UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR …€¦ · como aves, ganado, perros y gatos (Lapierre, 2013;...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA DETERMINACIÓN DE LA PREVALENCIA Y LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANA DE Campylobacter spp. EN CANINOS DE LAS PARROQUIAS URBANAS DE LA CIUDAD DE QUITO. Trabajo de Grado presentado como requisito para optar por el Título de Médico Veterinario Zootecnista AUTOR: SANTIAGO DAVID ANDRADE YÉPEZ Quito, Marzo de 2017
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
DETERMINACIÓN DE LA PREVALENCIA Y LA RESISTENCIA
ANTIMICROBIANA DE Campylobacter spp. EN CANINOS DE LAS
PARROQUIAS URBANAS DE LA CIUDAD DE QUITO.
Trabajo de Grado presentado como requisito para optar por el Título de
Médico Veterinario Zootecnista
AUTOR:
SANTIAGO DAVID ANDRADE YÉPEZ
Quito, Marzo de 2017
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
DETERMINACIÓN DE LA PREVALENCIA Y LA RESISTENCIA
ANTIMICROBIANA DE Campylobacter spp. EN CANINOS DE LAS
PARROQUIAS URBANAS DE LA CIUDAD DE QUITO.
Informe final de investigación presentado como requisito para optar el
Título de Médico Veterinario Zootecnista
AUTOR
SANTIAGO DAVID ANDRADE YÉPEZ
TUTOR
DR. RENÁN MENA PÉREZ
Quito, Marzo de 2017
ii
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a mis padres, mi familia y amigos los cuales me han
apoyado para culminar esta etapa de mi vida y seguir cumpliendo mis
metas.
A mis profesores y mentores que me permitieron mejorar a un nivel
personal y profesional.
Santiago David Andrade Yépez
iii
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a mis padres Arturo y Areli por siempre estar conmigo, por
apoyarme incondicionalmente en toda mi formación académica y
encaminarme correctamente, a mis hermanos Diego y Mateo porque
siempre han buscado mi bienestar y me han enseñado a nunca rendirme.
A mi abuelita Rosario por apoyarme durante toda mi vida académica. A mi
novia y mejor amiga Paola por estar siempre cuando la necesité y
apoyarme en todo este proceso.
Expreso mi más sincero agradecimiento a la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador al personal
de la clínica veterinaria por ayudarme a crecer profesionalmente en
especial al Dr. Renán Mena por confiarme la realización de este proyecto y
saber guiarme durante todo el proceso.
Al Dr. Christian Vinueza, Dra. María Inés Baquero, al equipo del laboratorio
de Bacteriología y de biología molecular de la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador, por
brindarme apoyo en el desarrollo del presente proyecto de investigación.
A mis amigos mi segunda familia que estuvieron en toda mi formación.
Gracias por todo.
iv
© DERECHOS DE AUTOR
Yo, Santiago David Andrade Yépez en calidad de autor del trabajo de
investigación “Determinación de la prevalencia y la resistencia
antimicrobiana de Campylobacter spp. en caninos de las parroquias
urbanas de la ciudad de Quito” autorizo a la Universidad Central del
Ecuador, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de
los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de
investigación.
Los derechos que como autor me corresponde, con excepción de la
presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo
establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de
Propiedad Intelectual y su Reglamento.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice
la digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el
repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley
Orgánica de Educación Superior.
En la ciudad de Quito, Marzo de 2017.
Santiago David Andrade Yépez
Cd. N°1719775288
v
INFORME DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Investigación, presentado por el
señor: SANTIAGO DAVID ANDRADE YÉPEZ, para optar por el Título o
Grado de Médico Veterinario y Zootecnista, cuyo título es
“DETERMINACIÓN DE LA PREVALENCIA Y LA RESISTENCIA
ANTIMICROBIANA DE Campylobacter spp. EN CANINOS DE LAS
PARROQUIAS URBANAS DE LA CIUDAD DE QUITO”. Considero que
dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a
la presentación pública y evaluación por parte del jurado examinador que
se designe.
Quito, a los 30 días del mes de marzo del 2017.
____________________________
Dr. Renán Mena Pérez
CI: 0401228036
CALIFICACIÓN DEL TRABAJO ESCRITO FINAL
vi
vii
viii
ix
INDICE GENERAL
DEDICATORIA ......................................................................................... ii
AGRADECIMIENTOS ............................................................................. iii
© DERECHOS DE AUTOR .................................................................... iv
INFORME DEL TUTOR ............................................................................ v
INDICE GENERAL .................................................................................. ix
LISTA DE CUADROS ............................................................................. xi
LISTA DE GRÁFICOS ........................................................................... xii
RESUMEN............................................................................................. xiii
ABSTRACT ............................................................................................ xiv
CAPÍTULO I ............................................................................................. 1
INTRODUCCIÓN ............................................................................... 1
OBJETIVOS ...................................................................................... 3
HIPÓTESIS ........................................................................................ 3
CAPÍTULO II ............................................................................................ 4
REVISIÓN DE LITERATURA ................................................................... 4
CAMPYLOBACTERIOSIS ................................................................. 4
HISTORIA DE Campylobacter ......................................................... 4
TAXONOMIA Y MORFOLOGIA ........................................................ 6
ESPECIES DE Campylobacter spp. ................................................ 8
EPIDEMIOLOGÍA .............................................................................. 9
DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y RESERVORIOS .......................... 9
SITUACIÓN DE LA CAMPYLOBACTERIOSIS EN EL ECUADOR . 12
PATOGENÍA Y FACTORES DE VIRULENCIA ............................... 14
TRANSMISIÓN ................................................................................ 14
MECANISMOS DE VIRULENCIA .................................................... 16
LIPOPOLISACÁRIDO Y LIPOOLIGOSACÁRIDO........................... 16
PRESENCIA DE FLAGELOS .......................................................... 17
ADHESIÓN E INVASIÓN ................................................................. 18
TOXINA DE DISTENSIÓN CITOLETAL .......................................... 18
SIGNOS CLÍNICOS ........................................................................ 19
x
TRATAMIENTO .............................................................................. 19
RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS .................................................. 20
RESISTENCIA A BETALACTÁMICOS .............................. 20
RESISTENCIA A MACRÓLIDOS ....................................... 21
RESISTENCIA A TETRACICLINAS ................................... 21
RESISTENCIA A AMINOGLUCÓSIDOS ............................ 21
RESISTENCIA A QUINOLONAS ........................................ 21
AISLAMIENTO, DIAGNÓSTICO E IDENTIFICACIÓN DE
Campylobacter spp. ....................................................................... 22
IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE Campylobacter spp. ........... 23
PRUEBAS BIOQUÍMICAS .............................................................. 23
PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN EN LÁTEX ................................... 23
ENSAYOS DE INMUNOABSORCIÓN ............................................. 24
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR ..................................................... 24
CAPÍTULO III ......................................................................................... 26
MATERIALES Y MÉTODO .................................................................... 26
MATERIALES ................................................................................. 26
METODOLOGÍA .............................................................................. 27
TIPO DE INVESTIGACIÓN .............................................................. 27
UBICACIÓN GEOGRÁFICA ............................................................ 27
FACTORES DE ESTUDIO ............................................................... 27
POBLACIÓN OBJETO DE ESTUDIO ............................................. 28
MUESTRA ....................................................................................... 28
PROCEDIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN .................................. 29
CAPÍTULO IV ......................................................................................... 40
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................ 40
CAPÍTULO V .......................................................................................... 50
CONCLUSIONES ............................................................................ 50
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................... 51
ANEXOS .......................................................................................... 62
xi
LISTA DE CUADROS
Cuadro 1. Clasificación de Campylobacter spp. ....................................... 6
Cuadro 2. Propiedades bioquímicas de diferentes especies de
Campylobacter…………………………………………………………………. 9
Cuadro 3. Cálculo del master mix para una reacción ............................. 35
Cuadro 4. Antibióticos usados en la concentración mínima inhibitoria ... 36
Cuadro 5. Puntos de quiebre para C. jejuni expresado en mg/L ............ 37
Cuadro 6. Puntos de quiebre para C. coli expresado en mg/L ............... 37
Cuadro 7. Resultados de animales positivos a Campylobacter en las
parroquias urbanas de la ciudad de Quito. ............................................. 40
Cuadro 8. Resultados del aislamiento de Campylobacter spp. en caninos
de las parroquias urbanas de la ciudad de Quito de acuerdo al sexo ..... 44
Cuadro 9. Resultados del aislamiento de Campylobacter spp. de acuerdo
a las administraciones zonales de la ciudad de Quito. ............................ 45
xii
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Campylobacter jejuni ............................................................... 8
Gráfico 2. Campylobacter spp.................................................................. 8
Gráfico 3. Modelo hipotético de como C. jejuni conduce a la invasión
bacteriana y establece las infecciones .................................................... 16
Gráfico 4. Toma de muestra de canino .................................................. 29
Gráfico 5. Estriación de Campylobacter spp. ......................................... 30
Gráfico 6. Bomba de vacío .................................................................... 31
Gráfico 7. Aplicación de gases ............................................................... 31
Gráfico 8. Colonias aisladas de Campylobacter. .................................... 32
Gráfico 9. Campylobacter spp teñido con safranina ............................... 33
Gráfico 10. Repique en agar sangre de colonias aisladas de
Campylobacter spp. ................................................................................ 33
Gráfico 11. Aplicación de 100 µl de la placa de Petri a la placa de
SensititreTM EUCAMP ............................................................................. 38
Gráfico 12. Colocación de la cinta adhesiva en las placas de Sensititre TM
EUCAMP2 .............................................................................................. 39
Gráfico 13. Lectura de las placas Sensititre TM EUCAMP2. .................... 39
Gráfico 14. Resultados en porcentaje del aislamiento de Campylobacter
spp. en caninos de las parroquias urbanas de la ciudad de Quito por
edades. ................................................................................................... 43
Gráfico 15. PCR múltiple para C. coli y C. jejuni. ................................... 46
Gráfico 16. Identificación de especies de Campylobacter mediante PCR
múltiple ................................................................................................... 46
Gráfico 17. Susceptibilidad de las cepas aisladas de Campylobacter jejuni
frente a 6 antibióticos analizados. ........................................................... 47
Gráfico 18. Susceptibilidad de las cepas aisladas de Campylobacter coli
frente a 6 antibióticos analizados. ........................................................... 48
xiii
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
DETERMINACIÓN DE LA PREVALENCIA Y LA RESISTENCIA
ANTIMICROBIANA DE Campylobacter spp. EN CANINOS DE LAS
PARROQUIAS URBANAS DE LA CIUDAD DE QUITO.
Autor: Santiago David Andrade Yépez Tutor: Dr. Renán Mena
Fecha: 21 de marzo de 2017 Resumen
La campilobacteriosis es una enfermedad que generalmente produce
infecciones gastrointestinales en el ser humano. Tradicionalmente se la
vincula con el consumo de carne de aves de corral, pero existen otros
reservorios como: bovinos, ovinos, porcinos, perros y gatos en los cuales
es un comensal de la mucosa intestinal. En esta investigación se aisló
Campylobacter spp. a partir de hisopados rectales en caninos
aparentemente sanos que asistieron a la Clínica Veterinaria de la
Universidad Central del Ecuador. Los animales provenían de las parroquias
urbanas de la ciudad de Quito. Finalizado el estudio, el mismo que duró 6
meses, se tomaron 271 muestras, las cuales fueron cultivadas en un agar
selectivo modificado con cefoperazona, carbón y desoxicolato (mCCDA).
Cuarenta muestras (14,76%) fueron positivas para Campylobacter spp.
