UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR CARRERA DE …€¦ · TERMALES DEL CANTÓN BAÑOS Y SUS POSIBLES...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERÍA EN GEOLOGÍA, MINAS, PETRÓLEOS Y AMBIENTAL

CARRERA DE INGENIERÍA AMBIENTAL

CARACTERIZACIÓN BIOTECNOLÓGICA DE BACTERIAS AISLADAS DE AGUAS

TERMALES DEL CANTÓN BAÑOS Y SUS POSIBLES APLICACIONES

INDUSTRIALES

TRABAJO DE TITULACIÓN, MODALIDAD PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PARA

LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA AMBIENTAL

AUTOR: MARÍA JOSÉ AGUIRRE ZAMBRANO

TUTOR: Dr. FÉLIX DANIEL ANDUEZA LEAL, MSc, PhD

QUITO

2018

v

APROBACIÓN DEL TRABAJO POR PARTE DEL TRIBUNAL

El delgado del Subdecano y los Miembros del tribunal calificador del trabajo de titulación,

modalidad proyecto de investigación: “CARACTERIZACIÓN BIOTECNOLÓGICA DE

BACTERIAS AISLADAS DE AGUAS TERMALES DEL CANTÓN BAÑOS Y SUS

POSIBLES APLICACIONES INDUSTRIALES”, preparado por la señorita MARÍA JOSÉ

AGUIRRE ZAMBRANO, egresada de la carrera de Ingeniería Ambiental, declaran que

el presente proyecto ha sido revisado, verificado y evaluado detenidamente,

calificándose como original y auténtico de la autora.

En la ciudad de Quito DM a los 16 días del mes de marzo de 2018.

______________________________

Ing. Paúl Malacatus, MSc

DELEGADO DEL SUBDECANO

________________ ________________

Dr. Carlos Ordoñez, MSc. Prof. Yonathan Parra, Dr.

MIEMBRO MIEMBRO

vi

A Dios por brindarme sabiduría y entendimiento

todos los días de mi vida.

A mis padres, Xavier Aguirre y Norma Zambrano

por brindarme todo su amor, sacrificio, apoyo

incondicional y ser el pilar fundamental para hoy

poder culminar esta etapa de mi vida.

A mis hermanos Darío Aguirre y María Sol

Aguirre a quienes amo grandemente y ser

ejemplos de perseverancia para conseguir todo

lo anhelado.

A Zuleyka Plaza por su cariño y sabios consejos

motivándome a ser mejor cada día.

María José

vii

AGRADECIMIENTOS

La autora expresa su agradecimiento a:

Félix Andueza Leal, Doctor en Biología, por dedicar su tiempo, conocimientos y

experiencia, siendo esencial en la realización y culminación de la presente investigación.

Andrés Granda, Ingeniero en Alimentos e Instructor en el Centro de Biología de la

Universidad Central del Ecuador, por su apoyo, asesoramiento y colaboración constante

en la realización de los ensayos y análisis microbiológicos contenidos en este trabajo.

Héctor Geovanny Villacres, Inspector de Servicios Municipales del Gobierno Autónomo

Descentralizado Municipal del cantón Baños de Agua Santa, por su apoyo a la

realización del proyecto, dentro del establecimiento a su cargo.

Demás familiares y amigos que de una u otra manera colaboraron para la elaboración

de este trabajo además de compartir momentos inolvidables.

María José

viii

CONTENIDO

LISTA DE TABLAS ..................................................................................................... xii

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................. xiv

LISTA DE ANEXOS ................................................................................................... xv

GLOSARIO ................................................................................................................ xvi

ABREVIATURAS ..................................................................................................... xviii

RESUMEN .................................................................................................................. xix

ABSTRACT ................................................................................................................ xx

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1

1. MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 3

1.1. Aguas Termales ........................................................................................................ 3

1.2. Microorganismos en biotecnología……………………………………………..7

1.2.1. Las bacterias .......................................................................................... 7

1.2.2. Microorganismos extremófilos ........................................................... 12

1.3. Tipos de microorganismos en aguas termales ……………………….......18

1.3.1 Microorganismos autóctonos……………………………………………18

1.3.2. Microorganismos alóctonos ............................................................... 19

1.4. Cultivo bacteriano .................................................................................................. 20

1.4.1. Medios de cultivo................................................................................. 20

1.5. Recuento de microorganismos .......................................................................... 22

1.5.1. Placas 3M Petrifilm .............................................................................. 23

1.6. Morfología bacteriana macro y microscópica ................................................ 25

1.6.1. Morfología macroscópica: Estudio de la forma y estructura de las

colonias .............................................................................................................. 25

1.6.2. Morfología microscópica: Estudio de la estructura de las

bacterias…. ........................................................................................................ 26

1.7. Pruebas bioquímicas para la identificación bacteriana ............................... 28

Págs

.

ix

1.8. Pruebas de susceptibilidad ................................................................................. 30

1.9. Diversidad y estabilidad de las comunidades microbianas ....................... 30

1.9.1. Índices de diversidad de especies ..................................................... 31

1.10. Aguas termo-minerales de Baños de Agua Santa ......................................... 32

1.10.1. Aguas termo-minerales del Balneario Ecológico “Santa Ana” ..... 33

2. METODOLOGÍA .................................................................................................. 34

2.1. Lugar de investigación ......................................................................................... 34

2.2. Materiales, equipos y medios de cultivo .......................................................... 35

2.2.1. Materiales ............................................................................................. 35

2.2.2. Equipos y reactivos ............................................................................. 35

2.2.3. Medios de cultivo................................................................................. 36

2.3. Muestreo ................................................................................................................... 36

2.4. Ensayos fisicoquímicos “in situ”....................................................................... 37

2.5. Análisis microbiológico ........................................................................................ 37

2.5.1. Recuento bacteriano ........................................................................... 38

2.6. Caracterización macroscópica de colonias .................................................... 39

2.7. Purificación de los aislados bacterianos ......................................................... 39

2.8. Identificación de microorganismos ................................................................... 40

2.8.1. Tinción Gram ....................................................................................... 40

2.8.2. Pruebas bioquímicas ........................................................................... 40

2.9. Caracterización biotecnológica de cepas identificadas .............................. 48

2.10. Índice de diversidad microbiana ........................................................................ 52

2.11. Sensibilidad antimicrobiana ................................................................................ 52

3. RESULTADOS .................................................................................................... 54

3.1. Parámetros fisicoquímicos “in situ” ................................................................. 54

3.2. Recuento bacteriano ............................................................................................. 57

3.2.1. Cuantificación de aerobios mesófilos ................................................ 57

Págs

.

x

3.2.2. Cuantificación de coliformes totales (UFC/ml) .................................. 58

3.2.3. Cuantificación de mohos y levaduras (UFC/ml) ................................ 59

3.2.4. Cuantificación de Pseudomonas (UFC/ml) ........................................ 60

3.3. Resultados de las propiedades tintoreales de las bacterias aisladas del

balneario “Santa Ana” ...................................................................................................... 61

3.3.1. Resultados de la tinción Gram de las bacterias aisladas ................. 61

3.4. Resultados de las pruebas bioquímicas .......................................................... 63

3.4.1. Bacterias Gram negativas ................................................................... 63

3.4.2. Bacterias Gram positivas .................................................................... 65

3.5. Género y especies bacterianas identificadas de las colonias aisladas del

balneario “Santa Ana” ...................................................................................................... 66

3.5.1. Géneros y especies de bacterias identificados ................................. 66

3.5.2. Porcentaje de especies bacterianas identificadas ............................ 67

3.6. Caracterización biotecnológica de las especies bacterianas aisladas e

identificadas ........................................................................................................................ 68

3.7. Cálculo del índice de diversidad microbiana .................................................. 69


4. DISCUSIÓN ......................................................................................................... 71

4.1. Parámetros fisicoquímicos “in situ” ................................................................. 71

4.2. Recuento bacteriano ............................................................................................. 73

4.2.1. Cuantificación de aerobios mesófilos ................................................ 73

4.2.2. Cuantificación del número de bacterias coliformes totales ............. 74

4.2.3. Cuantificación de mohos y levaduras ................................................ 75

4.2.4. Cuantificación de Pseudomonas ........................................................ 76

4.3. Propiedades tintoreales de las colonias aisladas del balneario “Santa

Ana” …………………………………....………………………………………………………………………………………..78

4.4. Especies identificadas de las bacterias aisladas del balneario “Santa

Ana” ………………………………………………………………………………………………………………….………….79

Págs

.

xi

4.5. Caracterización biotecnológica .......................................................................... 81


4.7. Índice de diversidad microbiana ........................................................................ 84

5. CONCLUSIONES ................................................................................................ 85

6. RECOMENDACIONES ........................................................................................ 88

7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 89

Págs

.

xii

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Temperatura optima de crecimiento bacteriano según el tipo de bacteria ..... 10

Tabla 2. pH óptimo de crecimiento bacteriano según el tipo de bacteria ..................... 10

Tabla 3. Clasificación de los microorganismos en función de su temperatura óptima de

crecimiento ................................................................................................................. 13

Tabla 4. Reacciones de bioconversión y aplicaciones de enzimas termoestables ...... 13

Tabla 5. Microorganismos en la industria .................................................................... 17

Tabla 6. Medios de cultivo para la identificación bacteriana ........................................ 29

Tabla 7. Índices de diversidad de especies ................................................................. 31

Tabla 8. Índice de diversidad de Shannon-Weaver ..................................................... 32

Tabla 9. Balance iónico del balneario "Santa Ana" ..................................................... 33

Tabla 10. Materiales utilizados .................................................................................... 35

Tabla 11. Equipos y reactivos utilizados ..................................................................... 35

Tabla 12. Medios de cultivo utilizados ......................................................................... 36

Tabla 13. Composición del medio mínimo .................................................................. 48

Tabla 14. Fuentes de carbono para el medio mínimo ................................................. 48

Tabla 15. Composición química del medio de cultivo para bacterias celulolíticas ....... 49

Tabla 16. Composición química del medio de cultivo para bacterias lipolíticas ........... 49

Tabla 17. Composición química del medio de cultivo para bacterias proteolíticas ...... 50

Tabla 18. Composición química del medio de cultivo para bacterias amilolíticas ........ 50

Tabla 19. Composición química del medio de cultivo para bacterias degradadoras de

petróleo....................................................................................................................... 51

Tabla 20. Interpretación de resultados para la caracterización biotecnológica ............ 51

Tabla 21. Antibiograma de discos. Interpretación de resultados ................................. 53

Tabla 22. Parámetros fisicoquímicos “in situ” del primer muestreo del balneario “Santa

Ana” ............................................................................................................................ 54

Tabla 23. Parámetros fisicoquímicos “in situ” del segundo muestreo del balneario

“Santa Ana” ................................................................................................................ 55

Tabla 24. Parámetros fisicoquímicos “in situ” del tercer muestreo del balneario “Santa

Ana” ............................................................................................................................ 55

Tabla 25. Parámetros fisicoquímicos promedios “in situ” del balneario “Santa Ana” ... 56

Tabla 26. Resultado de la cuantificación de aerobios mesófilos totales (UFC/ml) del

balneario “Santa Ana” ................................................................................................. 57

Págs

.

xiii

Tabla 27. Resultado de la cuantificación de coliformes totales del balneario “Santa

Ana” (UFC/ml)............................................................................................................. 58

Tabla 28. Resultado de la cuantificación de mohos y levaduras del balneario “Santa

Ana” ............................................................................................................................ 59

Tabla 29. Resultado de la cuantificación de Pseudomonas del balneario “Santa Ana”

(UFC/ml) ..................................................................................................................... 60

Tabla 30. Resultados de la cuantificación de bacterias Gram positivas y Gram

negativas del balneario “Santa Ana” ........................................................................... 61

Tabla 31. Resultados de las pruebas bioquímicas de las cepas bacterianas Gram

negativas del balneario “Santa Ana” ........................................................................... 63

Tabla 32. Resultados de las pruebas bioquímicas de las cepas bacterianas Gram

positivas del balneario “Santa Ana” ............................................................................. 65

Tabla 33. Resultado de la identificación de géneros y especies bacterianos aislados

del balneario "Santa Ana" ........................................................................................... 66

Tabla 34. Caracterización biotecnológica de las especies bacterianas aisladas del

balneario "Santa Ana" ................................................................................................. 68

Tabla 35. Resultado de la riqueza de especies del balneario "Santa Ana" .................. 69

Tabla 36. Resultados de los antibiogramas de las especies bacterianas aisladas del

balneario "Santa Ana" ................................................................................................. 70

Págs

.

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estudio macroscópico de las colonias. ......................................................... 26

Figura 2. Mapa de ubicación del Balneario “Santa Ana” Baños-Tungurahua .............. 33

Figura 3. Instalaciones del Balneario “Santa Ana” Baños-Tungurahua ....................... 34

Figura 4. Resultado del contaje de aerobios mesófilos del balneario “Santa Ana” ...... 57

Figura 5. Resultado del contaje de coliformes totales del balneario “Santa Ana” ........ 58

Figura 6. Resultado del contaje de mohos y levaduras del balneario “Santa Ana” ...... 59

Figura 7. Resultado del contaje de Pseudomonas del balneario “Santa Ana” ............. 61

Figura 8. Porcentaje de microorganismos Gram positivos y Gram negativos en el

balneario “Santa Ana” ................................................................................................. 62

Figura 9. Porcentaje de géneros bacterianos aislados del balneario "Santa Ana" ....... 67

Figura 10. Porcentaje de especies bacterianas aisladas del balneario "Santa Ana" ... 68

Figura 11. Porcentaje de especies bacterianas caracterizadas biotecnológicamente . 69

Págs

.

xv

LISTA DE ANEXOS

Anexo A. Puntos de muestreo .................................................................................. 99

Anexo B. Parámetros fisicoquímicos “in situ” ........................................................... 100

Anexo C. Recuento de microorganismos Coliformes totales/E.coli, mohos y levaduras

en placas 3M Petrifilm. .............................................................................................. 100

Anexo D. Cuantificación de aerobios mesófilos en agar antibiótico y Pseudomonas en

agar centrimida. ........................................................................................................ 100

Anexo E. Cepas puras aisladas en caldo BHI .......................................................... 101

Anexo F. Cepas puras sembrada por estría en agar antibiótico base. ..................... 102

Anexo G. Tinción Gram ............................................................................................ 102

Anexo H. Pruebas bioquímicas ................................................................................ 103

Anexo I. Caracterización biotecnológica................................................................... 105

Anexo J. Sensibilidad antimicrobiana ....................................................................... 106

Anexo K. Cálculo del índice de diversidad microbiana ............................................. 107

Págs

.

xvi

GLOSARIO

AGUA MINERAL NATURAL: agua obtenida de fuentes naturales o perforaciones de

aguas subterráneas, que se caracteriza por la presencia y proporción de sales minerales

y trazas de otros constituyentes necesarios para el metabolismo humano, además de

poseer pureza microbiológica original (Fagundo y González, 2007).

AGUA MINERAL: agua que se origina en acuíferos subterráneos, que difiere de las

demás por presentar un grado de mineralización y son estables en temperatura, caudal,

composición química y microbiota saprofítica (Fagundo y González, 2007).

AGUA MINEROMEDICINAL: agua que por su constitución de características

especiales poseen fines terapéuticos y son de uso público (Hernández y Fagundo, 2006)

AGUA MINERAL TERMAL: agua mineral cuya temperatura de surgencia debe superar

al menos los 4ºC, a la media anual ambiental del lugar donde emergen, permitiendo

utilizar su acción calorífica (Fagundo y González, 2007).

TERMA: proviene de la palabra Thermae-thermarum, que equivaldría al lugar de

surgencia de las aguas calientes o baños de agua caliente (Pérex, 1997).

BALNEARIO: institución sanitaria cuyos tratamientos se basan en el uso de aguas

mineromedicinales declaradas de utilidad pública o fangos aplicados mediante técnicas

hidrotermales diversas según prescripción médica (López y Rubio, 2002).

CRECIMIENTO MICROBIANO: es el aumento del número de microorganismos a lo

largo del tiempo, es decir el crecimiento demográfico de una población (Tortora et al.,

2007).

BIOTECNOLOGÍA: se denomina al uso integrado de la bioquímica, microbiología y

ciencias de la ingeniería para conseguir la capacidad de desarrollar aplicaciones

tecnológicas basadas en microorganismos, cultivos celulares y tisulares (Andocilla,

2003).

METABOLISMO: conjunto de procesos químicos que se desarrollan en su estructura

por medio de los cuales le permite tomar materiales, transformarlos y adaptarlos a sus

necesidades constructivas o a extraer energía de los compuestos directamente tomados

del medio (Andocilla, 2003).

xvii

MICROOGANISMOS SAPRÓFITOS: se consideran a aquellos organismos que viven

libres en la naturaleza y se nutren de materia inorgánica u orgánica no viva (Granados

y Villaverde, 2003).

MUESTREO: es el proceso de tomar una porción, la más representativa, de un volumen

de agua para el análisis de varias características definidas (INEN, 1998a).

MUESTRA PUNTUAL: muestra tomada al azar (con relación al tiempo y/o lugar de un

volumen de agua) (INEN, 1998b).

RESISTOMA: es la colección de todos los genes que pueden contribuir a la resistencia

fenotípica antibiótica (Wright, 2010).

xviii

ABREVIATURAS

% Porcentaje

m.s.n.m Metros sobre el nivel del mar

ºC Grados Celsius

mg/l Miligramos por litro

et al y colaboradores

ml Mililitro

mm Milímetro

UFC/ml Unidades Formadoras de colonia por mililitro

g/l Gramos por litro

O/F Oxidación-Fermentación de la glucosa

µS/cm Micro siemens por centímetro

µg Microgramos

xix

Caracterización biotecnológica de bacterias aisladas de aguas termales del

cantón Baños y sus posibles aplicaciones industriales, modalidad proyecto de

investigación.

RESUMEN

Se realizó el aislamiento y caracterización biotecnológica de las bacterias aisladas de

las aguas termales del balneario “Santa Ana” de Baños de Agua Santa, perteneciente a

la provincia de Tungurahua. Los análisis microbiológicos y biotecnológicos se los realizó

con el objetivo de cuantificar, caracterizar e identificar las bacterias aerobias y

anaerobias facultativas mesófilas presentes en el agua. Para la realización de los

análisis microbiológicos se tomaron muestras puntuales de la fuente, el reservorio y la

piscina del balneario. Se utilizaron métodos de siembra, cultivo y aislamiento

recomendado por las normas ISO (Cano, 2006) y la AOAC (2003), para la identificación

bacteriana se realizaron pruebas bioquímicas siguiendo la metodología de MacFaddin

(2003). En la fuente el número de bacterias aerobias mesófilas fue de 7,97x10 ufc/ml,

en el reservorio 2,9x102 ufc/ml y en la piscina 5,7x102 ufc/ml. Se aislaron 32 cepas

bacterianas de las cuales 9 pertenecieron a la fuente, 11 al reservorio y 12 a la piscina.

Se obtuvo un total de 11 bacterias Gram positivas (34%) y 21 bacterias Gram negativas

(66%). De las cepas bacterianas aisladas se logró identificar los géneros Aeromonas

(22%), Bacillus (13%), Psychrobacter (10%), Pseudomonas (9%), Staphylococcus (9%),

Actinobacillus (6%), Alcaligenes (3%), Peptostreptococcus (3%), Kurthia (3%),

Corynebacterium (3%) y Actinomices (3%) y de miembros de la familia

Enterobacteriaceae (16%). El 23% de las bacterias fueron proteolíticas, 22 % celulíticas,

21% amilolíticas, 18 % lipolíticas y el 16% degradadoras de petróleo. Los números de

especies en el agua termal del balneario indican una mayor riqueza en el último periodo

de muestreo (𝑑3 = 9) con respecto a los periodos anteriores (𝑑1 = 5; 𝑑2 = 5). Los

resultados obtenidos indican que existe un escaso número de bacterias, pero con una

buena diversidad y que contienen bacterias con diversas propiedades biotecnológicas,

las cuales pueden ser utilizadas en el diseño de procesos de biorremediación.

PALABRAS CLAVES: CARACTERIZACIÓN BIOTECNOLÓGICA, AGUA TERMAL,

CUANTIFICAR, IDENTIFICACIÓN BACTERIANA.

xx

Biotechnological characterization of isolated bacteria of thermal waters of canton

Baños and its possible industrial applications, modality research project.

ABSTRACT

The isolation and biotechnological characterization of the bacteria isolated from the

thermal waters of the spa "Santa Ana" of Baños de Agua Santa, belonging to the

province of Tungurahua, was carried out. The microbiological and biotechnological

analyzes were carried out with the objective of quantifying, characterizing and identifying

the facultative mesophilic aerobic and anaerobic bacteria present in the water. For the

realization of the microbiological analyzes, specific samples were taken from the source,

the reservoir and the spa pool. Sowing, cultivation and isolation methods recommended

by ISO (Cano, S., 2006) and AOAC (2003) standards were used. For biochemical

identification, biochemical tests were carried out following the methodology of Mac

Fadding (2004). At the source, the number of mesophilic aerobic bacteria was 7.97x10

ufc/ml, in the reservoir 2.9102 ufc/ml and in the pool 5.7102 ufc/ml. 32 bacterial strains

were isolated of which 9 belonged to the source, 11 to the reservoir and 12 to the pool.

A total of 11 Gram positive bacteria (34%) and 21 Gram negative bacteria (66%) were

obtained. From the isolated bacterial strains it was possible to identify the genera

Aeromonas (22%), Enterobacteriace (16%), Bacillus (13%), Psycrobacter (10%),

Pseudomonas (9%), Staphylococcus (9%), Actinobacillus (6%) ), Alcaligenes (3%),

Peptostreptococcus (3%), Kurthia (3%), Corynebacterium (3%) and Actynomices (3%).

23% of the bacteria were proteolytic, 22% cellulitic, 21% amylolitic, 18% lipolytic and

16% petroleum degraders. The numbers of species in the thermal water of the spa

indicate a greater wealth in the last sampling period (𝑑3 = 9) with respect to the previous

periods (𝑑1 = 5; 𝑑2 = 5).The results obtained indicate that these waters contain bacteria

with diverse biotechnological properties, which can be used in the design of

bioremediation processes.

KEYWORDS: BIOTECHNOLOGICAL CHARACTERIZATION, THERMAL WATER,

QUANTIFYING, BACTERIAL IDENTIFICATION

1

INTRODUCCIÓN

La preservación y el mantenimiento de los recursos naturales que al mismo tiempo

abren la puerta al desarrollo de las diversas actividades humanas en las sociedades

desarrolladas, hoy en día son uno de los retos más importantes del siglo XXI.

