UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE ......3.2.1.3. Prueba de anticuerpos por...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

MAESTRÍA EN EPIDEMIOLOGIA Y SALUD PÚBLICA VETERINARIA

Leishmaniasis, revisión sistemática de datos seroepidemiológicos de zonas endémicas

alrededor del mundo

Trabajo de Titulación (modalidad Proyecto de Investigación) previo a la obtención

del Título de Magister en Epidemiología y Salud Pública Veterinaria.

AUTOR: Alexandra Estefanía Troya Ontaneda

TUTOR: Marco Rafael Coral Almeida, PhD.

Quito, 2019

II

DERECHOS DE AUTOR

Yo, Alexandra Estefanía Troya Ontaneda, en calidad de autor y titular de los derechos morales y

patrimoniales del trabajo de titulación, Leishmaniasis, revisión sistemática de datos

seroepidemiológicos de zonas endémicas alrededor del mundo. Modalidad Proyecto de Investigación,

de conformidad con el artículo 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMIA SOCIAL DE LOS

CONOCIMIENTO, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central

del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la

obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor

sobre la obra, establecidos en la normativa citada.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador que se realice la digitalización y

publicación de este trabajo de Titulación en el Repositorio Virtual, de conformidad a lo

dispuesto en el art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de

expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por

cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de

toda responsabilidad.

Firma:

Nombre y apellidos: Alexandra Estefanía Troya Ontaneda

CC: 1721152393

Dirección electrónica: [email protected]

mailto:[email protected]

III

HOJA APROBACIÓN TUTOR

Yo, Marco Rafael Coral Almeida, en mi calidad de tutor del trabajo de titulación, elaborado por

ALEXANDRA ESTEFANÍA TROYA ONTANEDA, para optar por el del Título de Magister en

Epidemiología y Salud Pública Veterinaria, cuyo título es: ”LEISHMANIASIS, REVISIÓN

SISTEMÁTICA DE DATOS SEROEPIDEMIOLÓGICOS DE ZONAS ENDÉMICAS

ALREDEDOR DEL MUNDO”, considero dicho trabajo reúne los requisitos y los méritos

necesarios para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del tribunal

examinador que se designe.

En la ciudad de Quito, a los 08 días del mes de noviembre del 2019.

Marco Rafael Coral Almeida PH.D

DOCENTE-TUTOR DE TRABAJO DE TITULACIÓN

CÉDULA 1714505821

IV

APROBACIÓN DEL TRIBUNAL

“Leishmaniasis, revisión sistemática de datos seroepidemiológicos de zonas endémicas

alrededor del mundo”.

El tribunal constituido por:

Dra. Nadia López Paredes, MSc, presidenta; Dr. Lenin Ron Garrido, PhD; Dr. Roberto Bustillos

Huilca, MSc, miembros del tribunal; y Dr. Marco Coral Almeida, PhD, como tutor.

Luego de receptar el Trabajo de Titulación modalidad proyecto de investigación para la

obtención del Título de Magíster en Epidemiología y Salud Pública Veterinaria, presentado por

Alexandra Estefanía Troya Ontaneda, MVZ con el título de: “Leishmaniasis, revisión

sistemática de datos seroepidemiológicos de zonas endémicas alrededor del mundo”.

Ha emitido el siguiente veredicto: APROBADO

En la ciudad de Quito, a los 08 días de noviembre de 2019

Para constancia de lo actuado firman:

Dra. Nadia López Paredes, MSc. Presidenta del tribunal

Dr. Lenin Ron Garrido, PhD. Miembro del tribunal

Dr. Roberto Bustillos Huilca, MSc. Miembro del tribunal

Dr. Marco Coral Almeida, PhD. Tutor

V

AUTORÍA DE RESPONSABILIDAD

Yo, Alexandra Estefanía Troya Ontaneda, con cédula de identidad N° 1721152393, declaro

que este trabajo de titulación ““Leishmaniasis, revisión sistemática de datos

seroepidemiológicos de zonas endémicas alrededor del mundo” ha sido desarrollado

considerando los métodos de investigación existentes, así como también se ha respetado los

derechos intelectuales de terceros considerándose en las citas bibliográficas.

Consecuentemente declaro que este trabajo es de mi autoría, en virtud de ello me declaro

responsable del contenido, veracidad y alcance de la investigación mencionada.

Quito, 15 de octubre de 2019

Alexandra Estefanía Troya Ontaneda

CC. 1721152393

VI

DEDICATORIA

Quiero dedicar esta investigación:

A mis padres.