Seguido de esto se realizó PCR múltiple para la identificación de las
especies, los resultados fueron: C. coli (5%) C. jejuni (20%) y 75% no
amplifico con los cebadores utilizados. Se determinó la resistencia
antimicrobiana mediante la micro dilución en caldo usando el kit Sensititre
TM EUCAMP2. La resistencia de C. jejuni a los diferentes antibióticos fue:
ácido nalidíxico 25% (2/8), ciprofloxacina 38% (3/8), tetraciclina 38% (3/8)
y para estreptomicina 13% (1/8), para eritromicina y gentamicina no se
presentó resistencia. Para C. coli la resistencia a ácido nalidíxico,
ciprofloxacina y tetraciclina fue del 100% (2/2), y para gentamicina,
eritromicina y estreptomicina no se presentó resistencia. En conclusión, la
prevalencia obtenida de la muestra fue de 14,76% (40/271), siendo C. jejuni
la especie predominante, demostrando el riesgo que representan los perros
como reservorios de Campylobacter spp. y de cepas resistentes hacia los
antibióticos.
Palabras clave: Campylobacter spp/ CANES/ AISLAMIENTO/
TIPIFICACIÓN MOLECULAR/ PCR MULTIPLE/ RESISTENCIA
ANTIMICROBIANA.
xiv
Abstract
Campylobacteriosis is a disease that causes gastrointestinal infectious
diseases. Traditionally it is related to the consumption of poultry meat, but
there are other reservoirs such as bovines, sheeps, pigs, dogs and cats in
which it is a commensal of the intestinal mucosa. Campylobacter spp. From
rectal swabs on apparently healthy canines who attended the Veterinary
Clinic of the Central University of Ecuador. The animals come from the
urban parishes of the city of Quito. At the end of the study, which lasted 6
months, 271 samples were taken, which were cultured on a selective agar
modified with cefoperazone, carbon and deoxycholate (mCCDA). Forty
samples (14.76%) were positive for Campylobacter spp. Following this
multiple PCR was performed for species identification, the results were: C.
coli (5%) C. jejuni (20%) and 75% non-amplified with the primers used.
Antimicrobial resistance was determined by micro dilution and use of the
Sensititre TM EUCAMP2 kit. The resistance of C. jejuni to the different
antibiotics was: nalidixic acid 25% (2/8), ciprofloxacin 38% (3/8), tetracycline
38% (3/8) and streptomycin 13% (1/8), No resistance was present for
erythromycin and gentamicin. For C. coli resistance to nalidixic acid,
ciprofloxacin and tetracycline was 100% (2/2), and no resistance was found
for gentamicin, erythromycin and streptomycin. In conclusion, the
prevalence obtained from the sample was 14.76% (40/271), with C. jejuni
being the predominant species, demonstrating the risk that dogs represent
as reservoirs of Campylobacter spp. and of strains resistant to antibiotics.
Key words: Campylobacter spp / CANES / ISOLATION / MOLECULAR
TYPE / MULTIPLE PCR / ANTIMICROBIAL RESISTANCE
1
CAPITULO I
INTRODUCCIÓN
La campilobacteriosis es una enfermedad causada por bacterias del género
Campylobacter, las cuales son un grupo de bacterias que se encuentran
ampliamente distribuidas en diferentes nichos ecológicos y además son
comensales propios de la mucosa intestinal de animales de sangre caliente
como aves, ganado, perros y gatos (Lapierre, 2013; Quinn et al., 2011)
Es una de las enfermedades trasmitidas por alimentos más prevalentes en
todo el mundo, siendo una de las principales enfermedades asociadas en
el desarrollo de afecciones gastrointestinales (Lapierre, 2013). Según
informes en la Unión Europea, donde se han reportado que 9 millones de
personas son afectadas anualmente y en Estados Unidos se estima que
1,3 millones de personas son afectadas y 76 personas mueren cada año
(CDC, 2013; EFSA, 2014). Es la segunda enfermedad de mayor
presentación en países en vías de desarrollo, siendo más frecuente que las
infecciones causadas por Salmonella y Shigella, (Chanqueo, Gracía, León,
& Blu, 2005; Fernández, 2011; OMS, 2011).
Los signos clínicos en seres humanos pueden ser variados porque además
de presentar diarrea pueden presentar otras afecciones como: mialgias,
náuseas, vómitos, dolor abdominal, en donde generalmente las afecciones
son auto limitantes y no es necesario el uso de antibióticos ya que suelen
durar por lo general entre 3 a 6 días (OMS, 2011). Pero en niños así como
para personas inmunodeprimidas puede ser fatal, porque pueden darse
afecciones hepatobiliares, septicemia, artritis crónicas, el síndrome de
Guillain-Barré y el síndrome de intestino irritable (Acke et al., 2006;
Andrzejewska, Szczepańska, Klawe, Spica, & Chudzińska, 2013; OMS,
2011; G. Vasco et al., 2014).
Campylobacter spp. ha sido ampliamente estudiado en el área avícola
comprendiendo camales y granjas de producción, así como en el área de
salud humana, en donde se han desarrollado múltiples investigaciones en
2
diferentes localidades, sin embargo los estudios en animales de compañía
especialmente en caninos son escasos (Manzanillas, 2012; Simaluiza,
2015; Vasco, Graham, & Trueba, 2016).
En diferentes estudios se determinó que no todas las personas que
contrajeron la enfermedad fue por el consumo de carne de aves de corral
contaminada, ya que hay que tomar en cuenta que Campylobacter spp. se
distribuye ampliamente en la naturaleza, donde muchos animales de
sangre caliente tanto domésticos como silvestres pueden ser los portadores
(Lapierre, 2013).
Los perros debido al gran acercamiento que tienen con el ser humano,
ofrecen desde muchas perspectivas beneficios (Gómez G., Atehortua H.,
& Orozco Padilla, 2007), pero pueden representar un riesgo en el contagio
de campilobacteriosis.
En el presente estudio se realizó el aislamiento, la identificación de
especies mediante PCR y la evaluación de la resistencia antimicrobiana de
Campylobacter jejuni y Campylobacter coli usando el kit comercial
Sensititre TM EUCAMP2. A través de técnicas microbiológicas y
moleculares establecidas en el laboratorio de Bacteriología y Micología en
conjunto con el laboratorio de Biología Molecular en el área de la Unidad
de Investigación de Enfermedades Trasmitidas por Alimentos y
Resistencias Antimicrobianas (UNIETAR) de la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia.
3
OBJETIVOS
Objetivo general
Determinar la prevalencia de Campylobacter spp. y la presencia de
cepas multiresistentes de Campylobacter jejuni y Campylobacter coli en
caninos en las parroquias urbanas de la ciudad de Quito, los cuales
asisten por atención médica a la clínica de la facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador.
Objetivos específicos
• Aislar microbiológicamente Campylobacter spp. a partir de
muestras de hisopados rectales en caninos de la ciudad de Quito
en el medio selectivo mCCDA.
• Asociar la presencia de Campylobacter spp. con la edad, sexo y
el distrito al cual pertenecen los canes mediante la prueba de ji
cuadrado.
• Determinar la resistencia a antimicrobianos de cepas de
Campylobacter jejuni y Campylobacter coli identificadas
molecularmente.
HIPÓTESIS
H0: Los perros no son portadores de cepas de Campylobacter jejuni y
Campylobacter coli multiresistentes a antimicrobianos
H1: Los perros son portadores de cepas de Campylobacter jejuni y
Campylobacter coli multiresistentes a antimicrobianos.
4
CAPÍTULO II
REVISIÓN DE LITERATURA.
Campilobacteriosis.
La Organización Mundial de la Salud clasifica la campilobacteriosis como
una enfermedad infecciosa, producida por bacterias del género
Campylobacter. Es una de las principales causas de diarrea aguda
transmitida por alimentos y el contacto con animales en el mundo (OMS,
2011).
La campilobacteriosis desde hace mucho tiempo fue reconocida en el área
veterinaria principalmente en los casos de diarrea y aborto espontáneo que
se presentaban en el ganado bovino y ovino, sin embargo por muchos años
no se creía que podía afectar a los seres humanos (Law, Alcamo, &
Heymann, 2004). Pero desde 1975 cuando empiezan a surgir diversas
investigaciones, se identifica a Campylobacter spp. como productor de
diarrea aguda en el ser humano transmitida por animales (Gonzáles &
Cecchini, 2007).
Campylobacter spp. afecta principalmente a personas con
inmunosupresión como pacientes enfermos con VIH/SIDA y a niños
menores de dos años siendo los más vulnerables (Acke et al., 2006;
Andrzejewska et al., 2013). En países en vías de desarrollo se lo considera
como una enfermedad pediátrica siendo el agente patógeno que
mayormente se ha encontrado proveniente de diarreas, también se ha
observado que afecta a jóvenes y personas mayores de entre 15 y 44 años
(Orihuel, Sanz, Bertó, & Canet, 2015).
Historia del género Campylobacter.
Las infecciones por Campylobacter spp. han tenido un sinnúmero de
repercusiones en la salud pública y han sido estudiadas por más de un siglo
(Orihuel et al., 2015). Theodor Escherich, en 1886, observó por primera vez
al microscopio microorganismos de una forma curva espiralada, los cuales
5
se encontraban en muestras de heces y aparato digestivo, provenientes de
niños que murieron a causa de un proceso gastroentérico, lo que denominó
“cólera infantil” (Butzler, 2004; Skirrow, 1994). Este microorganismo no era
posible de cultivar en medios sólidos; sin embargo, no creía que estas
bacterias fueran la causa etiológica para las diarreas (Butzler, 2004).
En medicina veterinaria varios autores ya describían a Campylobacter spp.,
McFadyean y Stockman en el año de 1913 en Inglaterra, fueron los
primeros en implicar a Campylobacter spp. como agente causal de abortos
en ovejas (Butzler, 2004). Cinco años después Smith, implicó el mismo
microorganismo en abortos de bovinos en los Estados Unidos; y analizando
el trabajo de McFadyean y Stockman, asumió que la misma bacteria era el
agente etiológico, y junto con Taylor se propuso el nombre de Vibrio fetus
a la bacteria en cuestión (Smith & Taylor, 1919). Jones y cols en 1931
identificaron vibriones en diarreas en terneros por lo cual denominaron al
microorganismo como Vibrio jejuni, y posteriormente Doyle en 1948
denominó como Vibrio coli a las bacterias que presentaban la misma
morfología en porcinos con diarreas (Torralbo, 2013).
La primera infección reportada en humanos producida por Campylobacter
spp. se produjo en la ciudad de Illinois en los Estados Unidos en 1938, en
donde hubo la presencia de V. jejuni en 355 personas que sufrían
problemas gastrointestinales debido a que habían consumido leche
contaminada (Butzler, 2004). El género Campylobacter, fue propuesto en
el año de 1963 por Sebald y Veron cuando se reconoció que no tenía las
mismas características que el género Vibrio, su composición de bases de
nucleótidos es diferente, por su metabolismo no fermentativo y el
requerimiento que tenía para crecer era de una atmosfera microaerofílica
(Silva et al., 2011). En la década de los setenta Butzler y Skirrow, Bolton y
Robertson, Blaser y col, desarrollaron medios de cultivo en los cuales ya
pudo aislarse con mayor facilidad y así poder determinar la participación de
Campylobacter en los cuadros diarreicos en humanos (Viñas & Farace,
2007). En la década de los ochenta, Campylobacter spp., fue reconocido
6
oficialmente como la causa de gastroenteritis bacteriana en el hombre, y se
identifica como principal reservorio para el contagio del ser humano a la
carne de pollo contaminada (Torralbo, 2013).
Skirrow (1981) menciona la transmisión de Campylobacter por parte de
perros y gatos, se cita que las infecciones son causadas en su mayoría por
perros domésticos principalmente por cachorros y el grupo más afectado
son los niños de corta edad, denominándola a la campilobacteriosis como
la “nueva zoonosis”.
TAXONOMIA Y MORFOLOGÍA DEL GÉNERO Campylobacter
Campylobacter según la décima edición del Bergey´s Manual of
Determinative Bacteriology, (Cuadro 1), pertenece al reino bacteria, filo
Proteobacteria, clase Epsilonbacteria, orden Campilobacterales, en la
cuales se incluyen las familias Woilinella, Helicobacteraceae y
Campylobacteraceae, a la que pertenece Campylobacter (Butzler, 2004;
Lapierre, 2013; Parkhill et al., 2000; Torralbo, 2013).