A la par, el desarrollo científico y tecnológico en el ámbito de las ciencias de la vida, nos

ha permitido aplicar principios científicos y de ingeniería a la transformación de

materiales por acción de agentes biológicos (microorganismos, enzimas) con el

propósito de proveer a nuestra sociedad de bienes y servicios, siguiendo un objetivo

final de prevenir, mitigar o eliminar la presencia de compuestos contaminantes en el

medio ambiente (Blanch, 2007).

La necesidad de utilizar la biodegradación microbiana ha hecho que la biotecnología

ambiental se alineara a aislar microorganismos del medio ambiente, clasificarlos y

caracterizarlos fisiológicamente, analizar sus capacidades enzimáticas degradadoras,

para desarrollar procesos tecnológicamente aplicables a gran escala, y aspirar, en

determinados casos, una mejora genética de los microorganismos utilizados con el fin

de obtener cepas más eficientes en la degradación de compuestos orgánicos

contaminantes (Blanch, 2010).

El Ecuador es una de las 17 regiones de mayor mega diversidad en el mundo, contando

con la presencia de aguas termales y minerales localizadas principalmente en el callejón

interandino, ecosistema que, de ser investigado, puede constituirse en una fuente de

nuevos agentes biológicos, con aplicaciones a nivel industrial, farmacéutico, ecológico,

en sistemas de biorremediación, entre otros, siendo un enorme potencial de riqueza,

valor y bienestar (Burbano et al., 2013; Proecuador, 2013).

Aparte de los beneficios turísticos y medicinales que aportan las aguas termales y

minerales, estas presentan condiciones ambientales adecuadas para el crecimiento de

una gran diversidad de microorganismos autóctonos que son característicos de cada

tipo de agua dependiendo de sus propiedades fisicoquímicas (temperatura, pH,

composición).

En este tipo de ambientes extremos predominan las bacterias heterótrofas de los

géneros: Pseudomonas, Acinetobacter, Enterobacter, Micrococcus, Bacillus,

2

Staphylococcus y Arthrobacter, teniendo en menor proporción microorganismos

autótrofos (quimilitótrofos y fotótrofos) (De la Rosa y Mosso, 2000).

La biotecnología, ha intentado mejorar los procesos industriales utilizando la

microbiología como campo principal de su desempeño, basándose en la capacidad

asimiladora de microorganismos frente a diversas fuentes de carbono, evaluando

actividades lipolíticas, celulolíticas, proteolíticas, amilolíticas y degradadoras de

petróleo. Por lo que es preciso levantar información respecto a esta microbiota

bacteriana, analizar y sentar las bases para que abra el camino al desarrollo de nuevas

aplicaciones biotecnológicas en el control de los contaminantes, la regulación del ciclo

de los elementos, la gestión de los recursos hídricos y energéticos y la mejora de la

situación sanitaria (Blanch, 2010).

Por otro lado, la importancia de estas actividades enzimáticas radica en que las enzimas

producidas por estos microorganismos catalizan reacciones bioquímicas a altas

temperaturas, incrementando de esta manera el rendimiento de los procesos

industriales y disminuyendo el costo de producción (Labrador, 2006).

Es por ello, que el presente trabajo cuenta como principal objetivo estudiar desde un

punto de vista microbiológico y biotecnológico los microorganismos presentes en las

aguas termales del cantón Baños de Agua Santa, siguiendo los siguientes objetivos

específicos:

• Seleccionar la fuente de investigación en la ciudad de Baños de Agua Santa,

• Recolectar muestras del agua termal seleccionada en tres zonas del balneario (fuente,

reservorio y piscina),

• Determinar “In situ” las características fisicoquímicas (pH, temperatura, sólidos totales,

conductividad),

• Proceder en el laboratorio a la cuantificación de los microorganismos (aerobios

mesófilos, coliformes totales, Pseudomonas, mohos y levaduras),

• Aislar e identificar los microorganismos encontrados en base a pruebas bioquímicas y

fisiológicas de laboratorio,

• Realizar la caracterización biotecnológica, determinando la producción y degradación

de sustancias como enzimas, degradación de almidón, celulosa, hidrocarburos, y

xenobióticos.

• Determinar los índices de biodiversidad microbiana del agua termal.

3

CAPÍTULO I

1. MARCO TEÓRICO

1.1. Aguas Termales

Se llaman aguas termales a las aguas minerales superficiales que en su punto de

emanación poseen una temperatura mayor a la temperatura media anual del ambiente

y esta diferencia debe ser superior a los 5ºC. Estas aguas constituyen un recurso natural

que yace en estratos acuíferos subterráneos (Burbano et al., 2013).

Las aguas termales surgen de capas subterráneas de la tierra, las cuales se encuentran

a mayor temperatura, y son ricas en diferentes componentes minerales por esta razón

son llamadas aguas mineromedicinales y permiten su utilización en la terapéutica como

baños, inhalaciones, irrigaciones, y calefacción (De la Rosa. et al., 2004).

Por lo general se encuentran a lo largo de líneas de fallas ya que a lo largo del plano de

falla pueden introducirse las aguas subterráneas que se calientan al llegar a cierta

profundidad y suben después en forma de vapor (que puede condensarse al llegar a la

superficie, formando un géiser) o de agua caliente. (De la Rosa. et al., 2004).

Las diferentes normas y códigos alimentarios definen a las diferentes aguas tomando

en cuenta las características y la utilización de cada una. Entre estas definiciones

tenemos:

Agua mineral natural: Esta es un agua que se diferencia por contener determinadas

sales minerales y en sus proporciones relativas, estas aguas se obtienen directamente

de fuentes naturales o a su vez perforadas de aguas subterráneas procedentes de

estratos acuíferos. (OMS, 1998).

Agua mineral industrial: Agua mineral que debido a su composición tanto cuantitativa

como cualitativa permite un aprovechamiento de los minerales que contiene. (Fagundo

et al., 2007).

Agua mineral natural carbonatada: es aquella agua mineral natural efervescente, en

donde el contenido de gas carbónico proviene de la fuente. (INEN, 1982).

4

Agua mineral natural no carbonatada: Agua mineral natural no efervescente, este tipo

de agua no libera gas carbónico a la salida de la fuente de manera que sea perceptible

en condiciones normales. (INEN, 1982).

Agua mineral natural reforzada con gas de la fuente. Agua mineral natural efervescente

cuyo contenido de gas carbónico proviene de la fuente, luego de un tratamiento y

envasado, es superior que al determinado al surgir de la fuente. (INEN, 1982).

Agua mineral natural con adición de gas carbónico: Agua mineral natural que se le ha

hecho efervescente por adición de gas carbónico de origen diferente al de la fuente de

la cual proviene, luego de un tratamiento y envasado. (INEN, 1982).

Agua mineral natural descarbonatada: Agua mineral natural cuyo contenido de gas

carbónico proviene de la fuente ha sido eliminado total o parcialmente, luego de un

tratamiento y posterior envasado. (INEN, 1982).

Las aguas termales se clasifican según diferentes puntos de vista; por su uso, origen,

temperatura, tonicidad, mineralización global, composición fisicoquímica, acciones

terapéuticas, entre otras.

Dependiendo de su origen:

Las aguas subterráneas según Armijo y San Martin (2010) pueden ser:

a) Marinas: agua del océano que recientemente han inundado rocas y sedimentos

no consolidados.

b) Meteóricas: agua subterránea que en tiempo reciente entró en el ciclo

hidrológico.

c) Congénitas: agua que no está en contacto con la atmosfera desde hace mucho

tiempo.

d) Metamórficas: agua que durante su metamorfismo está en contacto con rocas.

e) Magmáticas: agua producida en los magmas no muy profundos.

f) Plutónicas: agua producida en los magmas profundos.

g) Juveniles: agua que está en contacto con la atmosfera.

Dependiendo de su temperatura las podemos clasificar en:

1. Aguas frías: menos de 20ºC

2. Aguas hipo termales: entre 20º a 30ºC

3. Aguas termales o meso termales: entre 30º a 40ºC

5

4. Aguas hipertermales: más de 40ºC

Esta clasificación es considerada universal y resulta la más aceptada (Burbano et al.,

2013).

Dependiendo de su composición química:

Según la Norma Cubana de Agua Mineral a las aguas se las clasifica en: (NC 93-01-

218. 1995.)

1. Manantiales de aguas ácidas: pH menor a 6.8

2. Manantiales de aguas neutras: pH entre 6.8 a 7.2

3. Manantiales de aguas alcalinas: pH mayor a 7.2

Dependiendo de su composición en minerales:

1) Según Fagundo, J., et al (2007) las aguas con más de un gramo por litro de

sustancias mineralizantes se dividen en los siguientes:

a) Sulfatadas: estas aguas contienen más de 1g/L de sustancias mineralizantes, en

las cuales predominan el ion sulfato. En la composición de estas aguas también se

encuentra la presencia de iones como sodio, bicarbonato, cloruro y magnesio los

cuales influyen en las propiedades terapéuticas de las mismas.

b) Cloruradas: aguas con más de 1 g/L de sustancias mineralizantes, en las cuales el

ion cloruro suele ir acompañado de sodio en cantidades semejantes, este tipo de

composición de las aguas indica que fluyen desde orígenes profundos donde la

existencia de fallas y grietas facilita su salida a la superficie. Estos tipos de aguas

se subdividen en: fuertes (más de 50 g/L), medianas (entre 10 y 50 g/L) y débiles

(menos de 10 g/L).

c) Bicarbonatadas: aguas con más de 1 g/L de sustancias mineralizantes, en las

cuales el ion bicarbonato se encuentra acompañado de sodio, cloruro, calcio,

magnesio, otros. Este tipo de aguas también se las llama carbónicas o

carbogaseosas cuando tienen en gran cantidad ácidos libre como CO2 en

cantidades mayores a 250 mg/L.

2) Por su parte las aguas con mineralización inferior a un gramo por litro, se las conoce

como aguas oligominerales, Fagundo, J., et al (2007) las clasifica en las siguientes:

6

a) Según la cantidad de mineralización: este tipo de aguas contienen una

mineralización menor a 1 g/L, pero pueden contener una cantidad abundante de

microelementos como: germanio, vanadio, molibdeno, cobalto, silicio, fósforo, etc.

Según este criterio se subdividen en: aguas de débil mineralización (menos de 0.2

g/L) y otro de mediana mineralización (0.2-1 g/L), pero sin considerárseles factores

mineralizantes especiales.

b) Según factores mineralizantes especiales: Este tipo de aguas se subdividen

atendiendo a su temperatura de la siguiente manera: acratopegas (con menos de

20 °C) y acratotermas (con más de 20 °C).

3) Aguas con componentes especiales reconocidos por su actividad biológica en

determinadas proporciones: esta clasificación se basa en la actividad biológica que

poseen determinados componentes los cuales deben estar en cantidades

establecidas por las normas. Se clasifican en los siguientes: (Fagundo, J., et al,

2007)

a) Sulfuradas: también llamadas sulfhídricas, contienen más de 1mg/L de sulfuro de

hidrógeno o ion sulfhídrico. La proporción en la que se encuentran estos dos

componentes va a depender del pH, en donde, mientras el pH sea inferior a 7.5

prevalecerá el sulfuro de hidrógeno y a valores mayores prevalecería el ion

sulfhídrico.

b) Carbogaseosas: con una cantidad de CO2 superior a 250 mg/L.

c) Silícicas: con una cantidad de SiO2 superior a 50 mg/L.

d) Arsénicas: con un contenido de As entre 0.2-0.3 mg/L.

e) Bóricas: con un contenido de B superior a 4 mg/L.

f) Fluóricas: con un contenido de F- entre 1.0-2.0 mg/L

g) Brómicas: con un contenido de Br- superior a 4 mg/L.

h) Yodhidricas: con un contenido de I- superior a 1 mg/L.

i) Líticas: con un contenido de Li superior a 1 mg/L.

j) Estróncicas: con un contenido de Sr superior a 10 mg/L.

k) Báricas: con un contenido de Ba superior a 5 mg/L.

l) Ferruginosas: estas aguas contienen más de 5 g/L de sustancias mineralizantes,

de las cuales el hierro se encuentra en su forma reducida y puede encontrarse en

concentraciones de más de 5 g/L.

7

1.2. Los microorganismos en biotecnología

La ciencia encargada del estudio de los microorganismos es la microbiología,

basándose en: forma, estructura e identificación: su distribución en la naturaleza, la

relación y acción que ejercen sobre las demás formas vivientes o no; las técnicas y

métodos en vivo o in vitro (Andocilla, 2003).

De acuerdo con Granados y Villaverde (2003), dentro del estudio de la microbiología se

encuentran todos aquellos microorganismos causantes de enfermedades como los

saprófitos y beneficiosos. En ella se engloba el estudio de bacterias, hongos, parásitos

y virus; los cuales, para poder ser vistos por el hombre, necesitan ser ampliados de

tamaño mediante equipos tales como el microscopio óptico o electrónico (Granados y

Villaverde, 2003).

Estos organismos poseen la mayor diversidad genética y metabólica de los seres vivos

(Madigan et al, 2004), con los cuales podemos obtener altos rendimientos en la

producción de sustancias químicas.

Gracias a que pueden llevar a cabo una gran variedad de reacciones en diversos

ambientes y medios de cultivo pueden llegar a producir compuestos de alto valor

agregado a partir de materiales biológicos y con la nula generación de residuos tóxicos

(Demain y Adrio, 2008).

Por lo mencionado anteriormente, estos tipos de organismos son clave en el desarrollo

de tecnologías que requieran de sistemas biológicos o sus derivados, dando paso a su

amplia aplicación en el área biotecnológica.

1.2.1. Las bacterias

Teniendo como premisa que las bacterias son organismos unicelulares muy pequeños

y sencillos, cuyo material genético no está rodeado por una membrana nuclear por lo

que toman el nombre de procariotas (Villaverde y Granados, 2003), se debe exponer

que éstas y sus componentes juegan un papel importante en biotecnología, con

aplicaciones en medicina, industria y agricultura (Singleton, 2003).

Para poder clasificar e identificar las bacterias, es impredecible utilizar ampliamente las

siguientes propiedades: por su forma, tamaño y estructura, por sus actividades

químicas, por los tipos de nutrientes que necesitan, en la forma de energía que utilizan,

en las condiciones físicas en que pueden crecer y en sus reacciones con ciertos

8

colorantes, siendo tales propiedades fácilmente evaluadas incluso en laboratorios

modestamente equipados (Singleton, 2003).

Normalmente el crecimiento conlleva la división de una célula en dos células similares

o idénticas. Así, en bacterias, el crecimiento y la reproducción están estrechamente

ligados, y el término crecimiento se utiliza generalmente para referirse a ambos

procesos. (Singleton, 2003).

Condiciones de crecimiento

Las bacterias solo crecen si el ambiente es adecuado; si no es óptimo y dependiendo

de la especie y las condiciones las bacterias puede no crecer o crecer a una tasa baja,

o la bacteria puede morir.

Según Singleton (2003), los requerimientos esenciales para el crecimiento incluyen (i)

un aporte adecuado de nutrientes; (ii) fuente de energía; (iii) agua; (iv) temperatura

apropiada; (v) pH apropiado; y (vi) niveles apropiados (o ausencia) de oxígeno. Por

supuesto, ninguno de estos factores funciona de forma aislada: una alteración en uno

puede aumentar o reducir los efectos de otro; por ejemplo, la temperatura máxima a la

cual una bacteria puede crecer podría ser inferior si el pH del ambiente no es el óptimo.

A continuación, se detallan los requerimientos esenciales que describe Singleton (2003)

para el crecimiento de las bacterias:

1. Nutrientes

Para el crecimiento, división y mantenimiento las bacterias necesitan nutrientes como

materias primas. Considerándolas como grupo, éstas utilizan un amplio rango de

compuestos como nutrientes; entre ellos se incluyen varios azúcares y otros

carbohidratos, aminoácidos, esteroles, alcoholes, hidrocarburos, metano, sales

inorgánicas y dióxido de carbono, pero hay que mencionar que ninguna bacteria

individual puede utilizar todos estos compuestos: no tiene todo el rango de enzimas

necesarias para aprovechar todos ellos, y en cualquier caso su cubierta celular no tiene

todos los sistemas de entrada para todos ellos.

En cualquier organismo, las células necesitan fuentes de carbono, nitrógeno, fosfato,

sulfuro y otros materiales a partir de los cuales se sintetizan la materia viviente.

9

2. Energía

La energía se necesita para la mayoría de las reacciones químicas esenciales que

tienen lugar en una célula viva; también se necesita para la motilidad flagelar y para la

importación de varios nutrientes. Toda esta energía se obtiene de fuentes ambientales.

En especies fototróficas, la energía se obtiene principal o únicamente de la luz, mientras

que las especies quimiotróficas obtienen la energía mediante el procesamiento de

compuestos químicos tomados del ambiente. Algunas especies pueden utilizar ambos

métodos.

3. Agua

Un 80% o más de la masa de una bacteria es agua y durante el crecimiento, los

nutrientes y productos de desecho entran y salen de la célula, respectivamente, en

solución; por ello, las bacterias pueden crecer solo sobre materiales que tengan la

adecuada cantidad de agua libre (disponible). No toda el agua en un material dado esta

necesariamente disponible para el crecimiento bacteriano; una parte, por ejemplo,

puede ser atrapada por geles hidrofílicos o por iones en solución.

Diferentes especies de bacterias toleran distintos grados de carencia extrema de agua

(desecación), aunque muchas especies no sobreviven mucho tiempo en estado de

sequedad.

4. Temperatura

Para un tipo de bacteria dado, existe una temperatura óptima de crecimiento en la que

el crecimiento es más rápido, esta tasa de crecimiento se verá afectada y disminuirá a

medida que la temperatura se aleje respecto al óptimo. Para una bacteria dada hay

temperaturas máximas y mínimas más allá de las cuales no habrá crecimiento.

Dentro de este requerimiento se describen a continuación los rangos de temperatura

óptimos para el crecimiento de las siguientes bacterias:

10

Tabla 1. Temperatura optima de crecimiento bacteriano según el tipo de bacteria

TIPO DE

BACTERIA

TEMPERATURA

ÓPTIMA

DE CRECIMIENTO

HÁBITAT ESPECIES

Termofílicas >45ºC

Abonos, fuentes

termales,

Aberturas

hidrotermales en el

Suelo oceánico

Thermobacteroides

(temperatura óptima 55-70ºC)

y Thermomicrobium

(temperatura óptima 70-75ºC).

Entre la Archaea, Pyrodictium

tiene la remarcable

temperatura optima de

crecimiento a 105ºC.

Mesófilas Entre 15 y 45ºC

Viven en un

Amplio rango de

hábitats

Incluyen bacterias patógenas

del hombre y otros animales

Psicrófilas <15ºC, Límite inferior

de crecimiento ≤0ºC Mares polares

Fuente: Singleton (2003)

Algunos termófilos exhiben características asociadas con la adaptación al crecimiento a

altas temperaturas; dicha adaptación puede evidenciarse en la composición de sus

estructuras celulares (por ej., membrana citoplásmica) y, en algunos casos, incluso en

su tipo de metabolismo energético (Singleton, 2003).

5. pH

La mayoría de las bacterias tienen su óptimo crecimiento a pH 7 (neutro), y la mayoría

no pueden crecer en condiciones de fuerte acidez o alcalinidad. Sin embargo, algunas

(que se encuentran, por ejemplo, en desagües de minas o en ciertas fuentes termales)

no solo toleran si no que prefieren condiciones ácidas o altamente ácidas; entre las que

consideramos las siguientes:

Tabla 2. pH óptimo de crecimiento bacteriano según el tipo de bacteria

TIPO DE BACTERIA pH ÓPTIMO ESPECIE

Acidófilos De 2 a 4 Thiobacillus thiooxidans

Archaea De 1 a 5 Sulfolobus

Entre 0,8 y 3 Thermoplasma acidophilus

11

Cont. Tabla 2. pH óptimo de crecimiento bacteriano según el tipo de bacteria

TIPO DE BACTERIA pH ÓPTIMO ESPECIE

Alcalófilos >8

Thermomicrobium roseum

(pH óptimo de 8,2 a 8,5)

Exiguobacterium

aurantiacum (pH óptimo de

8,5 a 9,5)

Fuente: Singleton (2003).

La bacteria Thermomicrobium roseum que se encuentra dentro de los alcalófilos se

encuentra en fuentes termales y Exiguobacterium aurantiacum ha sido encontrado en

efluentes de procesamiento de patatas; otros alcalófilos se encuentran en lagos

naturales alcalinos. Acidófilos y alcalófilos pueden crecer lentamente –o nada- a pH 7.

6. Oxígeno

Algunas bacterias necesitan oxígeno para crecer. Otras necesitan la ausencia de

oxígeno para su crecimiento. Aun otras pueden crecer independientemente de la

presencia o ausencia de oxígeno.

Las bacterias que deben tener oxígeno para crecer se denominan aerobias obligadas o

estrictas haciendo énfasis en su absoluta necesidad de oxígeno.

Los anaerobios obligados o estrictos crecen solamente en ausencia de oxigeno; estos

organismos se encuentran, por ejemplo, en lodos de rio y en el estómago de rumiantes.

Las bacterias que normalmente crecen en presencia de oxígeno, pero pueden también

crecer bajo condiciones anaeróbicas se denominan anaerobias facultativas. De forma

similar, aquellas que normalmente crecen anaeróbicamente, pero pueden crecer en

ausencia de oxigeno se denominan aerobias facultativas.

Las bacterias microaerófilas generalmente crecen mejor cuando la concentración de

oxigeno es menor (normalmente mucho) que la del aire (Singleton, 2003).

7. Iones inorgánicos

Todas las bacterias necesitan de ciertos iones inorgánicos (por ej., cloruro y magnesio)

en bajas concentraciones, altas concentraciones normalmente inhiben el crecimiento.

Los iones tienen varias funciones, por ejemplo, el magnesio en la membrana externa, el

hierro en los citocromos y en una serie de enzimas, y magnesio y níquel en enzimas o

sistemas enzimáticos.

12

Algunas bacterias halófilas crecen solo en presencia de alta concentración de

electrolitos (normalmente NaCl). Ciertos miembros de la Archaea (por ej., Halobacterium

salinarium) que viven en lagos salados y necesitan al menos 1,5 M de NaCl para crecer

(Singleton, 2004).

1.2.2. Microorganismos extremófilos

El descubrimiento de microorganismos que habitan en ambientes con temperaturas

extremas, pH extremos, altas presiones barométricas y alta salinidad, ha despertado el

interés de su estudio desde el punto de vista biotecnológico debido a las características

de estos microorganismos ya que sus biomoléculas son necesariamente resistentes a

las condiciones agresivas de su entorno, lo que desemboca en intensos trabajos para

estudiarlos en la perspectiva del desarrollo de aplicaciones industriales (Ramírez,

Serrano y Sandoval, 2006).

