investigacióndedicada a vacunas hemos llevado a cabo estudios deinmunización frente a distintos patógenos:Leishmania, VIH y malaria. Actualmente, uno de losaspectos en los que estamos trabajando es la genera-ción de vectores multiepitópicos, en los que seencuentren únicamente representados los epítoposmás relevantes para inducir una respuesta protectorafrente al agente patógeno. En el caso de malaria esta-mos trabajando en la expresión de epítopos de la pro-teína CS de Plasmodium yoelii, que es el agente cau-sante de la enfermedad en roedores. Nuestra estrate-gia se basa en la generación de vectores en los quelas secuencias de los distintos epítopos están separa-das por un elemento IRES, de tal manera que seexpresen como péptidos independientes.

Micrografía electrónicade partículas de torovi-rus, caracterizadas porla presencia de espículasen su superficie y unamorfología variable.





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2. Morfogénesis del virus vaccinia

La posibilidad de generar mutantes condicionales delvirus vaccinia en los que la expresión de una deter-mina proteína pueda ser reprimida o inducida, estácontribuyendo de forma definitiva a determinar lafuncionalidad de las proteínas virales en los distintosprocesos del ciclo replicativo. En concreto, utilizandoesta estrategia determinamos que las proteínas codi-ficadas por los genes A17L y A14L son esencialespara la formación de la envuelta de la partícula viraly que la proteína codificada por el gen A10L es nece-saria para el correcto ensamblaje del DNA viraldurante la formación del complejo nucleoproteico. Elanálisis ultraestructural por microscopía electrónicade estos mutantes ha sido llevado a cabo por C. Riscoy J.L. Carrascosa. Actualmente, estamos estudiandolos dominios funcionales de la proteína codificadapor el gen A14L, para lo cual hemos introducidomutaciones puntuales a lo largo de la secuencia. Estasdiferentes versiones de la proteína se han utilizado enestudios de complementación en trans para determi-nar cuales de ellas son capaces de recuperar la capa-cidad de ensamblaje del virus mutante. Así hemosdeterminado que el sitio de miristilación es esencialpara la funcionalidad de la proteína.

Inmunolocalización por microscopía confocal de la proteína p21 dela envuelta del virus vaccinia y la proteína celular p53, que es carac-terística del compartimento intermedio ERGIC, situado entre el retí-culo endoplásmico y el aparato de Golgi.





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Heljasvaara, R., Rodríguez, D., Risco, C., Carrascosa, J.L., Esteban, M. and Rodríguez, J.R. (2001). Themajor core protein P4a (A10L gene) of Vaccinia Virus is essential for the correct assembly of viralDNA into the nucleoprotein complex to form the immature viral particles. J. Virol 75: 5778-5795.

Esteban, M., Rodríguez, D., Rodríguez, J.R., Nussenzweig, R. and Zavala, F. (2001). A striking pro-perty of recombinant attenuated vaccinia viruses: efficient inducers of expansion of specifically pri-med CD8+ T cells. Virology 280: 155-159.

Gonzalo, R.M., Rodríguez, J.R., Rodríguez, D., González Aseguinolaza, G., Larraga, V. and Esteban,M. (2001). Protective immune response against cutaneous leismaniasis by prime/booster immuni-zation regimens with vaccinia virus recombinantes expressing Leismania infantum p36/LACK andIL-12 in combination with purified p36. Microbes and Infection 3: 701-711.

Gómez, C.E., Rodríguez, D., Rodríguez, J.R., Abaitua, F., Duarte, C. and Esteban, M. (2001).Enhanced CD8+ T cell immune response against a V3 loop multi-epitope polypeptide (TAB13) ofHIV-1 Env after priming with purified fusion protein and booster with Modified Vaccinia VirusAnkara (MVA-TAB) recombinant: a comparison of humoral and cellular immune responses with theVaccinia Virus Western Reserve (WR) vector. Vaccine 20: 961-971.

Gonzalo, R.M., del Real, G., Rodríguez, J.R., Rodríguez, D., Heljasvaara, R., Lucas, P., Larraga, V. andEsteban, M. (2001). A heterologous prime/booster regimen using DNA and recombinant vacciniavirus expressing the Leishmania infantum P36/LACK antigen protects BALB/c mice from cutaneousleishmaniasis. Vaccine 20: 1226-1231

Wallengren, K., Risco, C., Krinjse Locker, J., Esteban, M., and Rodríguez, D. (2001). The A17L geneproduct of Vaccinia Virus is exposed on the surface of IMV. Virology 290: 143-152.

Publicaciones





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Risco, C., Rodríguez, J.R., López Iglesias, C., Carrascosa, J.L., Esteban, M. and Rodríguez, D. (2002).Cellular elements involved in vaccinia virus assembly: ERGIC membranes and vimentin filamentsparticipate in VV morphogenesis. J. Virol 76: 1839-1855.

Stein, J., López, M., Abaitua, F., Rodríguez, D., Martínez, C., Medema, J.P. and Hahne, M. (2002).Analysis of the immuneregulatory role of APRIL. J. Clin. Invest. 109: 1587-1598.

Sánchez, A.B., Rodríguez, D., Garzón, A., Amorena, B., Esteban, M. and Rodríguez, J.R. (2002).Visna/Maedi Virus env protein expressed by a Vaccinia Virus recombinant induces cell-to-cell fusionin cells of different origins in the apparent absence of Env cleavage: role of glycosylation and of pro-teoglycans. Arch. Virol. 147: 2377-2392.





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Rodríguez, D.Vectores de expresión multiepitópicos como vacuna contra malaria. CICYT, BIO 99-0803, 2000- 2003.

Rodríguez, D.Morfogénesis del virus vaccinia: estudio inmunocitoquímico y bioquímico. CAM, 082.2/0042.1/2000, 2001-2002.

