Trabajo de Bioquimica_Hematologia-ADN

Trabajo N°1. Bioquímica II

Hematología Básica, ADN-ARN

Castillo, Yaviely;Centeno, Bárbara

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1. Introducción

Al igual que otras ciencias biomédicas, en la última década la hematología ha

presentado importantes avances, tanto en el campo de la fisiopatología y diagnóstico,

como también en las estrategias de tratamiento. Los problemas hematológicos que

afectan a los seres humanos han sido estudiados por diversos grupos de hematólogos,

a lo largo de los últimos 60 años del siglo XX, en investigaciones fundamentalmente

clínicas. La hematología se dedica al diagnóstico y tratamiento de pacientes que

presentan enfermedades sanguíneas, o cualquier tipo de cuadro clínico que puede ser

detectado mediante análisis sanguíneos [1].

Por otro lado, los ácidos nucleicos, las proteínas y los polisacáridos son

biomoléculas que en su conjunto realizan diversos procesos químicos que constituyen

la materia viva. De ahí la importancia e interés para los científicos, del estudio de sus

propiedades y funciones. Cabe mencionar que estas sustancias existen en forma de

macromoléculas, que son polímeros en los cuales cada tipo, está formado por la unión

de un número limitado de clases de unidades monoméricas. Donde en cada caso la

secuencia de unidades es específica. Existen dos tipos de acido nucleico que son: ADN

(Ácido desoxirribonucleico) y ARN (Ácido Ribonucleico) que actúan como

depositarios y transmisores de la información genética de cada célula, tejido y

organismo. Así la información contenida en el ADN puede ser copiada por partes, en

moléculas específicas de ARN denominadas ARN mensajeros (ARNm), este proceso se

denomina transcripción y la información codificada en el ARNm es luego traducida en

una secuencia específica de aminoácidos que forman una proteína. Este último

proceso se denomina traducción. El avance en el estudio de estas moléculas ha sido

vertiginoso, encontrando hoy tecnologías aplicadas con nanomateriales, polímeros,

tecnología PCR de amplificación del ADN, entre otros [2, 3]




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2. Hematología Básica

La hematología es la rama de la ciencia médica que se encarga del estudio de los

elementos de la sangre y sus precursores, así como de los trastornos estructurales y

bioquímicos de estos elementos, que puedan conducir a una enfermedad [1].

En general las enfermedades sanguíneas pueden afectar a al sistema

eritrocitario, sistema leucocitario, hemostasia o hemopatías malignas

(leucemias/linfomas, discrasias y otros) [4].

Las enfermedades de la sangre básicamente, pueden afectar elementos celulares

(eritrocitos, plaquetas y leucocitos), plasmáticos (inmunoglobulinas, factores

hemostáticos), órganos hematopoyéticos (médula ósea) y órganos linfoides (ganglios

linfáticos y bazo). Debido a las diversas funciones que los componentes sanguíneos

cumplen, sus trastornos darán lugar a una serie de manifestaciones que pueden

englobarse en diversos síndromes [1, 4].

De ésta manera para comprender ésta rama se debe conocer las definiciones

básicas relacionadas a la sangre.

2.1 Sangre y sus componentes

Básicamente la sangre está constituida por dos grupos;

- Elementos Formes: son elementos semisólidos y particulados en ésta

categoría entran las células sanguíneas; glóbulos blancos se originan en la

médula ósea mediante un complejo proceso de diferenciación y maduración

celular. En este proceso denominado hematopoyesis participan varios

factores de maduración. Y también se encuentran los derivados celulares que

son los eritrocitos (glóbulos rojos) y plaquetas [5].

- El plasma sanguíneo: un fluido traslúcido y amarillento que representa la

matriz extracelular líquida en la que están suspendidos los elementos




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formes. Este representa un medio isotónico para las células sanguíneas, las

cuales sobreviven en un medio que esté al 0,9 % de concentración.

Elementos Formes

Glóbulos Rojos

Los glóbulos rojos son células anucleadas que se forman en la médula ósea a

partir de «stem cells». Una vez en la circulación tienen como principal función

transportar oxígeno a los tejidos, tarea que desarrollan por aproximadamente 120

días, hasta que el sistema los retira de la circulación. Los glóbulos rojos tienen como

función principal y utilizando su proteína más abundante, la hemoglobina transportar

el oxígeno desde los pulmones a los tejidos

Glóbulos Blancos

Los glóbulos blancos o leucocitos incluyen linfocitos, granulocitos (neutrófilos,

eosinófilos y basófilos) y monocitos, que se forman en la médula ósea a partir de

Fig. N°1. Esquema de la Hematopoyesis para producción de los

componentes de la sangre




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células pluripotentes, en un proceso finamente regulado y con la participación de

diversas citoquinas y receptores para las mismas. Los leucocitos forman parte del

sistema inmune, el que se incluye entre los mecanismos biológicos destinados a

mantener la organización estructural y funcional de los individuos y está

genéticamente programado para la neutralización y eliminación, tanto de agentes

infecciosos, células y moléculas extrañas [1]

Plaquetas

Son pequeñas células que circulan en la sangre; participan en la formación de

coágulos sanguíneos y en la reparación de vasos sanguíneos dañados. Las plaquetas

son producidas en el proceso de formación de las células sanguíneas llamado

(trombopoyesis) en la médula ósea, por fragmentación en los bordes citoplasmáticos

de los megacariocitos. Desempeñan un papel fundamental en la hemostasia

(mecanismos para la detención de hemorragias en el organismo) y son una fuente

natural de factores de crecimiento. Estas circulan en la sangre de todos los mamíferos

y están involucradas en la hemostasia, iniciando la formación de coágulos o trombos

[6].