1.2.2.1. Termófilos

Se consideran termófilos aquellos microorganismos que crecen en temperaturas por

encima de 65ºC, la temperatura para un crecimiento óptimo se encuentra entre 70 –

80ºC y la máxima entre 80 – 113ºC. Las mayorías de las bacterias mesófilas crecen

más rápidamente entre 25 y 40ºC. No se han encontrado animales o plantas

multicelulares que vivan por arriba de los 50ºC (Ramírez, Serrano y Sandoval, 2006).

En función de la temperatura de crecimiento, los organismos se clasifican de la siguiente

manera:

13

Tabla 3. Clasificación de los microorganismos en función de su temperatura óptima de crecimiento

Temperatura Descripción

Hipertermófilos Su temperatura óptima de crecimiento

está por encima de los 80ºC y el máximo

crecimiento de cultivos puros se ha

llegado a dar entre 110 y 113ºC.

Termófilos Crece por encima de los 45ºC.

Mesófilos Temperatura óptima alrededor de 37ºC.

Frecuentemente son capaces de crecer

en rangos alrededor de 25 a 45ºC.

Psicrófilos Capaces de crecer por debajo de 5ºC y

con temperaturas máximas de 20ºC.

Frecuentemente son capaces de crecer

en rangos alrededor de 10ºC.

Psicrófilos facultativos Temperatura óptima de 15ºC llegando a

alcanzar los 20ºC y también capaces de

crecer hasta por debajo de 0ºC.

Fuente: Ramírez, et al, 2006.

1.2.2.1. Importancia biotecnológica bacteriana

Microorganismos y parte de estos, especialmente enzimas, son de mucho interés a nivel

industrial y biotecnológico debido a que se adaptan a duros procesos industriales y dan

lugar a conversiones biocatalíticas importantes dentro de la industria, tal como se

muestra en la Tabla 4.

ENZIMA RANGO Tº (ºC)

BIOCONVERSIÓN APLICACIONES

∝-Amilasa

(bacterial) 90-100 Almidón→Dextrosa

Hidrólisis de almidón, panadería,

cervecería, detergentes.

∝-Amilasa

(fúngica) 50-60 Almidón→Dextrosa Producción de maltosa

Pululanasa 50-60 Almidón→Dextrosa Producción de glucosa

Tabla 4. Reacciones de bioconversión y aplicaciones de enzimas termoestables

14

Cont. Tabla 4. Reacciones de bioconversión y aplicaciones de enzimas termoestables

ENZIMA RANGO Tº (ºC)

BIOCONVERSIÓN APLICACIONES

Xilanasa 45-65,

105ª Pulpa Craft→xilano + lignina Industria del papel

Quitinasa 65-75

Quitina→Quitobiosa

Quitina→N-acetilglucosamina

(quitibiasa)

N-acetilglucosamina→Glucosamina

(deacetilación)

Quitina→Quitosan (deacetilación)

Alimentos, cosméticos, farmacéuticos,

agroquímicos

Celulasa 45-

55,95ª Celulosa→Glucosa

Hidrólisis de celulosa, degradación de

polímeros en detergentes

Proteasa 65-85 Proteínas→aminoácidos y péptidos Industrias de cerveza, detergentes, cuero

y panadería

Lipasa 30-70

Remoción de grasa, hidrólisis,

Interesterificación, alcoholisis,

aminolisis.

Industria de lácteos, oleoquímicos,

detergentes, pulpas, farmaceúticos,

cosméticos y cuero

DNA

polimerasa 90-95 Amplificación del DNA Ingeniería genétca PCR

Fuente: Haki y Rakshit, 2003

A altas temperaturas las enzimas producidas por estos microorganismos termófilos

catalizan reacciones químicas de nivel industrial en donde permiten el incremento del

rendimiento en los procesos industriales y la disminución del costo de producción.

Siendo el aislamiento de estos microorganismos no solamente importante a nivel

ecológico y clínico si no también industrial y biotecnológico.

Enzimas Lipolíticas

Las lipasas están presentes en la naturaleza y son producidas algunas por plantas,

animales y microorganismos. Las lipasas de origen microbiano, principalmente de

bacterias y hongos, representan la más amplia clase de enzimas usadas en aplicaciones

biotecnológicas y química orgánica (Gupta et al., 2004; Labrador, 2006).

Estas enzimas han sido aisladas de una gran cantidad de microorganismos, siendo la

especie Bacillus la más frecuente, además de producir otras enzimas de interés

industrial como las celulasas, amilasas, elastasas, etc.

Entre las aplicaciones más importantes que se han encontrado para las lipasas están:

como lubricantes y aditivos en formulaciones cosméticas, la hidrolisis de la grasa de la

15

leche en la industria láctea, la remoción de impurezas no celulósicas a partir de algodón

en rama antes de futuros procesamientos de productos tinturados o terminados,

formulaciones de medicamentos en la industria farmacéutica, remoción de grasa

subcutánea en la industria del cuero. En la industria papelera las lipasas son usadas

para remover la pulpa producida en la fabricación del papel (Labrador, 2006).

Enzimas Amilolíticas

Las amilasas hidrolizan moléculas de almidón, para obtener diversos productos

incluyendo la dextrina, y progresivamente polímeros más pequeños compuestos por

unidades de glucosa (Labrador, 2006; Léveque et al., 2000). Algunos estudios genéricos

de las amilasas se han llevado a cabo principalmente en el género Bacillus,

especialmente en Bacillus subtilis (Olmos y Arellano, 1999).

Estas enzimas constituyen el 25% de las enzimas industriales que se encuentran en el

mercado, y entre sus usos principales se encuentran: la producción de edulcorantes

para la industria alimentaria, se utilizan hidrolizados de almidón como aditivos en la

fabricación de caramelos, alimentos en conserva o alimentos congelados, la utilización

de las amilasas bacterianas en las industrias de fabricación de papel y textil, para

producir almidón ligeramente hidrolizado que se emplea como recubrimiento adhesivo

del papel imprenta y lograr mejor brillo, mejor propiedad de impresión y suavidad

(Labrador, 2006).

En los detergentes estas contribuyen a mejorar la eficacia de la limpieza gracias a la

gran degradación de la mugre y produce un mínimo impacto ambiental por ser

biodegradable (Wiseman, 1991).

Enzimas Proteolíticas

Las proteasas son la principal enzima industrial y constituye más del 65% del mercado

mundial de enzimas, contribuyen a la catálisis de la hidrolisis de los enlaces peptídicos

de las proteínas, rompen un mismo tipo de enlace, el amida o el peptídico (Labrador,

2006), Haki y Rakshit, 2003; Kumar y Takagi, 1999).

Este tipo de enzimas están siendo utilizadas ampliamente en la industria alimenticia

para la fabricación de galletas, pan, etc., esto debido a que a su tasa media de reacción

producen menos amargura en proteínas de alimentos, farmacéutica, textil y del cuero

para el tratamiento de las pieles reemplazando el uso de químicos tóxicos, además de

la degradación de proteínas para sustratos en cervecería (Granados, 2003).

16

Dentro de los microorganismos que producen enzimas proteolíticas se encuentran los

géneros Pyrococcus, Thermococcu y Staphylothermus, igualmente el género Bacillus.

(Haki y Rakshit, 2003).

Enzimas Celulolíticas

La importancia de la celulosa radica en que constituye más del 40% de la biomasa de

las plantas y se puede hidrolizar en glucosa a través de tres enzimas, la β-glucosidasa,

la exogluconasa y la endo-gluconasa que tienen varias aplicaciones biotecnológicas

como la producción de alcohol; en detergentes provoca colores brillantes y suavidad,

mejora la alimentación de partículas de tierra; también se usan en el lavado de mezclilla,

pre-tratamiento de biomasa celulósica y sacarificación enzimática de desechos

agrícolas e industriales en la producción de químicos. (Niehaus et al, 1999).

Dentro de los microorganismos degradadores de celulosas se consideran a los hongos

y bacterias, que pueden ser aerobios, anaerobios, mesófilos y termófilos. Entre las

bacterias celuloliticas más abundantes y conocidas son las aerobias entre las cuales se

pueden citar: Cellulomonas sp., Corynebacterium sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp.,

(Lynd, et al, 2002).

En los sistemas aeróbicos donde se requiere agitación y aireación continuas, la pérdida

de enzimas secretadas y de los intermediarios de degradación puede afectar la

eficiencia del proceso. Sin embargo, los microorganismos aerobios ganan más energía

de la glucosa que los anaerobios (38 moles de ATP vs 2-4 moles de ATP por cada mol

de glucosa) por lo tanto, la eficiencia hidrolítica de los microrganismos aerobios es

benéfica en cuanto a ganancia energética, mientras que los microrganismos anaerobios

son más atractivos en biorremediación por el bajo costo que requieren (debido a la

ausencia de agitación para la aireación y tecnologías para el control de flujo) y la alta

eficiencia de la maquinaria hidrolítica sobre la celulosa. (Malherbe y Cloete, 2002).

Degradadoras de petróleo

El petróleo es un compuesto muy complejo debido a sus cuatro fracciones,

hidrocarburos saturados, hidrocarburos aromáticos, resinas y asfáltenos, por lo que es

considerado el contaminante más extendido en la biosfera y en el ambiente marino,

siendo un problema global ya que representa la mayor fuente energética para la

obtención de materias primas para la industria; tanto su explotación como transporte

generan problemas ambientales, generalmente por derrames accidentales y prácticas

17

inadecuadas de eliminación de efluentes en industrias y refinerías de petróleo (Al-

Mailem et al, 2010).

Los compuestos de hidrocarburos de petróleos son degradados a diferentes ritmos y en

algunos casos son inflexibles a la biodegradación; en el caso de hidrocarburos de bajo

peso molecular pueden degradarse rápidamente, pero los hidrocarburos de cadena

larga o aromáticos policíclicos tienden a ser poco biodegradables debido a su mayor

hidrofobicidad.

Entre las bacterias capaces de utilizar petróleo para su crecimiento y mantenimiento,

conocidas como degradadoras de hidrocarburos tenemos los géneros Bacillus sp.,

Rhodococcus, Mycobacterias, Micromycetes y Pseudomonas. Siendo el género

Pseudomonas el más eficiente debido a su versatilidad metabólica ya que por utilizar

como fuente de energía compuestos orgánicos tantos simples como complejos son

capaces de convertir sustratos habitualmente no degradables en metabolitos fácilmente

asimilables de ser catalizados enzimáticamente, además de ser productoras de enzimas

extracelulares, incluyendo la lipasa (Rolling, Head y Larter, 2003).

1.2.2.1.1. Microorganismos en la industria

Morales (2012) menciona que dentro de las características importantes que los

microorganismos de uso industrial deben cumplir, se encuentran: producir sustancias

de interés, estar disponible en cultivo puro, ser genéticamente estable y crecer en

cultivos a gran escala, además de que no debe ser patógeno para el hombre o para los

animales o plantas.

A continuación se muestra una tabla con los principales microorganismos utilizados en

todas las industrias:

Tabla 5. Microorganismos en la industria

INDUSTRIA PRODUCTOS / USOS BACTERIAS PRINCIPALES

Alimentaria

Bebidas alcohólicas (vinos,

cervezas, etanol industrial) Saccharomyces

Leches fermentadas, quesos,

embutidos.

Streptococcus, Leuconostoc,

Lactobacillus, Pediococcus,

Bifidobacterium

Ácido láctico Lactobacillus

Farmacéutica Antibióticos Penicilium, Streptomyces,

Bacillus

18

Cont. Tabla 5. Microorganismos en la industria INDUSTRIA PRODUCTOS / USOS BACTERIAS PRINCIPALES

Biotecnología y medio

ambiente

Biodegradación de

hidrocarburos

Pseudomonas, Acinetobacter

sp, Actinomycetes, Arthrobacter,

Bacillus sp, Micrococcus sp,

Mycobacterium

Depuración de aguas residuales Bacterias aerobias

Depuración de materia orgánica

semisólida Bacterias anaerobias

Agropecuarias Bioinsecticidas Bacillus

Fuente: Morales, 2012

1.3. Tipos de microorganismos en las aguas termales

1.3.1. Microorganismos autóctonos

Los microorganismos autóctonos de las aguas son aquellos microorganismos que

pertenecen o son propios del ambiente y crecen mejor en medios pobres en carbono y

con tiempos de incubación prolongados. En este tipo de comunidad microbiana existen

bacterias termófilas que crecen a más de 45ºC, pero la mayoría son mesófilas con

temperaturas óptimas de 37ºC, que se adaptan a estas condiciones de elevada

temperatura (De la Rosa y Mosso, 2002).

Según sus requerimientos nutricionales predominan las bacterias heterótrofas

oligotróficas, con escasos requerimientos de carbono y nitrógeno (oligocarbofílicas y

oligonitrofilicas). En menor número se han encontrado microorganismos autótrofos,

tanto quimilitotrofos (cianobacterias, bacterias verdes y rojas). La mayoría son aerobios

o anaerobios facultativos, de pequeño tamaño, móviles y con pigmentos (De la Rosa y

Mosso, 2002).

Las bacterias heterótrofas no suelen fermentar los azúcares, pero son proteolíticas,

amilolíticas, amonificantes y en menor número celuloliticas, estos tipos de bacterias

resultan beneficiosas debido a su intervención en la autodepuración de las aguas si, de

una forma accidental, sufren un aporte de materia orgánica (De la Rosa y Mosso, 2002).

En relación con las bacterias heterótrofas, De la Rosa y Mosso (2002) exponen que,

“Las aguas hipertermales presentan una mayor proporción de bacterias Gram positivas

mientras que en las meso termales predominan los bacilos Gram negativos y los cocos

Gram positivos. La elevada temperatura de las aguas hipertermales puede ser la causa

de esta diferencia ya que las bacterias Gram positivas son más resistentes al calor. Los

19

principales géneros identificados han sido: Pseudomonas, Bacillus; Micrococcus,

Staphylococcus, Enterobacter, Acinetobacter y Arthrobacter” (Mosso, et al, 1994).

El género Pseudomonas se encuentra muy presente y se halla en ambientes acuáticos

con pocos nutrientes, considerando a las especies del grupo fluorescente encontradas

en estas aguas, como P. fluorescens y P. putida, población autóctona de manantiales

meso e hipo termales. En aguas con menor temperatura también es frecuente la

presencia de otros bacilos Gram negativos como Acinetobacter, Alcaligenes,

Flavobacterium, Vibrio, Aeromonas (De la Rosa y Mosso, 2002).

Las numerosas especies del género Bacillus están ampliamente distribuidas y pueden

proceder del suelo o de las propias aguas. La presencia de los cocos Gram positivos,

Staphylococcus y Micrococcus, es frecuente en aguas minerales ya que resisten

concentraciones altas de sal, aunque no se detectan especies propias del hombre. Otros

géneros de cocos presentes en estas aguas son Vagococcus, Planococcus y

Marinococcus, típicos de ambientes acuáticos dulces y marinos (De la Rosa y Mosso,

2002).

El género Enterobacter, a pesar de su pertenencia a la familia enterobacteriáceas, se

considera que forma parte de la micro población autóctona, ya que se encuentra

ampliamente distribuido en la naturaleza. En ocasiones, principalmente en aguas

hipertermales o carbónicas, se encuentran bacilos Gram positivos irregulares como

Arthrobacter, Kurthia, Corynebacterium, Cellulomonas, Exiguobacterium, Rubrobacter,

y otros difíciles de identificar, cuyo hábitat puede ser el suelo pero que se han adaptado

a vivir en condiciones adversas (De la Rosa y Mosso, 2002).

1.3.2. Microorganismos alóctonos

Son aquellos microorganismos que están presenten en el agua pero que están de paso

por el ambiente. Basándose en el aspecto sanitario, este tipo de aguas no suelen

presentar bacterias patógenas, pero en algunos manantiales se han detectado

coliformes, enterococos, Clostridium sulfo reductores y Pseudomonas aeruginosa. (De

la Rosa y Mosso, 2002).

La existencia de coliformes no fecales en las aguas termales pueden provenir del suelo

o de los vegetales del mismo ambiente acuático por lo que no representan un riesgo

20

sanitario, además de que este tipo de microorganismo sobrevive en ambientes acuáticos

por su facilidad de adaptación formando “biofilms” (Lechevalier et al., 1987).

Existe cierta controversia en considerar a los enterococos y Clostridium sulfo reductores

como indicadores de una contaminación fecal cuando aparecen como un único

indicador, debido a que se han encontrado en ambientes donde no ha existido aporte

fecal, por lo que, en aguas poco contaminadas, como en los manantiales minerales, se

recomienda utilizar varios indicadores, teniendo a la Escherichia coli el más

representativo.

Si bien la presencia de Pseudomona aeruginosa en estas aguas mineromedicinales no

es deseable, debido a que es un patógeno oportunista y puede producir infecciones a

personas inmunodeprimidas, su presencia puede indicar una escasa protección del

manantial, aunque puede colonizar ambientes acuáticos y encontrarse en aguas

subterráneas no contaminadas por el hombre (Cajamarca y Contreras, 2011).

1.4. Cultivo bacteriano

1.4.1. Medios de cultivo

Un medio de cultivo es un conjunto equilibrado de nutrientes, factores de crecimiento y

otros componentes que juntos crean las condiciones necesarias para el desarrollo de

microorganismos en el laboratorio. Su diversidad metabólica es enorme, por lo cual, la

variedad de medios de cultivo es también amplia, y no existe un medio de cultivo

universal adecuado para todos los microorganismos cultivables en el laboratorio

(Gamazo et al., 2005).

1.4.1.1. Constituyentes habituales de los medios de cultivo

Dentro de los nutrientes, factores de crecimiento y componentes que necesita un medio

de cultivo, Gamazo et al (2005) describe los más esenciales:

1. Fuente de carbono y sales. En muchos casos, la glucosa, la lactosa u otras

dextrosas se emplean como fuente de carbono. Algunos medios de cultivo se

complementan con sales como el NaCl o diversos fosfatos y/o sulfatos de

potasio, magnesio, amonio, etcétera.

2. Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de

cultivo. El componente dominante en el agar bacteriológico es un polisacárido,

al que acompañan algunas impurezas, que se obtiene de ciertas algas marinas

(rodofitas). Un gel de agar al 1-2% en agua licúa hacia los 100ºC y se gelifica

21

alrededor de los 40ºC, dependiendo de su grado de pureza. Con la excepción

de algunos microorganismos marinos, el agar no se emplea como nutriente.

3. Extractos. Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales

(p. ej., carne, hígado, cerebro, semillas) son extraídos con agua y calor, y

posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos

preparados deshidratados se emplean con frecuencia en la confección de

medios de cultivo. Son una fuente rica de alimentos, vitaminas y diversos

factores de crecimiento. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta,

etcétera.

4. Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y

sales minerales que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas

animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína, etc.). las peptonas son muy

ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas

vitaminas y sales.

5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrada, plasma o suero

sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo

de algunos patógenos. La sangre no puede esterilizarse y debe, por tanto,

obtenerse en condiciones asépticas directamente de un animal sano. Los fluidos

corporales no solo contribuyen con factores de crecimiento, sino también con

sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.

6. Sistemas amortiguadores (soluciones tamponadas). Algunos componentes

son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango

óptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos más comunes son

neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a la neutralidad), y

sales como fosfatos disódicos o dipotásicos, o sustancias como las peptonas,

previenen variaciones del pH.

7. Indicadores de pH. Indicadores acido-base se añaden a menudo a los medios

de cultivo para detectar variaciones del pH.

8. Agentes reductores. Cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores que

se añaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el

desarrollo de microorganismos microaerófilos o anaerobios.

9. Agentes selectivos. La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo

puede convertirlo en selectivo. Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, ázida

sódica, telurito potásico, antibióticos, etc., a la concentración adecuada, actúan

22

como agentes selectivos frente a determinados microorganismos (Gamazo et al.,

2005).

1.4.1.2. Tipo de medios de cultivo

En función de su estado físico (Bailón et al, 2003):

1. Sólidos. En su composición se incluye un agente solidificante que no es

consumible por los microorganismos. Son útiles para el crecimiento, aislamiento

y obtención de cultivos puros. Estos medios se colocan en cajas Petri, y las

células se observan en forma de colonias.

2. Semisólidos. Útiles para observar metabolismo, propagación y obtención de

bacterias anaeróbicas.

3. Líquidos. Conocidos como caldos, ayudan a la difusión del microorganismo, se

colocan en tubo y el crecimiento bacteriano se observa por enturbiamiento

En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos se consideran (Gamazo

et al, 2005):

1. Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de

microorganismos.

2. Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado tipo

de microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.

3. Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo microbiano determinado,

inhibiendo el desarrollo de los demás.

4. Medios de identificación. Usados para estudiar la acción de un tipo específico

de microorganismos frente a un sustrato determinado. Ejemplo: pruebas

bioquímicas.

5. Medios diferenciales. Son aquellos en los que se ponen en relieve propiedades

que posee un determinado tipo de microorganismo.

1.5. Recuento de microorganismos

El recuento de microorganismos es un procedimiento que permite conocer el número de

microorganismos que están presentes en una muestra, uno de los procedimientos más

23

utilizados en la actualidad por su determinación microbiológica, conteo rápido y

eficiencia son las Placas 3M Petrifilm (3M Petrifilm, 2004).

1.5.1. Placas 3M Petrifilm

Las Placas 3M Petrifilm consisten en medios de cultivo que facilitan la determinación y

conteo rápido de microorganismos, ya se encuentran listos para realizar la siembra

bacteriana y están compuestos por: un film superior plástico recubierto de un adhesivo,

indicador y gel soluble en frio; y un film inferior de papel recubierto de plástico con

cuadricula impresa, adhesivo, medio de cultivo estándar y gel soluble en frio, lo que

permite llevar a cabo siembras de forma rápida y reproducible, además de estandarizar

y facilitar procesos de ensayos al minimizar las horas en las pruebas microbiológicas

(3M Petrifilm, 2004).

Muy aparte de ser procesos eficientes otra buena razón de su uso es que son métodos

reconocidos y aprobados por múltiples organismos como: AOAC INTERNATIONAL

(Asociation of Official Analytical Chemists) como Métodos Oficiales de Análisis (OMA),

Asociación Francesa de normalización, U.S. Grade a Pasteurized Milk Ordinance,

Canadá- Health Protection Branch HPB (3M Petrifilm, 2004).