Rodríguez, D.Torovirus humano: Caracterización genética y funcional. Desarrollo de herramientas para sudiagnóstico en clínica.CICYT, BIO 2002-03739, 2002-2005.

Kristina Wallengren. (2001). Co-dirección: Henrik Garoff y Dolores Rodríguez.Envelopment of retrovirus and vaccinia virus.Department of Biosciences at Novum Karolinska Institut, Estocolmo, Suecia.

Tesis doctorales






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Jefe de Línea Dolores Rodríguez

Personal Investigador Soledad BlancoAna Garzón

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Luis Enjuanes

Replicación, transcripción e interacciónvirus hospedador en coronavirus.Diseño de vectores virales


Los coronavirus tienen un genoma RNA de unas 30 kb,de cadena sencilla y polaridad positiva, que causaninfecciones en mucosas respiratorias y entéricas conalto impacto en salud animal y humana. El grupo estáinteresado en el estudio de las bases moleculares de lareplicación y transcripción, ensamblamiento, e inter-acciones virus hospedador en coronavirus. La informa-ción obtenida es aplicada a la ingeniería de vectoresvirales. El proyecto se ha dividido en cuatro secciones:





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1. Replicación y transcripción en coronavirus

Para estudiar los mecanismos de transcripción yreplicación del genoma viral por genética reversa seha construido un cDNA infectivo que codifica ungenoma viral de longitud completa. El cDNA se haclonado en un cromosoma artificial de bacterias(BAC). La estabilidad del cDNA se ha incrementadomediante la inserción de intrones sintéticos que seeliminan en un proceso asociado a la translocacióndel RNA viral del núcleo al citoplasma. A partir delcDNA infectivo se han construido replicones no cito-páticos para células humanas. Se está analizando laestructura secundaria de los extremos 5’ y 3’ delgenoma y la interacción entre estos extremos duran-te la replicación del genoma, así como la unión de lapolimerasa y otras proteínas virales y celulares aestos extremos durante la iniciación de la replicacióndel RNA genómico.

El análisis del mecanismo de transcripción en coro-navirus se inició con el estudio de las secuencias queregulan la transcripción (TRSs) utilizando minigeno-mas. En este sistema se identificaron TRS eficientes.La actividad de estas TRSs se ha confirmado utilizan-do genomas de coronavirus de longitud completa. Enestas TRSs se ha identificado un dominio central con-servado en todos los genes del virus y se demostróque los niveles de transcripción a partir de estasecuencia conservada estaban regulados por lassecuencias flanqueantes 5’ y 3’, que podían silenciarcompletamente la transcripción. La construcción de


un alto número de mutantes en la secuencia TRS hamostrado que la transcripción en coronavirus requie-re un apareamiento entre la cadena de polaridadnegativa y secuencias presentes en el extremo 3’ dellíder del genoma viral. Asimismo, se ha demostradoque los niveles de mRNA producidos se relacionancon la liberación de energía libre en este aparea-miento de secuencias y con la proximidad del extre-mo 5’ del mRNA al extremo 3’ del genoma. La infor-mación obtenida ha permitido proponer un mecanis-mo de transcripción en coronavirus basado en la sín-tesis discontinua durante la producción de la cadenanegativa. En la actualidad se está comprobando lacorrección del modelo propuesto, y se está analizan-do la influencia en transcripción de la estructura pri-maria y secundaria de la TRS y la interacción de estaestructura con proteínas virales y celulares medianteproteómica funcional.

2. Encapsidación del genoma viral

Previamente hemos demostrado la existencia de unacápsida interna que envuelve a la nucleocápsida heli-coidal en el coronavirus de la gastroenteritis porcinatransmisible (TGEV), lo que ha supuesto un cambionotable en la concepción de la estructura de los coro-navirus. Asimismo, se han identificado dos topologí-as de la proteína de membrana (M) y se ha localizadola secuencia del RNA (ψ) que media la encapsidacióndel genoma. En la actualidad se está reconstruyendoin vitro la nucleocápsida del virus, se está analizandosu estructura y las interacciones proteína–proteína y

proteína-RNA que se requieren para la encapsidacióndel genoma viral, incluyendo el análisis de proteínasvirales y celulares implicadas en la encapsidación.Estos estudios, basados en proteómica funcional, per-mitirán la relocalización de las señales de encapsida-ción del RNA para diseñar vectores virales bioseguros.

3. Interacción virus-hospedador. Basesmoleculares del tropismo y virulencia encoronavirus relacionados con el TGEV

Anteriormente se mostró que el tropismo del TGEVdepende del reconocimiento de la glicoproteína S delvirus y que hay dos requerimientos para que la infec-ción del tracto entérico tenga lugar: la interacción delvirus con el receptor celular (aminopeptidasa N) y unsegundo factor, posiblemente la interacción con un co-receptor, que se une a un dominio de la proteína Ssituado en torno al aminoácido 219. El cambio de unúnico aminoácido en la proteína S es responsable de lapérdida del tropismo entérico del TGEV, tal como se hademostrado caracterizando genética y fenotípicamen-te una colección de recombinantes de este virus. Elloha permitido la modificación del tropismo del TGEVpara que infecte a otras especies, incluyendo la huma-na, con el fin de obtener un vector viral para el diseñode vacunas y terapia génica aplicable a humanos.

Los estudios de modulación de la virulencia del virusse han favorecido notablemente al separar sus genes,que solapan parcialmente, e introducir sitios únicosde restricción entre los mismos. Ello ha permitido





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eliminar cada uno de los genes para determinar sison esenciales y modificar las TRSs que preceden acada gen. Se ha obtenido una amplia colección demutantes virales con distinto grado de virulencia y seestá determinando el efecto de algunos genes viralessobre la respuesta immune.