Plasma Sanguíneo

El plasma sanguíneo es la porción líquida de la sangre en la que están inmersos

los elementos formes. Es salado y de color amarillento traslúcido y es más denso que

el agua. El volumen plasmático total se considera como de 40-50 mL/kg peso. El

plasma sanguíneo es esencialmente una solución acuosa de composición compleja

conteniendo 91% agua, y las proteínas el 8% y algunos rastros de otros materiales

(hormonas, electrolitos, etc.). Estas proteínas son: fibrógeno, globulinas, albúminas y

lipoproteínas. Otras proteínas plasmáticas importantes actúan como transportadores

hasta los tejidos de nutrientes esenciales como el cobre, el hierro, otros metales y

diversas hormonas. Los componentes del plasma se forman en el hígado (albúmina y

fibrógeno), las glándulas endocrinas (hormonas), y otros en el intestino. Además de




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vehiculizar las células de la sangre, también lleva los alimentos y las sustancias de

desecho recogidas de las células. El suero sanguíneo es la fracción fluida que queda

cuando se coagula la sangre y se consumen los factores de la coagulación [4].

2.2 Análisis y recolección de muestras de sangre

El estudio de la sangre es fundamental en la etapa de diagnóstico y control de la

evolución en las enfermedades hematológicas. Los procedimientos para los análisis de

sangre son dependientes de la calidad de las muestras la cual debe ser recolectada,

identificada, transportada y almacenada adecuadamente para no provocar hemólisis

(desintegración de los glóbulos rojos) todo lo cual contribuirá a un buen análisis de la

muestra [7].

En primer lugar una muestra de sangre lleva algunos componentes para

preservar su constitución, a continuación se mencionan estos, juntos con otros

aspectos a tomar en cuenta para el análisis y recolección de muestras [1].

Fig. N°2. Diagrama resumen de la composición de la sangre.




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Anticoagulantes

Cuando la sangre se recibe en frascos sin anticoagulantes ésta se coagula dentro

de los 5 a 10 minutos de recolectada la muestra. Luego se produce la retracción del

coágulo liberándose el suero. Cuando se requiere obtener plasma (contiene los

factores de la coagulación), estudiar algunas propiedades de la sangre total o analizar

algunos de sus componentes celulares es necesario agregar un anticoagulante. Es

importante el tipo de anticoagulante, la concentración del mismo y la relación

sangre:anticoagulante; cuando ésta es no es correcta pueden ocurrir importantes

errores. Las sales de sodio o potasio son los tipos de anticoagulantes más efectivos y

usados, puesto que no se produce hemólisis ni deformación celular. Algunos de los

anticoagulantes más usados [4]:

- EDTA (Ácido Etilendeaminotetraacético): La coagulación requiere de iones

calcio (Ca2+), por lo que su quelación inhibe el proceso, uno de los agentes

quelantes más utilizados es el EDTA, la concentración recomendada es de 1 a

5 ppm [8].

- Citrato de Sodio: Inhibe la coagulación porque precipita de los iones calcio

La concentración sugerida es de 109 mM y se debe usar en una relación 9:1;

se utiliza en las pruebas de hemostasia [8].

- Heparina: La inhibición de la coagulación la realiza aumentando

significativamente la velocidad de acción de la antitrombina III, inhibidor

natural de las serino-proteasas de la coagulación, y causa menos hemólisis

que el EDTA concentración recomendada es de 15 a 20 ppb [4].




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Recolección de Muestras

Los tubos son los elementos más usados para la recolección de muestras de

sangre. Estos pueden ser al vacío (aspiran automáticamente la sangre) o no, de

plástico o vidrio, con o sin anticoagulante. Pueden diferenciarse por el color de la tapa

del tubo, según si contienen o no anticoagulante y en el primer caso identifican el

anticoagulante; los colores usados internacionalmente son: rojo (sin anticoagulante),

lila (EDTA), celeste (citrato de sodio) [4].

Antes de la recolección de la muestra, el primer paso es una adecuada

identificación del (los) tubo(s) en que se depositará la muestra; al menos debe incluir

el nombre y apellido del paciente, examen, y fecha [4].

2.2.1 Tipos de recolección

Entre los tipos de recolección más común podemos destacar:

Fig. N°3. Estructuras químicas de anticoagulantes más utilizados en la toma

de muestras de sangre [4].