Por ser ese pilar fundamental en mi vida, ya que sin ellos no hubiera logrado alcanzar

una meta más en mi vida profesional.

A mi hermana.

Por ser siempre incondicional y mí ejemplo a seguir en todos los ámbitos de

mi vida.

A mi familia y Efraín.

Por apoyarme e impulsarme a culminar este sueño.

Cami y Nena mis amores.

VII

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, agradezco a Dios por haberme permitido llegar a este día.

Quiero agradecer al Dr. Marco Coral, PhD. que más que un tutor ha sido un amigo, que me

supo brindar todos sus conocimientos para permitirme llegar al fin de una nueva etapa.

A la Universidad Central del Ecuador, donde me formé profesionalmente en mi posgrado.

Finalmente, a las personas que han contribuido al proceso y conclusión de este trabajo,

que ocupan un lugar especial en mi corazón.

VIII

TABLA DE CONTENIDO

LISTA DE TABLAS ......................................................................................................... xiii

LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................... xiv

LISTA DE ANEXOS ........................................................................................................ xvi

LISTA DE ABREVACIONES .......................................................................................... xvii

INTRODUCCIÓN GENERAL ............................................................................................. 1

OBJETIVOS ................................................................................................................... 3

Objetivo General ......................................................................................................... 3

Objetivos Específicos .................................................................................................. 3

HIPÓTESIS ................................................................................................................ 3

CAPÍTULO I. ...................................................................................................................... 4

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA - LEISHMANIASIS ............................................................... 4

1.1 DEFINICIÓN ......................................................................................................... 4

1.2. RESERVORIOS ................................................................................................... 6

1.4. AGENTE ETIOLÓGICO: ....................................................................................... 7

1.4.1. Promastigote: .................................................................................................... 8

1.4.2. Amastigote: ....................................................................................................... 8

1.6. TIPOS DE LEISHMANIA:.................................................................................... 10

1.6.1. Leishmanasis visceral ..................................................................................... 10

1.6.1.1. Periodo de Incubación ........................................................................... 10

1.6.1.2. Población en riesgo ............................................................................... 11

1.6.1.3. Ubicación geográfica ............................................................................. 11

1.6.2. Leishmaniasis cutánea .................................................................................... 11

1.6.2.1. Cuadro Clínico ....................................................................................... 11

1.6.2.2. Periodo de incubación............................................................................ 12

1.6.2.3. Población en riesgo ............................................................................... 12

1.6.2.4. Localización de las lesiones ................................................................... 12


IX

1.6.3. Leishmaniasis Mucocutánea ........................................................................... 13

1.6.3.1. Periodo de Incubación ........................................................................... 13


1.6.3.3. Población el riesgo ................................................................................. 13

1.7. VECTOR ............................................................................................................. 14

1.8. TRANSMISIÓN ................................................................................................... 15

1.9. CONTAGIO ........................................................................................................ 15

1.10. DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD. ......................................................... 15

1.11. VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA Y TRATAMIENTO ....................................... 18

1.12. LEISHMANIASIS EN CANINOS ...................................................................... 19

1.12.1. Transmisión.............................................................................................. 19

1.12.2. Signos Clínicos. ....................................................................................... 20

1.12.3. Diagnóstico .............................................................................................. 21

1.12.4. Tratamiento .............................................................................................. 21

1.13. LEISHMANIASIS EN FELINOS ....................................................................... 22

1.13.1. Transmisión.............................................................................................. 22

1.13.2. Sígnos Clínicos ........................................................................................ 22

1.13.3. Tratamiento .............................................................................................. 23

CAPÍTULO II. ................................................................................................................... 24

MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................ 24

2.1. DISEÑO DEL ESTUDIO ....................................................................................... 24

2.2. BÚSQUEDA ........................................................................................................ 24

2.2.1. Fase uno: ........................................................................................................ 25

2.2.2. Fase dos: ........................................................................................................ 25

2.2.3. Fase tres: ........................................................................................................ 26

2.3. RECOPILACIÓN DE DATOS .............................................................................. 26

2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................... 26

CAPÍTULO III ................................................................................................................... 28

RESULTADOS ................................................................................................................ 28

X

3.1. PRISMA .............................................................................................................. 28

3.2. METODOLOGÍA ................................................................................................. 30

3.2.1. Felinos ............................................................................................................ 30

3.2.1.1. Técnica serológica ELISA en felinos en Europa ..................................... 30

3.2.1.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en felinos en la región de

Europa ……….. ......................................................................................................... 31

3.2.1.3. Prueba de anticuerpos por inmunofluorescencia indirecta (IFAT) en

felinos en la región de Europa ................................................................................... 31

