TRANSFECCIONES II Biología Molecular 2009 Viernes 22 mayo.
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TRANSFECCIONES II
Biología Molecular 2009
Viernes 22 mayo
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Interacción de proteínas:Doble híbrido en células de levaduras
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pAD
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pBD
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Plásmidos reporteros
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Interacción de proteínas:Doble híbrido en células de mamífero
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pBIND
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pACT
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pG5/luc
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Ejemplo de resultados
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Enriquecimiento de transfectantes
• Cell sorting
Cotransfectando con vectores de expresión para GFP o proteínas de membrana que sean reconocidas por Ac-fluorescentes
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Transfección estable
• Por integración• Por recombinación homóloga• Como episoma
• Requiere de un marcador de selección en el vector
• Util para estudios que impliquen inducción de la expresión
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Marcadores de selección eucariontes
• Agent Action Marker Gene
• Blasticidin S Inhiben síntesis BlasticidinS deaminase• Hygromycin B proteica Gen hyg o hph • Puromycin• G-418 Neomycin phosphotransferase• Zeocina Intercalante del DNA gen Sh ble, se une • MTX Inhibits DNA syn. Dihydrofolate reductase
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Marcadores de selección
• G418 (Geneticina)– Bloquea la traducción– La resistencia es la neomicina fosfotransferasa ( Neor )– Para células de mamífero, plantas y levaduras
• Zeocina - Antibiótico de la familia bleomicina - Cliva el DNA - El producto del gen ble se une e impide el pegado al DNA. -de amplio espectro (mamíferos, levaduras y bacterias)
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Sistema reprimible por tetraciclina
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Sistema inducible por tetraciclina
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Vector de expresión del regulador
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Vector de expresión del regulador
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Vector de clonado del gen de interés
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Vector de expresión para dos genes regulados por tet
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Vector episomal
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Sistema de recombinación homóloga
• Flp-in Invitrogen: Recombinación sitio específica de Saccharomyces cerevisiae
• Sitio FRT (Flp recombination target)• Recombinasa Flp
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Vector que contiene el sitio FRT
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Pasos de recombinación homóloga
1- Generar línea que posea el sitio FRT
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Vector de clonado del gen de interés
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Vector de clonado del gen de interés
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Vector de expresión de la recombinasa
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2- Cotransfectar con vector con gen de interés y vector de expresión para recombinasa
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Resultado
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Disminuir expresión de un gen
-Ribozimas
aaaaa--------auucg--------ccguuua--------uaagc-- ggcaaau----
cDNA
ribozima
Clivado del mRNA blanco
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-Antisentido
aaaaa----------------caaucggccccuucguuua----gttagccggggaagcaaat
1-Oligonucleótido pequeño simple cadena (15 -25 bases)
Degradación por RNAsa del híbrido RNA/DNA
Disminuir expresión de un gen
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cDNA
aaaaaa5’ 3’a b c
2- Síntesis de un RNA antisentido complementario al gen blanco.
a’ b’ c’
mRNA
Degradación por RNAsa del híbrido RNA/RNA
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Disminuir expresión de un gen
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Síntesis in vitro
• Síntesis química
• Transcripción in vitro
• Digestión de los dsRNA por RNase III/DICER
Expression in vivo
• Plásmidos
• Templados para PCR (cassette de expresión siRNA)
• Vectores virales
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-RNAi (siRNA)
Clivado del mRNA blanco
aaaaa----------------caaucggccccuucguuua----
guuagccggggaagcaaau auuugcuuccccggcuaacRNAi(30 a 50 nucleotidos)
mRNA
a) Síntesis
b) cDNA
Degradación por RNAsa
Procesados por la maquinaria celular (dicer…)
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Estrategias siRNA
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Expresión de siRNA in vivo
Promotor/Enhancer
• • Pol III (U6, H1)
• • Pol II (CMV)
Secuencia de terminación• Pol III: string of 3-5T’s)Señal de poly(A) SV40
siRNA TempladoTemplado para cadenas sense , hairpin y antisense del siRNA
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Vector siRNA
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Vectores Plasmídicos
Expresión transiente
• No se trabaja con RNA
• Produce gran cantidad de vector
• Enriquecimiento de células transfectadas por sorting o selección
Expresión Estable (marcadores de selección)
• Produce líneas estables
• Animales transgénicos
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Vectores múltiples siRNA
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Vectores múltiples siRNA
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![Page 44: TRANSFECCIONES II Biología Molecular 2009 Viernes 22 mayo.](https://reader035.fdocuments.es/reader035/viewer/2022062222/5665b47a1a28abb57c91d0ce/html5/thumbnails/44.jpg)
Control siRNA
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![Page 46: TRANSFECCIONES II Biología Molecular 2009 Viernes 22 mayo.](https://reader035.fdocuments.es/reader035/viewer/2022062222/5665b47a1a28abb57c91d0ce/html5/thumbnails/46.jpg)
Bibliotecas siRNA
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Diseño del experimento
![Page 48: TRANSFECCIONES II Biología Molecular 2009 Viernes 22 mayo.](https://reader035.fdocuments.es/reader035/viewer/2022062222/5665b47a1a28abb57c91d0ce/html5/thumbnails/48.jpg)
Diseño del experimento
![Page 49: TRANSFECCIONES II Biología Molecular 2009 Viernes 22 mayo.](https://reader035.fdocuments.es/reader035/viewer/2022062222/5665b47a1a28abb57c91d0ce/html5/thumbnails/49.jpg)
Bibliotecas siRNA: ejemplo
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Bibliotecas siRNA: ejemplo
![Page 51: TRANSFECCIONES II Biología Molecular 2009 Viernes 22 mayo.](https://reader035.fdocuments.es/reader035/viewer/2022062222/5665b47a1a28abb57c91d0ce/html5/thumbnails/51.jpg)
Bibliotecas siRNA: ejemplo