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Punción Venosa: la típica punción venosa, El material a usar en la punción

venosa debe ser estéril

(jeringa desechable). El

tamaño de las agujas

dependerá de la cantidad de

sangre a recolectar y de la

edad del paciente; una

combinación de un número y

una letra indica el diámetro y longitud, así por ejemplo la más usada 21G1

indica que la aguja tiene un diámetro de 21 mm y 4 cm de longitud. Se deben

descartar las zonas que presentan hematomas, quemaduras, cicatrices y

edema. Las posibles venas a puncionar deben ser evaluadas aplicando un

torniquete por un período no superior a 1 minuto, ya que un mayor tiempo se

asocia con hemoconcentración. Antes de la punción se debe limpiar la zona

elegida con un algodón impregnado en alcohol 70%, luego se debe fijar la vena

traccionando suavemente la piel, introducir la aguja en el mismo sentido de la

vena y liberar inmediatamente el torniquete; la sangre debe ser aspirada

suavemente. Luego se retira la jeringa y con un algodón se presiona el lugar de

punción para evitar sangramiento. Antes de depositar la sangre en el tubo se

retira la aguja, la sangre se agrega lentamente por las paredes del tubo. Luego

de tapar ésta (si no es al vacío) y si la sangre fue recolectada en un tubo con

anticoagulante, se mezcla inmediatamente por inversión en forma suave, para

evitar alteraciones y daño celular [8, 4].

Punción Capilar: Cuando por diversas razones no se puede realizar la punción

venosa o la cantidad de la muestra

requerida es pequeña, se puede

obtener sangre por punción capilar. La

sangre capilar es obtenida por una

Fig. N°4. Ilustración de punción venosa directa [8]

Fig. N°5. Ilustración de punción capilar y

sitios adecuados para la punción en pie y

mano [8]




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punción con una lanceta; en adultos y niños el lugar a elección es la parte

lateral de un dedo de la mano y en recién nacidos es la parte lateral de la planta

del pie. Se debe hacer una punción fuerte y certera, se elimina la primera gota

de sangre y para tener una adecuada recolección se debe presionar muy

suavemente, evitando la salida de líquido tisular [8, 4].

2.2.2 Almacenamiento y transporte de muestras de sangre

Dentro de la primera hora de tomada la muestra de sangre los cambios en las

células sanguíneas son imperceptibles; éstos se hacen más importantes a partir de las

tres horas hasta completarse a las 8 horas, a temperatura ambiente. Las alteraciones

incluyen: leucocitos, desintegración de los glóbulos rojos, incremento del hematocrito,

y también alteración del tamaño y distribución de las plaquetas. Todas estas

alteraciones son evitables si la muestra de sangre se almacena a 4ºC [1].

Cuando una muestra de sangre va a ser transportada se deben tomar

precauciones para evitar las alteraciones descritas; aunque el transporte se realice

entre lugares cercanos se aconseja hacerlo en contenedores refrigerados [8].

Las condiciones para las pruebas de coagulación son más exigentes que para

análisis regulares de sangre [1].

2.2.3 Tinción de May Grünwald-Giemsa

Es una técnica de tinción derivada del método de Romanowsky que se utiliza

principalmente para el coloreo de muestras de frotis (extendido de sangre sobre un

portaobjeto) sanguíneos o extendidos de médula ósea. Emplea dos soluciones

colorantes [8]

La solución de May-Grünwald, que contiene el colorante ániónico eosina y el

colorante catiónico azul de metileno ambos disueltos en metanol. La solución de

Giemsa, que contiene eosina, azul de metileno y una serie de productos de la oxidación




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de este último tales como el azur A, el azur B, el violeta de metilo y el azul de metilo

[8].

Todos estos colorantes se encuentran en estado no ionizado mientras se

mantienen en solución de alcohol metílico, pero al añadir agua se ionizan y se unen

selectivamente a los constituyentes celulares precipitando como sales insolubles. Los

componentes celulares de naturaleza aniónica (ácida) se unen selectivamente a los

tintes catiónicos tiñéndose en variados tonos de azul. Estos componentes son

llamados basófilos: (ADN, mitocondrias, ribosomas y citoplasma de células ricas en

ARN). Los componentes celulares de naturaleza catiónica (básicos) se unen

selectivamente al tinte ácido eosina, tiñendose en variados tonos de naranja y rojo. A

estos elementos se los denomina acidófilos o eosinófilos. Este es el caso de la

hemoglobina, y de las proteínas contenidas en las granulaciones de los granulocitos

eosinófilos. Los componentes celulares que tienen afinidad por ambos tipos de

colorantes se denominan neutrófilos y se tiñen en variados tonos de violeta [1].

2.3 Hemograma

El hemograma es un examen hematológico fundamental. El estudio cuantitativo

y citológico de las células sanguíneas, permite avanza significativamente en la mayoría

de las enfermedades hematológicas, en que los glóbulos rojos, leucocitos y/o

Fig. N°6. Tinción May Grünwald-Giemsa




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plaquetas se ven afectados, ya sea por la falta de producción en la médula ósea o por

destrucción periférica. En la actualidad, se recomienda expresar los resultados de los

parámetros biológicos de acuerdo con el llamado sistema internacional de unidades

[1].