En el mercado se puede contar con Placas 3M Petrifilm para el recuento de cada

microorganismo, entre los cuales tenemos:

Recuento de aerobios totales

Recuento de E. coli/Coliformes totales

Placa de recuento Staph Express

Recuento de mohos y levaduras

La realización de recuento en este tipo de placas generalmente consta de:

1. Siembra

2. Incubación

3. Interpretación

24

1.5.1.1. Petrifilm para recuento de E. coli/Coliformes

Esta placa reúne dos ensayos en uno, ya que contiene nutrientes de bilis y rojo violeta,

un agente gelificante soluble en agua fría, un indicador de la actividad de glucoronidasa

y un indicador que hace muy fácil el recuento de colonias. Casi todas las E. coli producen

β-gl ucoranidas que produce un precipitado azul, la película superior de la placa atrapa

el gas producido por los coliformes y se observa claramente en forma de burbujas.

Aproximadamente un 95% de E. coli producen gas, observado en las colonias rojas y

azules asociadas con el gas atrapado sobre la placa (3M Petrifilm, 2004).

1.5.1.2. Petrifilm para recuento de Aerobios

Esta placa contiene nutrientes presentes en el agar, un agente gelificante soluble en

agua fría y un indicador rojo que facilita el recuento de las colonias (3M Petrifilm, 2004).

1.5.1.3. Petrifilm para recuento de Staph Express

Esta placa contiene un sistema de medio de cultivo preparado cromogenico de Baird-

Parker, modificado, selectivo y diferencial para Staphylococcus aureus,

microorganismos que se observan formando colonias de color rojo-violeta (3M Petrifilm,

2004).

1.5.1.4. Petrifilm para recuento de mohos y levaduras

Esta placa contiene nutrientes de cloro tetraciclina y cloranfenicol, indicador de fosfato,

un agente gelificante soluble en agua fría y un indicador que hace más fácil su recuento.

Las levaduras se observan comúnmente como colonias pequeñas de color verde

azulado, con bordes definidos y sin un centro negro. Los mohos en cambio suelen

observarse como colonias muy grandes de color no definido, con bordes irregulares y

un foco central (3M Petrifilm, 2004).

25

1.6. Morfología bacteriana macro y microscópica

1.6.1. Morfología macroscópica: Estudio de la forma y estructura de las

colonias

Una vez transcurrido el periodo de incubación estimado como el adecuado en el medio

de cultivo donde se ha realizado la siembra, deberán aparecer pequeñas masas visibles

a simple vista que han sido formadas por el crecimiento en ese punto de una célula

bacteriana. La reproducción de esa bacteria en otras muchas en ese punto del medio

sólido origina lo que se conoce con el nombre de colonia, estas colonias presentarán

una morfología macroscópica fácilmente reconocible y variable en las que su verificación

se realiza siempre en medios sólidos, que pueden ser en placa, sembrándolos por

estría. (Granados y Villaverde, 2003)

1.6.1.1. En placa, siembra por estría

Las colonias son masas constituidas por muchos millones de bacterias y estas son las

que se aprecian a simple vista formándose tras una siembra en placa. El tamaño y el

aspecto de cada colonia suele ser bastante constante para cada género y especies

bacterianas, hecho que se puede utilizar como característica diferencial. Para estos

debemos considerar los siguientes aspectos: (Granados y Villaverde, 2003)

Tamaño de las colonias:

Tamaño mediano, de 1 a 2 mm de diámetro.

Tamaño grande, de 4 a 6 mm de diámetro.

Extendidas en forma de velo invadiendo toda la superficie del medio sólido de

cultivo (tamaño grande).

Puntiformes con aproximadamente 0,5 mm de diámetro o inferiores.

Según la forma, elevación y borde que cada colonia podría presentar se dividen en los

siguientes:

26

Fuente: Granados y Villaverde, 2003

1.6.2. Morfología microscópica: Estudio de la estructura de las bacterias

Los aspectos de la morfología microscópica incluyen el tamaño, generalmente muy

pequeño (entre 0,1 y 4 micras), la forma y la agrupación. Conocer al menos su forma y

tipo de agrupación va a ser esencial y previo a cualquier proceso de identificación y

clasificación taxonómica. Dicha observación como se ha visto en los temas anteriores

puede llevarse a cabo a través de exámenes directos en fresco o por medio de tinciones

más o menos especificas según los casos. De cualquier manera, el estudio de la

morfología microscópica fundamentalmente va a incluir: (i) su forma como célula

procariota individual, y (ii) el tipo de agrupación celular en la cual se asocia (Granados

y Villaverde, 2003).

1.6.2.1. Estudio de su forma

De acuerdo con la forma que va a presentar esa bacteria como organismo individual se

debe considerar que las bacterias suelen adoptar fundamentalmente algunas de las

formas siguientes: (Granados y Villaverde, 2003)

Oval o esférica.

Cilíndrica o en forma de bastón.

Espiral o helicoidal

Filamentosa

Formas intermedias de algunos casos anteriores

Figura 1. Estudio macroscópico de las colonias.

27

Cuando la bacteria adopta forma esférica u oval recibe el nombre de coco o con forma

cocoidea. Muchos de estos microorganismos presentan diferentes formas de

agrupación, hecho que es muy útil para su identificación.

Cuando la bacteria adopta formas cilíndricas o bastón recibe el nombre de bacilo.

Algunos de estos bacilos tienden a agruparse, aunque con menor tendencia que en el

caso de las formas cocoides. Estas formas son características de algunos géneros,

como por ejemplo el Bacillus.

Cuando la bacteria adopta formas espirales recibe el nombre de espirilo; en estos casos

predominan las células individuales y más o menos aisladas.

Cuando adoptan formas filamentosas suelen presentar al microscopio óptico un aspecto

muy similar a los hongos.

Las formas intermedias se presentan en el caso de cocobacilos y vibriones.

1.6.2.2. Estudio de su agrupación bacteriana

De acuerdo con lo dicho las estructuras cocoides se pueden agrupar de la siguiente

forma:

Diplococos: es cuando se divide la bacteria en un plano permaneciendo unidos

en forma de parejas (Granados y Villaverde, 2003).

Estreptococos: es cuando la bacteria se divide en planos paralelos quedando

unidos entre si formando cadenas. Este tipo de agrupación es típica del Genero

Streptococcus.

Tétradas o Tetracocos: es cuando la bacteria se divide en dos planos

perpendiculares entre si formando grupos característicos de 4 células. Esta

agrupación es típica del Genero Micrococcus.

Estafilococos: es cuando la división tiene lugar en tres planos distintos formando

como consecuencia de estos racimos de cocos. Este tipo de agrupación es

típica del Genero Staphylococcus.

Sarcinas: hay determinados autores que engloban esta forma de agrupación

dentro de los Tetracocos, pero no son exactamente iguales. Esta agrupación se

forma como consecuencia de la división de la bacteria en tres planos

perpendiculares originando agrupaciones cuboides de en torno a 8 cocos o más.

28

Las agrupaciones bacilares son menos frecuentes, pero, en ocasiones, pueden

aparecer como:

Diplobacilos: corresponden a dos bacilos unidos como pareja y originados por la

división en un mismo plano.

Estreptobacilos: son agrupaciones de bacilos a modo de cadenas.

Formas irregulares: en ocasiones los bacilos pueden agruparse adquiriendo

formas muy irregulares análogas a las letras chinas. Este tipo de asociación es

característico del Genero Corynebacterium.

1.7. Pruebas bioquímicas para la identificación bacteriana

Una identificación bacteriana se puede realizar tras el estudio de característica

tintoreales morfológicas y bioquímicas de los microorganismos. La identificación

bioquímica se fundamenta en las características metabólicas específicas de cada

microorganismo y en la detección de la actividad de ciertas enzimas, etc. (Gamazo et

al., 2005).

Al igual que la mayor parte de los seres vivos, las bacterias son capaces de modificar el

ambiente que las rodea, captando sustancias necesarias para su multiplicación y

liberando al medio, productos de desecho, enzimas, exotoxinas, etc. Las interacciones

que cada tipo bacteriano establece con el entorno son propias y características. Esta

especificidad depende del genotipo de la bacteria y se expresa en un determinado

equipo enzimático. Por ello, la caracterización de dichas enzimas es una herramienta

útil para la identificación y clasificación bacterianas (Gamazo et al., 2005).

Con este fin, existe en el mercado una gran variedad de medios de cultivo diseñados no

solo para permitir el crecimiento y la multiplicación de los microorganismos, sino también

para inhibir los de algunos (medios selectivos) o resaltar determinadas características

metabólicas (medios diferenciales) (Gamazo et al., 2005).

A continuación, se presentan los medios de cultivo que se utilizan frecuentemente para

la identificación bacteriana:

29

Tabla 6. Medios de cultivo para la identificación bacteriana

1. Agar Sangre. Medio general rico en

nutrientes, además es un medio

diferencial beta-hemólisis (hemólisis

total); alfa-hemólisis (parcial); gamma

(sin hemólisis).

2. Agar MacConkey. Medio selectivo por

contener sales biliares y cristal violeta

que inhiben el crecimiento de las no

Enterobacterias. Es también un medio

diferencial, porque contiene lactosa y

un indicador de pH.

3. Prueba de citocromo c oxidasa.

Detecta la presencia de citocromo c en

la bacteria. Esta prueba, permite, por

ejemplo, diferenciar a la familia

Enterobacteriaceae (que carece el

citocromo c) del género Pseudomona

(que posee citocromo c).

4. Prueba de catalasa. Cuando se ponen

en contacto una bacteria con actividad

catalasa con peróxido de hidrógeno al 3%

se producen burbujas de oxígeno. Esta

prueba se puede emplear para diferenciar

el género Staphylococcus (catalasa

positiva) del género Streptococcus

(catalasa negativa).

5. Agar citrato de Simmons. Este medio

indica la capacidad de las bacterias de

metabolizar el citrato. Contiene citrato

como única fuente da carbono, fosfato

de amonio como única fuente de

fosfato y azul de bromotimol como

indicador de pH.

6. Agar fenilalanina. Medio que contiene

fenilalanina, empleado para determinar la

presencia de la enzima fenilalanina

desaminasa en las bacterias. El ácido

fenilpirúbico resultante se detecta

mediante la adición de cloruro férrico.

7. Agar de Kliger (KIA). Medio diferencial

complejo capaz de poner de manifiesto

simultáneamente varias

características enzimáticas de la

bacteria en aerobiosis y anaerobiosis:

fermentación de la glucosa;

fermentación de la lactosa; producción

de gas en la fermentación de ácido

sulfhídrico.

8. Agar manitol-sal. Medio selectivo (NaCl

al 7,5 %) y diferencial (manitol) muy

utilizado para el aislamiento e

identificación de Staphylococcus aureus.

9. Prueba de indol. Esta prueba se

emplea para detectar la presencia de la

enzima triptofanasa en las bacterias. Si

la bacteria posee la enzima

triptofanasa, al añadir el medio el

reactivo de Kovács, se producirá un

anillo de color rojo en la superficie del

caldo y la prueba será considerada

positiva.

10. Pruebas del rojo de metilo (RM) y

Voges-Proskauer (VP). Medios

diferenciales sutilizados para determinar

productos finales de la fermentación de la

glucosa: fermentación acido-mixta;

fermentación butilén glicólica.

Fuente: Gamazo et al., 2005

30

1.8. Pruebas de susceptibilidad

Siendo el Ecuador una potencia turística, en donde los balnearios de aguas termales

están teniendo una mayor acogida por la población nacional e internacional debido a

sus propiedades beneficiosas en la salud, es transcendental conocer la resistencia o

sensibilidad antibiótica de los microorganismos autóctonos y alóctonos que viven en

estas aguas.

Estas pruebas de susceptibilidad microbiana son válidas tanto para microorganismos de

importancia clínica como de importancia ambiental, considerando que nuestro objetivo

se basa en resultados cualitativos.

Lozano y Cercenado (2009), mencionan que el estudio de la sensibilidad de los

microorganismos a los antimicrobianos se realiza principalmente por técnicas de

dilución o de difusión, en donde la técnica de dilución proporciona resultados

cuantitativos y las de difusión cualitativos.

Los antibiogramas son métodos in vitro que determinan la susceptibilidad y resistencia

de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos, bajos condiciones

de laboratorio específicas y estandarizadas.

1.9. Diversidad y estabilidad de las comunidades microbianas

Generalmente la diversidad disminuye cuando una o unas pocas poblaciones alcanzan

densidades altas; los números elevados indican que una población individual ha

superado con éxito la competencia y ha logrado dominar en la comunidad. La diversidad

de especies de una comunidad es algo parecido a la diversidad genética de una

población, porque permite gran variedad de respuestas en un ecosistema dinámico

(Summers, 2005).

La diversidad de especies suele ser baja en los ecosistemas controlados físicamente,

porque las adaptaciones al estrés fisicoquímico imperante son prioritarias y dejan poco

espacio para la evolución de las interacciones entre las especies que se encuentran

integradas y en equilibrio. Los ambientes de turberas acidas, las fuentes termales y los

desiertos antárticos son ejemplos de hábitat controlados físicamente en los que la

diversidad de especies es relativamente baja. La diversidad de especies suele aumentar

31

en ecosistemas controlados biológicamente, es decir donde la importancia de las

interacciones entre poblaciones es superior al estrés abiótico (Summers, 2005).

1.9.1. Índices de diversidad de especies

Algunos índices matemáticos describen la riqueza y la distribución de especies en la

comunidad; son los índices de diversidad de especies, y se utilizan para describir el

conjunto de poblaciones de una comunidad. Los índices de diversidad raramente se han

aplicado a las comunidades microbianas debido a las dificultades técnicas para clasificar

los numerosos microorganismos que requiere su utilización (Summers, 2005).

Los índices de diversidad relacionan el número de especies y la importancia relativa de

las especies individuales. Los principales componentes de la diversidad de especies son

la riqueza de especies o variedad, y la uniformidad o equitatividad:

Tabla 7. Índices de diversidad de especies

Riqueza de especies (𝒅) 𝒅 =𝑺 − 𝟏

𝐥𝐨𝐠 𝑵

Donde 𝑺 = número de especies

𝑵 = número de individuos

Uniformidad (𝒆)

𝑒 =

𝐻

log 𝑆

Donde 𝐻 = índice de diversidad de

Shannon-Weaver

𝑆= número de especies

Equitatividad (𝑱)

𝑱 =

𝑯

𝑯𝒎𝒂𝒙

Donde 𝑯 = índice de diversidad de

Shannon-Weaver

𝑯𝒎𝒂𝒙 = valor máximo teórico del

índice de diversidad de Shannon-

Weaver para la población estudiada,

suponiendo que cada especie tenga

solamente un miembro

Fuente: Summers, 2005

La riqueza de especies puede expresarse mediante relaciones simples entre el número

total de especies y el número total de organismos. Es una medida del número de

especies en la comunidad, pero no de cuantos individuos existen de una especie

concreta (Rubio, 2016).

32

La equitatividad es una medida de la proporción de individuos dentro de cada especie e

indica si existen poblaciones dominantes.

Una medida de diversidad muy utilizada es el índice de Shannon-Weaver. Este índice

general de biodiversidad es sensible a la riqueza y a la abundancia relativa de especies.

Este índice debe de interpretarse con precaución porque es sensible al tamaño de la

muestra, especialmente en muestras pequeñas.

Tabla 8. Índice de diversidad de Shannon-Weaver

Índice de diversidad de

Shannon-Weaver (𝑯) 𝑯 =

𝑪

𝑵(𝑵 𝐥𝐨𝐠 𝑵 − ∑𝒏𝒊𝒍𝒐𝒈𝒏𝒊)

Donde 𝑪 = 2,3

𝑵 = número de individuos

𝒏𝒊= numero de individuos de

la especie i

Fuente: Rubio, 2016

1.10. Aguas termo-minerales de Baños de Agua Santa

Baños de Agua Santa es un Cantón que pertenece a la Provincia de Tungurahua, se

encuentra a una altura de 1.826 msnm, con una temperatura promedio de 20ºC. Posee

una población de 20.000 habitantes, y está ubicado en un valle a lado del volcán

Tungurahua (INEC, 2010).

Baños de agua Santa es una de las principales ciudades turísticas del Ecuador teniendo

como principal atractivo los balnearios de aguas termales que son conocidas por poseer

propiedades curativas para diversas enfermedades, entre las cuales podemos destacar

las enfermedades reumáticas crónicas, enfermedades respiratorias leves, etc.,

(Burbano et al., 2013).

La ciudad posee cinco balnearios municipales con aguas minerales y sulfurosas que

tienen temperaturas que van desde los 18ºC para las aguas frías hasta las hirvientes de

55ºC. Todas estas aguas emergen de las entrañas y deshielos del volcán Tungurahua

(Burbano et al., 2013).

Las cinco fuentes termales que hay en Baños son las siguientes: termas “La Virgen”,

termas “El Salado”, Balneario “Santa Ana”, Balneario “Las Peñas o Modernas”, “Santa

Clara” o “El Cangrejo” con piscina semi-olímpica (Burbano et al., 2013).

33

Fuente: Burbano et al, 2013

1.10.1. Aguas termo-minerales del Balneario Ecológico “Santa Ana”

Las termas de Santa Ana se encuentran ubicadas en la Av. Amazonas y s/n. Posee

aguas frías con una temperatura de 22ºC y aguas calientes con una temperatura de

35ºC. Las aguas termales del Balneario Ecológico “Santa Ana”, son de tipo sulfatadas,

magnésicas e hipertermales (Burbano et al., 2013).

Tabla 9. Balance iónico del balneario "Santa Ana"

ANION mg/l CATION mg/l OTRAS DETERMINACIONES

CO3H- 1274,00 Na+ 382,77 pH 7.3

CO3= 0,0 K+ 64,32 CE (uS/cm) 4810

SO4= 1358,0 Ca++ 103,10 DUREZA (mg/l) 2176

Cl- 367,26 Mg++ 466,2 TEMPERATURA (ºC) 44,80

NO3- 0,57 NH4+ 0,498

NO𝟐− <0,05 Fe2− 2,8

PO4= <0,5

OTRAS DETERMINACIONES

Turbidez

(NTU) 54

Cobre <0,25 OBSERVACIONES:

TIPO DE AGUA

SULFATADA

MAGNÉSICA,

HIPERTERMAL

Color 66 Cromo <1

Alcalinidad

(mg/l) 1274 Plomo <1

STD (mg/l) 3112,07 SiO2 1254

CO2 124,56

Fuente: Burbano et al., 2013

Figura 2. Mapa de ubicación del Balneario “Santa Ana” Baños-Tungurahua

34

CAPITULO II

2. METODOLOGÍA

2.1. Lugar de investigación

La presente investigación se llevó a cabo en las aguas termales del Balneario

“Santa Ana” perteneciente al cantón Baños de Agua Santa, Provincia de

Tungurahua, a una altitud de 1931 msnm, con una temperatura ambiente promedio

de 20ºC. Esta fuente de agua termal es de origen volcánico, de tipo hipertermal rica

en sulfuro y magnesio (Burbano et al., 2013).

Fuente

Reservorio

Piscina

Figura 3. Instalaciones del Balneario “Santa Ana” Baños-Tungurahua

35

2.2. Materiales, equipos y medios de cultivo

2.2.1. Materiales

Tabla 10. Materiales utilizados

MATERIALES

Mandil Pipetas automáticas

Asa de platino Tubos de ensayo

Matraz Erlenmeyer Puntas para pipetas

Cajas Petri Probeta

Cofia, guantes y mascarilla

desechables Lámpara de alcohol

Pizeta Palillos de dientes

Marcador indeleble Hielo

Cooler Hisopos de algodón

Placas portaobjetos Algodón

Cámara fotográfica Espátula

Fuentes de carbono para medio

mínimo (leche, mantequilla,

petróleo, almidón, celulosa)

Gasas

2.2.2. Equipos y reactivos

Tabla 11. Equipos y reactivos utilizados

EQUIPOS REACTIVOS

Multiparámetro HANNA Agua destilada

Estufa Cloruro mercúrico

Autoclave

Colorantes para Tinción Gram

(Cristal violeta, safranina, Lugol,

alcohol cetona)

Cámara de bioseguridad Aceite de inmersión

36

Cont. Tabla 11. Equipos y reactivos utilizados

EQUIPOS REACTIVOS

Microscopio Rojo Congo

Balanza digital Peróxido de hidrogeno al 3%

Cámara Luz ultravioleta Reactivos para el medio mínimo

2.2.3. Medios de cultivo

Tabla 12. Medios de cultivo utilizados

MEDIOS DE CULTIVO

Placas 3M Petrifilm Aerobios

totales Agar Agar

Placas 3M Petrifilm Coliformes

totales Agar Mueller Hinton

Placas 3M Petrifilm Mohos y

levaduras Agar MacConkey

Agar Antibiótico Agar Simmons Citrato

Agar Cetrimide Agar Urea

Agar Sangre Agar HPC

Caldo BHI Medio de Hugh-Leifson O-F

Agar Gelatina Agar SIM

2.3. Muestreo

El muestreo se realizó mediante la metodología descrita en la NORMA INEN 2 176-

98, AGUA. CALIDAD DEL AGUA. MUESTREO. TÉCNICAS DE MUESTREO, en el

Balneario Ecológico “Santa Ana” ubicado en el cantón Baños, de igual manera se

transportó las muestras bajo lo descrito en la NORMA INEN 2 169-98, AGUA.

CALIDAD DEL AGUA. MUESTREO. MANEJO Y CONSERVACIÓN DE

MUESTRAS.

El plan de muestreo consistió en recolectar 3 muestras representativas de agua y

una muestra de residuo sólido en caso de presencia. Se consideraron 3 zonas

37

(figura 3, pág. 34) diferentes del balneario, realizando el muestreo en 3 ocasiones,

durante un periodo de tiempo de 2 meses a una frecuencia de una muestra

quincenal. Se tomó muestras de: agua y residuo sólido de la fuente, agua del tanque

de reservorio, agua y residuo sólido de la piscina; procurando que fuesen

representativas y que no se contaminen (anexo A, pág. 99).

Las muestras de agua fueron tomadas en frascos para transporte de orina, estériles

de 250 ml, suficiente para realizar todos los análisis microbiológicos, y las muestras

de residuos sólidos fueron tomadas en recipientes para muestras fecales estériles.

Cada frasco se codificó según el lugar, fecha, hora y número de muestreo.

Previamente a la toma de muestra se llevó a cabo un aseo adecuado de manos,

brazos y antebrazos, al igual que el uso de vestimenta de protección adecuada:

Mandil, botas de trabajo, guantes y mascarilla (de ser necesario). Seguido se

procedió a tomar la muestra en contracorriente y tapar herméticamente el frasco sin

dejar burbujas dentro de este, sellándolo con cinta masqui para más seguridad, por

consiguiente, se los colocó en un cooler con hielo para mantener condiciones de

temperatura de 5ºC como menciona la (INEN, 1998b) para su correcto transporte

hacia el laboratorio.