4. Desarrollo de vectores virales para laobtención de vacunas y terapia génica

Se han obtenido tres tipos de vectores de expresiónbasados en el genoma del TGEV. El primero es depen-diente de un virus complementador y consta de doscomponentes: un minigenoma en el que se clona elgen heterólogo y el virus complementador. El segun-do está basado en un genoma único derivado delcDNA viral infectivo. El tercero incluye virus compe-tentes en replicación pero deficientes en propagacióny se basa en genomas defectivos en los que se handelecionado genes esenciales que son complementa-dos en trans en células empaquetadoras.

Los tres tipos de vectores se están utilizando en elestudio de la expresión génica en coronavirus y en laobtención de vectores virales específicos de tejido, deinterés en el diseño de vacunas y en terapia génica.Estos vectores se están utilizando para la expresión deestructuras análogas a partículas virales (VLPs) o anti-cuerpos recombinantes que proporcionen protecciónen superficies mucosas frente a infecciones por virus.La eficacia de estos vectores virales en la inducción de

respuestas inmunes lactogénicas ha sido demostrada.Asimismo, se están desarrollando vectores viralespara uso en humanos y un modelo experimental ani-mal (ratones transgénicos) para evaluar estos vecto-res. En la actualidad se está determinando el efectode la infección de células humanas analizando lasalteraciones en la expresión génica del hospedadorpor genómica funcional.

Microfotografía electrónica del virusTGEV purificado en gradiente de densi-dad, teñido negativamente con acetatode uranilo. Los oligómeros de la proteí-na de las espículas formando la “coro-

na” del virus se diferencian claramente.





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Escors, D., Ortego, J., Laude, H. and Enjuanes, L. (2001). The membrane M protein carboxy termi-nus binds to transmissible gastroenteritis coronavirus core and contributes to core stability. J. Virol.75: 1312-1324.

Enjuanes, L., Sola, I., Almazán, F., Izeta, A., González, J.M. and Alonso, S. (2001). Coronavirusderived expression systems. Adv. Exp. Med. Biol. 494: 309-322.

Sola, I., Alonso, S., Sánchez, C.M., Sánchez Morgado, J.M. and Enjuanes, L. (2001). Expression oftranscriptional units using transmissible gastroenteritis coronavirus derived minigenomes and full-length cDNA clones. Adv. Exp. Med. Biol. 494: 447-452.

Almazán, F., González, J.M., Penzes, Z., Izeta, A., Calvo, E. and Enjuanes, L. (2001). A strategy for thegeneration of an infectious transmissible gastroenteritis coronavirus from cloned cDNA. Adv. Exp.Med. Biol. 494: 261-266.

Escors, D., Ortego, J. and Enjuanes, L. (2001). The membrane M protein of the transmissible gas-troenteritis coronavirus binds to the internal core through the carboxy-terminus. Adv. Exp. Med. Biol.494: 589-594.

González, J.M., Almazán, F., Penzes, Z., Calvo, E. and Enjuanes, L. (2001). Cloning of a transmissiblegastroenteritis coronavirus full-length cDNA. Adv. Exp. Med. Biol. 494: 533-536.

Penzes, Z., González, J.M., Calvo, E., Izeta, A., Smerdou, C., Méndez, A., Sánchez, C.M., Sola, I.,Almazán, F. and Enjuanes, L. (2001). Complete genome sequence of transmissible gastroenteritiscoronavirus PUR46-MAD clone and evolution of the Purdue virus cluster. Virus Genes. 23: 105-118.

Enjuanes, L., Sola, I., Almazán, F., Izeta, A., González, J.M., Alonso, S., Sánchez Morgado, J.M.,Ortego, J., Escors, D., Calvo, E., Riquelme, C. and Sánchez, C.M. (2001). Coronavirus derived expres-sion systems. J. Biotechnol. 88: 183-204.

PublicacionesLínea de investigaciónLínea de investigación




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Escors, D., Ortego, J., Laude H. and Enjuanes, L. (2001). Organization of two transmissible gastroen-teritis coronavirus membrane protein topologies within the virion and core. J. Virol. 75: 12228-12240.

Alonso, S., Sola, I., Teifke, J.P., Reimann, I., Izeta, A., Balach, M., Plana Durán, J., Moormann, R.J.M.and Enjuanes, L. (2002). In vitro and in vivo expression of foreign genes by transmissible gastroen-teritis coronavirus-derived minigenomes. J. Gen. Virol. 83: 567-579.

Alonso, S., Izeta, A., Sola, I. and Enjuanes, L. (2002). Transcription regulatory sequences and mRNAexpression levels in the coronavirus transmissible gastroenteritis virus. J. Virol. 76: 1293-1308.

González, J.M., Penzes, Z., Almazán, F., Calvo, E. and Enjuanes, L. (2002). Stabilization of a full-length infections cDNA clone of transmissible gastroenteritis coronavirus by insertion of a intron. J.Virol. 76: 4655-4661.

Scwegmann Webels, C., Zimmer, G., Laude, H., Enjuanes, L. and Herrler, G. (2002). Binding of trans-missible gastroenteritis coronavirus to cell surface sialoglycoproteins. J. Virol. 76: 6037-6043.

Riquelme, C., Escors, D., Ortego, J., Sánchez, C.M., Uzelac Keserovic, B., Apostolov, K. and Enjuanes, L.(2002). Nature of the virus associated with endemic Balkan nephropaty. Emerg. Infect. Dis. 8: 869-870.

Ortego, J., Escors, D., H. Laude and Enjuanes, L. (2002). Generation of a replication-competent,propagation-deficient virus vector based on transmissible gastroenteritis coronavirus genome. J.Virol. 76: 11518-11529.

Ortego, J., Sola I., Almazán F., Ceriani J.E., Riquelme C., Balasch, M., Plana, J. and Enjuanes, L.(2003). Transmissible gastroenteritis coronavirus gene 7 is not essential, but affects in vivo replica-tion and virulence. Virology. 308: 13-22.