La forma clásica de expresar el hematocrito (Hto) en porcentaje (%) ha sido

substituida por las unidades correspondientes de acuerdo con el sistema SI. Debido a

que el Hto corresponde a la relación existente entre el volumen de hematíes y el de

sangre total, su unidad resulta de un cociente entre dos unidades de volumen

idénticas (L/L), por lo que equivale a 1. De acuerdo con ello, un Hto de 45%

corresponde según el sistema SI a 0.45 L/L o simplemente 0,45 [4, 8].

La de hemoglobina es el parámetro hematológico cuya forma de expresión ha

sido más discutida. Así mientras se ha preconizado expresarlo en milimoles por litro

(mmol/L), todavía se considera aceptable hacerlo en gramos por litro (g/L). La

variación del nuevo valor con respecto al de concentración de hemoglobina expresada

en unidades clásicas (g/dL) [4].

La información cualitativa y cuantitativa que proporciona el hemograma

podemos separarla en globulos rojos y blancos.

Tabla N°1. Ejemplo de un hemograma [4]




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Glóbulos rojos

El hematocrito corresponde al volumen de glóbulos rojos expresado

porcentualmente respecto a un volumen de sangre; de esta forma provee

un valor estimativo del grado de anemia. El valor del hematocrito se

obtiene por centrifugación de sangre anticoagulada. El procedimiento es

simple y reproducible. Brevemente, a un capilar (7.5 cm x 1 mm), se

agrega sangre anticoagulada con EDTA y luego de sellar un extremo se

centrifuga (5 min. a 12.000 r.p.m). Realizado el procedimiento sepueden

distinguir tres capas: glóbulos rojos,“buffy coat” (glóbulos blancos y

plaquetas), y plasma. El porcentaje de hematíes (hematocrito), se obtiene

a partir de una tabla graduada [8, 1].

La función primordial de la hemoglobina, principal proteína de los

glóbulos rojos, es transportar el oxígeno y el dióxido de carbono hacia y

desde los tejidos, respectivamente. Su determinación ayuda a establecer

el grado de la anemia. Para determinar la concentración de la

hemoglobina en la sangre, se utiliza el método de la

cianmetahemoglobina (HiCN), recomendado por el “International

Committee for Standarization in Hematology” (ICSH). Brevemente, la

sangre es diluida con el reactivo de Drabkin (incluye ferricianuro de

potasio y cianuro de potasio). Todos los tipos de hemoglobina son

oxidadas por el ferricianuro de potasio a metahemoglobina, que en

presencia de ferricianuro de potasio forma un compuesto estable,

cianmetahemoglobina. Para determinar la concentración de las muestras

se debe interpolar en una curva de calibración previamente preparada

usando un estándar [8, 1].




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La relación entre hematocrito y hemoglobina o recuento de glóbulos

rojos permite obtener índices que ayudan a clasificar las anemias según el

tamaño y cromia de los glóbulos rojos. Las constantes más usadas son

Volumen Corpuscular Medio (VCM) y Concentración de Hemoglobina

Corpuscular Media (CHCM) [8].

Hay también otras anomalías de tipo cualitativas, como cambio en la forma o en

el color de los glóbulos y a la presencia de agentes extraños en su estructura.

Glóbulos blancos

Las alteraciones que pueden presentar los leucocitos en el hemograma son de

dos tipos, cuantitativos y cualitativos (citológicos).

El recuento normal de leucocitos fluctúa entre 5.000–10.000/μL y en

recién nacidos entre 15.000-20.000/μL.

El extendido o frotis sanguíneo, es un elemento muy importante en la

realización del hemograma. Es posible obtener información con respecto

a la morfología de las tres series sanguíneas glóbulos rojos, leucocitos, y

plaquetas. Adicionalmente, el citohematólogo experimentado puede tener

una apreciación sobre aspectos cuantitativos: índices hematológicos,

recuento de leucocitos y recuento de plaquetas [8].

3. Citometría Hemática

Se refiere a la medición de las células de la sangre (citos = células; metro =

medida). La interpretación correcta de éste análisis permite establecer diagnósticos

definitivos sobre las enfermedades sanguíneas. La evaluación correcta de los

parámetros citomorfológico de la citometría hemática completa (CHC) ofrece

información acerca de los padecimientos primarios del tejido hematopoyético, y de




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otros trastornos no hematológicos y permite ampliar la variedad de diagnósticos

diferenciales [9, 10].

Consta de 2 partes;

1.- Fórmula roja: Determina los parámetros relacionados con los eritrocitos.

2.- Fórmula blanca: Determina los parámetros relacionados con los leucocitos.

La biometria hematica completa generalmente incluye los siguientes

componentes [11]:

- Recuento de leucocitos

- Recuento diferencial leucocitario

- Conteo de glóbulos rojos (RBC o recuento de eritrocitos)

- Hematocrito (Hct) o valores normales de hemoglobina (HBG)

- El volumen corpuscular medio

- Hemoglobina corpuscular media (promedio en cantidad de la

hemoglobina en los glóbulos rojos)

- La concentración media de hemoglobina corpuscular (la

concentración media de hemoglobina en un volumen dado de sangre).