2.4. Ensayos fisicoquímicos “in situ”

Los análisis fisicoquímicos “in situ” se llevaron a cabo con la ayuda del equipo

multiparámetro de marca HANNA, con el que, siguiendo el protocolo y la

metodología de este, se examinaron las muestras tomándose lectura de cada

parámetro: pH, temperatura, conductividad, potencial de oxidación-reducción,

salinidad, sólidos totales, resistividad y oxígeno disuelto (anexo B, pág. 100).

2.5. Análisis microbiológico

Una vez obtenidas las muestras fueron transportadas al laboratorio del Centro de

Biología de la Universidad Central del Ecuador, Quito, donde se llevaron a cabo los

análisis microbiológicos.

38

2.5.1. Recuento bacteriano

Para la determinación del número de bacterias correspondientes a Coliformes

totales/E. coli, mohos y levaduras se utilizaron los medios de cultivo en placas 3M

PetrifilmTM (anexo C, pág. 100), para cada tipo de microorganismo (APHA, 2005).

Cuantificación de Coliformes totales/E.coli: Se levantó la lámina

transparente superior y con ayuda de una pipeta de manera perpendicular a

la placa se agregó 1ml de la muestra de agua en el centro del medio, sin

tocarlo y soltar el film superior; seguidamente se baja el film y se coloca el

aplicador sobre el inóculo ejerciendo presión y evitando introducir burbujas

de aire, se esperó un minuto hasta que se solidifique el gel. Las placas se

incubaron cara arriba a 35ºC durante 48 horas; transcurrido el tiempo se

procedió al conteo de las colonias y se reportaron los resultados como

UFC/ml (3M Petrifilm, 2004).

Cuantificación de mohos y levaduras: Se alzó la lámina trasparente

superior y con ayuda de una pipeta de manera perpendicular a la placa se

agregó 1ml de la muestra de agua en el centro del medio, sin tocarlo y soltar

el film superior; seguidamente se baja el film y se coloca el aplicador sobre

el inóculo ejerciendo presión y evitando introducir burbujas de aire, se esperó

un minuto hasta que se solidifique el gel. Las placas se dejaron al ambiente

cara arriba con una temperatura de 25ºC durante 3-5 días; transcurrido el

tiempo se procedió al conteo de las colonias y se reportaron los resultados

como UFC/ml (3M Petrifilm, 2004).

Para la cuantificación de aerobios mesófilos se procedió a realizar una siembra por

extensión en superficie de la muestra de agua en agar antibiótico; y para la

determinación del número de Pseudomonas se realizó el mismo tipo de siembra en

agar Cetrimide (anexo D, págs. 100-101), siguiendo la siguiente metodología (Cano,

S., 2006):

1. Se prepararon los medios de cultivo para cada tipo de microrganismo y se los

vertió en las cajas Petri en donde se debe esperar que el medio de cultivo este

solidificado (uno 15ml/caja).

2. Se depositó en la superficie de agar 1ml de la muestra para el caso de aerobios

mesófilos y 0,5ml de la dilución para Pseudomonas.

39

3. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procedió a extenderla sobre

toda la superficie de la caja, usando un asa de Digrasky estéril.

4. Se esperó de 2 a 3 minutos a que se seque el inóculo.

5. Se llevaron las cajas a incubar a 37ºC durante 24-48 horas.

2.6. Caracterización macroscópica de colonias

Transcurrido el tiempo de incubación y cuantificación de bacterias, se realizó la

caracterización macroscópica a simple vista en la cámara de bioseguridad tipo I,

observando y comparando las características morfológicas de las colonias que

crecieron en la superficie del agar antibiótico sembradas por extensión en placa,

procedimiento que debe realizarse minuciosamente debido a que es el punto de

partida para obtener cepas puras.

En las colonias de cada caja se observó: tamaño, textura, superficie, borde, color,

elevación (figura 1, pág. 24) (Granados y Villaverde, 2003).

2.7. Purificación de los aislados bacterianos

Una vez obtenido las características morfológicas de cada colonia observada, se

realizó una división de las diversas colonias identificadas para analizarlas por

separado, dándonos un total de 32 cepas puras caracterizadas macroscópicamente.

Cada cultivo fue sembrado en caldo BHI (Brain heart Infusion), para obtener un mejor

crecimiento bacteriano, el caldo se lo preparó siguiendo las instrucciones del

fabricante, con la correcta rotulación de las cepas aisladas, llevándolas a incubar a

37ºC durante 24 horas (anexo E, pág. 101).

Teniendo los cultivos puros en caldo, se realizó el método de siembra por estría en

placa de cada cepa en agar antibiótico base (anexo F, pág. 102), para iniciar con las

pruebas bioquímicas que nos ayudaran con la identificación de los microorganismos

aislados.

Para el crecimiento de microorganismos anaerobios facultativos se aislaron las

bacterias en Caldo BHI en tubo y agar antibiótico base en caja con la particularidad

de que se dieron condiciones anaerobias (anexo E, pág. 101).

40

2.8. Identificación de microorganismos

2.8.1. Tinción Gram

Para obtener una caracterización microscópica de las bacterias aisladas se utilizó el

método de Tinción Gram, con el que se puede conocer la forma y tipo de agrupación

de la colonia, sean estos cocos o bacilos Gram positivos o Gram negativos, método

que es esencial y previo a cualquier proceso de identificación de microorganismos.

Con los cultivos puros sembrados en la caja, se procedió a realizar la tinción Gram

de la siguiente manera: Con un asa estéril, se tomó una muestra de la colonia,

seguidamente se realizó un frotis en el portaobjetos y se fijó la muestra con ayuda

de un mechero de alcohol. Con la muestra fija se añadió cristal violeta, se esperó

durante 1 min y se enjuagó con agua destilada, seguidamente se añadió lugol a la

muestra, se esperó por 1 minuto y se enjuagó con agua destilada, luego se añadió

el alcohol-cetona, se esperó 30 segundos y se enjuagó con agua destilada, por

último, se añadió safranina y se esperó durante 1 minuto, se enjuagó con agua

destilada y se secó la muestra con ayuda del mechero. Para finalizar se observó al

microscopio añadiendo aceite de inmersión (100x) (anexo G, pág. 102-103).

2.8.2. Pruebas bioquímicas

Una vez elaborada la tinción Gram a todas las colonias, se continuó con la

realización de las pruebas bioquímicas para cada cepa pura siguiendo los esquemas

propuestos por MacFaddin (2003) y Koneman (2008).

Dentro de las pruebas bioquímicas que se consideraron tenemos las siguientes:

Oxidasa

Esta prueba es importante para detectar la presencia o carencia (en caso de

anaerobios obligados) de la enzima citocromo-oxidasa en las bacterias, es muy

útil para diferenciar el género Enterobacterias (oxidasa negativa) de la especie

Pseudomona o Neisseria (oxidasa positiva). El papel indicador de la tirilla de

oxidasa contiene para-amino-N-dimetil-anilina, reactivo que es oxidado por el

citocromo oxidasa. (anexo H, págs. 103-104).

41

Metodología

1. Con la ayuda de una pinza estéril se tomó una tirilla de oxidasa y se la

colocó sobre una porción de colonia pura sembrada en la caja.

2. Se esperó 1 minuto, y si la tirilla cambia de color a azul-violeta la prueba

se considera positiva, caso contrario si la tirilla permanece del mismo

color la prueba se considera negativa (MacFaddin, 2003).

Catalasa

Esta prueba es utilizada para diferenciar miembros de la familia Micrococcaceae

de miembros de la familia Streptococcaceae.

Metodología

1. Con un asa estéril se tomó una muestra de la colonia pura y se realizó

un frotis sobre un portaobjetos previamente limpio.

2. Sobre la muestra se agregó 1-2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3%.

3. Si se observa producción de burbujas o efervescencia la prueba resulta

positiva para esa colonia, en caso contrario de no reaccionar el

peróxido de hidrógeno la prueba se considera negativa (MacFaddin,

2003)

SIM (Sulfuro-Indol-Movilidad)

Esta prueba es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol

de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo.

Metodología

1. Se preparó el medio SIM de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2. Teniendo un cultivo fresco de 18-24 horas en caldo BHI, se tomó con una

aguja de inoculación recta estéril un poco de muestra.

3. En un tubo se sembró por punción profunda hasta abarcar dos tercios de

profundidad del medio de cultivo desde la superficie (es importante que

la siembra sea en línea recta).

4. Se incubó a 37ºC durante 24 horas.

5. Luego pasado el tiempo de incubación, se agregó 3-5 gotas de reactivo

de Kovács.

42

6. Finalmente se leyeron los resultados, considerando la siguiente

interpretación: (Britanialab, 2015)

Cepas móviles

Producen turbidez del medio, que se

extiende más allá de la línea de

siembra

Cepas inmóviles El crecimiento se observa solamente

en la línea de siembra

Cepas 𝐇𝟐𝐒 positivas Ennegrecimiento a lo largo de la línea

de siembra o en todo el medio

Cepas 𝐇𝟐𝐒 negativas El medio permanece sin cambio de

color

Cepas indol positivas Desarrollo de color rojo luego de

agregar el reactivo de Kovács

Cepas indol negativas Sin cambios de color

TSI

Este medio universal es empleado para la diferenciación de enterobacterias, en

base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido

sulfhídrico.

Metodología

1. Se preparó el medio según las instrucciones del fabricante, al momento

de colocar el agar en el tubo se lo hizo en pico de flauta.

2. Con un asa de aro estéril se tomó muestra del cultivo puro en caldo BHI

y se inoculó picando el fondo del tubo y extendiendo sobre la superficie del

medio.

3. Se llevó a la incubadora de 37ºC durante 24 horas

4. Transcurrido el tiempo de incubación se tomaron los resultados según la

siguiente interpretación: (Britanialab, 2010)

Pico alcalino/fondo ácido (pico

rojo/fondo amarillo)

El microorganismo solamente

fermenta la glucosa

Pico ácido/fondo ácido (pico

amarillo/fondo amarillo)

El microorganismo fermenta

glucosa, lactosa y/o sacarosa

Pico alcalino/fondo alcalino

(pico rojo/fondo rojo)

El microorganismo es no

fermentador de azucares

43

La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica

que el microorganismo produce gas

El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo

produce ácido sulfhídrico

Simmons Citrato

Este medio es utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la

capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.

Metodología

1. Se preparó el medio de cultivo según las indicaciones del fabricante;

al momento de colocar el agar en el tubo se lo hizo en pico de flauta.

2. Con la ayuda de un asa de aro se tomó muestra de una colonia

aislada en caldo BHI (el cultivo puro debe ser de 18-24 horas).

3. Se inoculó en el tubo que contenía el medio mediante la siembra

primero por picadura y luego en estría en la superficie inclinada.

4. Se incubó a 37ºC durante 24-48 horas

5. Finalmente se leyeron los resultados, mediante la siguiente


Negativo

El medio permanece de color verde

debido a que no hay desarrollo

bacteriano y no hay cambio de color

Positivo Crecimiento y color azul en el pico,

alcalinidad

MacConkey

Este medio es esencial para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil

desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos, además que permite diferenciar

las bacterias que utilizan o no, lactosa. Toda la familia de enterobacterias se

desarrolla en el mismo.

Metodología

1. Se preparó el medio de cultivo según las indicaciones del fabricante

44

2. Terminado el autoclavado del medio, colocar 15 ml en cada caja Petri

y dejar secar hasta que solidifique.

3. Teniendo reactivadas las cepas con un hisopo estéril se tomó

muestra de las colonias sembradas en caldo BHI y se sembró con el

método de siembra por estría en placa.


5. Se leyeron los resultados según la siguiente interpretación:

(Britanialab, 2015)

Lactosa positiva El medio se torna de color azul

Lactosa negativa El medio no tiene cambio en su

coloración

Agar Sangre

Este medio es utilizado para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo

de numerosos microorganismos. La adición de sangre en el medio es útil tanto

para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios como anaerobios

exigentes a partir de una gran variedad de muestras, así también para la

observación de reacciones de hemólisis.

Metodología

1. Se preparó el medio de agar sangre según las instrucciones del

fabricante.

2. Se retiró el agar del autoclave y se dejó enfriar a 45-50ºC para

agregar sangre desfibrinada 5%, se homogenizó y se distribuyó en

las cajas.

3. Teniendo los cultivos puros en caldo BHI reactivados y solidificado el

medio, con ayuda de un hisopo estéril se tomó una muestra del tubo

y se sembró en la caja con el método de siembra por estría en placa.

4. Se llevó a incubar a 37ºC durante 24 horas.

5. Se leyeron los resultados de hemólisis según la siguiente


Hemólisis alfa Se produce un halo color verdoso

alrededor de la colonia

45

Hemólisis beta Se produce un halo claro y brillante


Hemólisis gamma El medio no presenta modificación

de color

Coagulasa

La prueba de coagulasa tiene por objetivo probar la capacidad de un

microorganismo de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa

(estafilocoagulasa). Esta prueba se utiliza para diferenciar especies dentro del

género Staphylococcus. También se utiliza para identificar definitivamente S.

aureus y con frecuencia se usa para indicar virulencia o patogenicidad.

Metodología

1. Una vez obtenido el plasma suficiente para la cantidad de colonias a

analizar se agregó 0,5ml en cada tubo de vidrio

2. Se tomó una muestra de la colonia directamente del caldo con un asa

estéril y se sembró en el tubo con el plasma mezclando suavemente.

3. Se incubó a 37ºC durante 4 horas

4. Se inclinó el tubo para ver si hay coágulo, en caso de haberlo el

resultado es positivo. (Gutiérrez, 2011)

Ureasa

Este medio es utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad

ureásica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como

Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.

Metodología

1. Se preparó el medio con los siguientes reactivos y proporciones:

Reactivos Estándar Para 200 ml

Urea 20 gr/ml 4 gr

Fosfato mono potásico 9.1 gr/ml 1,82 gr

Fosfato disódico 9.5 gr/ml 1.9 gr

Extracto de levadura 0.1 gr/ml 0.02 gr

Rojo fenol 0.001 gr/ml 0.002 gr

46

2. Terminado la esterilización en el autoclave se procedió a esterilizar una

aguja recta y se tomó un poco de muestra de una colonia aislada

3. Se inoculó en el tubo que contiene el agar mediante la siembra por

picadura.


5. Se leyeron los resultados, considerando las siguientes interpretaciones:

(Britanialab, 2010)

ACTIVIDAD UREÁSICA COLOR DEL MEDIO

Positiva Rojo-rosado

Positiva débil Rojo-rosado

Negativa Amarillo

Hidrólisis de gelatina

Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo para

producir enzimas proteolíticas que licuan la gelatina (gelatinasas)

Metodología

1. Se preparó el medio de cultivo, con los siguientes componentes:

Peptona 10.0 g

Cloruro de sodio 5.0 g

Extracto de carne 5.0 g

Gelatina 4.8 g

Agar 15.0 g

Agua destilada 1000.0 ml

2. Una vez autoclavado el medio y puesto en las cajas Petri, se tomó una

muestra del caldo BHI y se inoculó con filamento una estría en la

superficie del medio.

3. Se incubó a 37ºC por 2 a 7 días.

4. Transcurrido el tiempo de incubación se cubrió la placa con el reactivo

precipitante de proteínas (cloruro mercúrico ácido):

Cloruro mercúrico 15.0 g

Ácido clorhídrico concentrado 20.0 ml

Agua destilada 100.0 ml

47

5. Si al momento de colocar el reactivo se presenta un precipitado blanco,

indica presencia de gelatina no hidrolizada; la ausencia del precipitado

en la región de crecimiento bacteriano indica hidrólisis de gelatina

(Britanialab, 2015).

Medio Hugh-Leifson O/F

Se utiliza esta prueba para indicar el tipo de metabolismo energético de las

bacterias Gram negativas, sea este oxidativo (O) o fermentativo (F), utilizando

como sustrato la glucosa. Permite además determinar movilidad y producción de

gas.

Metodología

1. Se preparó el medio siguiendo las indicaciones del fabricante

2. Una vez esterilizado en el autoclave, se tomaron dos tubos de ensayo

para cada colonia y con la ayuda de un asa recta estéril se cogió un poco

de muestra de una colonia aislada.

3. Se inocularon ambos tubos por el método de picadura

4. El primer tubo se tapó suavemente a fin de permitir el ingreso de oxigeno

5. Al segundo tubo se le agregó 1.5-2ml de aceite mineral estéril y se tapó

completamente

6. Ambos tubos se incubaron a 37ºC durante 24 horas

7. Se leyeron los resultados, según la siguiente interpretación: (Britanialab,

2010)

Reacción Tubos con

reacción Tubo abierto Tubo cerrado

Oxidación Abierto Amarillo Verde

Fermentación Cerrado Abierto Amarillo

Amarillo

Amarillo

Amarillo

Sin oxidación o

fermentación Ninguna Azul o verde Verde

48

2.9. Caracterización biotecnológica de cepas identificadas

La realización de la caracterización biotecnológica de cada una de las cepas

bacterianas aisladas (anexo F, pág. 99), necesitó el empleo de un medio mínimo, en

el que las fuentes de carbono fueron diferentes para cada tipo de caracterización

realizada (Andueza, 2007).

La composición del medio mínimo se ilustra en la siguiente tabla.

Tabla 13. Composición del medio mínimo

Reactivos Para 200ml

Fosfato de sodio

monohidratado 1M 8ml

Oxalato de amonio 10% 2ml

Sulfato de magnesio 5% 2ml

Citrato hidro clorhídrico 10ml

Cloruro de calcio 10ml

Fuente: Andueza, 2007

Con respecto a las fuentes de carbono para un volumen de 200ml que se utilizó en

la caracterización tenemos:

Tabla 14. Fuentes de carbono para el medio mínimo

Fuente de carbono Tipo de microorganismo

Celulosa (8.3 ml) Celulolíticos

Mantequilla (4 ml) Lipolíticos

Leche (40 ml) Proteolíticos

Almidón soluble (0.4 g) Amilolíticos

Diésel (10 ml) Degradadores de

hidrocarburos

Para cada microorganismo sean, celulolíticos, lipolíticos, proteolíticos, amilolíticos y

degradadores de petróleo se utilizaron diversas composiciones químicas, las

49

mismas que se presentan en las tablas 15 y 16 (pág. 49), 17 y 18 (pág. 50) y 19

(pág. 51), respectivamente.

La preparación de los medios mínimos para cada caracterización abarcó un volumen

de 200 ml.

Tabla 15. Composición química del medio de cultivo para bacterias celulolíticas

Medio de cultivo

utilizado Composición Cantidad

Agar CMC

Peptona universal 0.5 g

Fosfato monobásico de

potasio 0.02 g

Fosfato di básico de

potasio 0.02 g

Agar-Agar 15.6 g

Celulosa 8.3 ml

Extracto de levadura 0.5 g

Sulfato de amonio 0.1 g

Cloruro de calcio 0.1 g

Fuente: Andueza, 2007

Tabla 16. Composición química del medio de cultivo para bacterias lipolíticas

Reactivos Cantidad

Fosfato de sodio monohidratado 1M 8 ml

Oxalato de amonio 10% 2 ml

Sulfato de magnesio 5% 2 ml

Citrato hidro clorhídrico 1% 10 ml

Cloruro de calcio 0.1% 10 ml

Agar-Agar 6 g

Mantequilla derretida 4 ml

Nota. Fosfato de sodio monohidratado 1M, citrato hidro

clorhídrico 1% y cloruro de calcio 0.1%, fueron agregados

después de la esterilización

50

Tabla 17. Composición química del medio de cultivo para bacterias proteolíticas

Reactivos Cantidad






Agar-Agar 6 g

Leche entera 40 ml




Tabla 18. Composición química del medio de cultivo para bacterias amilolíticas

Reactivos Cantidad






Agar-Agar 6 g

Almidón soluble 0,4 g




51

Tabla 19. Composición química del medio de cultivo para bacterias degradadoras de

petróleo

Reactivos Cantidad






Agar-Agar 6 g

Diésel 10 ml

Fosfato de sodio monohidratado 1M, citrato hidro clorhídrico

1% y cloruro de calcio 0.1%, fueron agregados después de la

esterilización

Una vez finalizada la preparación de los medios de cultivo, y la reactivación de los

cultivos puros, se procedió a sembrar todas las cepas en cada uno de los medios

con ayuda de un hisopo estéril. Seguidamente se incubaron a 37ºC, durante 2-7

días.

Para la revisión de los resultados, se necesitó la utilización de reactivos para

revelado, tal como se resume en la tabla 20.

Tabla 20. Interpretación de resultados para la caracterización biotecnológica

Tipo de

microorganismo Reactivo Interpretación

Celuloliticos Mancha de color en la tira de papel

Lipolíticos

Rojo Congo + fosfato

cálcico concentrado +

ácido clorhídrico

Formación de un halo transparente


Proteolíticos Ácido acético Formación de un halo transparente


Amilolíticos Lugol

Formación de un halo transparente

alrededor de la colonia, el medio se

tornará de color azul

52

Cont. Tabla 20. Interpretación de resultados para la caracterización

biotecnológica

Tipo de

microorganismo Reactivo Interpretación

Degradadores de

petróleo Peróxido de hidrógeno

Se tendrá presencia de burbujeo o

efervescencia en la colonia al

momento de colocar el reactivo

Fuente: Jácome, 2017

2.10. Índice de diversidad microbiana

Para el estudio, se calculó el índice de riqueza de especies, el cual se expresa

mediante el índice de Margalef (1958):

Riqueza de especies

(𝑑)

𝑑 =𝑆 − 1

log 𝑁

Donde 𝑆 = número de

especies

𝑁 = número de individuos

La riqueza de especies se expresa mediante una relación simple entre el número

total de especies y el número total de organismos, es una medida del número de

especies de la comunidad, pero no de cuantos individuos existen de una especie

concreta (Rubio, 2016).

Puede parecer que un índice apropiado para caracterizar la riqueza de especies de

una comunidad sea el “número total de especies” (S). Sin embargo, es

prácticamente imposible enumerar todas las especies de la comunidad y, como S

depende del tamaño de la muestra, es limitado como índice comparativo.

2.11. Sensibilidad antimicrobiana

La prueba por antibiogramas se realizó por el método de Kirby Bauer. Esta prueba

se llevó a cabo en placas de agar Mueller Hinton y se la realizó a cada una de las

cepas bacterianas, trabajando con los siguientes discos de antibióticos: ampicilina

(10 µg), eritromicina (15 µg), sulphamethoxazole / trimetoprim (25 µg) y fosfomicina

(50 µg).