3.2.2. Caninos ........................................................................................................... 32


caninos en la región de África. ................................................................................... 32

3.2.2.2. Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) en caninos en la

región de África .......................................................................................................... 33

3.2.2.3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en caninos en la región de

África ……….. ............................................................................................................ 34

3.2.2.4. Prueba de aglutinación directa (DAT) en caninos en la región de África 34

3.2.2.5. Prueba de aglutinación directa (DAT) en caninos en la región de Asia. . 35


región de Asia. ........................................................................................................... 36


Europa ……… ........................................................................................................... 36

3.2.2.8. Prueba de aglutinación directa (DAT) en caninos en la región de Europa

…………………… ...................................................................................................... 37


región de Europa ....................................................................................................... 38

3.2.2.10. Prueba de anticuerpos de inmunofluorescencia indirecta (IFI) en caninos

en la región de Europa ............................................................................................... 39

3.2.2.11. Prueba Inmunocromatografía con antígeno RK39 en caninos en la región

de Europa ………....................................................................................................... 40

3.2.2.12. Prueba de anticuerpos de inmunofluorescencia indirecta (IFI) en caninos

en la región de América ............................................................................................. 40

XI


región de América. ..................................................................................................... 41


caninos en la región de América ................................................................................ 42


América…….. ........................................................................ …………………………43

3.2.2.16. Prueba Inmunocromatografía con antígeno (RK39) en caninos en la

región de América ...................................................................................................... 44

3.2.3. Humanos ......................................................................................................... 44

3.2.3.1. Prueba de aglutinación directa (DAT) en humanos en la región de África

………………. ............................................................................................................ 44

3.2.3.2. Prueba Inmunocromatografía con antígeno RK39 en humanos en la

región de África .......................................................................................................... 45

3.2.3.3. Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) en humanos en

la región de América .................................................................................................. 46

3.2.3.4. Prueba de anticuerpos de inmunofluorescencia indirecta (IFI) en

humanos en la región de América .............................................................................. 46

3.2.3.5. Prueba de aglutinación directa (DAT) en humanos en la región de Asia 47


la región de Asia ........................................................................................................ 48

3.2.3.7. Prueba Inmunocromatografía con antígeno (RK39) en humanos en la

región de Asia ............................................................................................................ 48


la región de Europa .................................................................................................... 49


humanos en la región de Europa ............................................................................... 50

3.2.3.10. Prueba de anticuerpos de inmunofluorescencia indirecta (IFI) en

humanos en la región de Europa ............................................................................... 51

CAPÍTULO IV. ................................................................................................................. 60

DISCUSIÓN ..................................................................................................................... 60

CAPÍTULO V. .................................................................................................................. 63

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................... 63

XII

5.1. Conclusiones ......................................................................................................... 63

5.2. Recomendaciones ................................................................................................. 65

REFERENCIAS BIBLIOGRAFIA ...................................................................................... 66

ANEXOS .......................................................................................................................... 71

XIII

LISTA DE TABLAS

Tabla 1 Principales vectores y reservorios de la especie de Leishmania más importantes 6

Tabla 2 Clasificación taxonómica de las especies de Leishmania que afectan mamíferos y

su localización geográfica. ...................................................................................................... 7

Tabla 3 Casos de leishmaniasis cutánea por provincia de enero a octubre en el año 2013

............................................................................................................................................... 9

Tabla 4 Clasificación de Leishmania según su especie y subespecie .............................. 14

Tabla 6 Técnicas Diagnósticas para Leishmania ............................................................. 17

Tabla 7 Resultados de metaanálisis ............................................................................... 52

Tabla 8 ELISA por Especies en América ......................................................................... 53

Tabla 9 ELISA por Especies en Europa ........................................................................... 53

Tabla 10 ELISA por Especies en Asia ............................................................................. 54

Tabla 11 PCR por especies en Europa ............................................................................ 54

Tabla 12 IFAT por Especies en Europa ........................................................................... 55

Tabla 13 IFI por Especies en América ............................................................................. 55

Tabla 14 IFI por Especies en Europa ............................................................................... 56

Tabla 16 DAT por Especies en Asia ................................................................................ 57

Tabla 17 DAT por Especies en África .............................................................................. 58

Tabla 18 Continentes por humanos, caninos y felinos ..................................................... 58

XIV

LISTA DE FIGURAS

Fig 1 Distribución mundial de la leishmaniasis: ......................................................................... 5

Fig 2 Distribución numérica anual del total de casos en tres cantones ................................. 9

Fig 3 L. Visceral ............................................................................................................................ 10