- El recuento de plaquetas:

- El volumen medio de plaquetas (MPV) es una medida que

describe el tamaño medio de las plaquetas en la sangre [4].

Las técnicas para realizar éstas mediciones van desde técnicas instrumentales

como espectrofotometría, utilizando de colorímetros, entre otras. A continuación se

describen algunas técnicas relacionadas.

3.1 Determinación de Hematocrito

Puede determinarse por métodos manuales o métodos automáticos. Los

métodos manuales consisten en la centrifugación de la muestra de sangre y los




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métodos automáticos pueden basarse en el cálculo de estos a partir de valores de

VCM, o el análisis de la sombra que produce la población eritrocitaria, al reflejarse en

un campo oscuro [8].

3.2 Determinación de Leucocitos

La sangre anticoagulada se deposita en un

líquido que permite evidenciar los leucocitos,

manteniéndolos visibles. La cámara de Neubauer es

una cámara de contaje adaptada a un microscopio de

campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un

porta-objeto con una depresión en el centro, en el

fondo de la cual, con la ayuda de una punta diamante,

se ha marcado una cuadricula [8, 11].

4. ADN y ARN

Los ácidos nucleicos son los componentes más fundamentales de la célula viva.

Parece probable que la vida en sí empezara su evolución con los ácidos nucleicos,

puesto que éstas son las únicas sustancias biológicas que poseen la propiedad de

autoduplicación. Hoy en día, los ácidos nucleicos actúan como depositarios y

transmisores de la información genética de cada célula, tejido y organismo. Existen

dos tipos de ácido nucleico el ARN (ácido ribonucleico) y el ADN (ácido

desoxirribonucleico). Cabe mencionar que estas estructuras son tan importantes que

“Los planos para la construcción de un organismo están codificados en su ácido

Fig. N°7. Identificación de áreas para el conteo

de eritrocitos y leucocitos.




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nucleico” [2, p. 95] en moléculas de gran tamaño como la que se muestra en la Fig. N°

8.

Gran parte del desarrollo físico de un organismo a lo largo de su vida está

programado en estas moléculas. Las proteínas que elaboran sus células y las funciones

que realizarán están todas registradas en esta “cinta” molecular [2]. Por ello el estudio

de sus propiedades, de su estructura, entre otras características, ha sido de gran

interés para la ciencia, a continuación brevemente se hará un recuento de la

investigación evolutiva de estas estructuras ADN y ARN hasta la actualidad.

Desde finales de los años 50 y la década de los 60, los investigadores en busca

del origen de la vida admiten cada vez más la naturaleza específica y compleja de la

vida unicelular y de las biomacromoléculas de las que dependen esos sistemas.

Además, estos investigadores han caracterizado esta complejidad y especificidad en

términos de información. Haciendo referencia al ADN, ARN y a las proteínas como

portadores o depósitos de “información”. Infiriendo que la vida se origino de la

información contenida en estas biomacromoléculas [12].

Durante gran parte del siglo XX, ya los investigadores conocían la composición

química del ADN, sabían que además de fosfatos, el ADN se componía de cuatro bases

nucleotídicas diferentes, llamadas adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C), y

que el ARN difería con respecto al ADN en que la T estaba reemplazada por (U)

uracilo, en la Fig. N°9, se muestra las estructuras de las unidades monoméricas del

ADN Y ARN. En 1909, el químico P. A. Levene propuso que las cuatro bases

Fig.N°8. ADN de un solo cromosoma humano [18]




17

nucleotídicas siempre se daban en cantidades iguales dentro de la molécula de ADN.

Él formuló lo que llamó la “hipótesis tetranucleotídica”, luego está más tarde resultó

incorrecta [12].

Como consecuencia esta concepción comenzó a cambiar a mediados de los años

40 por varias razones. En primer lugar, los famosos experimentos de Oswald Avery

fueron cruciales ya que apuntaron al ADN como material genético, debido a que los

estudios sobre cepas virulentas y no virulentas de Pneumococcos identificaron el ADN

como un factor clave a la hora de explicar las diferencias hereditarias entre distintas

estirpes bacterianas. En segundo lugar, Erwin Chargaff, de la Universidad de

Columbia, a finales de los años 40 puso en duda la “hipótesis tetranucleotídica”.

Chargaff demostró, en contradicción con los primeros trabajos de Levene, que las

frecuencias de nucleótidos difieren realmente entre especies, incluso cuando a

menudo dichas frecuencias se mantienen constantes dentro de las mismas especies o

dentro de los mismos órganos o tejidos de un único organismo [2, 12]

Y por último mediante estos experimentos se había llegado a la conclusión de

que el ADN era una sustancia genética, surgiendo así nuevas preguntas, ¿Cómo podría

transmitir esa información a la célula?, Esta respuesta fue encontrada tras el

Fig.N°9. Estructuras químicas [2]




18

descubrimiento de la estructura tridimensional del ADN por Watson y Crick en 1953.