Cuadro 1. Clasificación de Campylobacter spp.
Reino Bacteria
Filo Proteobacteria
Clase Epsilonbacteria
Orden Campilobacterales
Familia Campylobacteraceae
Fuente: Torralbo (2013)
Elaboración: El Autor
Morfología del género Campylobacter.
Campylobacter spp. es una bacteria Gram negativa con un tamaño de 0,2-
0,8 µm de ancho y 0,5-5 µm de largo, tiene una forma curva o espiralada
7
(Quinn et al., 2011). Cuando dos bacterias se juntan tiene la apariencia de
“alas de gaviota” o una forma de “V”, es un organismo que se puede
desarrollar óptimamente a 37 ± °C, pero las especies C. jejuni, C. coli, C.
lari y C. upsaliensis tienen la capacidad de desarrollarse a 41,5±°C,
constituyendo el grupo termotolerante (Hernández & Hernández, 2007;
Quinn et al., 2011; Silva et al., 2011). (Grafico 1 y 2).
Es una bacteria que no forma esporas, no es sacarolítica y tiene un bajo
contenido de guanina y citosina, además que es incapaz de crecer en un
pH menor a 4,9 y mayor de 9,0; sin embargo, su pH óptimo está entre 6,5
y 7,5 (Boto, 2014; Silva et al., 2011).
Es una bacteria con condiciones microaerofílicas, lo cual quiere decir que
para su desarrollo necesita de una atmósfera la cual contenga: 5% de
oxígeno, 10% dióxido de carbono y 85% de Nitrógeno (Holmberg,
Rosendal, Engvall, Ohlson, & Lindberg, 2015). Es una bacteria motil, por lo
cual puede contener uno o más flagelos en sus polos (Lapierre, 2013; OIE,
2008; Quinn et al., 2011).
En cultivos envejecidos o expuestos a condiciones atmosféricas adversas
como la exposición a oxígeno atmosférico, puede desarrollar una forma
cocoide, pero no se pueden cultivar puesto que disminuyen su nivel de
péptidos, ácidos nucleicos superdesoximutasa y su integridad celular
(Hernández & Hernández, 2007). Esto ha generado controversia puesto
que se podrían tratar de formas viables pero no cultivables del
microorganismo (Hernández & Hernández, 2007).
Campylobacter spp. es susceptible a la congelación, deshidratación e
irradiación (OMS, 2011), pero últimamente se ha observado que algunas
especies de Campylobacter son resistentes a estos fenómenos físicos
(Fernández, 2011).
8
Gráfico 1. Campylobacter jejuni (100x)
Fuente: MedlinePlus (2016).
Gráfico 2. Campylobacter spp. (100x).
Fuente: El Autor
Especies de Campylobacter.
Campylobacter se agrupa en 17 especies y 6 subespecies. Las más
frecuentes en producir afecciones son: C. coli y C. jejuni, la cual se divide
en dos subespecies: C. jejuni jejuni y C. jejuni doylei, pero también se ha
descrito que C. lari y C. upsaliensis han sido aisladas en pacientes con el
síndrome diarreico, pero no son tan frecuentes (Del et al., 2008; Fernández,
2011; OMS, 2011).
Se han incluido 24 especies potenciales dentro del género Campylobacter
entre las cuales están: C. fetus, C. hyointestinalis, C. lanieane, C. sputorum,
C. mucosalis, C. concisus, C. curvus, C. showae, C. hominis, C.
9
insulaenigrae, C. canadienses, C. peloridis, C. subantarticus, C.
upsaliensis, C helveticus y recientementes se han agregado C. avium
(Mirko Rossi et al., 2009) C. cuniculorum (Zanoni, Debruyne, Revez, Rossi,
& Vandamme, 2009) C. ureolyticus (Vandamme, Debruyne, De Brandt, &
Falsen, 2010) y C. troglodytis (Kaur et al., 2011).
Las propiedades bioquímicas de Campylobacter spp. son variadas a
diferentes reacciones en sus especies, como se las puede observar en el
cuadro 2.
Cuadro 2. Propiedades bioquímicas de diferentes especies de Campylobacter.
+ reacción positiva, - reacción negativa, V variable dependiendo de la cepa, ND no determinado.
Elaboración: El Autor Fuente: Torralbo, (2013); OIE (2008); Viñas & Farace, (2007).
EPIDEMIOLOGÍA
Distribución geográfica y reservorios.
La epidemiología de Campylobacter spp. es complicada ya que al ser
microorganismos que varían de acuerdo a las estaciones del año, sus
Hidrólisis
Especie Catalasa Hipurato Indol Voges-
Proskauer Oxidasa Ureasa
C. jejuni + - + - + -
C. coli + - - - + -
C. lari + - - - + V C. fetus + - - + -
C. upsaliensis - - + - + - C.
hyointestinalis + - - - + -
C. rectus V - - - + -
C. showae + - - - + - C. sputorum V - - - + -
C. hominis - ND - - + - C. gracilis V - V - V -
10
factores de riesgo son diferentes tanto en los entornos rurales como en los
entornos urbanos (Nichols, Richardson, Sheppard, Lane, & Sarran, 2012).
Campylobacter spp. se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes
nichos ecológicos y se considera a la campylobacteriosis una de las
zoonosis de mayor importancia a nivel mundial, ya que se ha constatado
que se extiende alrededor del mundo (OMS, 2011). Incluso en lugares bien
alejados, como en la Antártida se ha logrado aislar C. lari en pingüinos
(Tuemmers, Torres, & De Los Rios-Escalante, 2011).
Esta bacterias han logrado aislarse en varias especies de animales,
alrededor del mundo.
Rodríguez, Guzmán, & Verjan (2015) reportan aislamientos de C.
upsaliensis y C. coli en Suecia, Alemania, Noruega y Suiza. Garcia, Steele,
& Taylor (2010) aislaron Campylobacter spp. de ovejas en Italia, Francia y
en Escocia.
En Reino Unido y Dinamarca se aisló Campylobacter spp. de canes (Hald,
Pedersen, Wainø, Jørgensen, & Madsen, 2004; Parsons et al., 2009).
En el continente asiático, en China se ha aislado con mayor frecuencia
Campylobacter spp. en pollos broilers (Wang, Guo, & Li, 2013), en Japón
se reportó el aislamiento de Campylobacter spp. en perros y gatos (Misawa,
Kawashima, & Kondo, 2001). En África se ha aislado Campylobacter spp.
en distintas regiones tanto de aves domésticas como de aves silvestres,
ganado bovino, camellos y caballos. Salihu, Magaji, Abdulkadir, & Kolawale
(2010) en Nigeria aislaron Campylobacter spp. en el 27,7% de una muestra
de 141 canes.
En Oceanía se ha aislado Campylobacter spp. en varias especies animales
las cuales también incluían perros y gatos (Baker, Barton, & Lanser, 1999;
Mohan, 2015).
En Sudamérica se ha aislado Campylobacter spp. en perros y gatos, en
aves de corral y en ganado, incluso en animales de la zona amazónica, en
11
donde la especie con mayor prevalencia ha sido C. coli (Fernández, 2011).
En Argentina se aisló Campylobacter spp. en el hospital de la ciudad de
Santa Rosa en pacientes así como en sus mascotas, sobresaliendo la
relación genética de los aislamientos entre las personas con sus mascotas,
sugiriendo que tuvieron la misma fuente de contaminación (Tamborini,
Casabona, Viñas, Asato, & Hoffer, 2012).
En los países sudamericanos lo notable es la presencia de portadores
humanos sanos lo cual es raro y de baja presentación, esto se puede ligar
a las malas condiciones sanitarias básicas donde viven las personas.
Teniendo mayor facilidad para que Campylobacter spp. se pueda transmitir
desde sus reservorios especialmente a niños de corta edad (Fernández,
2011).
Todo esto da una idea de cuan extendido está Campylobacter spp.
alrededor del mundo, así como de sus diferentes reservorios.
La gravedad con la que Campylobacter spp. va a afectar a su hospedador
es la cantidad de inóculo que se ingiera y la condición inmunológica del
paciente, pues tiene una dosis infectante baja comprendida entre 500-600
microorganismos (Hernández, Aguilera, & Castro, 2013). Siendo los
factores de riesgo la carne de aves de corral contaminada, agua
contaminada y el contacto con mascotas (Acke et al., 2006; Bennett, Dolin,
& Blaser, 2015; Organización Panamericana de la Salud, 2012; Orihuel et
al., 2015).
El principal reservorio para Campylobacter spp. son las aves de corral y las
aves silvestres, ya que es un comensal normal de la mucosa intestinal en
donde la especie que predomina es C. jejuni y C. coli. Otros mamíferos
también pueden actuar como reservorio de la enfermedad como bovinos,
cerdos, ovejas y perros (EFSA, 2012). Los canes pueden presentar
Campylobacter spp.; presentando con mayor frecuencia las especies de C.
upsaliensis y C. jejuni (Hald et al., 2004). Sin embargo los canes muchas
12
de las veces no presentan signos clínicos y las infecciones pueden pasar
inadvertidas (Nelson & Couto, 2014; Quinn et al., 2011).
Se considera que un seis por ciento de casos de campilobacteriosis
humana se debe al contacto con mascotas, por lo cual aunque las aves de
corral son el principal reservorio no se debe desestimar el contacto con
perros como vía de infección (Rossi, Hänninen, Revez, Hannula, & Zanoni,
2008; Torralbo, 2013).
En los canes uno de los factores más importantes para que se infecte el
individuo con Campylobacter spp. es la edad, porque se ha observado que
lo animales jóvenes tienen un mayor riesgo de infección (Nelson & Couto,
2014).
Si el animal tiene procesos virales o parasitarios Campylobacter spp. puede
agravar los signos clínicos (Ettinger & Feldman, 2009; Torralbo, 2013). Se
menciona que Campylobacter es un microorganismo oportunista y puede
hacer sinergia con otros microorganismos patógenos en el intestino del
perro cuando colonizan la mucosa intestinal, esto permite a Campylobacter
spp. tener una colonización más eficaz (Torralbo, 2013).
Se ha descrito que la raza de los canes no tiene asociación con el contagio
de Campylobacter spp., pero Westgarth et al. (2009) observó que los perros
de raza pequeña presentaban un mayor porcentaje de aislamientos para
Campylobacter spp., lo cual representa un riesgo para niños pequeños que
conviven con mascotas (Hald & Madsen, 1997).
Situación de la Campilobacteriosis en el Ecuador.
En el Ecuador la campilobacteriosis ha sido poco estudiada, esto se debe
a que muchas de las veces a las enfermedades diarreicas no se les da la
adecuada importancia, y al ser una enfermedad auto limitante no se reporta
a los organismos de salud. Sin embrago es uno de los principales motivos
por el cual los niños asisten a los centros de salud (Andrade, García,
Castillo, Morocho, & Chávez, 2013).
13
En el país se han realizado varias investigaciones referentes a las
enfermedades diarreicas. Una de las primeras fue en el año de 1984 en
donde Guderian, Ordoñez, & Bossano (1987) examinaron 100 niños en una
edad comprendida entre 1 a 24 meses, los cuales presentaban diarrea en
esa ocasión en el hospital pediátrico de Quito “Baca Ortiz”, dando como
resultado que el 23% de las muestras fue positivo a Campylobacter fetus
subsp. jejuni.
Vasco et al. (2014) realizó un estudio de caso control, recolectando
muestras de heces fecales de personas que presentaban signos
gastrointestinales y aquellas que no los padecían, en la comunidad rural de
Borbón en la provincia de Esmeraldas y en Guamaní en la ciudad Quito. En
la zona urbana de una muestra de 200 personas, observó que 11 individuos
presentaban Campylobacter jejuni (5,5%) y 5 individuos Campylobacter coli
(2,5%), mientras que en Borbón la presentación fue más baja ya que solo
hubo un caso para Campylobacter jejuni y Campylobacter coli. El hallazgo
de Campylobacter fue mayor en la zona urbana que en la zona rural, pese
a que en la zona rural las condiciones sanitarias no eran las más
adecuadas.