Fig 4 L. Cutánea ........................................................................................................................... 12

Fig 5 L. mucocutánea .................................................................................................................. 14

Fig 6 Diagrama de flujo que describe la búsqueda bibliográfica y la selección de estudios

............................................................................................................................................................... 29

Fig 7 Técnica ELISA en felinos en Europa ............................................................................... 30

Fig 8 Técnica de PCR en felinos en Europa ............................................................................ 31

Fig 9 Técnica de IFAT en felinos en Europa ............................................................................ 32

Fig 10 Técnica de IFAT en caninos en África .......................................................................... 32

Fig 11 Técnica de ELISA en caninos en África ....................................................................... 33

Fig 12 Técnica PCR en caninos en África ................................................................................ 34

Fig 13 Técnica DAT en caninos en África ................................................................................ 35

Fig 14 Técnica DAT en caninos en Asia ................................................................................... 35

Fig 15 Técnica de ELISA en caninos en Asia .......................................................................... 36

Fig 16 Técnica de PCR en caninos en Europa........................................................................ 37

Fig 17 Técnica de DAT caninos en Europa.............................................................................. 38

Fig 18 Técnica de ELISA en caninos en Europa ..................................................................... 38

Fig 19 Técnica de IFI en caninos en Europa ........................................................................... 39

Fig 20 Técnica de rK39 en caninos en Europa........................................................................ 40

Fig 21 Técnica de IFI en caninos en América.......................................................................... 41

Fig 22 Técnica de ELISA en caninos en América ................................................................... 42

Fig 23 Técnica de IFAT en caninos en América...................................................................... 43

Fig 24 Técnica de PCR en caninos en América ...................................................................... 43

XV

Fig 25 Técnica de rK39 en caninos en América ...................................................................... 44

Fig 26 Técnica de DAT en humanos en África ........................................................................ 45

Fig 27 Técnica de rK39 en humanos en África ...................................................................... 45

Fig 28 Técnica de ELISA en humanos en América ............................................................... 46

Fig 29 Técnica de IFI en humanos en América ...................................................................... 47

Fig 30 Técnica de DAT en humanos en Asia ......................................................................... 47

Fig 31 Técnica de ELISA en humanos en Asia ...................................................................... 48

Fig 32 Técnica de rK39 en humanos en Asia ......................................................................... 49

Fig 33 Técnica de ELISA en humanos en Europa ................................................................. 50

Fig 34 Técnica de IFAT en humanos en Europa.................................................................... 50

Fig 35 Técnica de IFI en humanos en Europa ........................................................................ 51

XVI

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Desarrollo de forest plot en R con paquete meta. ................................................... 71

Anexo 2. Artículos excluidos en la etapa 2 de la revisión sistemática .................................. 79

xvii

LISTA DE ABREVACIONES

LV Leishmaniasis Visceral

LC Leishmaniasis cutánea

LMC Leishmaniasis muco-cutánea

L Leishmania

IDR Prueba de Montenegro

IHQ Inminohistoquímica

IFI Prueba de anticuerpos de inmunofluorescencia indirecta

CIEP Pruebas de inmunoelectroforesis

DPP Prueba rápida de leishmaniasis visceral canina

ICT Pruebas de tira reactiva inmunocromatográfica cualitativa

MAD Prueba de aglutinación modificada

DAT Prueba de aglutinación directa

LST Prueba cutánea de Leishmania

xMAP Sistema de inmunoensayo multiplex basado en microesferas

WM Western Blot

xviii

TÍTULO: Leishmaniasis, revisión sistemática de datos seroepidemiológicos de zonas endémicas alrededor del mundo.

AUTORA: Alexandra Estefanía Troya Ontaneda

TUTOR: Dr. Marco Rafael Coral Almeida, PhD.