El modelo propuesto por Watson y Crick concebía “una estructura de doble hélice

para explicar la forma de cruz de Malta de los patrones obtenidos por los estudios del

ADN realizados por Franklin, Wilkins y Bragg a comienzos de los años 50 mediante

cristalografía de rayos X” en la Fig. N°10 , se muestra una fotografía de difracción de

rayos X producido por fibras de ADN húmedas [2, 12]

De acuerdo con el modelo de Watson y Crick, ahora bien conocido, las dos

hebras de la hélice estaban hechas de moléculas de azúcar y fosfato unidas por enlaces

fosfodiéster. Las bases nucleotídicas estaban unidas horizontalmente a los azúcares en

cada una de las hebras de la hélice y a una base complementaria de la otra hebra para

formar un “peldaño” interno en una “escalera” torsionada. Por razones geométricas,

su modelo requería el apareamiento (a lo largo de la hélice) de adenina con timina y

de citosina con guanina [12]

Estos descubrimientos pronto demostraron que las secuencias de ADN no solo

eran muy complejas sino también altamente específicas en lo relativo a sus

requerimientos biológico-funcionales. El descubrimiento de la complejidad y la

especificidad de las proteínas habían llevado a los investigadores a sospechar un

papel funcional específico para el ADN. La estructura del ADN descubierta por Watson

y Crick sugería un medio por el que la información o la especificidad podían

codificarse a lo largo de la espiral del esqueleto de azúcar-fosfato. Su modelo sugería

que las variaciones en la secuencia de bases nucleotídicas pudieran encontrar

Fig.N°10. Pruebas sobre la esctructura del ADN [2]




19

expresión en la secuencia de aminoácidos que forman las proteínas. La hipótesis de

secuencia sugería que las bases nucleotídicas en el ADN funcionaban como letras de

un alfabeto o caracteres en una máquina de codificar. Del mismo modo como las letras

de un alfabeto en un lenguaje escrito pueden realizar la función de comunicación

dependiendo de su secuencia, igualmente podrían las bases nucleotídicas del ADN

originar la producción de una molécula funcional de proteína dependiendo de su

preciso ordenamiento secuencial [2, 12]

Por otro lado los ácidos nucleicos mencionados anteriormente ADN y ADN están

involucrados en la síntesis de proteínas o “expresión génica” la cual consistía en

primer lugar en la copia de largas cadenas de bases nucleotídicas durante un proceso

conocido como transcripción. Es decir, para que la información contenida en el ADN

pueda ser utilizada por las células debe transcribirse a una molécula de ARN, donde la

molécula de ARN se copia fielmente a partir de la molécula de ADN. La copia

resultante, un “transcrito”, fabrica una hebra sencilla de “ARN mensajero” que ahora

contenía una secuencia de bases de ARN que refleja con precisión la secuencia de

bases de la hebra original de ADN. El transcrito es entonces transportado hasta un

orgánulo complejo denominado ribosoma. En el ribosoma, el transcrito es “traducido”

con ayuda de moléculas adaptadoras altamente específicas (llamadas ARN-

transferentes) y de enzimas específicas (llamadas aminoacil ARNt sintetasas) para

producir una cadena de aminoácidos en crecimiento [12]

Se puede inferir de lo antes mencionado que un gen está compuesto, por una

secuencia lineal de nucleótidos en el ADN, dicha secuencia determina el orden de los

aminoácidos en las proteínas. Sin embargo el ADN no proporciona directamente de

inmediato la información para el ordenamiento de los aminoácidos y su

polimerización, sino que lo hace a través de otras moléculas, los ARN.

Como se ha mencionado anteriormente, la ciencia ha seguido una investigación

constante acerca de estas biomoléculas como son el ADN, ARN y las proteínas, por

nombrar algunas de las tecnologías que se están utilizando actualmente, se




20

encuentran: seguimiento óptico de nanopartículas de sílice modificado

orgánicamente, como vehículos de ADN: Un enfoque no viral de la nanomedicina para

la entrega de genes [13]. Estudio de Nanoparticulas bioconjugadas para la protección

del ADN de escisión, la ingeniería genética ha traído consigo nuevos retos y

oportunidades para la medicina y la investigación biomédica. Sin embargo, la

ingeniería genética la tecnología está limitada en las manipulaciones de ADN porque

sus hebras se escinden en entornos celulares. Aunque se han tomado algunas medidas

para proteger el ADN de la escisión, tales como la adición de inhibidores en soluciones

de ADN y este atrapado en liposomas, estos métodos pueden dificultar aún más la

manipulación de ADN, por ello los nanomateriales con propiedades únicas como gran

superficie de área, estructura de poros, efecto encajado, y el efecto del tamaño; han

sido utilizados con eficacia en bioanálisis y la administración de fármacos. Es por lo

tanto que utilizando estos se espera puedan proteger a las secuencias de ADN

incrustados debido a sus grandes estructuras de superficie y poros [14], la Fig. N°11,

muestra una micrografía correspondiente a las nanoparticulas utilizadas en este

estudio.