53

Con ayuda de un hisopo estéril se tomó una muestra de la colonia desde el caldo

lactosado y se realizó una siembra por estría en la superficie del agar, luego se dejó

secar por 10 minutos (Cavalieri et al, 2005).

Una vez seco el inóculo se colocaron los discos de sensibilidad individualmente con

ayuda de una pinza esterilizada, las cajas se llevaron a incubar a 37º C durante 18-

24 horas (anexo G, pág. 102-103); terminada la incubación se midieron los halos

de inhibición con una regla y se tomaron los resultados según las siguientes

interpretaciones:

Tabla 21. Antibiograma de discos. Interpretación de resultados

ANTIMICROBIANO Disco (µg)

Zona inhibición

(mm) OBSERVACIONES

R (≤) S(≥)

Ampicilina 10 14 14 Entéricos y Enterococo

Ampicilina 10 29 29 Staphylococcus y otros

sensibles a Penicilina G

Eritromicina 15 18 18

Trimetoprim /

sulphamethoxazole 1.25/23.75 19 19

Fosfomicina 50 21 21

*R=Resistente; S=Susceptible/Sensible

Fuente: Bernal y Guzmán, 1984; Cavalieri, 2005

54

CAPITULO III

3. RESULTADOS

3.1. Parámetros fisicoquímicos “in situ”

Con la ayuda de un multiparámetro marca HANNA se obtuvieron los datos descritos en

las tablas 22 (pág. 54), 23 y 24 (pág. 55) y 25 (pág. 56) en donde se detallan los

resultados de los análisis fisicoquímicos tomados “in situ” del primero, segundo y tercer

muestreo además de los datos promedios de los muestreos realizados en el balneario

“Santa Ana”.

Tabla 22. Parámetros fisicoquímicos “in situ” del primer muestreo del balneario “Santa

Ana”

Parámetros Unidades Fuente Reservorio Piscina Varianza

(σ)

Desviación

estándar (s)

Temperatura

del agua ºC 48 39 35 44.3 6.7

Potencial de

oxidación -

reducción

mV -45.0 -56.2 -79.8 315.6 17.8

pH Unidades de pH 7.30 7.31 7.93 0.1 0.4

Conductividad µS/cm 4980 5070 4710 0.0 0.2

Oxígeno

disuelto mg/l 5.94 5.91 4.83 0.4 0.6

Salinidad mg/l 2.7 2.7 2.5 0.0 0.1

Resistividad Ω x cm 201 198,8 211 42.3 6.5

TDS mg/l 4960 5010 4780 0.0 0.1

55

Tabla 23. Parámetros fisicoquímicos “in situ” del segundo muestreo del balneario

“Santa Ana”


(σ)

Desviación

estándar (s)

Temperatura

del agua ºC 42 38.7 28.3 51.1 7.2

Potencial de

oxidación -

reducción

mV -29.02 -54.0 -104.3 1470.2 38.3

pH Unidades de pH 7.02 7.43 8.27 0.4 0.6


Oxígeno

disuelto mg/l 3.52 5.32 6.10 1.8 1.3

Salinidad mg/l 2.5 2.6 2.6 0.0 0.1

Resistividad Ω x cm 212 208 208 5.3 2.3

TDS mg/l 4680 4810 4790 0.0 0.1

Tabla 24. Parámetros fisicoquímicos “in situ” del tercer muestreo del balneario “Santa

Ana”


(σ)

Desviación

estándar (s)

Temperatura

del agua ºC 44 40 32.4 34.7 5.9

Potencial de

oxidación -

reducción

mV -38.0 -55.1 -90.05 1354.6 36.8

pH Unidades de pH 7.3 8 8 0.2 0.4


Oxígeno

disuelto mg/l 4.16 3.91 5.18 0.5 0.7

Salinidad mg/l 2.5 2.6 2.6 0.0 0.1

Resistividad Ω x cm 216 209 206 26.3 5.1

TDS mg/l 4630 4780 4840 0.0 0.1

56

Tabla 25. Parámetros fisicoquímicos promedios “in situ” del balneario “Santa Ana”


(σ)

Desviación

estándar

(s)

Temperatura

del agua ºC 44.7 39.2 31.9 41.0 6.4

Temperatura

ambiente ºC 20 20 20 0.0 0.0

Potencial de

oxidación -

reducción

mV -37.3 -55.1 -91.4 758.8 27.5

pH Unidades de

pH 7.2 7.6 8.1 0.2 0.4


Oxígeno

disuelto mg/l 4.5 5.0 5.4 0.2 0.4

Salinidad mg/l 2.6 2.6 2.6 0.0 0,0

Resistividad Ω x cm 209.7 205.3 208.3 5.1 2.3

TDS mg/l 4960 4900 4800 0.0 0.1

Los datos descritos en la tabla 25 detallan los resultados promedios de los análisis

fisicoquímicos tomados “in situ” del balneario “Santa Ana”.

Como se muestra la tabla 25, la temperatura registrada en la fuente tuvo un valor

promedio de 44.7ºC, siendo la mayor, considerando las que se obtuvieron en el

reservorio (39.2ºC) y piscina (31.9ºC). Teniendo una temperatura ambiente promedio de

20ºC y una temperatura de emanación de 44.7ºC, se caracteriza a esta agua como

hipertermal.

Se obtuvo un valor promedio de pH básico en las tres zonas, reportándose 7.2 para la

fuente, 7.6 para el reservorio y 8.1 para la piscina.

Con respecto a la conductividad los valores promedios obtenidos fueron: 4800 µS/cm

para la fuente, 4900 µS/cm para el reservorio y 4800 µS/cm para la piscina.

Se observa cantidades promedios elevadas de sólidos totales en las aguas de este

balneario, revelando una gran concentración de minerales, tal como se muestra en la

57

tabla 25, el mayor valor se obtuvo en la fuente teniendo 4960 mg/l, seguido por el

reservorio 4900 mg/l y la piscina 4800 mg/l.

El oxígeno disuelto exhibe valores promedios de 4.5 mg/l para la fuente, 5.0 mg/l para

el reservorio y 5.4 mg/l para la piscina.

3.2. Recuento bacteriano

3.2.1. Cuantificación de aerobios mesófilos

Tabla 26. Resultado de la cuantificación de aerobios mesófilos totales (UFC/ml) del

balneario “Santa Ana”

Lugar

Muestra

Nº1

(UFC/ml)

Muestra

Nº2

(UFC/ml)

Muestra

Nº3

(UFC/ml)

Media ( )

(UFC/ml)

Fuente 8x10 1.1x10 1.48x102 7.97x10

Reservorio 1.03x102 4.6x10 7.37x102 2.95x𝟏𝟎𝟐

Piscina 5.1x10 1.2x10 1.65x103 5.73x𝟏𝟎𝟐

PROMEDIO

DEL

BALNEARIO

7.8x10 2.3x10 8.47x𝟏𝟎𝟐 3.16x𝟏𝟎𝟐

8%

31%61%

Porcentaje Aerobios Totales

PiscinaReservorio

Fuente

Figura 4. Resultado del contaje de aerobios mesófilos del balneario “Santa Ana”

58

Relacionando la tabla 26 con la figura 4, podemos observar que en la fuente la cantidad

de bacterias mesófilas promedio fue de 7.97x10 UFC/ml (8%), en el reservorio de

2.95x102 UFC/ml (31%) y en la piscina fue de 5.73x102 UFC/ml (61%). Lo que nos lleva

a un valor promedio en todo el balneario de 3.16x102 UFC/ml.

3.2.2. Cuantificación de coliformes totales (UFC/ml)

Tabla 27. Resultado de la cuantificación de coliformes totales del balneario “Santa

Ana” (UFC/ml)

Lugar

Muestra

Nº1

(UFC/ml)

Muestra

Nº2

(UFC/ml)

Muestra

Nº3

(UFC/ml)

Media ( )

(UFC/ml)

Fuente 4.5x10 2.1x10 3.0x10 3.2x10

Reservorio 0 0 0 0

Piscina 1.28x102 9.5x10 1.0x102 1.08x𝟏𝟎𝟐

PROMEDIO

DEL

BALNEARIO

5.8x10 3.9x10 4.3x10 4.7x10

En cuanto al resultado en el contaje de coliformes totales, relacionando la tabla 27 con

la figura 5, podemos observar que en la fuente se obtuvo una cantidad promedio de

3.2x10 UFC/ml (23%), en el reservorio no se reportaron coliformes totales (0%) y en la

23%

0%77%

Porcentaje de Coliformes Totales

Reservorio

Fuente

Piscina

Figura 5. Resultado del contaje de coliformes totales del balneario “Santa Ana”

59

piscina fue de 1.08x102 UFC/ml (77%). Lo que nos lleva a un valor promedio del todo el

balneario de 4.7x10 UFC/ml.

3.2.3. Cuantificación de mohos y levaduras (UFC/ml)

Tabla 28. Resultado de la cuantificación de mohos y levaduras del balneario “Santa

Ana”

Lugar

Muestra Nº1

(UFC/ml)

Muestra Nº2

(UFC/ml)

Muestra Nº3

(UFC/ml) Media( ) (UFC/ml)

Mohos Levaduras Mohos Levaduras Mohos Levaduras Mohos Levaduras

Fuente 1.2x10 0 0 0 0.2x10 1.7x10 0.5x10 0.6x10

Reservorio 4.8x10 0.7x10 0 0 4.8x10 0 3.2x10 0.2x10

Piscina 2.8x10 2.4x10 0.6x10 0 3.6x10 0 2.3x10 0.8x10

PROMEDIO

DEL

BALNEARIO

2.9x10 1.03x10 0.2x10 0 2.9x10 0.56x10 2x10 0.53x10

Figura 6. Resultado del contaje de mohos y levaduras del balneario “Santa Ana”

79%

21%

PORCENTAJE DE MOHOS Y LEVADURAS

Mohos

Levaduras

60

Con respecto al resultado del contaje de mohos (79%), según lo reportado en la tabla

28 (pág. 59), podemos observar que se obtuvo un valor promedio de mohos de 0.5x10

UFC/ml en la fuente, 3.2x10 UFC/ml en el reservorio y 2.3x10 UFC/ml en la piscina. Lo

que nos lleva a un valor promedio total de mohos en el balneario de 2x10 UFC/ml.

Por el contrario, respecto al resultado del contaje de levaduras (21%), según lo

reportado en la tabla 28, podemos mencionar que se obtuvo un valor promedio de

0.6x10 UFC/ml en la fuente, 0.2x10 UFC/ml en el reservorio y 0.8x10 UFC/ml en la

piscina. Lo que nos lleva a un valor promedio de levaduras en el balneario de 0.53x10

UFC/ml.

3.2.4. Cuantificación de Pseudomonas (UFC/ml)

Tabla 29. Resultado de la cuantificación de Pseudomonas del balneario “Santa Ana”

(UFC/ml)

Lugar

Muestra

Nº1

(UFC/ml)

Muestra

Nº2

(UFC/ml)

Muestra

Nº3

(UFC/ml)

Media ( )

(UFC/ml)

Fuente 8x10 2x10 0 33.3

Reservorio 6x10 2x10 2x10 33.3

Piscina 0 2x10 2x10 13.3

PROMEDIO

DEL

BALNEARIO

5x10 2x10 1.3x102 26.7

61

Figura 7. Resultado del contaje de Pseudomonas del balneario “Santa Ana”

Con respecto al resultado del contaje promedio de Pseudomonas, considerando lo

descrito en la tabla 29 y figura 7, podemos observar que se obtuvo un valor promedio

de 33.3 UFC/ml de Pseudomonas en la fuente (42%), 33.3 UFC/ml en el reservorio

(42%) y 13.3 UFC/ml en la piscina (16%). Lo que nos lleva a un valor promedio total en

el balneario de 26.7 UFC/ml.

3.3. Resultados de las propiedades tintoreales de las bacterias aisladas

del balneario “Santa Ana”

3.3.1. Resultados de la tinción Gram de las bacterias aisladas

Tabla 30. Resultados de la cuantificación de bacterias Gram positivas y Gram

negativas del balneario “Santa Ana”

Bacterias Gram positivas y Gram negativas

Lugar Gram+ Gram- TOTAL

Fuente 4 5 9

Reservorio 3 8 11

Piscina 4 8 12

TOTAL 11 21 32

42%

42%

16%

Porcentaje de Pseudomonas

Reservorio

Piscina

Fuente

62

34%

66%

Porcentaje de Gram+ y Gram-

Gram-

Gram+

Figura 8. Porcentaje de microorganismos Gram positivos y Gram negativos en el balneario “Santa Ana”

63

3.4. Resultados de las pruebas bioquímicas

3.4.1. Bacterias Gram negativas

Tabla 31. Resultados de las pruebas bioquímicas de las cepas bacterianas Gram negativas del balneario “Santa Ana”

CEPAS TINCION CATALASA OXIDASA

MACCONKEY

AGAR SANGRE

- HEMOLISI

S

SIMMONS CITRATO

TSI

UREA

SIM O/F

Pico /Fondo

Producción de gas

Producción de ácido

sulfhídrico

Movilidad

Indol Producción de ácido sulfhídrico

Oxidación

Fermentación

C.P. 1 Cocos G- + + Si

creció

No fermenta lactosa

Gamma + A/A - + + - + - + -

C.P. 8 Bacilos G- + + Si

creció

No fermenta lactosa

Beta - K/A - - + + + - + -

C.P. 9 Cocos G- + + Si

creció fermenta lactosa

Beta - A/A - - + - - + + -

C.P. 10 Bacilos G- - + Si

creció

No fermenta lactosa

Beta - K/A + - + - - - + +

C.P. 12 Bacilos G- - - Si

creció

No fermenta lactosa

Gamma - K/A + + - + + + + +

C.P. 14 Bacilos G- + - Si


Gamma - A/A + - - + + - + +



Beta + A/A + + - + + + + +

C.P. 16 Diplococo

s G- + +

Si creció

fermenta lactosa

Gamma + K/A + - + + - - + -


creció

No fermenta lactosa

Gamma - A/A + - - + + + + +


creció

No fermenta lactosa

Alfa + K/A - - + - - - + +



Alfa + A/A + - - + + - + +

64

Cont. Tabla 31. Resultados de las pruebas bioquímicas de las cepas bacterianas Gram negativas del balneario “Santa Ana”

CEPAS TINCION CATALASA OXIDASA

MACCONKEY

AGAR SANGRE

- HEMOLISI

S

SIMMONS CITRATO

TSI

UREA

SIM O/F

Pico /Fondo

Producción de gas

Movilidad Movilidad


Oxidación

Fermentación


creció

No fermenta lactosa

Alfa + K/A + - - - + - + +

C.P. 21 Diplococo

s G- + +

Si creció

No fermenta lactosa

Beta + K/A + + - + - + + -


creció

No fermenta lactosa

Beta + K/A + + - + + + + +


creció

No fermenta lactosa

Beta + A/A + - - + + - + +



Gamma - A/A + - - + + - + +


creció

No fermenta lactosa

Beta + K/A + + - + + - - +



Gamma - A/A + - - + + + + +


creció

No fermenta lactosa

Alfa + K/A + + + - + + + +

C.P. 30 (solido1

) Bacilos G- + +

Si creció

+ K/A + + + - - + + +

C.P. 31 (solido2

) Bacilos G- + -

Si creció

No fermenta lactosa

Beta + A/A + + + + - + + +

A: ácido, K: alcalino, O/F: prueba bioquímica de Hugh-Leifson, +: positivo, -: negativo, C.P: cultivo puro bacteriano

65

3.4.2. Bacterias Gram positivas

Tabla 32. Resultados de las pruebas bioquímicas de las cepas bacterianas Gram positivas del balneario “Santa Ana”

CEPAS TINCIÓN CATALAS

A OXIDASA

MACCONKEY AGAR

SANGRE - HEMOLISIS

CITRATO

COAGULASA

TSI UREA

SIM HIDRÓLISIS

DE GELATINA

O/F

Pico/Fondo

Producción

de gas

Producción de ácido sulfhídrico

Movilidad


Oxidación

Fermentación

C.P. 2 Bacilos G+ + - No

creció ____ Beta + - A/A - - - - - - + - +


creció ____ Gamma - - A/A - - + - - - + + +


creció ____ Gamma - - A/A + + - + - + + - -

C.P. 5 Bacilos G+ + + No

creció ____ Beta - - A/A - - - - + - - + +

C.P. 6 Cocos G+ + + Si

creció ____ Alfa - - K/K - - - - + - + + +

C.P. 7 Cocos G+ - + Si

creció

No fermenta lactosa

Alfa - - A/A - - + - - - - - +

C.P. 11 Cocos en tetra G+

- + Si

creció Fermenta

lactosa Alfa + - A/A - - - - - - + + +

C.P. 12.1

(solido)

Diplococos G+

+ - Si

creció Fermenta

lactosa - - K/A + + - + + + + + +

C.P 13 Bacilos G+ + + Si

creció

No fermenta lactosa

Gamma - - K/K + + + + + + + + +

C.P. 22 Staphyloco

ccus G+ + -

Si creció

Fermenta lactosa

Gamma + - K/A + - + + - + + + +

C.P. 23 Bacilos G+ + - Si

creció Fermenta

lactosa Beta - - A/A + - + + - - + + +

A: ácido, K: alcalino, O/F: prueba bioquímica de Hugh-Leifson, +: positivo, -: negativo, C.P: cultivo puro bacteriano

66

3.5. Género y especies bacterianas identificadas de las colonias aisladas

del balneario “Santa Ana”

3.5.1. Géneros y especies de bacterias identificados

Tabla 33. Resultado de la identificación de géneros y especies bacterianos aislados

del balneario "Santa Ana"

GRAM NEGATIVOS

LUGAR CEPAS GÉNERO ESPECIE CEPAS GÉNERO ESPECIE

Fuente

CP1 Psychrobacter Psychrobacter

immobilis

CP30(soli

doM3) Actinobacillus

Actinobacillus

lignieresii

CP8 Pseudomonas Pseudomonas

sp CP14 Escherichia

Escherichia

hermanii

CP17 Aeromonas Aeromonas

hydrophila

Reservorio

CP19

Aeromonas

Aeromonas

caviae CP18 Yokonella

Yokonella

regensburgei

CP28 Aeromonas

hydrophila CP9

Psychrobacter

Psychrobacter

immobilis

CP29 Aeromonas

media CP16

Psychrobacter

immobilis

CP15 Aeromonas

hydrophila CP21 Alcaligenes

Alcaligenes

latus

Piscina

CP20

Aeromonas

Aeromonas

media CP26

Citrobacter

Escherichia

hermanii

CP24 Aeromonas

hydrophila

CP31(Pis

cina M3,

sólido)

Citrobacter

freundii

CP25 Aeromonas

caviae

CP12(sóli

do

piscina,

M2)

Edwardsiella

tarda

CP10 Actinobacillus Actinobacillus

lignieresii CP27 Pseudomonas

Pseudomonas

fluorescens

67

Cont. Tabla 33. Resultado de la identificación de géneros y especies

bacterianos aislados del balneario "Santa Ana"

GRAM POSITIVOS

LUGAR CEPAS GÉNERO ESPECIE CEPAS GÉNERO ESPECIE

Fuente

CP7

Staphylococc

us

Staphylococc

us sp CP13 Bacillus spp Bacillus alvei

CP12.1(

SOLIDO

, M2)

Staphylococc

us klosii CP6

Peptostreptoc

occus

Peptostreptococ

cus

saccharolyticus

Reservorio

CP23

Bacillus spp

Bacillus

stearothermo

philus

CP3 Bacillus spp Bacillus

mycoides

CP2 Bacillus

mycoides

CP4(SÓLI

DO

PICINA,

M1)

Kurthia Kurthia gibsonii

CP22 Staphylococc

us

Staphylococc

us cohnii

subsp.