En el área avícola han habido diferentes investigaciones principalmente en
mataderos, en las diferentes áreas de procesamiento de las carcasas y
vísceras, así como en supermercados y ferias libres donde se obtuvieron
muestras positivas a Campylobacter spp. Demostrando el riesgo que
representa para la población en lo referente a salud pública (Medina
Santana & Vinueza Burgos, 2015; Moreno, 2015; Poma Vivanco & Vinueza
Burgos, 2014).
Sin embargo, en los canes la información es escasa, registrándose en el
país 3 estudios. Dos fueron hechos en la ciudad de Loja y uno fue realizado
en la comunidad semirural de Yaruqui en la provincia de Pichincha
(Manzanillas, 2012; Toledo, Simaluiza, Ochoa, & Fernández, 2015; Vasco,
Graham, & Trueba, 2016).
14
Manzanillas (2012) recolectó heces fecales de 43 canes los cuales
presentaban signos gastroentéricos y signos respiratorios, sin tomar en
cuenta a los animales sanos, esto fue realizado en la ciudad de Loja en el
hospital docente veterinario de la Universidad Nacional de Loja. Dando
como resultado que un 65.12% fue positivo para Campylobacter spp.
Simaluiza (2015) recolectó heces fecales de canes en los parques públicos
de la ciudad de Loja en donde el 6,2% de las muestras fue positivo para
Campylobacter spp., pero esto no es una cifra real pues se desconoce la
influencia antibiótica, el tiempo en que defecó el animal y fueron tomadas
las muestras. Este resultado pudo haberse dado ya que Campylobacter
spp. necesita de condiciones especiales para su crecimiento y pudo haber
muerto hasta la toma de la muestra.
En otro estudio realizado en la comunidad semirural en Otón-Yaruqui
localizada al este de Quito, se tomaron muestras de varios animales los
cuales eran pollos, ganado, patos, ovejas, cuyes, conejos, caballos, perros
y gatos, así como también se recolectaron muestras de los habitantes de
la comunidad (Vasco et al., 2016).
Los resultados obtenidos arrojaron que Campylobacter jejuni fue el más
prevalente de las 82 muestras animales con un 30,7% junto con otros
agentes entero patógenos. La presentación de Campylobacter spp. en
canes fue de un 30% en una muestra de 12 animales (Vasco et al., 2016).
PATOGENIA Y FACTORES DE VIRULENCIA
Transmisión.
Campylobacter spp. tiene varios factores asociados a su virulencia pero no
están comprendidos del todo, algunos estudios sugieren que la motilidad
por la presencia de flagelos, la capacidad de adherencia e invasión de la
célula junto con la producción de citotoxinas, podrían ayudar a entender
15
cómo actúa Campylobacter spp. (Lapierre, 2013; S. Lee et al., 2016;
Velasco, Vizcaya, Nieves, & Pérez Schael, 2002).
Los animales se contagian mediante la transmisión feco-oral, cuando
ingieren comida o agua contaminada con heces, a través de fómites
contaminados con heces, por contacto directo con animales infectados y a
través de la ingestión de carne mal cocida, o productos contaminados (Iowa
State University, 2006).
Pero aún no se ha podido establecer claramente como los canes se
contagian de la campilobacteriosis puesto que no ha sido tan estudiada
como en las aves de corral, pero se piensa que los perros pueden
contagiarse por el contacto con aves domésticas o a través de las personas
mediante la ingestión de restos de comida (Damborg et al., 2016; Mughini
et al., 2013; Torralbo, 2013).
Hay que considerar que varios autores describen que los perros callejeros
de las ciudades se contagian con mayor frecuencia que los perros de las
zonas rurales (Hald et al., 2004).
Los perros que provienen de albergues y tienen un alto contacto con otros
perros por un largo periodo de tiempo, presentan mayor prevalencia de
Campylobacter spp. (Backert & Hofreuter, 2013; Torre & Tello, 1993).
Campylobacter spp. al ingresar al tracto gastrointestinal evade la capa de
moco del intestino con lo cual interactúa con las células epiteliales,
produciendo interleucina 8, lo cual provoca que células inmunitarias como
macrófagos, neutrófilos y células dendríticas reaccionen a la invasión
bacteriana de la célula epitelial, provocando la respuesta inflamatoria
(Gráfico 3) (O Cróinín & Backert, 2012; Young, Davis, & Dirita, 2007).
16
Gráfico 3. Modelo hipotético de como C. jejuni conduce a la invasión bacteriana y establece las infecciones.
Fuente: O Cróinín & Backert (2012).
La infección por Campylobacter spp. se lleva a cabo en 4 fases las cuales
comprenden: colonización, adherencia en las células del intestino, invasión
y la producción de endotoxinas (Hernández, Aguilera, & Castro, 2013).
Los mecanismos que causan los factores de virulencia que se describirán
a continuación son basados en C. jejuni por ser la especie más estudiada
(Torralbo, 2013).
MECANISMOS DE VIRULENCIA
• Lipopolisacárido y lipooligosacárido.
Campylobacter spp. contiene en su membrana una cápsula la cual le
permite colonizar e invadir el intestino y le otorga resistencia al suero. En la
17
cápsula se encuentra el lipopolisacarido (LPS) y el lipooligosacárido (LOS),
los cuales tienen actividades endotóxicas, se adhieren a las células
epiteliales y las invaden (Bouwman, de Zoete, Bleumink-Pluym, Flavell, &
van Putten, 2014). El antígeno “O” presente en el lipopolisacárido contiene
ácido siálico el cual es similar a los gangliosidos humanos(Cáceres, 2013;
Lapierre, 2013). El lipooligosacárido participa también en la resistencia y
tiene cierto mimetismo molecular por los gangliosidos neuronales en los
nervios periféricos en el ser humano y en conjunto con el lipopolisacárido
participarían en el trastorno autoinmune del síndrome de Guillian-Barré
(Hernández et al., 2013).
• Presencia de flagelos.
Los flagelos participan en la invasión del intestino delgado, porque
necesitan movilizarse desde el intestino delgado hasta el colon (Lapierre,
2013). También participan en la supervivencia bacteriana en los diferentes
nichos del tracto gastrointestinal, ya que pueden sobrevivir al ácido gástrico
y a las sales biliares (Lapierre, 2013).
El flagelo se compone de una proteína denominada flagelina, la cual se
encuentra formada por una flagelina mayor FlaA y una menor FlaB. Las
cuales son esenciales para que se pueda unir el flagelo a las células
epiteliales del intestino, donde se produce la invasión y subsecuente la
quimiotaxis en conjunto con la secreción de proteínas. Esto se debe porque
Campylobacter spp. no posee los sistemas de secreción tipo 3 o 4, los
cuales se encuentran en otras especies patógenas de entero bacterias
(Lapierre, 2013).
Los flagelos son importantes, relacionándose con la adhesión e invasión,
por lo cual si este factor cambia o muta la capacidad de adhesión e invasión
se verá reducida (Raddadi et al., 2010).
18
• Adhesión e invasión.
La capacidad de Campylobacter spp. para adherirse a la pared del intestino
aún no está totalmente determinado pero se cree que están involucrados
múltiples factores (Backert & Hofreuter, 2013). Campylobacter spp. al lograr
adherirse a la mucosa intestinal, se puede unir a receptores específicos de
la superficie basal de los enterocitos (Torralbo, 2013).
Esta bacteria se puede mover a través de las uniones estrechas y así
invadir a las células epiteliales, o ser capturado por macrófagos en los
cuales puede provocar la apoptosis. Todo esto induce a que se produzcan
citosinas y quimosinas las cuales contribuyen a la diarrea (Raddadi et al.,
2010).
Una vez adherido Campylobacter spp. a las células epiteliales del intestino,
el citoesqueleto de los enterocitos se reorganiza para el ingreso del agente
patógeno (Ziprin, Young, Stanker, Hume, & Konkel, 1999). En donde es
favorecido por las glicoproteínas de la pared, así como por proteínas
codificadas por los genes flaA (Koolman, Whyte, Burgess, & Bolton, 2016).
El factor cadF tiene una función de disparador con la célula huésped y es
una de las principales proteínas de adhesión a la fibronectina de la matriz
celular (Lapierre, 2013). Las invasinas son producidas por los genes ciaB y
pldA, las cuales afectan a los mecanismos de defensa del hospedador
(Ziprin et al., 1999).
• Toxina de distensión citoletal (CDT).
Es una toxina que es producida por diversas especies bacterianas, esta
toxina detiene el ciclo celular en G1 o G2 en la mitosis, provocando muerte
celular y por consecuente la respuesta inflamatoria (Raddadi et al., 2010).
Se constituye por tres subunidades codificadas por los genes cdtA, cdtB y
cdtC, los cuales permiten la unión a la membrana celular del hospedador
produciendo el daño celular en el ADN del huésped (Lapierre, 2013). La
subunidad cdtB es más activa la cual destruye el mecanismo de reparación
19
celular produciendo la muerte de la célula así como también la producción
de IL-8 (Raddadi et al., 2010).
Signos clínicos.
Campylobacter spp. se aloja en el colon, por lo cual en el ser humano
provoca diarrea, además que puede asociarse a más afecciones como
meningitis, septicemia, artritis reactivas, mialgias severas, dolor abdominal,
síndrome de Guillain-Barré, síndrome de Miller-Fisher, síndrome de
intestino irritable e infecciones hepatobiliares (Lapierre, 2013a; OIE, 2008).
En animales las diferentes especies de Campylobacter spp. provocan
diarreas, lesiones del tracto gastrointestinal, hepatitis focal, abortos,
infertilidad y placentitis, sin embargo se debe tomar en cuenta que
Campylobacter spp. es un comensal normal de la flora intestinal de los
animales sanos y muchas de las veces pueden pasar los signos clínicos
inadvertidos (Quinn et al., 2011)
Nelson & Couto (2014) mencionan que perros y gatos que viven en
albergues, criaderos y perreras tienen una mayor probabilidad de contraer
campilobacteriosis. En canes la campilobacteriosis suele ser auto limitante
y tener un buen pronóstico con el uso adecuado de antibióticos, pero puede
ocasionar diarrea crónica.
Tratamiento.
En canes el tratamiento de elección es la terapia con eritromicina 11-15
mg/kg/Vía oral/ TID, neomicina 20 mg/kg/Vía oral/ BID durante 1-3 días
hasta obtener la resolución de los signos clínicos, sin embargo el
tratamiento puede llegar a extenderse si no se mejoran las condiciones
ambientales especialmente en animales de criaderos o refugios (Nelson &
Couto, 2014).
20
RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS
La resistencia que actualmente presentan las bacterias a los diferentes
antimicrobianos es un tema preocupante de salud pública ya que cada vez
es más difícil tratar clínicamente las infecciones, esto se da porque los
microorganismos activan genes los cuales les permiten que manifiesten
mecanismos para generar resistencia a los agentes terapéuticos
empleados (Cabrera, Gómez, & Zúñiga, 2007).
Diferentes cepas de Campylobacter spp. de origen humano y animal han
generado resistencia en los últimos años para los fármacos de elección
como: macrólidos, fluoroquinolonas, tetraciclinas y penicilinas (Fernández,
2011; González-Hein, Cordero, García, & Figueroa, 2013).
Los mecanismos por los cuales Campylobacter spp. genera resistencia
aún no se los ha entendido del todo, pero se considera que la
permeabilidad celular externa donde intervienen los lipooligosacáridos y la
cápsula, produce que se disminuya la permeabilidad a los antibióticos y
porinas o bombas de eflujo donde los antibióticos son extruidos, pueden
ser los responsables (Boto, 2014; Jeon, Muraoka, & Zhang, 2010).
• Resistencia a Beta-lactámicos
Campylobacter spp. es resistente a la mayoría de betalactámicos, pero
existen algunos a los cuales sigue siendo susceptible como: amoxicilina y
ampicilina (Iovine, 2013).