RESUMEN

La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria intracelular obligada de algunas especies mamíferas incluído el humano. En los últimos años, las infecciones leishmaniales se han convertido en un tema de estudio en diversas partes del mundo. Sin embargo, no hay muchos reportes de casos ya que por su forma de presentación se la confunde con otras enfermedades. Es por esta razón, que esta revisión sistemática se centró en la recopilación de datos seroepidemiológicos en humanos, perros y gatos según la distribución geográfica y los diferentes métodos diagnósticos en regiones declarados endémicos a nivel mundial de leishmaniasis durante el período de 1991 a 2019. Para la obtención de artículos se realizó la búsqueda en PubMed y LILACS centrándose en diferentes técnicas diagnósticas en el mundo. La selección de artículos se hizó en 3 fases aplicando criterios de inclusión y exclusión mediante la aplicación Rayyan, obteniendo un total de 409 artículos científicos. Una vez obtenida la base de datos, se utilizó la metodología PRISMA obteniendo un total de 146 artículos. Se realizó un metaanálisis en el programa RStudio versión 1.2. 1335, utilizando el paquete “meta” se procedió a estimar la prevalencia de antígenos circulantes para L. visceral, L. canina, L. infantum y la seroprevalencia de anticuerpos en cada continente con base en un modelo de efectos aleatorios. A continuación, se presentó los resultados en Forest plot haciendo la comparación de misma técnica diagnóstica, diferente región geográfica; misma técnica diagnóstica, diferente especie; diferente técnica diagnóstica, misma región; misma especie; misma región geográfica. Por lo tanto se obtuvieron los siguientes resultados: América, Europa, Asia, África por técnicas diagnósticas en caninos, no se encontró diferencias significativas en sus estudios y presentó heterogeneidad alta. En Europa, Asia y África por técnicas diagnósticas en humanos, no se encontró diferencia significativa en sus estudios y presentó heterogeneidad alta. En Europa por técnicas diagnósticas en felinos no se encontró diferencias significativas y presentó heterogeneidad alta. En un siguiente análisis se debería tomar en cuenta las sub regiones que es muy probable que existan dentro de las grandes regiones y que tengan una particularidad en la epidemiología o en la transmisión de la enfermedad y por esta razón son heterogéneas. Los resultados de este estudio deben guiar al movimiento One Health para que se estudie nuevos reservorios de leishmaniasis en lugares considerados endémicos, por otro lado, se debe proponer que, en los próximos estudios de esta enfermedad, se acompañen de nichos ecológicos del vector y estudios conglomerados espaciales para identificar los puntos calientes (hot spots). PALABRAS CLAVE: LEISHMANIASIS/REVISIÓN SISTEMÁTICA/ SEROPREVALENCIA.

xix

TÍTULO: Leishmaniasis, systematic review of seroepidemiological data of endemic areas around the world.

AUTHOR: Alexandra Estefanía Troya Ontaneda

TUTOR: Dr. Marco Rafael Coral Almeida, PhD.

ABSTRACT

Leishmaniasis is an obligate intracellular parasitic disease of some mammalian species

including humans. In recent years, leishmanial infections have become a subject of study in

various parts of the world. However, there are not many case reports since its presentation

can be mistaken with other diseases. It is for this reason, that this systematic review focused

on the collection of sero-epidemiological data in humans, dogs and cats according to

geographical distribution and the different diagnostic methods in regions declared endemic of

leishmaniasis around the world during the period from 1991 to 2019. For the procurement

articles, a search was conducted in PubMed and LILACS, focusing the search on different

diagnostic techniques around the world. The selection of this articles, was done in 3 phases

using inclusion and exclusion criteria through the Rayyan application, obtaining a total of 409

scientific articles. Once the database was obtained, the PRISMA methodology was used to

obtain a total of 146 articles. A meta-analysis of the RStudio version 1.2 1335 program was

performed, using this “meta” package the prevalence of circulating antigens was estimated for

cutaneous leishmaniasis, mucus cutaneous and visceral and the seroprevalence of antibodies

in each continent were estimated based on a random effects model. Next, the results were

presented in Forest plot making the comparison of the same diagnostic technique, different

diagnostic technique, same region; same species; same geographical region. The following

results were obtained: America, Europe, Asia, Africa for canine diagnosis techniques, no

significant differences were found in their studies and presented high heterogeneity. In Europe,

Asia and Africa for diagnostic techniques in humans, no significant difference where found in

their studies and there was high heterogeneity. In a following analysis, sub-regions that are

very likely to exist within large regions and that have a particularity in epidemiology or disease

transmission should be considered and for this reason are heterogeneous. The results of this

study should guide the One Health movement to study new reservoirs of leishmaniasis in

places considered endemic, on the other hand, a proposal should be made for the next studies

of this disease, accompanied by ecological vector niches and space cluster studies to identify

hot spots.

KEYWORDS: LEISHMANIASIS/ SYSTEMATIC REVIEW/ SEROPREVALENCE.