Sola, I., Alonso, S., Zuñiga, S., Balach, M., Plana Durán, J. and Enjuanes, L. (2003). Engineering trans-missible gastroenteritis virus genome as an expression vector inducing latogenic immunity. J. Virol.77: 4357-4369.

Holmes, K. and Enjuanes, L. (2003). The SARS Coronavirus: A Postgenomic Era. Science 300: 1377-1378.





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Enjuanes, L.Expresión genética en coronavirus. Desarrollo de vectores para la expresión especifica de tejido deinterés para el diseño de vacunas y en terapia génica.CICYT, Proyecto Ref. BIO98-0756, 1998-200, 37.300.000 Ptas.

Enjuanes, L.Diseño de Vacunas para la protección del ganado porcino frente a infecciones entéricas y respiratorias.Acciones Integradas Hipano-Alemanas, 1999-2000.

Enjuanes, L.Generic coronavirus vaccine vectors for protection of farm animals against mucosal infections.UE, Proyecto Ref. CE QLRT-1999-00002, CSIC LIFE/991/0218, 1-1-2000 – 31-12-2002, 238.500,31 €.

Enjuanes, L.Desarrollo de un vector vacunal para la especie porcina basado en genomas de coronavirus.CAM, Proyecto Ref. CAM 07B/0020/99, 1-1-2000 – 31-12-2000, 28.939 €.

Enjuanes, L.Immunotherapy of enteric infections by rotaviruses and coronaviruses using plantibodies. UE, Proyecto Ref. CE QLRT-1999-30739, CSIC LIFE/992/0587, 2000-2002, 246.857 €.

Enjuanes, L.Biosafe coronavirus vaccine vector for the prevention of human infections of the enteric and respi-ratory tracts.UE, Proyecto Ref. CE QLRT-2000-00874, CSIC LIFE/992/0859, 2001-2004, 263.857 €.

Proyectos financiadosLínea de investigaciónLínea de investigación




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Enjuanes, L.Biosafe coronavirus vector-based vaccine for prevention of foot-and-mouth disease.UE, Proyecto Ref. UE QLRT-2001-00825, CSIC LIFE/001/1282, 2002-2005, 256.742 €.

Enjuanes, L.Targeting immunocomplex production in plants.UE, Proyecto Ref. UE QLRT-2001-01050, CSIC LIFE/001/1273, 2002-2005, 248.105 €.

Enjuanes, L.Ingeniería de genomas de coronavirus para el diseño de vectores bioseguros.CICYT, Proyecto Ref. BIO2001-1699, 2001-2004, 252.569,33 €.





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Alonso Villanueva, Sara. (1996-2001).Estudio de las secuencias reguladoras de la transcripción en el coronavirus de la gastroenteritis por-cina transmissible. Diseño de vectores virales.Universidad Autónoma de Madrid, cum Laude.

Escors Murugarren, David. (1997-2001).Composición y estructura de la cápsida interna del virus de la gastroenteritis porcina transmisible.Universidad Autónoma de Madrid, cum Laude.

Riquelme Gabriel, Cristina. (1998).Estudio de las bases moleculares del tropismo de coronavirus del grupo I.Universidad Autónoma de Madrid.

Galán Avella, Carmen. (2002).Estudio de la replicación del virus de la gastroenteritis porcina transmisible.Universidad Autónoma de Madrid.

Capiscol Pérez de Tudela, M. Carmen. (2002).Estudio de la señal de encapsidación en el virus de la gastroenteritis porcina transmisible.Universidad Autónoma de Madrid.

Ceriani, Juan E. (2002).Construcción de partículas análogas a rotavirus (VLP’s) utilizando vectores virales basados en geno-mas de coronavirus.

Moreno, José Luis. (2002).Estudio de la regulación de la transcripción de coronavirus. Diseño de un vector viral para vacunasy terapia génica.

Tesis doctoralesLínea de investigaciónLínea de investigación




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Enjuanes, L. (2001).Biosafety of mucosa-specific RNA-vectors expressing foreign antigens and recombinant antibodiesfor prevention of disease.EC-sponsored Research on Safety of Genetically Modified Organisms, Eds. Kessler, C.,Economidis, I, pp 209-211, European Communities, Luxemburgo.

Enjuanes, L. and Cavanagh, D. (2002).Coronaviridae. The Springer Index of Viruses, Eds. C. A. Tidona, G. Darai, pp 272-280, University of Heidelberg,Alemania.

Enjuanes, L., Almazán, F. and Ortego, J. (2002).Virus based vectors for gene expression in mammalian cells: coronavirus.Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Eds. S. C. Makrides, Elsevier Science,Amsterdam, Holanda.

LibrosLínea de investigaciónLínea de investigación




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PersonalPersonal


Enjuanes, L. (2002).Success stories.Universal vaccine vector, EU, Life Science Program.

Enjuanes, L. (2002).Biotecnología en pocas palabras.Biotecnología y Salud. Nº 2, Sociedad Española de Biotecnología, Madrid.

Enjuanes, L., Sola, I., Almazán, F. y Ortego, J. (2002).Resistencia a infecciones mediante el diseño de vectores virales bioseguros y la transgenésis.La ciencia y la tecnología ante el tercer milenio, Eds. J. M. Sánchez Ron, Vol I, pp. 465-482,España Nuevo Milenio, Madrid.

Artículos divulgaciónLínea de investigaciónLínea de investigación




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Enjuanes, L. Infectious coronavirus cDNA clones.CSIC, November 2000.International, número registro: PCT/EP 00/12063 (P 55171).

Enjuanes, L., Ortego Alonso, J. y Escors Murugarren, D.Secuencia de ácido nucleico que comprende la señal de encapsidación del RNA de un coronavirusdel grupo 1 y sus aplicaciones.CSIC, 22 Enero 2002.International, número registro: 200200158.