La resistencia a los beta-lactámicos por parte de Campylobacter spp. aún
no está comprendida del todo, pero se piensa que se realiza por tres
mecanismos: inactivación enzimática por β- lactamasas codificadas
cromosómicamente, reducción de la absorción debido a alteraciones en las
porinas de la membrana externa y bombas de eflujo. C. coli y C. jejuni son
capaces de producir betalactamasas los cuales inactivan la molécula de
betalactama por hidrolización de su anillo estructural (Iovine, 2013).
21
• Resistencia a macrólidos
La resistencia que le confiere Campylobacter spp. a los macrólidos son las
mutaciones en las posiciones 2074 y 2075 del gen rm que codifica 23s
ARNr, porque muta interfiriendo con el sitio de unión del ribosoma de
destino (Iovine, 2013).
Se describen otros mecanismos en los cuales mutan los genes rplD y rplV
afectando a las zonas de las proteínas ribosómicas L4 y L2 y también por
alteraciones en las bombas de eflujo inespecíficas (Boto, 2014).
• Resistencia a Tetraciclinas
La resistencia de Campylobacter spp. a las tetraciclinas se da por el gen
TetO, el cual se ubica en un plásmido auto-transmisible contribuyendo a
que se produzca proteínas de protección ribosomal, (Wieczorek, Osek,
Wieczorek, & Osek, 2013).
• Resistencia a aminoglucósidos
La resistencia de Campylobacter spp. a los aminoglucósidos está dada por
la modificación enzimática, disminuyendo la afinidad de los
aminoglucósidos por el ARNr. Estas enzimas se clasifican en 3 tipos:
aminoglucósidos acetiltransferasas, aminoglucósidos adeniltransferas,
aminoglucósidos fosfotransferasas (Wieczorek et al., 2013).
• Resistencia a quinolonas
Las quinolonas tiene dos sitios blanco en bacterias Gram negativas, el
principal Toposiomerasa II y el secundario Topoisomerasa IV, pero
Campylobacter no pose el sitio secundario y esto se dá por una mutación
dada por un cambio aminoacídico en la región de la topoisomerasa II, el
cual se lo denomina región determinante de resistencia a las quinolonas
(García, 2009). La resistencia que se produce es porque existen
mutaciones en el gen GyrA, las cuales reducen la afinidad por las
fluoroquinolonas con la ADN girasa (Jeon et al., 2010).
22
AISLAMIENTO, DIAGNÓSTICO E IDENTIFICACIÓN DE Campylobacter
spp.
Para el aislamiento exitoso de Campylobacter spp. depende de factores
como el medio de cultivo, la temperatura de incubación la cual se
recomienda que sea a 42°C, con el propósito de minimizar el crecimiento
de contaminantes y la atmósfera apropiada con un 5-10% de dióxido de
carbono, para que se puede desarrollar óptimamente el microorganismo
(Koneman et al., 2006).
Para el diagnóstico de Campylobacter spp. la prueba establecida es el
cultivo y aislamiento, el cual puede llevarse a cabo a partir de heces o
hisopados rectales, basándose en la morfología de las colonias; las cuales
pueden ser pequeñas, aplanadas, de un color metálico grisáceo con una
apariencia acuosa, junto con la observación al microscopio (Quinn et al.,
2011).
Campylobacter spp. tiene resistencia intrínseca a diferentes antibióticos
como: bacitracina, novobiocina, rifampicina, estreptomicina B, trimetoprim,
vancomicina y varios betalactámicos, esto ha permitido que se puedan
hacer varios medios de cultivo para las diferentes especies de
Campylobacter (Boto, 2014).
Como se ha mencionado Campylobacter spp. es una bacteria que necesita
de condiciones especiales, por lo cual existen diferentes medios de cultivo
para satisfacer sus necesidades, los medios de cultivo pueden contener
sangre como: agar Preston, agar Skirrow, agar Butzler y Campy-cefex o
pueden contener carbón como: agar mCCDA, Karmali y CAT, con el
propósito de eliminar los derivados tóxicos del oxígeno, además que
pueden agregarse antibióticos para su selectividad, especialmente
cefalosporinas, sin embargo aún no se establecen métodos estandarizados
para el aislamiento de Campylobacter spp. a partir de heces, muestras de
alimentos o agua (OIE, 2008).
Existen técnicas para el diagnóstico presuntivo, como:
• Tinción Gram directa
23
• La microscopia de contraste de fases
• La tinción de Hucker
• La tinción de Vagó
Estas técnicas constituyen un método fácil para el aislamiento y la
detección rápida de Camylobacter spp. en la práctica clínica diaria
(Chanqueo et al., 2005; Fernández, 2011). La tinción Gram directa tiene un
valor predictivo positivo del 60%, la microscopia de contraste de fase tiene
un 85,7%, mientras que la tinción de Hucker presenta una sensibilidad del
37,5% y una especificidad del 100% (Chanqueo et al., 2005; Fernández,
2011). Hay que considerar que el diagnóstico por tinción es útil pero no
sustituye al cultivo el cual es el mejor método para la detección de
Campylobacter spp. (Morales & Herrera, 2009).
La filtración pasiva desarrollada por Steele y McDermott, es un método en
el cual no se utilizan medios selectivos y consiste en depositar una muestra
sobre un filtro, el cual no permite que microorganismos grandes pasen.
Campylobacter spp. al ser móvil y delgado pasa fácilmente por la
membrana, transcurrido entre 30 a 45 minutos se retira el filtro y la placa
es incubada por 72 horas a 37°C en microaerofilia (Fernández, Vera, &
Villanueva, 2007).
Identificación de especies de Campylobacter spp.
Para la identificación de especies de Campylobacter spp. existen diferentes
pruebas:
• Pruebas bioquímicas: Permiten observar las características
fenotípicas de cada especie y así poder diferenciarlas, actualmente
estas pruebas ya no se utilizan debido a la mutación bacteriana y se
están reemplazando por métodos moleculares (OIE, 2008).
• Pruebas de aglutinación en látex: Es una prueba la cual utiliza
anticuerpos policlonales y detecta proteínas de membrana y
flagelares. Las partículas de látex se recubren con inmunoglobulinas
24
las cuales se levantan contra el antígeno de varias especies de
Campylobacter spp (Gharst, Oyarzabal, & Hussain, 2013).
• Ensayos de Inmunoabsorción ligados a enzimas: Es una prueba
rápida pero que debe ser confirmada por medio del cultivo (Gharst
et al., 2013). Existen kits comerciales como el ProSpecT™
Campylobacter en heces la cual tiene una sensibilidad del 97-100%
y especificidad del 98-100%(Oyarzabal & Battie, 2012), y el kit
Campylobacter test el cual es un test rápido de inmunocromatografía
para la detección de Campylobacter spp. en heces humanas el cual
tiene una sensibilidad del 99% y especificidad del 99% (Francisco
Soria Melguizo S.A., 2012).
• Identificación molecular: Este método es rápido y específico para la
identificación de Campylobacter spp. y es una herramienta fiable, la
sensibilidad de los ensayos de PCR está en el rango de 103 UFC/ml
pero se reduce al analizar matrices de alimentos (Gharst et al.,
2013).
La PCR consiste en la amplificación de una secuencia de ADN diana
en un ciclo de tres pasos:
1. La doble cadena de ADN se desnaturaliza a una alta temperatura
2. Dos oligonucleótidos sintéticos monocatenarios hibridan en las
hebras de ADN en sitios específicos
3. Ocurre la polimerización mediante el cual los cebadores
complementarios del ADN monocatenario se extiende con la
presencia de desoxirribonucleótidos y una ADN polimerasa
termoestable (Elnifro, Ashshi, Cooper, & Klapper, 2000; J. W.-F.
Law, Ab Mutalib, Chan, & Lee, 2014).
El método del PCR multiple ha sido diseñado para detectar agentes
virales, bacterianos u otros agentes infecciosos en una reacción,
actualmente es usado también para el diagnóstico rutinario de
Campylobacter coli y Campylobacter jejuni por ser simple y rápido
para identificar diferente cepas (Persson & Olsen, 2005).
25
PCR multiple ha sido utilizado con éxito para la identificación de
diferentes especies de Campylobacter spp., principalmente en aves
dando resultados fiables, pero la FDA (Food and Drug
Administration) considera que esta prueba es confirmatoria y es
necesario hacer un cultivo (Gharst et al., 2013).
26
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS.
MATERIALES
En la presente investigación se utilizaron los siguientes materiales:
• Agar mCCDA marca Oxoid TM
• Agar sangre marca Oxoid TM
• Placas Sensitre® EUCAMP
• Cloruro de Sodio
• Caldo Mueller-Hinton marca Oxoid TM
• Sangre lisada de equino
• Sangre desfibrinada de ovino
• Pipeta de 1000 µl
• Pipeta de 100 µl
• Pipeta multicanal
• Vortex
• Densitómetro
• Hisopos estériles
• Cajas Petri plásticas
• Cajas de guantes de látex desechables
• Tubos de ensayo estériles
• Jarra de microaerofilia
• Tanque de gases 8%CO2.
• Cooler
• Incubadora 41,5 ± °C.
• Incubadora 37 °C
• Cámara de Bioseguridad.
• Equipo para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
27
Metodología
Tipo de Investigación.
El tipo de investigación que se utilizó en el proyecto fue de tipo
observacional transversal.
Ubicación Geográfica.
La clínica veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de
la Universidad Central del Ecuador se encuentra a 2.864 msnm con las
siguientes coordenadas Latitud 01153.97°y Longitud 783024.26 °.
El trabajo de campo se lo realizó en la clínica veterinaria de la Facultad de
Medicina Veterinaria y zootecnia de la Universidad Central del Ecuador,
mientras que el trabajo de laboratorio fue ejecutado en el laboratorio de
Bacteriología y Micología y en el laboratorio de biología molecular
perteneciente a la Unidad de Enfermedades Transmitidas por Alimentos y
Resistencias Antimicrobianas (UNIETAR) de la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador.
Factores de Estudio.
En el trabajo se determinó la prevalencia de Campylobacter spp. en caninos
procedentes de las parroquias urbanas de la ciudad de Quito mediante
aislamiento bacteriológico en el medio selectivo mCCDA en el laboratorio
de biología molecular. El medio selectivo mCCDA es un medio sólido el
cual contiene desoxicolato, sulfato ferrosol los cuales promueven el
crecimiento de Campylobacter spp, cefoperazona la cual inhibe el
crecimiento de microorganismos Gram negativos y positivos y anfotericina
inhibe el crecimiento de levaduras y hongos, es el medio recomendado por
la OIE para el aislamiento de Campylobacter termo tolerante en muestras
de heces y alimentos el cual fue propuesto por la organización internacional
de Estandarización (ISO) según la norma ISO 10272:2006 para la
enumeración de Campylobacter termo tolerante en alimentos (Habib,
Uyttendaele, & De Zutter, 2011; OIE, 2008).
28
Población Objeto de Estudio.
La población objeto de estudio estuvo conformada por canes los cuales
asistían a consulta a la clínica veterinaria de la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador y pertenecían
a las parroquias urbanas de la ciudad de Quito en la Provincia de Pichincha
(Anexo 1 y 2).
Se tomó en cuenta solo a animales clínicamente sanos sin que hayan
presentado el síndrome diarreico y que no hayan estado sometidos a una
terapia antimicrobiana, seguido de una autorización por parte del
propietario (Anexo 3). Para la identificación se realizó un código
alfanumérico en el cual constaba el distrito al cual pertenecía y el número
de muestra, seguido de esto se clasificó a los animales por tipo de atención
como: inmunoprofilaxis, dermatología, traumatología, neurología y
oncología.
Muestra
El tipo de muestreo que se realizó fue de tipo estratificado, porque se
trabajó dentro de las parroquias urbanas y en distritos, para que de esta
manera la muestra sea lo más homogénea posible.
En la ciudad de Quito existen 1’619.146 habitantes (INEC, 2012), por lo
cual se estima que existe 1 canino por cada 4 habitantes (Jácome &
Alarcón, 2015).