1

INTRODUCCIÓN GENERAL

En el Ecuador y parte de Latinoamérica, Asia, Medio Oriente y Europa, los protozoos del

género Leishmania son transmitidos a humanos y animales por vectores Psychodidae. Las 2

presentaciones de Leishmania están presentes en Ecuador, Leishamaniasis Cutánea y

Leishamaniasis muco-cutánea, mientras que en el país, aún no se han reportado casos de

Leishamaniasis Visceral (Burza, Croft, & Boelaert, 2018). En algunos pacientes, la

leishmaniasis puede producir lesiones graves en mucosas, sobre todo en tejidos

nasofaríngeos. Como indican Aritra Das, Morchan Karthick, Shweta Dwivedi, Indranath

Banerjee, Tanmay Mahapatra, Sridhar Srikantiah, (s.f. en Ecuador, no existe mucha

información sobre esta enfermedad, por lo que se la reconoce como “La enfermedad olvidada”.

Cómo indica Alva J, Vélez ID, Bern C, Herrero M, Desjeux P, Cano J, Jannin J ( 2012), existen

pocos datos sobre esta enfermedad, sin embargo, en los últimos años, la incidencia de

leishmaniasis ha ido aumentando, sobre todo en sectores donde existe deforestación o en

zonas donde hay pobreza, al igual que en nuevos sectores donde hay zonas urbanizadas

(Morsy TA, Khalil NM, Salama MM, Hamdi KN, al Shamrany YA, 2019). A pesar de

presentarse este protozoo en Ecuador, no existen datos actualizados, pero se estima que

mundialmente al año se presentan 1,5 millones de casos nuevos que no han sido reportados

(Taheri, 2014).

Las diferentes técnicas diagnósticas de laboratorio de la leishmaniasis se dividen en métodos

directos e indirectos, dependiendo del cuadro clínico que se presente. Las leishmanisis

cutánea y mucho-cutánea pertenecen al género Leishmania que comprende alrededor de 22

especies. Para poder distinguir las especies, se necesitan realizar métodos moleculares,

análisis de isoenzimas o anticuerpos monoclonales (Bandyopadhyay P, Ghosh DK, De A,

Ghosh KN, Chaudhuri PP, Das P, 1991). Los humanos y los animales domésticos son

huéspedes accidentales para muchas especies de Leishmania, que se mantienen en ciclos

entre animales silvestres y moscas de arena. La L. infantum, L. peruviana y posiblemente

2

otras especies pueden permanecer en perros, aumentando el riesgo de transmisión a las

personas. Otros animales domésticos pueden estar involucrados como huéspedes de

mantenimiento secundarios. L. donovani y L. tropica están adaptados a los humanos, aunque

en ocasiones también pueden infectarse los animales. Por esta razón es importante obtener

una estimación combinada, de igual manera evaluar la heterogeneidad observada que

reportará este estudio (Aransay A, Scoulica E, 2019).

3

OBJETIVOS

Objetivo General

Identificar las variaciones en la seroprevalencia de Leishmania spp. según la distribución

geográfica y los diferentes métodos diagnósticos a nivel mundial para identificar patrones

epidemiológicos de la enfermedad de la familia Trypanosomatidae, mediante la selección

sistemática de artículos científicos.

Objetivos Específicos

Realizar un metaanálisis para sintetizar datos de una colección de estudios basados en la

evidencia de información de interés sobre Leishmania y así poder analizar la situación a nivel

mundial de esta enfermedad y dar un enfoque estadístico para combinar los resultados de

múltiples estudios.

Realizar una revisión sistemática, aplicando los criterios de selección, mediante la lectura de

artículos, revistas científicas sobre seroprevalencia, métodos de diagnóstico y datos

epidemiológicos para la elaboración de un PRISMA y poder comparar las técnicas

diagnósticas sobre Leishmania con otras similares a nivel mundial.

HIPÓTESIS

HO= Se va a encontrar patrones en la epidemiología de la Leishmaniasis, incluyendo la

distribución geográfica de la enfermedad y los métodos de diagnósticos.

H1= No se va a encontrar patrones en la epidemiología de la Leishmaniasis, incluyendo la

distribución geográfica de la enfermedad y los métodos de diagnósticos.

4

CAPÍTULO I.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA - LEISHMANIASIS

1.1 DEFINICIÓN

La leishmaniasis es ocasionada por un protozoo parásito que se considera endémico en

grandes áreas tropicales y subtropicales, causada por el género Leishmania, que se transmite

por la picadura del flebótomo hembra infectado (Berrueta, 2010).

La epidemiología de la leishmaniasis depende de las características de la especie del parásito

y de las las características ecológicas locales, las cuales van a variar dependiendo del lugar

donde se transmite. Este protozoo tiene mas de 20 especies diferentes y al menos se sabe

que existen más de 90 especies de flebotominos que pueden actuar como vectores esta

enfermedad (Vargas MF, Torres G, Arenas R, 2011). La leishmaniasis está considerada una

enfermedad tropical zoonótica desatendida y en algúnos casos hasta olvidada (Akhoundi M,

Downing T, Votýpka J, Kuhls K, Lukeš J, Cannet A, Ravel C, Marty P, Delaunay P, Kasbari M,

Granouillac B, Gradoni L, 2017).