PatentesLínea de investigaciónLínea de investigación




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Editor de Archives of Virology. (1997).

Miembro de “Editorial Advisory Board of Veterinary Microbiology”. (2000).

Member of the Editorial Board of Virus Research. (2001).

Profesor honorario de la Universidad Autónoma de Madrid. (2001).

Miembro del comité de evaluación del “Animal Health and Animal Genome and GeneticMechanisms. U.S. A. Department of Agriculture”. (2002).

Premios y distincionesLínea de investigaciónLínea de investigación




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Jefe de Línea Luis Enjuanes

Personal Investigador Fernando AlmazánIsabel SolaJavier OrtegoSara AlonsoDavid EscorsSonia ZúñigaJose M. GonzálezCristina RiquelmeCarmen GalánCarmen CapiscolJose L. MorenoJuan E. CerianiCarlos M. SánchezVerónica HernándezDiana Dorado

Visitantes Dr. Robert LambNorthwestern UniversityIllinois, EEUU

Dr. Eckard WimmerState University of New York at StonyBrook, New York, EEUU

Dr. Felix ReyCNRS-INRAParis, France

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Jose Ramón Naranjo

Análisis funcional el represortranscripcional DREAM


El trabajo de nuestro grupo se centra en el estudio delrepresor transcripcional DREAM (ModuladorAntagonista de sitios DRE) caracterizado y clonadopor nuestro grupo en 1999 (Carrión y cols., Nature398:80-84, 1999). En esencia, DREAM es la primeraproteína capaz de fijar calcio y que a su vez es capazde unirse como tetrámero a sitios específicos en elDNA y reprimir transcripción. En el periodo 2001-2002,nuestro trabajo se ha orientado en dos direcciones:

1. Análisis de la funcionalidad de DREAM invivo mediante transgénesis téjido-específicacon mutantes dominantes negativos

DREAM es una proteína ligadora de calcio con cuatromotivos tipo EF-hand. Mutación de dos residuosespecíficos en cualquiera de la EF-hand funcionalesde DREAM genera un mutante dominante negativode DREAM que es insensible a calcio y por lo tantotiene un efecto represor permanente y no modulablepor calcio. Por otro lado, sabemos que DREAM inter-acciona de una manera dependiente de calcio y AMPcíclico con factores de transcripción de la superfami-lia bZIP (Ledo y cols, Mol. Cell. Biol. 20:9120-91262000) y como resultado también se produce la pérdi-da de unión al sitio DRE lo que determina un proce-so similar de desrepresión. De forma paralela, muta-ción del sitio de interacción con proteínas bZIP gene-ra un dominante negativo DREAM insensible a la des-represión por AMP cíclico. Estos dominantes negati-vos sencillos y el doble se han utilizado para prepararcasettes de expresión bicistronica con el reporterolacZ y distintos promotores específicos de tejido:CaMKIIα para neuronas postnatales, lck para expre-sión en timo y tiroglobulina para células foliculares detiroides. De la caracterización realizada hasta la fechaen 9 líneas transgénicas en cerebro, se ha encontra-do una relación funcional directa entre expresión delos dominantes negativos y represión de un gendiana de DREAM, la prodinorfina pudiendose esta-blecer una reducción significativa en los valores de




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dinorfina A y dinorfina B en distintas áreas cerebralesen las lineas transgénicas lo que correlaciona con unfenotipo hiperalgésico en estos animales.

2. Análisis de la interacción DREAM-CREB

El proceso de desrepresión mediado por DREAM enrespuesta a la activación de PKA implica una interac-ción específica de αCREM y εCREM con DREAM a tra-vés de dos dominios LCD (leucine-charge residue richdomains) localizados en el dominio KID y bZIP de

estas proteínas. A su vez dos dominios LCD enDREAM participan en esta interacción. Como quieraque el dominio LCD en el KID es común a la proteínaCREB estudiamos la posibilidad de que DREAMpudiera también interaccionar con CREB y las conse-cuencias funcionales de dicha interacción en cuantoa transcripción dependiente de cAMP mediada porsitios CRE. Nuestra hipótesis de trabajo resultócorrecta y pudimos demostrar que la interacciónDREAM-CREB se da y tiene como consecuencia un bloqueo del reclutamiento del coactivador

Sección coronal de cerebro de ratón transgénico y salvaje mostrando alteraciones morfológicas en distintas áreas cerebrales.




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transcripcional CBP y una inhibición dependiente decalcio de la transactivación por CREB/CBP de los pro-motores con secuencias CRE. Estos resultados mues-tran un punto nuevo de convergencia de las vías deseñalamiento por calcio y cAMP en el núcleo.

Sección transversal detestículo de ratóntransgénico mostrandola expresión dirigidadel mutante dominan-te negativo de DREAM(puntos blancos).




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Mellström, B. and Naranjo, J.R. (2001). Ca2+-dependent transcriptional repression and derepres-sion: DREAM, a direct efector. Sem. Cell. Dev. Biol. 12: 59-63.

Mellström, B. and Naranjo, J.R. (2001). Mechanisms of Ca2+-dependent transcription. Curr. Op.Neurobiol. 11: 312-319.

Sanz, C., Mellström, B., Link, W.A., Naranjo, J.R. and Fernández Luna, J.L. (2001). IL-3-dependentactivation of DREAM is involved in transcriptional silencing of the apoptotic hrk gene inhematopoyetic progenitors. EMBO J. 20: 2286-2292.

Mellström, B., Ceña,V., Lamas, M., Perales, C., González, C. and Naranjo, J.R. (2002). Gas1 isinduced during and participates in excitotoxic neuronal death. Mol. Cell. Neurosci. 19: 417-429.

Ledo, F., Mellström, B., Kremer, L. and Naranjo, J.R. (2002). Ca2+-dependent block of CREB-CBPtranscription by repressor DREAM. EMBO J. 21: 4583-4592.