Por lo tanto, el tamaño del universo fue de 404.787 canes, la fórmula que
se aplicó es la siguiente:
𝑛 =𝑁𝜎2𝑍2
(𝑁 − 1)𝑒2 + 𝜎2𝑍2
Dónde:
n = el tamaño de la muestra.
N = tamaño de la población.
29
𝜎 = Desviación estándar de la población
Z = Valor obtenido mediante niveles de confianza.
e = Límite aceptable de error muestral.
Para el nivel de confianza se tomará el 90% y un error aceptable del 5%.
𝑛 =404.787 ∙ 0,52 ∙ 1,6452
0,052(404.787 − 1) + 0,52 ∙ 1,6452= 271
La muestra tomada fue de 271 perros de las parroquias urbanas de la
ciudad de Quito, en donde se muestreó 54 animales de cada administración
zonal.
Procedimiento de la Investigación
1. Fase de Campo (muestreo).
Para el aislamiento de Campylobacter spp se realizó hisopados rectales,
de perros que asistieron a consulta en la Clínica Veterinaria.
Se hizo la sujeción de cada animal con la ayuda de un interno de la clínica
veterinaria, efectuando una limpieza de la zona perianal con suero
fisiológico y gasas estériles (Gráfico 4). Se realizó un hisopado rectal el cual
se introdujo en un tubo de ensayo estéril, rompiendo el último segmento del
hisopo para evitar contaminación.
Gráfico 4. Toma de muestra de canino
Fuente: El Autor
30
2. Fase de Laboratorio
El procedimiento para el aislamiento de Campylobacter spp. se lo realizó
por estriación simple, de la siguiente forma:
• Con el hisopo se realizó el inóculo primario en el primer cuadrante
de la caja Petri con el medio mCCDA.
• Se esteriliza un asa de platino al fuego, se enfría el asa en un borde
de la caja Petri, y en el segundo cuadrante rozando el inóculo
primario se realiza estrías hasta la otra esquina, con movimiento de
atrás hacia adelante.
Se realizó el mismo procedimiento con los dos cuadrantes restantes,
esto con el objetivo de obtener colonias aisladas.
Gráfico 5. Estriación de Campylobacter spp.
Fuente: El Autor
Incubación.
Se colocaron todas las cajas en una jarra para microaerofilia, en donde
con la ayuda de una bomba de vacío y un tanque de gases (92%N2 y
8% CO2) se incubó por 48 horas a 41,5±°C, lo cual propiciaba un
ambiente óptimo para el desarrollo de Campylobacter termotolerante
(Gráfico 6 y Gráfico 7).
31
Al cabo de 48 horas se extrajeron las cajas y se observó si presentaban
colonias con las características típicas.
Gráfico 6. Bomba de vacío para microaerofilia.
Fuente: El Autor
Gráfico 7. Aplicación de gases para microaerofilia.
Fuente: El Autor
Identificación de la morfología de colonias
Las colonias de Campylobacter spp. son colonias pequeñas, redondas,
planas, mucoides, con la apariencia de gotas de agua de un color
plateado y con brillo metálico (Gráfico 8).
32
Gráfico 8. Colonias aisladas de Campylobacter spp. en mCCDA.
Fuente: El Autor
Confirmación de Campylobacter spp.
Tinción Gram modificada.
La tinción modificada de Campylobacter spp. utiliza solo la safranina
como colorante.
Procedimiento para la tinción
a) Se tomó una colonia del microorganismo y se homogenizó con agua
destilada estéril en una placa porta objetos.
b) Se secó al ambiente y fijó a la llama del mechero.
c) Se colocó safranina durante 1 minuto, se lavó y dejó secar al ambiente.
Interpretación: Campylobacter spp. son bacilos curvos, pequeños, en
forma de bastón o en “alas de gaviota”. (Gráfico 9).
33
Grafico 9. Campylobacter spp. teñido con safranina (100x)
Fuente: El Autor
Procedimiento para la crio conservación de Campylobacter spp.
Repique de Campylobacter spp.
Se confirma que haya dos colonias aisladas para su repique en agar
sangre, las cuales se incubaron en microaerofilia a 42°C durante 48 horas
(Gráfico 10).
Grafico 10. Repique en agar sangre de colonias aisladas de
Campylobacter spp..
Fuente: El Autor
34
Se colocó 700 µl de sangre defibrinada de ovino en un tubo criovial o
ependorf®, seguido de esto se toma una asada del cultivo puro del repique
de agar sangre y se lo colocó en el tubo criovial o ependorf®,, se
homogeniza y se realiza el mismo procedimiento con las muestras positivas
restantes, para posteriormente ser almacenadas a -80°C
Registro y análisis de datos
Registro de muestreo de Campylobacter spp.: La recolección de
información del paciente en la Clínica Veterinaria, se obtuvo mediante un
cuestionario donde se proporcionó una breve anamnesis de los animales
muestreados los datos, posteriormente fueron introducidos en una hoja de
Microsoft Excel® donde constaba si los animales fueron positivos al
aislamiento de Campylobacter spp (Anexo 4).
Técnica para tipificación molecular de C. jejuni y C. coli.
Preparación del ADN
Se colocó 300 µl de TE al 1% en tubos ependorf® y con un asa de 1 µl se
tomó material del repique en agar sangre, se realizó vortex y se lo colocó
en el termobloque por 20 minutos a 90°C y a 150 revoluciones por minuto
(rpm). Seguido de esto centrifugó por 4 minutos a 10000 rpm. Acabado el
proceso se toman 275 µl y se colocó en un nuevo tubo ependorf® para
posteriormente ser procesada la muestra.
PCR múltiple
Los primers utilizados son: C. coli 1 (5´-AG GCA AGG GAG CCT TTA ATC-
3´), C. coli 2 (5´-TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC-3´), C. jejuni 3 (5´-CA
TCT TCC CTA GTC AAG CCT-3´) y C. jejuni 4 (5´-AAG ATA TGG CTC
TAG CAA GAC-3´). Los primers de C. coli anidan en el gen homólogo de la
glicerol-3fosfatodeshidrogenasa y los primer de C. jejuni anidan en una
secuencia teórica que codifica a la proteína putativa peri plasmática.
35
Se utilizó el Kit Go Taq G2® Flexi DNA Polymerase de Promega, este Kit
contiene dNTP Mix, MgCl2 y 5X Green GoTaq®. También se utilizó para la
PCR la Nucleasa-free Water® y el dNTP Mix® de 10nM, marca Promega,
que no están incluidos en el Kit. En el cuadro 3 se detalla cómo se realizó
el master mix para las reacciones.
Cuadro 3. Cálculo del master mix para 40 reacciones.
Reactivo Volumen
total
Concentración inicial
Concentración final
Volumen para una reacción
Cantidad Unidad Cantidad Unidad cantidad Unidad
Agua 324,8
8,12 µl Template 40,0
1 µl
Buffer 120,0 5 X 1 X 3 µl dNTP Mix 18,0 10 mM 0,3 mM 0,45 µl
MgCl2 72,0 25 mM 3 mM 1,8 µl Col 1 4,8 100 mmol/µl 0,8 mmol/µl 0,12 µl Col 2 4,8 100 mmol/µl 0,8 mmol/µl 0,12 µl Jun 3 4,8 100 mmol/µl 0,8 mmol/µl 0,12 µl Jun 4 4,8 100 mmol/µl 0,8 mmol/µl 0,12 µl Taq 6,0 5 U/µl 0,05 U/µl 0,15 µl
Total
15 µl
Fuente: Vandamme et al. (1997)
Procedimiento
El protocolo touchdown que se utilizó en el termociclador para la realización
del PCR se detalla en el anexo 5.
Resistencia antimicrobiana.
Para determinar la resistencia antimicrobiana existen métodos de difusión
y métodos de dilución.
El método de difusión tiene varias técnicas: el antibiograma disco-placa y
Épsilon test (Picazo et al., 2000). El método de dilución se basa en el
análisis de una suspensión de bacterias en una concentración
predeterminada y óptima para determinar el crecimiento del organismo en
presencia de concentraciones crecientes del antimicrobiano, el cual se
encuentra diluido en el medio de cultivo. Actualmente se utiliza el método
36
de micro dilución en caldo, facilitando la lectura y la interpretación de los
resultados (OIE, 2012).
La concentración mínima inhibitoria (CMI) es la mínima concentración del
antimicrobiano el cual inhibe el crecimiento visible de un microorganismo
después de 24 horas de incubación a una temperatura de 37°C (Horna,
Silva, Vicente, & Tamariz, 2012).
Determinación de la concentración mínima inhibitoria.
La susceptibilidad de C. jejuni y C. coli frente a 6 diferentes antibióticos de
relevancia en el uso terapéutico, fue evaluada usando una micro dilución
en caldo con el kit comercial SensititreTM Campylobacter plates- EUCAMP2.
Los antibióticos usados y las diluciones en las cuales se encuentran en
SensititreTM Campylobacter plates- EUCAMP2 se detallan en el cuadro 4.
Cuadro 4. Antibióticos usados en la concentración mínima inhibitoria
Antimicrobiano Rango de la dilución µg/ml
Gentamicina 0.12 – 16
Estreptomicina 1 – 16
Ciprofloxacina 0.06 – 4
Tetraciclina 0.25 – 16
Eritromicina 0.5 – 32
Ácido Nalidíxico 2 – 64
Modificado por: El Autor Fuente: www.thermofisher.com (2016).
Para determinar la resistencia a antimicrobianos se utilizó los puntos de
quiebre del The European Committee on Antimicrobial Susceptibility
Testing (EUCAST) para C. jejuni y C. coli, detallados en el cuadro 5 y 6.
37
Cuadro 5. Puntos de quiebre para Campylobacter jejuni expresado en mg/L
Antibiótico Sensible
≤ Resistente
≥
Gentamicina 2 4
Ciprofloxacina 0.5 1
Tetraciclina 1 2
Eritromicina 4 8
Ácido Nalidíxico 16 32
Estreptomicina 2 4
Fuente: EUCAST 2016 Modificado por: El Autor.
Cuadro 6. Puntos de quiebre para Campylobacter coli expresado en mg/L
Antibiótico Sensible
≤ Resistente
≥
Gentamicina 2 4
Ciprofloxacina 0.5 1
Tetraciclina 2 4
Eritromicina 8 16
Ácido Nalidíxico 16 32
Estreptomicina 4 8
Fuente: EUCAST 2016
Modificado por: El Autor.
Preparación de la microdilución en caldo para el kit comercial Sensititre TM EUCAMP2
• Colocar 1 ml de NaCl de solución en tubos de ensayo.
• Con un asa de 10 µl se tomó colonias de la placa Petri y se
suspendió en la solución de NaCl.
• Homogenizar con vortex hasta obtener 0,5 (0,4~0,6) en la escala de
Mc Farland, usando el densitómetro.
• Colocar 10 ml de caldo Mueller-Hinton en tubos de ensayo
estériles, seguido de esto se agregó 250 µl sangre lisada de
equino.
38
• Agregar 50 µl de la suspensión de 0,5 de Mc Farland, a los tubos
que contenían el caldo Mueller-Hinton con la sangre lisada de
equino.
• Se realizó nuevamente vortex.
• En la mitad de una caja Petri se vertió la muestra depositada en los
tubos de ensayo.
• Se tomó una placa Sensititre TM EUCAMP2 la cual se dividió en dos.
• Mediante la pipeta multicanal de añadió 100 µl del volumen de la
placa de Petri a la placa de micro dilución (Gráfico 11).
Gráfico 11. Aplicación de 100 µl de la placa de Petri a la placa de
SensititreTM® EUCAMP2
Fuente: El Autor
• Verter la siguiente muestra en la otra mitad de la caja Petri y de
nuevo usando la pipeta multicanal se llenó los pocillos restantes con
la muestra del caldo Mueller-Hinton-Sangre.
• Colocar una micro-película adhesiva perforada en la parte superior
de las placas de SensititreTM EUCAMP2 (Gráfico 12).