Urealyticum

Piscina

CP5(SÓ

LIDO

PISCIN

A, M1)

Corynebacteri

um

Corynebacteri

um striatum CP11 Actinomices

Actinomices

meyeri

3.5.2. Porcentaje de especies bacterianas identificadas

Psychrobacter10%

Pseudomonas9%

Aeromonas22%

Actinobacillus6%

Enterobacteriace16%

Alcaligenes3%

Bacillus13%

Peptostreptococcus3%

Staphylococcus9% Kurthia

3%

Corynebacterium3%

Actynomices3%

Porcentaje de géneros bacterianos

Psychrobacter

Pseudomonas

Aeromonas

Actinobacillus

Enterobacteriace

Alcaligenes

Bacillus

Peptostreptococcus

Staphylococcus

Kurthia

Corynebacterium

Actynomices

Figura 9. Porcentaje de géneros bacterianos aislados del balneario "Santa Ana"

68

3.6. Caracterización biotecnológica de las especies bacterianas aisladas e

identificadas

Tabla 34. Caracterización biotecnológica de las especies bacterianas aisladas del balneario "Santa Ana"

ESPECIES Celuloliticos Lipolíticos Proteolíticos Amilolíticos Degradadoras

de petróleo

Psychrobacter

immobilis - - - + -

Pseudomonas sp + + + + +

Pseudomonas

fluorescens + + + + +

Aeromonas hydrophila + - + + +

Aeromonas caviae + - + - -

Aeromonas media + + + - +

Actinobacillus

lignieresii - + + + -

Escherichia hermanii + + - + +

Yokonella regensburgei - + + - +

Citrobacter freundii + + + + +

Edwardsiella tarda + + + + -

Alcaligenes latus + - - + -

Bacillus alvei - - + + -

Bacillus mycoides - - + + -

Figura 10. Porcentaje de especies bacterianas aisladas del balneario "Santa Ana"

0%2%4%6%8%

10%12%14%

Psychrobacter…

Pse

ud

om

on

a sp

Pseudomona…

Ae

rom

on

a h

ydro

ph

ila

Ae

rom

on

a ca

viae

Ae

rom

on

a m

edia

Actinobacillus…

Esch

eric

hia

he

rman

ii

Yoko

nella…

Cit

rob

acte

r fr

eun

dii

Edw

ard

siel

la t

ard

a

Alc

alig

enes

latu

s

Bac

illu

s al

vei

Bac

illu

s m

yco

ides

Bacillus…

Pep

tostreptococcus…

Stap

hilo

coccus…

Stap

hyl

oco

ccu

s sp

Stap

hilo

cocc

us

klo

sii

Ku

rth

ia g

ibso

nii

Corynobacterium…

Act

yno

mic

es m

eyer

i

9%

6%

3%

13%

6%

3%

6% 6%

3% 3% 3% 3% 3%

6%

3% 3% 3% 3% 3% 3% 3% 3%

PORCENTAJE

69

Cont. Tabla 34. Caracterización biotecnológica de las especies

bacterianas aisladas del balneario "Santa Ana"

ESPECIES Celuloliticos Lipolíticos Proteolíticos Amilolíticos Degradadoras

de petróleo

Bacillus

stearothermophilus + - + - -

Peptostreptococcus

saccharolyticus + - - - -

Staphylococcus cohnii

subsp. Urealyticum + + + + +

Staphylococcus sp - - - + -

Staphylococcus klosii + + + - +

Kurthia gibsonii + + + - +

Corynebacterium

striatum + + - - +

Actinomices meyeri - - + + -

+ (Se registró crecimiento); - (No registró crecimiento)

3.7. Cálculo del índice de diversidad microbiana

Tabla 35. Resultado de la riqueza de especies del balneario "Santa Ana"

Riqueza de especies (𝒅)

Primer muestreo 5

Segundo muestreo 5

22%

18%

23%

21%

16%

Porcentaje de la caracterización biotecnológica según las fuentes de carbono

Celuloliticos

Lipoliticos

Proteoliticos

Amiloliticos

Degradadoras de petroleo

Figura 11. Porcentaje de especies bacterianas caracterizadas biotecnológicamente

70

Riqueza de especies (𝒅)

Tercer muestreo 9

Riqueza total de

especies 19


Tabla 36. Resultados de los antibiogramas de las especies bacterianas aisladas del balneario "Santa Ana"

ESPECIES Eritromicina

(15 µg)

Ampicilina

(10 µg)

Suphamethoxazole /

Trimetoprim (25 µg)

Fosfomicina

(50 µg)

Psychrobacter immobilis R R R S

Pseudomonas sp R R R R

Pseudomona fluorescens R R R R

Aeromonas hydrophila S S S S

Aeromonas caviae R S S S

Aeromonas media R S S S

Actinobacillus lignieresii R R R S

Escherichia hermanii S S S S

Yokonella regensburgei R R S R

Citrobacter freundii R R R S

Edwardsiella tarda R S S S

Alcaligenes latus R R R R

Bacillus alvei R S S S

Bacillus mycoides S S S R

Bacillus

stearothermophilus S R S S

Peptostreptococcus

saccharolyticus S S S S

Staphylococcus cohnii

subsp. Urealyticum R R S S

Staphylococcus sp S S S S

Staphylococcus klosii R R S S

Kurthia gibsonii R R R R

Corynebacterium striatum R R R S

Actinomices meyeri S S S S

R: resistente, S: sensible

Cont. Tabla 35. Resultado de la riqueza de especies del balneario "Santa Ana"

71

CAPITULO IV

4. DISCUSIÓN

4.1. Parámetros fisicoquímicos “in situ”

En las tablas 22 (pág. 54), 23 y 24 (pág. 55) se recogen los datos generales

correspondientes a las constantes fisicoquímicas tomadas “in situ” del primer,

segundo y tercer muestreo respectivamente realizado en la fuente, reservorio y

piscina del balneario “Santa Ana” del cantón Baños de Agua Santa.

En la tabla 25 (pág. 56) se puede observar que la temperatura ambiente se

encuentra en el orden de los 20ºC, y la temperatura de emanación del agua termal

alrededor de los 45ºC, siendo el valor de temperatura de emanación mayor con 25ºC

a la temperatura del ambiente del lugar, se cumple lo descrito por Burbano (2013),

quien afirma que para que un agua se considere termal, esta debe estar por encima

de los 5ºC de la temperatura ambiente de la zona en que se encuentra.

En los análisis realizados por el INAMHI en el 2013, se reporta una temperatura de

44.80ºC para el balneario “Santa Ana”, dato que concuerda con la temperatura que

se registró en este estudio, razón por la que las aguas siguen siendo consideradas

hipertermales de acuerdo a la clasificación dada por Burbano et al (2013), que

menciona que se consideran hipertermales las aguas que cuenten con temperaturas

mayores o iguales a 40ºC. Así mismo Maraver, F., et al (2004) en el Vademécum de

Aguas Mineromedicinales Españolas, considera hipertermal a las aguas que

presentan temperaturas mayores a 37ºC.

En este caso la temperatura del agua del reservorio (39.2ºC) y la piscina (31.9ºC)

son menores a la de la fuente, esta diferencia de temperatura se puede atribuir a la

distancia recorrida por el agua desde la fuente hasta el reservorio y la piscina,

recorrido que el agua lo realiza por mangueras y tuberías de PVC, pero sigue

cumpliendo con los criterios de termalidad, debido a que el agua es de origen

hipertermal.

Disponer con un agua de origen hipertermal, resulta beneficioso para el estudio y

crecimiento de microorganismos autóctonos de este ecosistema que resistan

temperaturas elevadas, debido a que por su temperatura óptima de crecimiento

72

pueden contener características biotecnológicas favorables de interés industrial y en

las aplicaciones en sistemas de biorremediación. Cabe mencionar que Núñez et al,

(2004) en su investigación revela que el crecimiento microbiano es proporcional a la

temperatura, es decir, a temperaturas mínimas se inhibe, y mientras la temperatura

aumenta, el crecimiento tiene el mismo comportamiento hasta encontrar su

temperatura óptima de desarrollo, es necesario considerar que a temperaturas

elevadas se puede provocar la muerte celular (Núñez, et al, 2004).

En relación con el pH se determinó que estas aguas tienen un pH ligeramente básico

reportando valores promedio de 7.6, valor que no se ajusta con el reportado en el

estudio de aguas termo minerales en el Ecuador realizado por el INAMHI (2013) en

donde se obtuvo un pH de 6.3 para estas aguas. Los valores de temperatura y pH

son relevantes en este estudio ya que determinan cuales son las condiciones con

las que debe contar el agua termal para que las bacterias autóctonas crezcan y se

reproduzcan satisfactoriamente. Especificando un poco más, según el libro VI,

anexo 1, (Texto Unificado de legislación Secundaria, 2015) sobre los criterios de

calidad para aguas de contacto primario destinadas para fines recreativos estas

deben considerar pH entre 6.5 – 8.5; rango en el cual se encuentran nuestros

resultados de pH.

Valores similares con un pH promedio de 7 se reportaron en los manantiales

termales de Puente Viesgo (De la Rosa et al, 2007) en España.

Flores (2013) menciona que estos pH ligeramente básicos se deben a que las aguas

de estos manantiales están compuestas principalmente por iones sulfatos y sulfuros

que forman ácido sulfhídrico en sus aguas subterráneas, aunque es importante

recalcar que cada manantial cuenta con un pH distinto que dependerá de su

composición química.

Los valores de conductividad eléctrica reportados en este estudio presentan

concordancia con respecto a los valores reportados en estudios anteriores de aguas

termales realizado por el INAMHI (2013), teniendo una conductividad eléctrica

promedio de 4833 µS/cm en las aguas del balneario “Santa Ana”.

Esta agua es de mineralización excesiva según lo expuesto por Rodier (1998), quien

comenta que aguas con una conductividad superior a 1000 µS/cm son de

mineralización excesiva o importante y no son aptas para consumo.

73

Por su conductividad las aguas del balneario “Santa Ana” se asemejan más a las

aguas del balneario “El Salado” (≥3999 µS/cm) que a la de otros balnearios de la

zona (Núñez, 2015).

Valores de conductividad superiores a 1500 µS/cm, son similares a los obtenidos en

otros análisis (Núñez, 2015; Macas, 2015 y Torija et al, 2009).

Según se observa en la tabla 25 (pág. 56), existe una cantidad de oxígeno disuelto

menor (5.0 mg/l) a lo estipulado en el libro VI, anexo 1, (Texto Unificado de

Legislación Secundaria, 2015) sobre los criterios de calidad para aguas de contacto

primario destinadas para fines recreativos en donde se cita que el valor del oxígeno

disuelto no debe ser menor a 6 mg/l. Sin embargo, existen trabajos en donde se han

dado resultados iguales o menores de oxígeno disuelto como los expuestos por

Torija (2007). Las razones por las que el oxígeno en el agua tiende a disminuir son

cuando el agua está muy caliente o cuando hay gran cantidad de bacterias o

minerales que forman una sobrepoblación usando el oxígeno en grandes cantidades

(Peña, 2017).

Con respecto a los sólidos totales disueltos promedio de estas aguas termales se

tiene un valor de 4886.7 mg/l, valor superior al obtenido por el INAMHI en el 2013

registrando un valor de 3112.07 mg/l, lo que indica que existe un aumento de sales

minerales en las capas del suelo lo que justifica la disminución del nivel de oxígeno

disuelto en el agua, este aumento de sales puede deberse a la desintegración lenta

de la roca madre o pueden ser aportados por el viento y el agua que arrastran

minerales de otras zonas erosionadas.

4.2. Recuento bacteriano

4.2.1. Cuantificación de aerobios mesófilos

En la tabla 26 (pág. 57) y el gráfico 4 (pág. 57) se muestra toda la descripción

correspondiente a la cantidad de bacterias mesófilas encontradas en la fuente, el

reservorio y la piscina, desde el primer hasta el tercer muestreo del balneario “Santa

Ana”. En donde el número de microorganismos totales ha sido de 3.16x102 UFC/ml;

valor que se ajusta a lo mencionado por De la Rosa y Mosso (2000) que manifiestan

que en el punto de emergencia de los manantiales, la población de microorganismos

autóctonos puede ser alta, con una media de 106 por ml, pero muchos de estos

74

microorganismos son metabólicamente inactivos, están en estado durmiente y no se

multiplican, por lo que el número de los viables suele ser pequeño, de 10 - 103 por

ml dependiendo su temperatura de incubación y el medio empleado en su detección.

En la fuente el número de bacterias aerobias mesófilas es de 7.97x10 UFC/ml,

correspondiente al 8% del porcentaje de aerobios totales. En el estudio de la

microbiología mineromedicinal realizado por Mosso, et al (2008) en el Balneario de

Veldelateja en Madrid se obtuvieron valores de bacterias heterótrofas aerobias en el

punto de emergencia inferiores a 100 UFC/ml; dato que concuerda con nuestro

resultado e indica una buena protección del manantial y no representan un riesgo

sanitario, además de inhibir el crecimiento de algunos microorganismos debido a su

temperatura de 44.7ºC.

Con respecto al reservorio el número de bacterias aerobias mesófilas es de 2.95x102

UFC/ml, correspondiente al 31% del porcentaje de aerobios totales. En este caso se

debe considerar que el valor de aerobios mesófilos sobrepasa lo mencionado en el

estudio de la microbiología mineromedicinal realizado en el balneario Alicún de las

Torres por De la Rosa et al (2007) que manifiestan que cifras inferiores a 100 UFC/ml

indican buena protección del acuífero; esto indica que no existe una protección

adecuada del agua del reservorio lo que se expone a un riesgo sanitario. De igual

manera Andueza (2014) menciona, que la presencia de bacterias aerobias mesófilas

en grandes cantidades demuestra un problema de higiene y contaminación del agua.

La cuantificación de aerobios mesófilos de la piscina presenta un caso similar al del

reservorio ya que cuenta con una cantidad de 5.73x102 UFC/ml de bacterias

mesófilas, correspondiente al 61% del porcentaje de aerobios totales, el mayor en

todas las zonas analizadas; cantidad que sobrepasa lo estipulado en el estudio de

la microbiología mineromedicinal realizado en el balneario de Puente Viesgo por De

la Rosa et al., (2007) en donde el número de bacterias ha sido inferior a 10 UFC/ml.

Esto demuestra la falta de aseo en la piscina y una deficiente protección después

de cada uso de esta.

4.2.2. Cuantificación del número de bacterias coliformes totales

En la tabla 27 (pág. 58) y grafico 5 (pág. 58) se presentan los resultados de la

cuantificación de las bacterias coliformes totales de las muestras de la fuente, el

reservorio y la piscina. En la fuente se halló una presencia de coliformes totales en

75

orden de 3.2x10 UFC/ml, correspondiente al 23% del porcentaje total de coliformes

totales; en la muestra del reservorio por su parte presentó ausencia de coliformes

totales, mientras que en la piscina se registró un mayor crecimiento de bacterias con

una media de 1.08x102 UFC/ml, correspondiente al 77% del porcentaje total de

coliformes totales.

En el estudio de la microbiología mineromedicinal realizado en el balneario de

Veldelateja por Mosso, et al (2008) se concluyó que no se presentaron

microorganismos indicadores de contaminación fecal. Sin embargo, se encontraron

coliformes totales pertenecientes a las especies Citrobacter freundii y Enterobacter

amnigenus. La presencia de estas especies en las aguas, en ausencia de E. coli no

indican contaminación fecal, ya que son ubicuas y no suponen riesgo para la salud

de los usuarios.

Así también en el estudio de Núñez (2015) realizado en el balneario “El Salado” se

registran valores de 9x10 UFC/ml en la piscina, valor que tiene similitud con el

resultado hallado en las muestras del agua de la piscina de nuestro estudio.

En el estudio mineromedicinal realizado en el manantial Rio se encontraron

coliformes totales en orden de 18 UFC/ml de las especies Citrobacter freundii y

Enterobacter amnigenus, pero como ya lo mencionamos estas bacterias no indican

contaminación fecal ni riesgo en la salud de los bañistas (Núñez, 2015).

La presencia de coliformes totales en la fuente del balneario “Santa Ana” no es un

riesgo sanitario ya que pueden proceder del suelo o de los vegetales y sobreviven

en ambientes acuáticos por su facilidad de adaptación formando “biofilms”

(Lechevalier et al, 1987).

4.2.3. Cuantificación de mohos y levaduras

En el presente estudio se realizó solamente la cuantificación de mohos y levaduras,

no se realizó su aislamiento e identificación, sin embargo, cabe mencionar que en el

estudio de microbiología de los manantiales mineromedicinales del balneario de

Veldelateja, se identificaron hongos filamentosos pertenecientes a los géneros

Penicillium, Fusarium y Cladosporium, de igual manera se reportaron la presencia de

mohos y levaduras escasos en la vertiente (Mosso et al, 2008).

76

En la tabla 28 (pág. 59) y grafico 6 (pág.59) se puede observar el número de mohos

y levaduras que crecieron a los 7 días de incubación, correspondiente a las muestras

de la fuente, el reservorio y la piscina. En la muestra de la fuente con respecto a los

mohos se presentaron cantidades de 0.5x10 UFC/ml y de levaduras 0.6x10 UFC/ml;

en la muestra del reservorio con respecto a los mohos se presentaron cantidades

de 3.2x10 UFC/ml y de levaduras 0.2x10 UFC/ml. Por último, en las muestras de la

piscina se registraron cantidades de mohos de 2.3x10 UFC/ml y de levaduras 0.8x10

UFC/ml. El porcentaje de mohos en las muestras es del 79% mientras que el

porcentaje de levaduras corresponde al 21% restante.

En el estudio de la microbiología mineromedicinal realizado en el balneario Alicún

de las Torres por De la Rosa et al (2007) se reportó presencia de mohos y levaduras

en las aguas, con valores similares al presente estudio.

Núñez (2015) en las aguas termales del balneario “El Salado” registró valores en la

piscina de 2.15x10 para mohos y 1.765𝑥102 para levaduras, datos que se asemejan

a los encontrados en este estudio en el agua de la piscina del balneario “Santa Ana”.

Cabe mencionar que la existencia de mohos y levaduras en la fuente puede ser

causa de la contaminación del suelo o del ambiente, ya que no se encuentra

totalmente cubierta y protegida. La presencia de mohos y levaduras en la piscina,

indica contaminación que puede ser por parte de los bañistas o la falta de

mantenimiento de esta.

4.2.4. Cuantificación de Pseudomonas

En la tabla 29 (pág. 60) y gráfico 7 (pág. 61) se presentan el número de

Pseudomonas correspondientes a las muestras de la fuente, el reservorio y la

piscina. En la muestra de la fuente se presentaron cantidades de 3.33x10 UFC/ml,

correspondiente al 42% del porcentaje total de Pseudomonas; en la muestra del

reservorio se registraron cantidades de 3.33x10 UFC/ml, correspondiente al 42% del

porcentaje total de Pseudomonas; y por último, en las muestras de la piscina se

reportaron cantidades de 1.33x10 UFC/ml, correspondiente al 16% del porcentaje

total de Pseudomonas, teniendo un promedio total de Pseudomonas de 2.67x10

UFC/ml.

77

En el estudio sobre el balneario Cervantes en Ciudad Real-España, realizado por

Mosso, et al (2006) se obtuvo presencia de Pseudomonas fluorescens con 5.7% en

el manantial de Cervantes y 2.5% en el manantial de San Camilo. Por el contrario,

en el estudio de la microbiología del agua mineromedicinal del balneario “El Paraíso”

de Manzanera en Teruel-España realizado por De la Rosa, M., et al (2001) existió

ausencia de Pseudomonas, Esos resultados se asemejan al estudio realizado en el

balneario “Santa Ana” donde se obtuvo 3% de Pseudomonas fluorescens y 6% de

Pseudomonas spp, tal como se muestra en la figura 10 (pág. 68).

En el estudio de la microbiología de las aguas mineromedicinales de los balnearios

de Jaraba en Madrid-España, realizado por De la Rosa, et al (2004), en los

manantiales San José y Pilas del balneario La Virgen se detectaron Pseudomonas

aeruginosa en número bajos (4 UFC/250ml) y Pseudomonas fluorescens con 4.5%

en el manantial San Luis y 2.9% en el manantial Pilas.

Estas bacterias del ciclo del nitrógeno son esenciales en los hábitats acuáticos ya

que degradan la materia orgánica (Ward, 1996). Siendo una bacteria muy ubicua se

puede encontrar en aguas superficiales contaminadas con aguas residuales y en los

suelos.

La existencia de Pseudomonas en la piscina puede deberse a una contaminación

cruzada desde el suelo (entorno natural) hacia la piscina, producida por los bañistas

al momento del uso de las instalaciones, sumando el inadecuado tratamiento de

limpieza y desinfección, por lo que es muy probable que en estas aguas se

produzcan infecciones urinarias, de heridas, oculares, etc. en los bañistas.

Su presencia en ausencia de indicadores fecales y de otros patógenos, puede ser

debida a una contaminación antigua y transitoria por filtraciones del agua de rio. Se

ha señalado que esta bacteria puede colonizar manantiales de aguas minerales

naturales debido a su capacidad de sobrevivir en ambientes oligotróficos (Morais.,

et al, 1997; Legnani, et al, 1999).

Se considera necesaria su eliminación mediante un total aislamiento de la captación

para evitar las filtraciones de aguas superficiales, así como la limpieza y desinfección

de las canalizaciones.

78

4.3. Propiedades tintoreales de las colonias aisladas del balneario “Santa

Ana”

La tinción Gram se realizó sobre 32 cepas bacterianas aisladas, en la muestra

perteneciente a la fuente se tuvieron 9 cepas en su mayoría Gram negativas, en la

muestra del reservorio se obtuvieron 11 cepas en su generalidad Gram negativas y

en la muestra de la piscina se obtuvieron 12 cepas las cuales en su mayoría de igual

manera fueron Gram negativas (tabla 30, pág. 61).

Dentro de la coloración Gram se obtuvo un total del 68% de bacterias Gram

negativas y el 34% de bacterias Gram positivas, siendo el resultado de nuestro

estudio diferente a otros trabajos, como el estudio de las aguas del balneario de

Alhama de Granada, donde Mosso et al (2002) aisló e identificó el 49.1% de

bacterias Gram positivas y el 20.7% de bacterias Gram negativas.

De la Rosa y Mosso (2000) en su estudio sobre la diversidad microbiana de las

aguas minerales termales, mencionan que, en relación con las bacterias

heterótrofas, las aguas hipertermales presentan una mayor proporción de bacterias

Gram positivas, mientras que en las meso termales predominan los bacilos Gram

negativos y los cocos Gram positivos, y lo que diferencia se debe a que las bacterias

Gram positivas son más resistentes al calor que las Gram negativas. Estas

consideraciones no concuerdan con nuestros resultados, a pesar de que las aguas

del balneario “Santa Ana” son consideradas hipertermales.

Por su parte Núñez (2015) en su investigación aisló 26 cepas de bacterias mesófilas

de las cuales 19 (73.08%) fueron identificadas, correspondiendo a morfología

bacteriana de bacilos Gran negativos 10 (52.63%), cocos Gran positivos 5 (26.31%)

y bacilos Gram positivos 4 (21.06%). Estos datos al comparar con los del balneario

“Santa Ana”, se asemejan, de modo que en ambos lugares predominan los bacilos

Gram negativos, contando con aguas hipertermales.

En el estudio del balneario de Baños de la Concepción, realizado por Mosso (2011),

se registró un alto porcentaje de bacilos Gram negativos en aguas con una

temperatura de 28ºC, se asemeja a nuestro estudio ya que, con respecto a los

bacilos, se obtuvieron los Gram negativos en mayor proporción tal como lo muestra

la tabla 30 (pág. 61) y la figura 8 (pág. 62), siendo la muestra de la piscina con mayor

número de bacilos correspondiente a un 47% del porcentaje total.

79

Es importante hacer mención que cada agua termal estudiada cuenta con una

microbiota característica por lo que, la cantidad de bacterias Gram positivos y Gram

negativos van a diferir en función de las características y condiciones del entorno

que las rodea.

4.4. Especies identificadas de las bacterias aisladas del balneario “Santa

Ana”

En la tabla 33 (págs. 66-67) se describen los géneros y las especies bacterianas

identificadas del balneario “Santa Ana” correspondientes a la fuente, el reservorio y

la piscina. En la fuente se aislaron 9 especies bacterianas: Psychrobacter immobilis,

Pseudomonas sp, Aeromonas hydrophila, Actinobacillus lignieresii, Escherichia

hermanii, Bacillus alvei, Peptostreptococcus saccharolyticus, Staphylococcus sp y

Staphylococcus klosii. En el reservorio se aislaron 9 especies: Aeromonas caviae,

Aeromonas hydrophila, Aeromonas media, Yokonella regensburgei, Psychrobacter

immobilis, Alcaligenes latus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus mycoides y

Staphylococcus cohnii subsp. Urealyticum. Por último, en la piscina se aislaron 12

especies: Aeromonas media, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae,

Escherichia hermanii, Citrobacter freundii, Edwardsiella tarda, Actinobacillus

lignieresii, Pseudomonas fluorescens, Corynebacterium striatum, Actinomices

meyeri, Kurthia gibsonii y Bacillus mycoides. Tomando en cuenta los resultados de

identificación podemos asegurar que las aguas termales del balneario “Santa Ana”

cuenta con una gran diversidad de especies bacterianas.