Matsu-ura, J.T., Konishi, Y., Aoki, T., Naranjo, J.R., Mikoshiba, K. and Tamura, T. (2002). Seizure-Mediated Neuronal Activation Induces DREAM Gene Expression in the Mouse Brain. Mol. BrainRes. 109: 198-206.

Publicaciones




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Molecular characterization of Gas1-induced neuronal death.Janssen Research Fundation.

Análisis funcional de la muerte inducida por Rho y Gas1: implicación en neuropatologias dege-nerativas humanas. Fondos FEDER.

Análisis por recombinación homóloga de la funcionalidad del gen gas1 en neurodegeneración.Comunidad Autónoma de Madrid.

Análisis de la funcionalidad de DREAM mediante transgénesis tejido-específica. Comunidad Autónoma de Madrid.

Calcium-regulated expression of calcium transporting systems during neuronal development,survival and death.Human Frontiers Science Program.

Análisis de las interacciones proteína-proteína y los genes diana que median los efectos trans-cripcionales de DREAM.MCyT (BMC2001-1431).





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Jefe de Línea Jose Ramón Naranjo

Investigadora Prog. Ramón y Cajal Britt Mellström

Becarios Postdoctorales Koldo Aurrekoetxea (desde Febrero 2001 hasta Noviembre 2002)Magali Savignac (desde Septiembre 2001)Begoña Torres (desde Julio 2002)Malgosia Palczewska (desde Octubre 2002)

Becarios Predoctorales Francisco Ledo (desde Julio 1998)Jorge Barrio (desde Julio 2000)J. Rubén Cabrera (desde Noviembre 2001)Carlos Perales (desde Mayo 2001)

Técnico de Laboratorio David Campos

Visitantes Patrick Groves (desde Septiembre 2002)Nencki Institute

Ludwig Wagner (desde Junio 2001 hasta Diciembre 2001)Wien University

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Juan Ortín

Transcripción y replicacióndel RNA del virus de la gripe


1. Interacción de la proteína NS1 con factorescelulares

Resultados previos de nuestro grupo habían demos-trado la interacción de la proteína NS1 con la proteínahStaufen. Para entender el papel que esta interacción

juega en la infección, hemos estudiado la función deesta proteína humana en células en cultivo. Se hanpurificado complejos intracelulares que contienenhStaufen mediante dos pasos de cromatografía de afi-nidad por el método TAP. Estos complejos contienenun conjunto repetitivo de proteínas cuya identifica-ción por espectrometría de masas está en proceso(Villacé y cols, resultados no publicados).

Los RNAs asociados a estos complejos han sido iden-tificados por clonaje y la especificidad de su unión seha verificado mediante el uso de un mutante dehStaufen defectivo para la unión a RNA in vitro. Entrelos RNAs específicos destacan los de hGoliath y com-plexina-1, ya que sus genes juegan un papel impor-tante en el desarrollo y la diferenciación (Marión ycols., enviado a publicación).

Además de la interacción de NS1 con el factor de ini-ciación de la traducción eIF4G, previamente descrita,hemos demostrado que esta proteína se asocia direc-tamente a la polyA-binding protein citoplásmica(PABP1). Esta interacción tiene lugar por regiones deNS1 no involucradas en su unión a eIF4G y no requie-re la presencia de RNA, ya que tiene lugar con mutan-tes de PABP1 que carecen de la región de unión apoliA. La región de PABP1 que interacciona con NS1no está implicada en su interacción con eIF4G y lomismo ocurre con eIF4G. Estos datos sugieren que en


células infectadas la unión de los mRNAs virales a losribosomas puede estar favorecida por la formaciónde complejos en los que estos mRNAs intaraccionensimultáneamente con NS1, eIF4G y PABP1. De acuer-do con este modelo, los mRNAs virales, pero no losmRNAs celulares, se encuentran asociados a NS1 enlas células infectadas por el virus (Aragón y cols.,enviado a publicación).

2. Interacción de la polimerasa del virus de lagripe con factores celulares

Mediante rastreo genético con la subunidad PA de lapolimerasa por el método del doble híbrido se haidentificado a la proteína hCLE como un factor celu-lar que interacciona con la polimerasa viral. Esta pro-teína de 36 kDa tiene homología con la proteínacdc68 de levadura, implicada en la modulación detranscripción, y con otros activadores transcripciona-les como la proteína human FACT. Su interacción conPA no requiere la presencia de otras proteínas y tienelugar por la región 493-574 de ésta. La relevancia deesta interacción durante la infección viral queda paten-te por la asociación de hCLE a RNPs virales activaspurificadas, reconstituidas in vivo a partir de cDNAs.

3. Análisis funcional de la polimerasa viral

Usando como base el alineamiento de secuencias dela subunidad PB2 de la polimerasa con proteínas quese unen a estructuras cap, se han generado mutantespuntuales en esta subunidad que alteran posicionesconservadas entre ellas. Una serie de estos mutantes

Distintas vistas de laestructura de una ribo-nucleoproteína, mostran-do 9 monómeros de NPy la polimerasa.




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dan lugar a complejos de polimerasa que están afec-tadas en su función biológica pero no en la formacióndel complejo. El análisis de su funcionalidad en unsistema de reconstitución in vivo mostró que su capa-cidad para replicar vRNAs modelo estaba afectada.Sin embargo, las RNPs mutantes generadas no pre-sentaban defectos en su capacidad para transcribir invitro, en un sistema dependiente de iniciadores concap. Estos fenotipos indican que las mutaciones intro-ducidas en PB2 afectan la replicación pero no latranscripción del genoma viral, en contra de las pre-dicciones iniciales. Estas conclusiones fueron avala-das al estudiar los fenotipos de virus mutantes encuyos genes de PB2 se habían introducido las muta-ciones indicadas. Estos virus mutantes mostrabanretraso en su cinética de replicación, en la síntesis deproteínas virales y en la acumulación de RNAs, pero sutranscripción primaria (independiente de replicación)no estaba afectada (P. Gastaminza y cols., en prensa).