39
Gráfico 12. Colocación de la cinta adhesiva en las placas de
SensititreTM EUCAMP2
Fuente: El Autor
• Las placas de SensititreTM EUCAMP2 se colocaron en una jarra para
someterla a microaerofilia durante 48 horas a una temperatura de
37°C
• Para la lectura se utilizó el formato establecido por el fabricante
(Gráfico 13). (Anexo 6).
Gráfico 13. Lectura de las placas SensititreTM EUCAMP2
Fuente: El Autor
40
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Presentación de resultados
Durante los seis meses de muestreo se obtuvo 271 muestras de las cuales
40 (14,76%) fueron positivas a Campylobacter spp. Los resultados del
aislamiento se detallan en el Cuadro 7.
Cuadro 7. Resultados de animales positivos a Campylobacter en las
parroquias urbanas de la ciudad de Quito.
Número de animales Resultado Porcentaje
Positivos 40 14,76%
Negativos 231 85,23%
Total 271 100%
Fuente: Investigación directa Elaboración: El Autor
La prevalencia obtenida en este estudio fue del 14,76% (40/271) la cual
concuerda con los rangos observados en perros que han sido muestreados
en otros estudios, el cual va desde un 14% a un 38%. Por ejemplo: en
Tailandia estudios hechos en perros se obtuvo una prevalencia del 14%
(Sahanukool, Chaveerach, & Noppon, 2012), en Chile estudios hechos en
canes se ha obtenido una prevalencia del 31,2% (Fernández & Oval, 2013;
Fernández et al., 2007); en Reino Unido se obtuvo una prevalencia del
38% (Parsons et al., 2010); en Colombia un estudio realizado en canes
aparentemente sanos reportó una prevalencia del 23% (Rodríguez
Gutiérrez et al., 2015); en Brasil se obtuvo una prevalencia del 18,3%
(Rodrigues, 2011); en Argentina la prevalencia obtenida en canes de
apariencia sana fue de 16,96% (C. López et al., 2003; C. M. López et al.,
2002). Finalmente, en España se obtuvo una prevalencia del 35,2%
(Torralbo, 2013).
41
Sin embargo, se han observado variaciones con prevalencias más bajas o
más altas. En Argentina de una muestra de 260 perros diagnosticados
sanos atendidos en la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad
Nacional de la Plata, el 7,3% resultó positivo a Campylobacter spp.
(Giacoboni, Puchuri, Castellano, Echeverria, & Fernández, 1999). En Brasil
se reportó de un 5-8% de muestras positivas a Campylobacter provenientes
de canes aparentemente sanos (Aquino, Pacheco, Ferreira, & Tibana,
2002).
En comparación con los resultados locales se observa que en la ciudad de
Loja, Nuñez & Simaluiza (2016) de 70 muestras recolectadas el 10% fue
positivo a Campylobacter spp. Los hisopados fecales fueron tomadas de
parques cerca de la ciudad de Loja al azar (Parque Recreacional Jipiro y
Parque Lineal La Tebaida), pero sin tener una anamnesis del animal.
Además, que se desconoce el tiempo desde que el animal defecó y la
recolección de la muestra y si tuvo tratamiento antibiótico, esta podría ser
la razón de la diferencia de los porcentajes en los dos estudios.
En contraste en Chile se obtuvo una prevalencia del 42,5% en animales
sanos (Fernández, Khaler, Salazar, & Ríos, 1994), y a nivel de país
Manzanillas (2012), obtuvo un porcentaje del 65% de animales positivos.
Es necesario remarcar que los animales muestreados tenían trastornos
gastrointestinales. Esto se debe a que Campylobacter puede actuar como
agente primario en animales sanos o puede ser un organismo oportunista
en animales que presentan diarrea, por otros desordenes gastrointestinales
o que están infestados por parásitos (Acke et al., 2006).
Además, en la provincia de Pichincha en la comunidad de Yaruquí del
cantón Quito, Vasco et al. (2014) de 12 canes muestreados obtuvo el 30%
positivo a Campylobacter spp.; estos resultados podrían ser explicados por
que el número de animales fue menor, y los canes convivían con aves de
corral lo cual predispone a que los animales contraigan Campylobacter spp.
42
Las infecciones por Campylobacter spp. en los perros varían de acuerdo a
la condiciones físicas a las que se encuentra expuesto el animal así como
las situaciones de estrés, ya que perros domésticos tiene una menor
prevalencia frente a perros que son callejeros o aquellos que se encuentran
en condiciones de hacinamiento como en albergues o criaderos (Iowa State
University, 2006). Se ha observado que perros que viven en hacinamiento
la prevalencia hacia Campylobacter es más elevada con un 41,2% y un
87% (Acke et al., 2006).
Comportamiento de los resultados con relación a: la edad, zona y sexo
de los animales respecto a Campylobacter spp.
Análisis con relación a la edad.
De acuerdo a la edad de los animales se obtuvo los siguientes resultados,
21,43% (18/84) animales de 0 a 12 meses, 10,78% (11/102) animales 12 a
60 meses y 12,94% (11/85) animales mayores de 60 meses. Al análisis
estadístico con ANOVA (X21=222.55, P=0,11) indicó que no existe afectación
estadística en los tres grupos estudiados.
Para determinar si existió un efecto simple de la edad se realizó el test de
ji cuadrado utilizando el software “R” (versión 3.0.1), donde se observó que
los cachorros tenían una mayor probabilidad de ser portadores de la
bacteria (estimate= 0.8130, P=0,050) con respecto al intercepto (-2.1130,
P=<0.000), sin embrago estos valores no son estadísticamente
significativos. (Gráfico 14).
La prevalencia de Campylobacter spp.se ha observado generalmente que
está ligado a la edad de los animales. Los animales jóvenes son los
principales portadores como se observa en el estudio. Esto es corroborado
por López et al. (2002), quienes determinaron en animales menores de 12
meses sanos una prevalencia del 17%. Burnens, Angéloz-Wick, & Nicolet
(1992) en un estudio realizado en Suiza en 71 perros sin signos clínicos; el
21% fue positivo.
43
Los animales adultos no se los puede excluir como potencial reservorio de
Campylobacter spp. Holmberg, Rosendal, Engvall, Ohlson, & Lindberg
(2015), obtuvieron una alta prevalencia de Campylobacter spp en adultos
al igual que Workman, Mathison, & Lavoie (2005), la edad de los animales
positivos a Campylobacter spp. fue en promedio de 18 meses. Salihu et al.
(2010), no encontraron diferencias significativas relacionadas con la
prevalencia de Campylobacter con la edad de los canes al igual que en el
presente estudio, siendo los cachorros menores de un año más propensos
al riesgo de infección (Andrzejewska et al., 2013). La explicación de la
susceptibilidad de los cachorros podría estar manifestada porque animales
mayores de 2 meses ya no se encuentran protegidos por la inmunidad
calostral, por lo cual serían más sensibles. Lo cual demostraría el riesgo al
que están expuestos niños pequeños que conviven con cachorros (B. Hald
& Madsen, 1997).
Gráfico 14. Resultados en porcentaje del aislamiento de Campylobacter
spp. de acuerdo a la edad en caninos de las parroquias urbanas de la
ciudad de Quito.
Fuente: Investigación directa Elaboración: El Autor
21,4%
10,8%
12,9%
0%
5%
10%
15%
20%
25%
0-12 meses 12-60 meses >60 meses
Porc
enta
je d
e A
nim
ale
s P
ositiv
os
Edad en meses
44
Análisis de acuerdo al sexo de los animales en las parroquias urbanas
de la ciudad de Quito.
De las muestras procesadas el 14,49% (20/118) de aislamientos positivos
correspondió a hembras, mientras que el 15,04% (20/113) de aislamientos
positivos correspondió a machos. Cuadro 8.
Cuadro 8. Resultados del aislamiento de Campylobacter spp. en caninos
de las parroquias urbanas de la ciudad de Quito de acuerdo al sexo.
Sexo Positivos Negativos Porcentaje
Hembras 20 118 14,49%
Machos 20 113 15,04%
Fuente: Investigación directa
Elaboración: El Autor.
La relación entre el sexo del animal y la infección por Campylobacter no
presentó diferencia significativa p=0.74 (P>0,05) coincidiendo con varios
autores (Acke et al., 2006; Parsons et al., 2010b, 2011; Salihu et al., 2010).
Análisis de acuerdo a las administraciones zonales en las parroquias
urbanas de la ciudad de Quito.
En la zona 1 hubo un 13,21% (7/46), en la zona 2 11,32% (6/47), en la zona
3 18,18% (10/45), en la zona 4 12,96% (7/47) y en la zona 5 17,86%
(10/46), fueron positivos. (Cuadro 9).
45
Cuadro 9. Resultados del aislamiento de Campylobacter spp. de acuerdo
a las administraciones zonales de la ciudad de Quito.
Administraciones Zonas Resultados Porcentajes
ADM. QUITUMBE ZONA1 7 13,21%
ADM. ELOY ALFARO ZONA2 6 11,32%
ADM. MANUELA SAENZ ZONA3 10 18,18%
ADM. EUGENIO ESPEJO ZONA4 7 12,96%
ADM. LA DELICIA ZONA5 10 17,86%
Fuente: Investigación directa
Elaboración: El Autor.
El análisis por zonas no es estadísticamente significativo p=0.89 (P>0,05);
sin embargo, se puede observar que los resultados pertenecientes a la
administración Manuela Saénz (18,18%) y la administración La Delicia
(17,85%) presentan un mayor porcentaje de animales positivos a
Campylobacter spp. en comparación con las administraciones de:
Quitumbe (13,21%), Eloy Alfaro (11,32%) y Eugenio espejo (12,96%). Esto
se puede deber a diversos factores entre los cuales están los ambientales
y poblacionales, en la zona centro (Manuela Saénz) y la zona norte (La
Delicia) el clima es cálido templado y hay una mayor población de perros
callejeros en contacto con perros domésticos lo cual favorece el desarrollo
de Campylobacter spp. (Fernández & Oval, 2013; Orihuel et al., 2015).
Identificación de especies de Campylobacter spp.
Se realizó la identificación de las especies de las muestras positivas, para
esto se utilizó una PCR múltiple, identificando el amplicón de acuerdo al
peso de los pares de bases para C. coli (364pb) y para C. jejuni (773 pb),
detalladas en el gráfico 15.
46
Gráfico 15. PCR múltiple para C. coli y C. jejuni.
Fuente: Laboratorio UNIETAR
Elaboración: El Autor.
AL someter las muestras positivas de Campylobacter spp. a PCR múltiple,
se obtuvo C. jejuni 20% (8/40), C. coli 5% (2/40) y el 75% (30/40) no se
amplificó con los cebadores utilizados. (Gráfico 16).
Gráfico 16. Identificación de especies de Campylobacter mediante PCR
múltiple
Fuente: Investigación directa Elaboración: El Autor.
20%
5%
75%
C. jejuni C. coli Campylobacter spp.
47
La especie que presentó mayor frecuencia fue C. jejuni (20%), seguido de
C. coli (5%) coincidiendo con los estudios de: Giacoboni et al. (1999)
quienes reportan un mayor aislamiento de C. jejuni (7,3%). En el estudio
realizado por Andrzejewska et al. (2013), la especie predominante fue C.
jejuni (4,8%) en 83 muestras provenientes de canes en Polonia.
Steinhauserova, Fojtikova, & Klimes (2000) encontraron una prevalencia
del 57% para C. jejuni en canes sanos en la República Checa, esto se
puede deber a situaciones geográficas o ambientales en las cuales hay un
mayor predominio de esta especie (Andrzejewska et al., 2013).
Determinación de la resistencia a antimicrobianos
Gráfico 17. Susceptibilidad de las cepas aisladas de Campylobacter jejuni
frente a 6 antibióticos analizados.
GEN:
Gentamicina
CIP:
Ciprofloxacina
TET:
Tetraciclina
ERY:
Eritromicina
NAL: Ácido
Nalidíxico
STR:
Estreptomicina
Elaboración: El Autor.