Como indica LLynn MA, n.d., exísten reportes de la misma enfermedad en 98 paises, se

estima una incidencia anual de 0.7-1.2 millones de casos de L. cutánea y 0.2-0.4 millones de

L. visceral, a la que se le atribuye 20 mil a 40 mil muertes al año” (p.13-105). Como se indica

en la Fig 1, en el año 2013 se pudo observar los reportes de esta enferemdad. Todos los

nuevos casos de leishmaniasis cutánea están representados en la escala de colores.

5

Fig 1 Distribución mundial de la leishmaniasis:

Se muestra el mapa de distribución mundial de la leishmaniosis cutánea, y en (B) de la leishmaniasis visceral según la OMS en el año 2013. De: World Health Organization Map Production: Control of neglected Tropical Diseases (NTD). Tomado

de (OMS, 2019).

6

1.2. RESERVORIOS La leishmaniasis se encuentra presente en diferentes especies de mamíferos. Las especies

afectadas van a depender de la especie de Leishmania para la cual van a actuar como

reservorios como se indica en la Tabla 1 (Hernández-Flores JJ, Morales-Aguirre JJ, 2019).

Como indica Fleta, Rodríguez, & Clavel (2001) “El ser humano puede constituir una fuente

ocasional de infección por lo que puede contagiarse si entran en contacto con el ciclo

zoonótico de transmisión de las Leishmaniasis”

Tabla 1 Principales vectores y reservorios de la especie de Leishmania más importantes

ESPECIES VECTOR RESERVORIO DISTRIBUCIÓN

Viejo Mundo

L. donovani P. argentipes Humanos Asia

P. orientalis Roedores, caninos África

L. infantum P. pernicious, P. ariasil

L. major P. papatasi Roedores Mediterráneo, África y Asia

L. tropica P. sergenti Roedores Mediterráneo, Asia

L. aethiopica P. longipes, P. pedifer Roedores Etiopía, Kenia

Nuevo Mundo

L. chagasi Lu. Lomgipalpis Zorros, caninos Brasil, América del Sur

Marsupiales América Central

L. mexicana Lu. Olmeca Roedores Yucatán, Guatemala

L. braziliensis Psy. Wellcomi Roedores América del Sur y Central

L. guyanensis Lu. Umbratilis Mamíferos América del Sur

L. peruviana Lu. Peruensis Roedores Perú

Lu. Verrucarum

L. panamensis Lu. Trapidoi Mamíferos América Central y del Sur

L. amazonensis Lu. Flaviscutellata Roedores América del Sur

L.: leishmania; P.: Phlebotomus; Lu.: Lutzomyia; Psy.: Psychdopygus

Tomada de Fleta et al., (2001).

7

1.3. TAXONOMÍA

Existen muchas especies de L. Leishmania, las cuales van a tener diferentes especies

asociadas entre el viejo y nuevo mundo, las cuales han sido clasificadas de acuerdo a su

morfología, caracteres clínicos, entre otros. Como se puede observar en la Tabla 2, se va a

diferenciar el tipo de leishmaniosis presente según la localización geográfica (“Leishmaniosis:

breve puesta al día,” 2019).

Tabla 2 Clasificación taxonómica de las especies de Leishmania que afectan mamíferos y su localización geográfica.

Subgénero Completo de Especies Especies asociadas

Localización geográfica

Tipo de Leishmaniasis

L. (Leishmania) L. donovani L. donovani Viejo mundo

L.archibaldi Viejo mundo

L.infantum Viejo mundo y América

L. chagasi América

L. tropical

L. tropica L. aethiopica Viejo mundo

L. killicki

L. major

L. major L. arabica Viejo mundo Cutánea

L. gerbilli

L. turanica

L. mexicana

L. amazonesis

L.aristidesi

L. mexicana L. garnhami América Cutánea

L.aristidesi

L. forattinii

L. pifanoi

L. venezuelensis

L. waltoni

L.(Viannia) L. braziliensis L. braziliensis América Muco-cutánea

L. peruviana

L. guyanensis L. guyanesis

L. lidenbergi L. panamensis

L. utingensis L. shawi

L. naiffi

Adaptada de “Leishmaniosis: breve puesta al día,” (2019).