La subunidad PA tiene una actividad proteolítica queconlleva la degradación de proteínas que se coexpre-san con ella y su autoproteolisis. Utilizando un siste-ma de reconstitución in vivo de RNPs con mutantespuntuales que tienen afectada esta actividad seobservó que existía una correlación entre disminu-ción de la actividad replicativa de la polimerasareconstituida y la actividad proteolítica. Estas muta-ciones puntuales de la subunidad PA han sido intro-ducidas en virus infecciosos, observandose la mismacorrelación, sin que en ningún caso se afecte la acti-vidad transcripcional de la polimerasa. Además, unode los residuos mutados origina una forma de PAhiposfosforilada abriendo la posibilidad adicional deregulación de la replicación viral por un mecanismode fosforilación-defosforilación (M. Huarte y cols.,enviado a publicación).

Imágenes correspondientes aribonucleoproteínas recombi-nantes individuales del virusde la gripe.




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4. Estudios estructurales de laribonucleoproteína (RNP) y la polimerasa del virus de la gripe

Las RNPs virales generadas por reconstitución y repli-cación in vivo a partir de cDNAs han sido estudiadaspor microscopía electrónica de muestras teñidas yreconstrucción tridimensional de imágenes. A partirde una genoteca de RNPs con vRNA moldes de longi-tud variable se seleccionó una variante de 248 nucle-ótidos para su estudio detallado. Su reconstrucción tri-dimensional ha permitido revelar una estructura cir-cular en la que se pueden apreciar 9 monómeros denucleoproteína (NP) y el complejo de la polimerasa. Elanillo de NP presenta fuertes interacciones entre sus

monómeros en la base de la estructura, sugiriendoque el vRNA puede estar localizado en dicha zona.Además, los monómeros de NP presentan una vorti-cidad que puede ser la causa de la estructura super-helicoidal que presentan las RNPs de mayor longitud.La polimerasa interacciona de manera desigual conlos dos monómeros de NP adyacentes. Este modelotridimensional es la primera información estructuraldetallada de una RNP de virus con RNA de polaridadnegativa. Estudios más recientes sobre el complejode la polimerasa de estas RNPs ha permitido incre-mentar su resolución e identificar las regiones en lasque se localizan sus subunidades (E. Area y cols.,resultados no publicados).

Alteraciones del complejo de iniciación de traducción por interacción de NS1 con el vRNA viral y los factores celulares.




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Martín Benito, J., Area, E., Ortega, J., Llorca, O., Valpuesta, J.M., Carrascosa, J.L. and Ortín, J. (2001).Three dimensional reconstruction of a recombinant influenza virus ribonucleoprotein particle. EMBORep. 21: 313-317.

Huarte, M., Sanz Ezquerro, J.J., Roncal, F., Ortín, J. and Nieto, A. (2001). PA subunit from influenzavirus polymerase complex interacts with a cellular protein with homology to a family of transcrip-tional activators. J. Virol 75: 8597-8604.

Gschoesser, C., Almanzar, G., Hainz, U., Ortin, J., Schonitzer, D., Schild, H., Saurwein Teissl, M. andGrubeck Loebenstein, B. (2002). CD4(+) and CD8(+) mediated cellular immune response to recom-binant influenza nucleoprotein.Vaccine, 20: 3731-3738.




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Ortín, J.Análisis estructural y funcional de la polimerasa del virus de la gripe: interacciones con factores vira-les y celulares.DGICYT, 1998-2001.

Nieto, A.Caracterización de la funcionalidad de proteínas del virus de la gripe que interfieren con el metabo-lismo de la célula infectada.DGICYT, 1999-2002.

Ortín, J.La proteína NS1 del virus de la gripe: Estudio de sus funciones durante la replicación viral y uso delgen NS1 como diana para generar virus vacunales atenuados.CAM, 2002-2003.

Ortín, J.Búsqueda de compuestos potencialmente antigripales: Diseño de ensayos específicos y rastreo decolecciones de compuestos naturales y sintéticos.PETRI-MSD, 2001-2002.

Ortín, J.Estructura de la ribonucleoproteína (RNP) del virus de la gripe: Estudio de los mecanismos de trans-cripción y replicación y de los factores celulares implicados.DGICYT, 2002-2004.




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Jefe de Línea Juan OrtínAmelia Nieto

Postdoctorales Íñigo SalanuevaSandra Ufano

Predoctorales Estela AreaIdoia BurguiAna M. FalcónUrtzi GaraigortaMaite HuarteAlicia PérezAriel RodríguezEva TorreiraPatricia VillacéPablo Gastaminza

Ayudantes Yolanda Fernández




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Jose F. Rodríguez

Biología Molecular de Birnavirus


El virus de la bursitis infecciosa del pollo (infectious bur-sal disease virus, IBDV) es el agente causal de unaenfermedad (IBD) caracterizada la destrucción de labolsa de Fabricio y la consiguiente inmunosupresión delas aves afectadas. La bursitis infecciosa es la enferme-dad vírica más importante para la industria avícolamundial. El IBDV es el miembro mejor caracterizado defamilia Birnaviridae que agrupa a virus con genomasconstituidos por dos moléculas de RNA bicatenario.

El objetivo fundamental de nuestro laboratorio es eldesarrollo de nuevas estrategias para el control deesta enfermedad a través del conocimiento de aspec-tos básicos de la biología molecular del virus.

Caracterización molecular del virus. Los viriones deIBDV carencen de envuelta, son icosaédricos (T=13),y tienen un diametro de 60-65 nm. A diferencia de lamayoría de los virus dsRNA, la cápsida de los birna-virus esta formada por una única capa proteíca. Lasproteínas que conforman la cápsida (VPX, VP2, yVP3) se generan mediante procesamiento proteolíti-co de una poliproteína de 106 kDa codificada por elsegmento A del genoma viral.