GEN CIP TET ERY NAL STR
Sensible 100% 62% 62% 100% 75% 87%
Resistente 0% 38% 38% 0% 25% 13%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Sensible Resistente
48
Gráfico 18. Susceptibilidad de las cepas aisladas de Campylobacter coli
frente a 6 antibióticos analizados
GEN:
Gentamicina
CIP:
Ciprofloxacina
TET:
Tetraciclina
ERY:
Eritromicina
NAL: Ácido
Nalidíxico
STR:
Estreptomicina
Elaboración: El Autor.
Picazo et al. (2000), mencionan que la micro dilución en caldo se usa de
preferencia para la determinación de la concentración mínima inhibitoria
(CMI). La CMI es la prueba de preferencia frente a otros métodos que
evalúan la susceptibilidad antimicrobiana dando respuestas definitivas
cuando el resultado por otro método es indeterminado (Horna et al., 2012).
La resistencia hacia los antimicrobianos fue evaluada en las especies de
Campylobacter jejuni y Campylobacter coli, utilizando como control de
calidad la cepa de C. jejuni ATCC33560, los parámetros utilizados fueron
los siguientes: para ciprofloxacina 0,06 a 16,0, para eritromicina 0,25 a
16,0, para gentamicina 0,12 a 2,0, para tetraciclina 0,06 a 16,0 y para ácido
nalidíxico 2,0 a 32,0 (Luber, Bartelt, Genschow, Wagner, & Hahn, 2003).
Campylobacter jejuni, presentó resistencia para ácido nalidíxico 25% (2/8),
ciprofloxacina 38% (3/8), tetraciclina 38% (3/8) y para estreptomicina 13%
GEN CIP TET ERY NAL STR
SENSIBLE 100% 0% 0% 100% 0% 100%
RESISTENTE 0% 100% 100% 0% 100% 0%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
SENSIBLE RESISTENTE
49
(1/8), mientras que para gentamicina y eritromicina no se presentó
resistencia (8/8). Para C. coli existió resistencia para ácido nalidíxico,
ciprofloxacina y tetraciclina 100% (2/2), mientras que para gentamicina,
estreptomicina y eritromicina no se presentó resistencia; sin embargo, hay
que considerar que solo se obtuvieron 2 muestras positivas para C. coli por
lo cual este dato puede ser subjetivo.
La respuesta sobre la resistencia o la sensibilidad dependió del tipo de
antibiótico y la especie de Campylobacter, porque las dos variables actúan
de manera independiente sobre el nivel de respuesta en la sensibilidad. Al
compararse C. coli tiene una respuesta menor que C. jejuni (estimate -2,62,
P=0,02) con respecto al intercepto.
Pantozzi, Moredo, Vigo, & Giacoboni (2010), evaluaron la resistencia a
antibióticos en animales de abasto y de compañía, en animales de
compañía (canes) se presentó una resistencia alta para ácido nalidíxico
60%, tetraciclinas 80%, ciprofloxacina 20% y no se presentó resistencia
para eritromicina y gentamicina. Torralbo (2013) halló en canes una
resistencia media alta para ácido nalidíxico del 52,7%, para tetraciclina un
38%, para gentamicina presentó una reducida resistencia, la resistencia a
eritromicina fue baja 3,3%. Lee, Billington, & Joens, (2004), hallaron en
canes que ninguno de los aislamientos de Campylobacter fue resistente a
gentamicina y eritromicina, concordando con los datos del presente estudio.
Varios autores concuerdan en que los caninos presentan una reducida
resistencia a eritromicina (Andrzejewska et al., 2013; M. Lee, Billington, &
Joens, 2004). Aun así, se han reportado elevadas resistencias a este
antibiótico, el cual es uno de los antimicrobianos de elección para el
tratamiento de la campilobacteriosis. Kumar et al. (2012), encontraron
canes que presentaban un 90,20% de resistencia a eritromicina, así como
una elevada resistencia a tetraciclina 88,23% y ciprofloxacina 80,93%; sin
embargo, todas las cepas fueron sensibles a estreptomicina, amikacina,
cloranfenicol y levofloxacina.
50
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES
• La prevalencia de Campylobacter spp. en caninos sanos de las
parroquias urbanas de la ciudad de Quito fue del 14,76% (40/271),
para C. jejuni fue del 20% (8/40), C. coli 5% (2/40) y 75% (30/40)
correspondió a Campylobacter spp.
• Mediante la prueba de ji cuadrado no se determinó asociación de
Campylobacter spp. con la edad, sexo y el distrito a los cuales
pertenecían los canes.
• Los animales sin trastornos gastrointestinales fueron reservorios
significativos de Campylobacter spp. en las parroquias urbanas de
la ciudad de Quito, donde C. jejuni obtuvo el mayor porcentaje de
aislamientos (20%) seguido de C. coli (5%), los cuales son los
principales agentes en causar morbilidad en el hombre.
• La resistencia de C. jejuni a los diferentes antibióticos fue: ácido
nalidíxico 25% ciprofloxacina 38%, tetraciclina 38% y para
estreptomicina 13%, para eritromicina y gentamicina no se presentó
resistencia. Para C. coli la resistencia a ácido nalidíxico,
ciprofloxacina y tetraciclina fue del 100%, y para gentamicina,
eritromicina y estreptomicina no se presentó resistencia. La
resistencia hacia los antimicrobianos es un problema creciente en la
salud pública ya que cada vez aparecen nuevos mecanismos de
resistencia bacteriana, por lo que las opciones para tratar
infecciones cada vez son más limitadas. Recientemente se han
reportado cepas de Campylobacter spp. de origen animal y humano
resistentes a los antibióticos de elección terapéutica (quinolonas,
tetraciclinas y aminoglucósidos) por tanto, las implicaciones de estos
resultados ponen en evidencia que los perros actúan como depósito
de Campylobacter siendo un potencial factor de riesgo, porque
puede haber transmisión de esta clase de cepas hacia las personas.
51
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62
ANEXOS
Anexo 1 Distribución de Circuitos por distrito de las Unidades Operativas. Ministerio de Salud Pública del Ecuador.
63
Anexo 2. Parroquias Urbanas de la ciudad de Quito. Empresa Pública
Metropolitana de Movilidad y Obras Públicas.
ADMINISTRACIÓN QUITUMBE
ADMINISTRACIÓN ELOY ALFARO
ADMINISTRACIÓN MANUELITA
SAENZ
ADMINISTRACIÓN EUGENIO ESPEJO
ADMINISTRACIÓN LA DELICIA
1.GUAMANÍ 1. LA MENA 1. PUENGASI 1. BELISARIO
QUEVEDO 1. COTOCOLLAO
2.TURUBAMBA 2. SOLANDA 2. LA LIBERTAD 2. MARISCAL
SUCRE 2. PONCEANO
3.LA ECUATORIANA
3. LA ARGELIA 3. CENTRO HISTÓRICO
3. IÑAQUITO 3. COMITÉ DEL PUEBLO
4.QUITUMBE 4. SAN
BARTOLO 4. ITCHIMBIA 4. RUMIPAMBA
4. EL CONDADO
5.CHILLOGALLO 5. LA
FERROVIARIA 5. SAN JUAN 5. JIPIJAPA
5. CARCELÉN
6. CHILIBULO
6. COCHAPAMBA
7. LA MAGDALENA
7. CONCEPCIÓN
8. CHIMBACALLE
8. KENNEDY
9. SAN ISIDRO
DEL INCA
64
Anexo 3.
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CLÍNICA VETERINARIA
CONSENTIMIENTO DE TOMA DE MUESTRAS
San Francisco de Quito D.M______________________
de___________________ Yo_______________________________ C.I.
_____________________________Dirección________________________
Teléfono ________________________
Propietario (a) del animal de las siguientes características zootécnicas:
Especie ____________ Raza _____________ Sexo_________
Edad___________
Por la presente autorizo a los estudiantes Santiago Andrade y Eunice
Espinoza, realice el procedimiento de toma de muestra de heces, con el
objetivo de realizar un estudio académico sobre resistencia a antibióticos, se
me ha explicado todo el procedimiento a realizar en donde el paciente no
sufrirá ningún daño.
_______________________ _______________________
F. Propietario (a) F. El Estudiante
C.I. C.I.
65
Anexo 4.
66
67
Anexo 5. Programa del termociclador.
Evento Temperatura Tiempo Ciclos
Etapa inicial de desnaturalización
94°C 5 min 1
Desnaturalización 94°C 1 min
2 Alineación de Primers 64°C 1 min
Extensión de la cadena 72°C 1 min
Desnaturalización 94°C 1 min
2 Alineación de Primers 62°C 1 min
Extensión de la cadena 72°C 1 min
Desnaturalización 94°C 1 min
2 Alineación de Primers 60°C 1 min
Extensión de la cadena 72°C 1 min
Desnaturalización 94°C 1 min
2 Alineación de Primers 58°C 1 min
Extensión de la cadena 72°C 1 min
Desnaturalización 94°C 1 min
2 Alineación de Primers 56°C 1 min
Extensión de la cadena 72°C 1 min
Desnaturalización 94°C 1 min
30 Alineación de Primers 54°C 1 min
Extensión de la cadena 72°C 1 min
Elongación final 72°C 10 min 1
Fuente: Fernandez (2009). Modificado por: El Autor.
68
Anexo 6.
Formato para lectura kit comercial Sensititre TM EUCAMP2.
69
Anexo 7
MCCDA OXOID® CM0739
Presentación
• Agar base: 500g
• Suplemento liofilizado: 10 viales 2L c/u
Fórmula (1L)
• MCCDA g/lt
• Caldo Nutritivo N°2 25.0g
• Carbón Bacteriológico 4.0g
• Caseína hidrolizada 3.0g
• Desoxicolato de Sodio 1.0g
• Sulfato Ferroso 0.25g
• Piruvato de Sodio 0.25g
• Agar 12.0g
ph (25°C ) 7.4 ± 0.2
Suplemento Selectivo CCDA por vial por litro
Cefoperazona 16mg 32 mg
Anfotericina B 5mg 10mg
Preparación
Suspender 22,75 g de MCCDA en 500 ml de agua destilada y hervir hasta
disolver. Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos. Enfriar a 50°C y
asépticamente añadir 1 vial de suplemento selectivo CCDA previamente
reconstituido con 2ml de agua destilada estéril. Mezclar bien y dispensar en
cajas Petri estériles
Conservación
Las cajas Petri se almacenan hasta dos semanas en fundas plásticas, en
posición invertida a 2-8°C.
70
Agar sangre
Presentación
• Agar Base:500g
Fórmula (1L)
• Infusión de músculo cardiaco a partir de
sólidos
2g
• Caseína digerida por enzimas pancreáticas 13g
• Extracto de Levadura 5g
• Agar 15g
pH 7,4 ± 0.2 (25°C)
Preparación
Suspender 40 gramos del medio en un litro de agua destilada. Mezclar bien y
disolver, agitando frecuentemente hasta disolución completa. Dejar hervir
durante 1 minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Dejar
enfriar a 45-50°C y añadir de 5-10% de sangre desfibrinada y estéril,
homogenizar y verter en placas de Petri estériles
71
Reactivos de Biología Molecular
Kit “GoTaq® G2 Flexi DNA Polymerase” para PCR.
• GoTaq® G2 Flexi DNA Polymerase
Cód. M780A
• 5X Green GoTaq® Flexi Buffer
Cód.M891A
• 5X Colorless GoTaq® Flexi Buffer
Cód.M890A
• Magnesium Chloride Solution, 25mM
Cód.A351H
Primers
• Primers de Campylobacter col1 SY140127478-001, SYGMA
• Primers de Campylobacter col2 SY140127481-005, SYGMA
• Primers de Campylobacter jun3 SY130807052-019, SYGMA
• Primers de Campylobacter jun4 SY130807052-020, SYGMA
Nucleótidos
• dNTPMix, 10nM, 1000 μl Promega. Cód. U1515
Electroforesis.
• Agarose, LE, Analytical Grade
Cód. V3125
• TAE Buffer, Molecular Biology Grade (Tris-acetate-EDTA)
Cód. V4281
• SYBR® Safe DNA Gel Stain
Cód. S33102
• 100 bp DNA Ladder
Cód. 15628-050