Según la tabla 33 (págs. 66-67) el género Aeromonas es el más frecuente en estas

aguas, ocupando el 22% del porcentaje total de las bacterias identificadas; seguido

por el grupo de las Enterobacteriaceae con un 16%, el género Bacillus spp con un

13%, los géneros Psychrobacter, Pseudomonas y Staphylococcus con un 9% cada

uno, los géneros Actinobacillus, Alcaligenes, Peptostreptococcus, Kurthia,

Corynebacterium y Actinomices con un 3% cada uno. Considerando las especies

identificadas con mayor porcentaje tenemos: Aeromonas hydrophila (13%),

Psychrobacter immobilis (9%), Pseudomonas sp, Aeromonas caviae, Actinobacillus

lignieresii, Escherichia hermanii y Bacillus mycoides (6%), las demás especies

cuentan con un porcentaje mínimo del 3%.

80

En las aguas hipertermales se han identificado generalmente los siguientes

géneros: Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Enterobacter,

Actinobacter y Arthrobacter (Mosso et al, 1994), tal como se cita en el estudio sobre

diversidad microbiana de las aguas minerales termales realizado por Mosso et al

(1994), a pesar que en nuestro caso no se registraron géneros de Micrococcus,

Actinobacter y Arthrobacter, estos datos concuerdan con el estudio debido a que

se identificaron bacterias de los géneros Pseudomonas, Bacillus, Staphylococcus

y Enterobacter en mayor proporción.

De la Rosa y Mosso en el año 2000, además mencionan que el género

Pseudomonas es muy ubicuo y se encuentra en ambientes acuáticos con pocos

nutrientes, en los que considera a las especies del grupo fluorescente encontradas

en estas aguas, como son Pseudomona putida y Pseudomonas fluorescens, las

cuales forman parte de la población autóctona de los manantiales meso y como en

este caso hipertermales.

Núñez (2015), realizó el estudio microbiológico de las aguas termo

mineromedicinales del balneario “El Salado” de Baños de Agua Santa, donde

identificó en su mayoría cepas de la Familia Enterobacteriaceae (75%), seguido de

Staphylococcus aureus (17.4%) y Staphylococcus spp (11.6%), mientras que de los

bacilos Gram positivos identificados corresponden al género Bacillus spp (24%), al

comparar estos datos con los resultados del balneario “Santa Ana”, son diferentes,

reportando un mayor porcentaje del género Aeromonas (22%), Enterobacteriaceae

(16%) y Bacillus spp (13%).

Por otro lado, en aguas con menor temperatura es frecuente la presencia de otros

bacilos Gram negativos como Alcaligenes y Aeromonas, por su parte las numerosas

especies de Bacillus están ampliamente distribuidas y pueden proceder del suelo o

de las propias aguas. La presencia de Staphylococcus es frecuente en aguas

minerales ya que resisten concentraciones altas de sal, aunque no se detectan

especies propias del hombre. Otras especies como las Enterobacter a pesar de su

pertenencia a la familia enterobacterias, se considera que forma parte de la micro

población autóctona debido a que se encuentra ampliamente distribuido en la

naturaleza. Por su parte, con respecto a bacilos Gram positivos en aguas

hipertermales es frecuente encontrar especies de los géneros Kurthia y

Corynebacterium que a pesar de que su hábitat es el suelo, se pueden adaptar a

vivir en condiciones adversas. (De la Rosa y Mosso, 2000).

81

Considerando que en nuestro estudio se identificaron especies de importancia

sanitaria como Clostridium y Pseudomona aeruginosa, De la Rosa y Mosso (2000)

mencionan que a pesar que las aguas termales no deben tener bacterias patógenas

ni indicadores fecales, la presencia de coliformes no fecales no es un riesgo

sanitario ya que pueden proceder del suelo o de los vegetales y sobreviven en

ambientes acuáticos por su facilidad de adaptación, estos géneros fueron

frecuentes en las muestras de reservorio y piscina del balneario, lo que demuestra

que se debe tener un mejor aseo de sus instalaciones después de su uso por los

bañistas asimismo de contar con protección del perímetro ya sea de la piscina y el

reservorio, además estas especies pueden provenir de contaminación aportada por

los bañistas.

Los géneros Staphylococcus y Pseudomonas, así como en este estudio, de igual

manera fueron encontrados en el trabajo realizado en el balneario de Alicún de las

Torres, en España (Torija, et al, 2009).

4.5. Caracterización biotecnológica

La mineralización y transformación de la materia orgánica son realizadas en un 90%

por los microorganismos a partir de la descomposición de restos animales; Chapelle

(2000) asegura que la presencia de microorganismos hace que esta transformación

sea posible debido a sus elevadas tasas de crecimiento, diversidad metabólica y

capacidad de degradar una gran variedad de compuestos orgánicos que existen en

la naturaleza.

La determinación de microorganismos de interés ecológico en este tipo de

ecosistemas, como lo son las aguas termales, es importante para entender sus flujos

de energía y materia, encontrando así que las bacterias amilolíticas y celuloliticas

están relacionadas con los ciclos del carbono, las proteolíticas en cambio se

encuentran relacionadas con los ciclos del nitrógeno; además esta microbiota es

relevante por su capacidad degradadora de diversas sustancias orgánicas y sus

propiedades biotecnológicas en biorremediacion (Chapelle, 2000).

Es así como en este estudio se realizó la caracterización biotecnológica de 23 cepas

bacterianas puras, haciéndolas crecer en medios con diferentes fuentes de carbono

(leche, mantequilla, diésel, celulosa y almidón soluble), obteniendo los siguientes

resultados por especies que se resumen en la tabla 34 (págs. 68-69).

82

El 23% resultaron de bacterias proteolíticas, el 22 % de bacterias celulíticas, 21%

de bacterias amilolíticas, 18 % de bacterias lipolíticas y el 16% de bacterias

degradadoras de petróleo (figura 11, pág. 69).

Existen bacterias que dieron positivo para las cinco fuentes de carbono como son

las especies: Pseudomonas spp, Pseudomonas fluorescens, Citrobacter freundii y

Staphylococcus cohnii subsp. Urealyticum. De igual manera se registraron especies

que solo reaccionaron a una sola fuente de carbono como es el caso de la

Psychrobacter immobilis, Alcaligenes latus y Staphylococcus sp (amiloliticas),

Peptostreptococcus saccharolyticus (Celulolitica).

En el estudio de la microbiología del manantial mineromedicinal del balneario Puente

Viesgo realizado por Mosso et al (2007) las aguas del balneario presentaron

bacterias proteolíticas, amilolíticas y celulolíticas en número bajo en la emergencia

del manantial, en donde las bacterias proteolíticas aisladas pertenecen a las

especies Bacillus licheniformis, Burkholderia y Pseudomona fluorescens y las

bacterias amiloliticas a Pseudomonas stutzeri y Bacillus licheniformis. Todo lo

anterior concuerda con nuestro resultado ya que la Pseudomona fluorescens

encontrada en este estudio es proteolítica. Las bacterias proteolíticas y amilolíticas

se encuentran ampliamente distribuidas en ambientes acuáticos y se han

encontrado en manantiales extranjeros y españoles, sus enzimas han sido

productos de recientes aplicaciones biotecnológicas.

En el estudio de la microbiología del manantial mineromedicinal del balneario de

Valdeteja realizado por Mosso, et al (2007), se encontraron bacterias aisladas que

intervienen en el ciclo del carbono con actividad proteolítica como Aeromonas

hydrophila y Pseudomonas fluorescens, con actividad amilolítica Aeromonas

hydrophila y Bacillus spp. Estos resultados de igual manera concuerdan con los

obtenidos en este estudio de acuerdo con las especies mencionadas por los autores.


Los resultados obtenidos para los antibiogramas se resumen en la tabla 36 (pág. 70),

los datos se registraron luego de las 24 horas una vez colocados los cultivos en la

incubadora, las interpretaciones de los resultados se realizó siguiendo las

determinaciones que se muestran en la tabla 21 (pág. 53); el 68% de bacterias

aisladas fueron resistentes a la Eritromicina (15 µg), y el 32% mostraron

83

susceptibilidad. En cuanto a la ampicilina (10 µg) el 55% de las cepas aisladas

presento resistencia y el otro 45% susceptibilidad; considerando el

sulphamethoxazole / trimetoprim (25 µg) el 36% de las cepas mostraron resistencia

a este antibiótico y el 64% presentó susceptibilidad; finalizando para la fosfomicina

(50 µg) el 27% presentó resistencia y el 73% restante mostro susceptibilidad.

Al realizar una prueba de sensibilidad antimicrobiana (Giglio & Toro, 1992)

determinan que las especies: Pseudomonas sp y Citrobacter freundii son resistentes

a la ampicilina; resultado que concuerda con los datos obtenidos en esta

investigación.

En el estudio de los antibiogramas realizados ambulatoriamente en un área de salud

(Alcaraz, 2002), se determina que la bacteria del género Staphylococcus es

resistente a la ampicilina, mientras que en la presente investigación se comprueba

que el género Staphylococcus spp es sensible y Staphylococcus klosii presenta una

resistencia al transcurrir las 18 horas.

Por su parte Álvarez, et al (2004), encontraron en cepas de la especie Aeromonas

hydrophila una resistencia a la eritromicina de 100%, mientras que en el presente

estudio Aeromonas hydrophila se demuestra que es sensible a la ampicilina,

eritromicina, fosfomicina y Sulphamethoxazole / Trimetoprim.

Tomando en cuenta el uso frecuente de estas piscinas y los resultados obtenidos

en cuanto a la resistencia de algunos microorganismos encontrados en ellas es

indispensable que se lleve a cabo el control de la dispersión de las cepas y la

eliminación del riesgo de contagio de enfermedades por lo que se deberá realizar

un tratamiento antes de la disposición del agua, así como la limpieza semanal del

balneario.

Estudios realizados en los últimos años evidencian que, en casi todos los

ecosistemas, incluidos los de los medios acuáticos, existe un reservorio de genes

de resistencia en la población de microorganismos autóctonos, que se ha

denominado resistomas de antibióticos que es capaz de comunicarse y diseminar

estos genes entre las bacterias de distintos tipos de ecosistema incluido el humano

(Dante & Sommer, 2014). Los resultados obtenidos en relación con los perfiles de

resistencia antimicrobiana de las cepas bacterianas presentes en el agua termal

muestran que este tipo de agua puede ser un reservorio importante de los genes

de resistencia a diversos antibióticos y que se deben aplicar medidas de vigilancia

84

epidemiológicas tanto en los manantiales que son fuentes de esta agua termal,

como en las piscinas empleadas en cada balneario.

4.7. Índice de diversidad microbiana

Summers (2005) en su estudio sobre el desarrollo de las comunidades microbianas

expresa que, para una mejor adaptación de los microrganismos es preferible que la

población esté dominada por pocas poblaciones (baja diversidad de especies) y

menciona que las comunidades en una fuente de agua termal son menos diversas

que las de un río no contaminado.

De igual manera menciona que la diversidad de especies es baja en los ecosistemas

controlados físicamente, porque las adaptaciones al estrés fisicoquímico imperante

son prioritarias y dejan poco espacio para la evolución de las interacciones entre las

especies que se encuentran integradas y en equilibrio. Los ambientes de tuberías

ácidas, las fuentes termales y los desiertos antárticos son ejemplos de hábitats

controlados físicamente en los que la diversidad de especies es relativamente baja,

texto que concuerda con el valor calculado en este estudio, teniendo un total de

𝑑 =19 de riqueza de especies en el agua termal del Balneario “Santa Ana”,

considerando que los valores indican una mayor riqueza en el último periodo de

muestreo (𝑑3 = 9) con respecto a los periodos anteriores (𝑑1 = 5; 𝑑2 = 5).

Sánchez, et al (1993) en su estudio sobre riqueza de especies, abundancia y

composición indicaron que los números de especies reales en la muestra expresaron

mayor riqueza en los dos primeros periodos de muestreo, resultado que no

concuerda con nuestro valor, debido a que en los dos primeros periodos de muestreo

se obtuvieron los menores valores de riqueza de especies, mientras que en el tercer

periodo se intensificó el valor de riqueza, esto expresa que durante el mes de julio la

riqueza se mantiene constante pero en agosto se intensifica.

Un caso particular es que investigadores afirman que debido al cambio climático la

distribución, tamaño, estructura y abundancia de las poblaciones de algunas

especies se vieran afectadas, pues su crecimiento está determinado por la

temperatura, humedad y factores ambientales. Por ello indican que es probable que

con el cambio de clima, especies que antes no aparecían en algunas zonas

aparezcan, por ejemplo lugares fríos o calientes pueden colonizarse por

microorganismos distintos (Almaraz y Zaragoza, 2008; Uribe, 2015).

85

5. CONCLUSIONES

En cuanto a los parámetros fisicoquímicos tomados “in situ” de las aguas del

Balneario “Santa Ana” se obtuvieron los siguientes resultados: temperatura

de emanación de 45ºC, pH promedio de 7.6, conductividad eléctrica

promedio de 4833 µS/cm, un promedio de 5.0 mg/l de oxígeno disuelto y

4886.7 mg/l en promedio de sólidos totales disueltos. Los valores de

temperatura, pH y conductividad eléctrica se encuentran dentro de los

valores reportados por el INAMHI en el año 2013 y con respecto al pH según

lo estipulado en el libro VI, anexo I, para criterios de calidad de agua con

fines recreativos; concluyendo que estas aguas son de tipo hipertermal,

alcalina y de mineralización excesiva.

El valor obtenido de 5.0 mg/l correspondiente al oxígeno disuelto no cumple

con el limite permisible estipulado en el libro VI, anexo I, para criterios de

calidad de agua con fines recreativos el cual detalla que el valor de oxígeno

disuelto debe superar los 6 mg/l. La disminución de oxigeno está relacionada

con la temperatura del agua de acuerdo a la ley de Henry (la solubilidad de

un gas en un líquido es inversamente proporcional a la temperatura),

El Balneario “Santa Ana” presentó un total de 3.16x102 UFC/ml de

microorganismos aerobios mesófilos, teniendo en la fuente 7.97x10 UFC/ml

de bacterias aerobias mesófilas correspondiente al 8% del porcentaje de

aerobios totales; en el reservorio se cuantificaron 2.95x102 UFC/ml,

correspondiente al 31% del porcentaje de aerobios totales y en la piscina se

obtuvo una cantidad de 5.73x102 UFC/ml de bacterias mesófilas,

correspondiente al 61% del porcentaje de aerobios totales, el mayor en todas

las zonas analizadas; demostrando la falta de aseo en la piscina y una

deficiente protección después de cada uso de la misma.

En la fuente se halló una presencia de coliformes totales en orden de 3.2x10

UFC/ml, correspondiente al 23% del porcentaje total de coliformes totales;

en la muestra del reservorio por su parte no presentó coliformes totales,

mientras que en la piscina se registró un mayor crecimiento de bacterias con

una media de 1.08x102 UFC/ml, correspondiente al 77% del porcentaje total

de coliformes totales. La presencia de coliformes totales en estas aguas en

ausencia de E. coli no indican contaminación fecal, debido a que son ubicuas

y no suponen riesgo para la salud de los usuarios.

86

Con respecto a los mohos se presentaron cantidades de 0.5x10 UFC/ml y de

levaduras 0.6x10 UFC/ml; en la muestra del reservorio con respecto a los

mohos se presentaron cantidades de 3.2x10 UFC/ml y de levaduras 0.2x10

UFC/ml; por último, en las muestras de la piscina se registraron cantidades

de mohos de 2.3x10 UFC/ml y de levaduras 0.8x10 UFC/ml. El porcentaje

de mohos en las muestras es del 79% mientras que el porcentaje de

levaduras corresponde al 21% restante.

En la muestra de la fuente se presentaron cantidades de 3.33x10 UFC/ml,

correspondiente al 42% del porcentaje total de Pseudomonas; en la muestra

del reservorio se registraron cantidades de 3.33x10 UFC/ml, correspondiente

al 42% del porcentaje total de Pseudomonas; y por último en las muestras

de la piscina se reportaron cantidades de 1.33x10 UFC/ml, correspondiente

al 16% del porcentaje total de Pseudomonas, teniendo un promedio total de

Pseudomonas de 2.67x10 UFC/ml. Resultados que preocupan en la zona de

la piscina debido a que estos microorganismos son considerados patógenos

para los seres humanos que podrían generar graves problemas de salud. Su

existencia se debe a la falta de control del agua y limpieza de las

instalaciones.

Dentro de la coloración Gram se obtuvo un total del 68% de bacterias Gram

negativas y el 34% de bacterias Gram positivas.

En la fuente del Balneario se aislaron las especies: Psychrobacter immobilis,

Pseudomonas spp, Aeromonas hydrophila, Actinobacillus lignieresii,

Escherichia hermanii, Bacillus alvei, Peptostreptococcus saccharolyticus,

Staphylococcus spp y Staphylococcus klosii.

En el reservorio se aislaron las especies: Aeromonas caviae, Aeromonas

hydrophila, Aeromonas media, Yokonella regensburgei, Psychrobacter

immobilis, Alcaligenes latus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus mycoides

y Staphylococcus cohnii subsp. Urealyticum.

En la piscina se aislaron las especies: Aeromonas media, Aeromonas

hydrophila, Aeromonas caviae, Escherichia hermanii, Citrobacter freundii,

Edwardsiella tarda, Actinobacillus lignieresii, Pseudomonas fluorescens,

Corynebacterium striatum, Actinomices meyeri, Kurthia gibsonii y Bacillus

mycoides.

El género Aeromonas es el más frecuente en estas aguas, ocupando el 22%

del porcentaje total de las bacterias identificadas; seguido por el grupo de las

87

Enterobacteriaceae con un 16%, el género Bacillus con un 13%, los géneros

Psychrobacter, Pseudomonas y Staphylococcus con un 9% cada uno, los

géneros Actinobacillus, Alcaligenes, Peptostreptococcus, Kurthia,

Corynebacterium y Actinomices con un 3% cada uno.

Del total de cepas aisladas se obtuvo en la caracterización biotecnológica: el

23% de bacterias proteolíticas que cuentan con aplicaciones en la industria

alimentaria y textil, el 22 % de bacterias celulíticas con aplicación en la

degradación de polímeros detergentes, el 21% de bacterias amilolíticas

encargadas principalmente de la hidrólisis del almidón en la industria

alimentaria, el 18 % de bacterias lipolíticas con aplicaciones en la industria

láctea, farmacéutica y textil y el 16% de bacterias degradadoras de derivados

de petróleo encargadas de la biodegradación de hidrocarburos y depuración

de aguas residuales.

El 68% de bacterias aisladas fueron resistentes a la Eritromicina (15 µg), y

el 32% mostraron susceptibilidad. En cuanto a la ampicilina (10 µg) el 55%

de las cepas aisladas presentó resistencia y el otro 45% susceptibilidad;

considerando el sulphamethoxazole / trimetoprim (25 µg) el 36% de las

cepas mostraron resistencia a este antibiótico y el 64% presentó

susceptibilidad; finalizando para la fosfomicina (50 µg) el 27% presentó

resistencia y el 73% restante mostró susceptibilidad.

Los números de especies en el agua termal del balneario “Santa Ana”

indican una mayor riqueza en el último periodo de muestreo (𝑑3 = 9) con

respecto a los periodos anteriores (𝑑1 = 5; 𝑑2 = 5), teniendo un total en

riqueza de especies de 𝑑 = 19.

88

6. RECOMENDACIONES

Realizar análisis microbiológicos periódicos en fuente, reservorio y piscina para

controlar las poblaciones bacterianas, principalmente las que son consideradas

patógenas para los seres humanos.

Realizar el cambio o mantenimiento del sistema de tuberías, principalmente las

que conectan la fuente con el reservorio, ya que se encuentran expuestas al

entorno pudiendo tener formación de biofilms (población de células que crecen

unidas a una superficie) que pueden generar contaminantes externos y causar

graves daños a la salud de los usuarios.

Mejorar el tipo y la frecuencia del mantenimiento que se da a las piscinas, antes

y después del uso de las instalaciones.

Las personas que laboran en el balneario deben realizarse controles médicos

periódicamente, para evitar un posible foco de contaminación y prevenir

enfermedades.

Incrementar la investigación sometiendo a los microorganismos aislados a otros

tipos de aplicaciones como en un sistema de tratamiento de aguas residuales.

89

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ANEXOS

99

Anexo A. Puntos de muestreo

a) Muestra Nº1 y 2, agua y residuo sólido de

la fuente

c) Muestra Nº4 y 5, agua y residuo

sólido de la piscina

b) Muestra Nº3, agua del tanque

reservorio

100

Anexo B. Parámetros fisicoquímicos “in situ”

Anexo C. Recuento de microorganismos Coliformes totales/E.coli, mohos y levaduras en placas 3M Petrifilm.

Anexo D. Cuantificación de aerobios mesófilos en agar antibiótico y Pseudomonas en agar centrimida.

a) Cuantificación Coliformes totales/E.

coli b) Cuantificación mohos y levaduras

a) Siembra de aerobios mesófilos en

agar antibiótico

b) Cuantificación de aerobios

mesófilos

101

Anexo E. Cepas puras aisladas en caldo BHI

d) Cuantificación de Pseudomonas en

cámara luz ultravioleta

c) Siembra de especie Pseudomonas en

agar centrimida

Condiciones anaerobias

para bacterias anaerobias

facultativas

102

Anexo F. Cepas puras sembrada por estría en agar antibiótico base.

Anexo G. Tinción Gram

a) Tetracocos Gran positivos Cepa11 b) Diplococos Gram negativos

Cepa16

103

Anexo H. Pruebas bioquímicas

c) Bacilos Gram positivos d) Cocos Gram negativos

a) MacConkey b) Agar Sangre

c) Catalasa d) Citrato de Simmons

104

e) Coagulasa f) Hidrólisis de gelatina

g) Prueba de SIM h) Prueba de TSI

i) Ureasa j) O/F

105

Anexo I. Caracterización biotecnológica

a) Amilolíticas

d) Proteolíticas

c) Lipolíticas b) Celuloliticas

e) Degradadoras de

Petróleo

106

Anexo J. Sensibilidad antimicrobiana

107

Anexo K. Cálculo del índice de diversidad microbiana

Riqueza de especies

(𝑑) del primer muestreo 𝑑 =

𝑆 − 1

log 𝑁

Donde 𝑆 = número de

especies

𝑁 = número de individuos

𝑑 =

5 − 1

log 6

𝑑 =

4

0.77815125

𝑑1 = 5

Riqueza de especies

(𝑑) del segundo

muestreo

𝑑2 = 5

Riqueza de especies

(𝑑) del tercer muestreo

𝑑3 = 9

Riqueza total de

especies (𝑑)

𝑑 = 19

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