Otras investigaciones utilizan dendrímeros que forman complejos con el ADN en

la utilización de vectores no virales en la liberación de material genético. Los

dendrímeros son polímeros que presentan estructuras con dimensiones

Fig.N°11. Imagen TEM de las nanopartículas de sílice modificada

con amino (45 ± 4) nm [14]




21

nanométricas, baja polidispersión y una alta densidad funcional en la superficie con

un pequeño volumen molecular. La Fig. N°12 muestra un esquema del mecanismo de

acción del complejo dendrímero-plásmido ADN el cual se inicia con una interacción

entre el complejo y la membrana celular

seguida de una endocitosis dependiente de

energía. El ADN o el complejo debe salir de la

cavidad endosómica-lisosómica, sin que se

produzca la degradación ácida o enzimática,

y alcanzar el núcleo en donde se produce la

transcripción sobre el mRNA y éste en el

citosol codifica la proteína terapéutica [15, 16]

4.1 Tecnología (PCR) para generar copias de secuencias de ADN

Las técnicas de biología molecular actuales están basadas en la manipulación y

detección de gran número de moléculas y los pasos para realizar proyectos consisten

en la amplificación de secuencias de ADN [17].

Tradicionalmente, la amplificación del ADN se ha realizado in vivo, mediante un

proceso conocido de forma genérica como clonación. Ésta abarca la manipulación,

replicación del ADN y la transformación de células con dicho ADN, hasta alcanzar un

número suficiente que permita su estudio por las técnicas clásicas [17].

Sin embargo estos estudios presentan como desventaja que con llevan procesos

muy laboriosos. Actualmente se ha empleado como tecnología la amplificación de ADN

mediante nuevos métodos de secuenciación como lo es la llamada Reacción en Cadena

de la Polimerasa (PCR; del inglés, “Polymerase Chain Reaction”). Se puede considerar

la PCR como una clonación in vitro, ya que se puede amplificar en un tubo de ensayo

Fig.N°12. Representación esquemática

de la internalización celular de

plásmidos asociados a dendrímeros y

transcripción de la proteína terapéutica.




22

una secuencia de DNA determinada muchas veces y además en un tiempo mínimo de

horas o incluso minutos. La PCR puede sustituir a la clonación in vivo clásica en

muchos casos, siendo en otros un aliado esencial para simplificar el proceso e

incrementar la probabilidad de éxito [17, 18].

Abarcando un poco de historia en 1985, el químico Kary Mullis desarrolló la

técnica PCR permitiendo la amplificación exponencial de una molécula de ADN,

generando millones de copias de un fragmento. Esto se lleva a cabo con

oligonucleótidos que contienen un grupo extremo 3´ libre, que es complementario con

la cadena molde de ADN. Los “oligos” funcionan como punto de inicio para la adición

de nucleótidos y para copiar la cadena molde en el PCR. Una vez que el

oligonucleótido se une a su blanco, la polimerasa de ADN puede seguir extendiendo la

hebra complementaria. En una reacción típica de PCR se usan dos oligonucleótidos

que flanquean la región de ADN que se desea amplificar. El número de copias del

fragmento de ADN que se encuentra entre los dos oligonucleotidos se amplifica con

varios ciclos de reacción. Cada ciclo de una reacción de PCR consta de tres pasos,

como se muestra en la Fig. N°13. Estos tres pasos de desnaturalización, hibridación y

polimerización se repiten “n” veces, duplicándose en cada ciclo el número de cadenas

delimitadas por los oligos [18].

Fig.N°13. Ciclo de reacción de PCR [18].




23

4.1.1 Pasos del método de secuenciación PCR

- Desnaturalización: “El templado es el fragmento de ADN que se desea

amplificar, junto con la región que reconocen los oligonucleótidos. Para que

el oligonucleótido se pueda unir, es necesario que el templado sea de cadena

sencilla” (9 pág. 23). Es decir, este paso es para separar las cadenas de ADN,

esto se consigue incrementando la temperatura, con una incubación breve

del tubo de reacción a 94 ºC [17].

- Hibridación o apareamiento de los oligos al DNA molde. Para ello se baja la

temperatura de reacción, de forma que pequeñas secuencias de ADN se unan

a sus secuencias complementarias [17, 18].

- Extensión de la cadena de ADN: Se consigue elevando la temperatura de

reacción normalmente a 72°C, la cual es óptima para la polimerasa de DNA.

En este paso, la polimerasa extiende la cadena complementaria del templado.

La síntesis de la cadena complementaria tiene como punto de inicio el

complejo oligonucleótido/templado. El tiempo de incubación de este paso

depende del tamaño del segmento que se desea amplificar. El resultado son

dos hélices completas Watson & Crick en la región delimitada por los oligos.

Por lo cual se puede inferir que se duplica el número inicial de moléculas de

ADN [17, 18].

Actualmente esta técnica tiene gran importancia en biología molecular para

amplificar secuencias de ADN que luego son fácilmente clonadas y/o secuenciadas.