La utilización de diferentes sistemas de expresióneucarióticos nos ha permitido establecer modelosexperimentales para la caracterización del procesa-miento proteolítico y la morfogénesis de la partículaviral. Mediante la expresion de versiones mutageniza-das de la poliproteína viral hemos establecido conexactitud la posición de los sitios de procesamiento. Ladeterminación de la secuencia exacta de estos produc-tos ha abierto la posibilidad de analizar de forma indi-vidual el papel funcional de estos productos proteicos.

Ensamblaje de proteínas estructura-les de IBDV en células de insecto. Laco-expresión de los genes correspon-dientes a la RNA polimerasa y la poli-proteína permite la formación deestructuras idénticas a las detectadasen células infectadas con el virus.




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Nuestro trabajo acerca de la morfogénesis viral secentra en la caracterización de las interacciones entrelas diferentes proteínas estructurales, y en el estudiode la encapsidación del genoma viral. La proteínaVP3 juega un papel central en el proceso morfogené-tico. Esta proteína, que actúa como proteína de anda-miaje durante el ensamblaje de la partícula, interac-ciona con la proteína externa de la cápsida, con laRNA polimerasa y con el RNA genómico. La caracte-rización molecular de esta proteína nos ha perimitidolocalizar los diferentes dominios de interacción esen-ciales para el proceso morfogenético. Estos resulta-dos nos han servido de base para una nueva linea deinvestigación encaminada al desarrollo de mutantescondicionales del virus y sistemas transgénicosrefractarios a la infección.

Como parte de este trabajo, se ha determinado laestructura tridimensional de virus completos y cápsi-das vacías con y sin la RNA polimerasa viral.Actualmente estamos realizando un análisis compa-rativo de las diferentes estructuras para determinar latopología de la RNA polimerasa y del genoma viral.Por otra parte, se comenzando un proyecto encami-nado a la determinación de la estructura atómica delvirus y de diferentes complejos virales.

Generación de nuevas vacunas y sistemas de diag-nóstico. La expresión tanto de la poliproteína comode las diferentes proteínas estructurales de formaindividual a partir de recombinantes del virus vacunaly baculovirus nos ha perimitido desarrollar sistemasde alto rendimiento para la producción de antígenosvíricos formando diferentes tipos de estructuras.Estos antígenos están siendo utilizados para el des-arrollo de nuevas vacunas y sistemas de diagnóstico.Desde el punto de vacunación, nuestra meta consisteen el desarrollo de vacunas partículadas de adminis-tración oral y nasal.

Morfogénesis de IBDV. Las proteínas estructurales deIBDV se ensamblan dando lugar a dos tipos de estructu-ras: túbulos de tipo I y partículas virales. Las partículas seasocian formando grandes inclusiones paracristalinasdenominadas viroplasmas. La imagen, obtenida median-te microscopía confocal, muestra la superposición de lasseñales correspondientes a las proteínas estructuralesVPX y VP3.




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Martínez Torrecuadrada, J.L., Castón, J.R., Castro, M., Carrascosa, J.L., Rodríguez, J.F. and Casal, J.I.(2000). Different architectures in the assembly of infectious bursal disease virus capsid proteinsexpressed in insect cells. Virology. 278: 322-31.

Lombardo, E., Maraver, A., Espinosa, I., Fernández Arias, A. and Rodríguez, J.F. (2000). VP5, the non-structural polypeptide of infectious bursal disease virus, accumulates within the host plasma mem-brane and induces cell lysis. Virology. 277: 345-57.

Caston, J.R., Martínez Torrecuadrada, J., Maraver, A., Lombardo, E., Rodríguez, J.F., Casal, J.I. andCarrascosa, J.L. (2001). C terminus of infectious bursal disease virus major capsid protein VP2 isinvolved in definition of the t number for capsid assembly. Journal of Virology 75: 10815-28.

Fernández Fernández, M.R., Mouriño, M.J., Rivera Rodríguez, J.F., Plana Durán, J. and García, J.A.(2001). Protection of rabbits against rabbit hemorrhagic disease virus by immunization with theVP60 protein expressed in plants with a potyvirus vector. Virology 280: 283-91.

Maraver, A., Clemente, R., Rodríguez, J.F. and Lombardo, E. (2003). Identification and molecularcharacterization of the RNA polymerase-binding motif of the inner capsid protein VP3 of infectiousbursal disease virus. Journal of Virology 77: 27459-68.

Kochan G., González, D. and Rodríguez, J.F. (2003). Characterization of the RNA-binding activity ofVP3, a major structural protein Archives of Virology. 148: 723-44.

Maraver, A., Oña, A., Abaitua, F., González, D., Clemente, R., Díaz, A., Caston, J.R., Pazos, F. andRodríguez, J.F. (2003). The oligomerization domain of VP3, the scaffolding protein of infectious bur-sal disease virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of Virology 77: 6438-49.




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Rodríguez, J.F. (coordinador: Peter Mertens, IAH, UK)Phylogenetic sequence analysis and improved diagnostic assay systems for viruses of the FamilyReoviridae.EU, 2001-2003.

Rodríguez, J.F.Morfogénesis del virus de la bursitis infecciosa. Desarrollo de mutantes defectivos mediante genética inversa.MCYT, 2001-2003.

Rodríguez, J.F.Desarrollo de una vacuna oral contra el virus de la bursitis infecciosa del pollo.CAM, 2002-2003, proyecto coordinado con BIONOSTRA S.L.




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Jefe de Línea Jose F. Rodríguez

Personal Investigador Mª Dolores González de LlanoAna OñaFernando AbaituaAntonio MaraverXimena RenjifoRoberto ClementeAitor NavarroAinhoa Mielgo




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