Asimismo, tiene otras múltiples y muy interesantes aplicaciones. Por ejemplo, para

generar mutaciones aleatorias o dirigidas; identificar genes expresados de forma

diferencial; rastrear rápida y eficientemente bibliotecas génicas; construcción de

bibliotecas sustractivas de cDNA (“subtractive cDNA libraries”); secuenciar mediante

secuenciación cíclica; entre otras [17].




24

5. Conclusiones

La Hematología es una rama esencial para el desarrollo en el diagnóstico de

enfermedades y anomalías relacionadas con la sangre, el fluido más importante,

después del agua, en nuestro cuerpo; por tanto su estudio conlleva a una mejor

comprensión de todos los parámetros y variables relacionados con la sangre.

Obtener herramientas para la interpretación de los hemogramas es otra parte

fundamental de los estudios en hematología, así como las técnicas analíticas

necesarias para el análisis cuantitativo y cualitativo de las diferentes células que

componente la sangre, todo esto mediante la citometria hemática, o biometría

hemática completa

Otra parte importante de nuestro funcionamiento como seres humanos, a parte

de los fluidos sanguinos, son las proteínas, las funciones de éstas en nuestro

organismo son de suma importancia y vienen dictadas por las secuencias de

aminoácidos, y estas a su vez dependen de la secuencia de bases de ADN, ya que las

secuencias de las regiones codificantes del ADN poseen un alto grado de especificidad.

El ADN se copia a ARN en un proceso que se llama "transcripción", se puede

inferir que transcribe un texto, es decir lee y lo copia, pero no se copia a otra molécula

de ADN sino a una molécula de ARN. Estas moléculas, luego, van a ser "leídas" por un

ribosoma, en un proceso llamado "traducción".




25

6. Bibliografía

[1] J. San Miguel y F. Sanchez-Guijo, Hematologia: Manual Basico Razonado,

Barcelona: Elsevier, 2009.

[2] C. Mathews, K. Holde y A. K, Bioquímica, España: Pearson, 2008.

[3] J. A. Méndez Aranguren y colaboradores, «Los microsatélites (STR´s), marcadores

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revisión,» vol. 13, nº 1, pp. 30-42, 2005.

[4] J. Palomo, J. Pereira y J. Palma, Hematologia: Fisiopatologia y Diagnostico, Talca:

Editorial Universidad de Talca, 2009.

[5] R. Tallitsch, M. Frederic y T. Michael, Human anatomy, San Francisco:

Pearson/Benjamin Cummings, 2006.

[6] J. Pereira, «Estructura, producción, cinética y función de las plaquetas,» de

Fisiología de la sangre, Universitaria, 1993.

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[8] E. Anne, Clinical Hematology principles, procedures, correlations, Ed. Lippincott

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Barcelona, Editorial Medica Panamericana, 2009, pp. 13-32.

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Facultad de Medicina de la UNAM , vol. 53, nº 4, pp. 36-43, 2010.

[11] R. Argüelles, Fundamentos de Hematologia, Barcelona: Editorial Medica

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[12] S. C. Meyer, «El ADN y el Origen de la Vida: Información, Especificidad y

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[15] V. Jato y J. Luis, «NANOTECNOLOGÍA FARMACÉUTICA: UNA GALÉNICA

EMERGENTE,» 2006.

[16] S. L. Pal y colaboradores, «Nanoparticle: An overview of preparation and




26

characterization,» vol. 1, nº 6, pp. 228-234, 2011.

[17] G. D. Pérez, «Amplificación de DNA mediante PCR (Reacción en Cadena de la

Polimerasa)».

[18] R. Campion De Necochea, «Métodfos Fisicoquímicos en Biología: Secuenciación

de Ácidos Nucleicos,» 2004.

Contenido

1. Introducción ........................................................................................................................................ 1

2. Hematología Básica .......................................................................................................................... 2

2.1 Sangre y sus componentes ..................................................................................................... 2

2.2 Análisis y recolección de muestras de sangre ................................................................ 5

2.2.1 Tipos de recolección ........................................................................................................ 7

2.2.2 Almacenamiento y transporte de muestras de sangre ...................................... 9

2.2.3 Tinción de May Grünwald-Giemsa ............................................................................. 9

2.3 Hemograma .............................................................................................................................. 10

3. Citometría Hemática .................................................................................................................... 13

3.1 Determinación de Hematocrito ........................................................................................ 14

3.2 Determinación de Leucocitos ............................................................................................ 15

4. ADN y ARN ........................................................................................................................................ 15

4.1 Tecnología (PCR) para generar copias de secuencias de ADN ............................ 21

4.1.1 Pasos del método de secuenciación PCR .............................................................. 23

5. Conclusiones .................................................................................................................................... 24

6. Bibliografía........................................................................................................................................ 25

16 de enero de 2015

Hematología Básica

ADN

ARN

Trabajo N°1. Bioquímica II:

Realizan:

- T.S.U Castillo, Yaviely

- T.S.U Centeno, Bárbara

Profesor(a)

- Lic. Carolina Pérez

Trabajo de Bioquimica_Hematologia-ADN

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