1.4. AGENTE ETIOLÓGICO:

La Leishmaniasis es una enfermedad parasitaria intracelular obligada del humano y algunos

mamíferos, es un protozoo que pertenece a la familia Trypanosomatidae. Este parásito se lo

encuentra en dos estadios durante su ciclo de vida (Áurea Pereiraa, n.d.).

8

1.4.1. Promastigote:

Es una forma móvil, flagelada que se desarrolla y multiplica en el tracto digestivo de los

insectos vectores de esta enfermedad. Al observar en el microscopio presenta un cuerpo oval

y una anchura entre 3-5 µm y 1,5-2,5 µm (Leonardo Sánchez-Saldaña et al., 2004).

1.4.2. Amastigote:

Es una forma inmóvil, no tiene flagelos y se hospeda en los macrófagos del mamífero, el cual

se divide de acuerdo con el género Leishmania. Presenta una forma fusiforme con un tamaño

superior entre 10-30 µm de largo y los 1,5-3 µm de ancho (Leonardo Sánchez-Saldaña et al.,

2004).

Según Berrueta (2010) la trasmisión se lleva a cabo por la picadura de los insectos flebótomos

hembra infectados. Esta enfermedad es polimorfa de la piel y mucosas, su presentación es

mediante la aparición de una pápula o muchas, que va a aumentar de tamaño, cambiando a

una úlcera la cual va a causar dolor y es propensa a infectarse, al cabo de un periodo de

tiempo, esta lesión puede cicatrizarse en semanas o años (Áurea Pereiraa, n.d.).

1.5. EPIDEMIOLOGÍA

En ciertas personas, la Leishmania puede producir lesiones en mucosas, sobre todo en tejidos

nasofaríngeos. Como indican Aritra Das, Morchan Karthick, Shweta Dwivedi, Indranath

Banerjee, Tanmay Mahapatra, Sridhar Srikantiah, 2016; en Ecuador, no existe mucha

información sobre esta enfermedad, por lo que se la reconoce como “La enfermedad olvidada”

(Berrueta, 2010). La leishamniasis se encuentra distribuido en 88 países, que como indica el

Ministerio de Salud Pública en Ecuador se ha evidenciado una prevalencia de 1712 casos

aproximadamente, durante el 2004 al 2010, presentandose solo en Pichincha 367 casos

(Calvopiña Manuel, Loor R., Lara F., 2012).

9

Fig 2 Distribución numérica anual del total de casos en tres cantones

(San Miguel de los Bancos, Pedro Vicente Maldonado y Puerto Quito) durante el periodo de 2007 a 2011. Adaptado de Calvopiña Manuel, Loor R., Lara F (2012).

Como se aprecia en la Fig 5, se detalla el número de casos presentados en Ecuador

desde el 2007 al 2011, teniendo un total de casos de 52 en el año 2007, 79 casos en el

2008, 119 casos en el 2009, 69 casos en el 2010, 113 casos en el 2011.

Como se indica en la Tabla 3, se han presentado 1073 casos totales de placas

diagnosticadas de Leishmania en el Ecuador, con un número mayor de casos presentes

en la provincia de Esmeraldas, despúes Cotopaxi, mientras que Chimborazo, Loja solo

han presentado 1 caso de esta enfermedad.

Tabla 3 Casos de leishmaniasis cutánea por provincia de enero a octubre en el año 2013.

PROVINCIA

TOTAL DE PLACAS

DIAGNOSTICADAS PLACAS

POSITIVAS PLACAS

NEGATIVAS

Esmeraldas 421 101 320

Guayas 2 2 0

Bolívar 24 13 11

El Oro 54 25 29

Manabí 9 7 2

Morona Santiago 33 26 7

Pichincha 11 11 0

Sucumbíos 79 58 21

Orellana 117 69 48

Chimborazo 15 12 3

Cañar 1 1 0

Santo Domingo 63 38 25

Los Ríos 10 9 1

Loja 1 1 0

Zamora Chinchipe 14 13 1

Napo 61 31 30

Pastaza 153 124 29

Cotopaxi 5 1 4

TOTAL 1073 542 531

Tomado de la OMS#949, informe de una reunión del Comité de Expertos de la OMS sobre el control de la Leishmania (OPS, 2015).

52

79

119

69

113

0

50

100

150

Año 2007 Año 2008 Año 2009 Año 2010 Año 2011

10

1.6. TIPOS DE LEISHMANIA:

1.6.1. Leishmanasis visceral

Se la conoce también como Kala azar, término que significa enfermedad negra, ya que los

habitantes de la India presentaban esté color negro a grisáceo en la piel. Presenta síntomas

leves, como episodios irregulares de fiebre, pérdida de peso, gastroenteriris,

hepatoesplenomegalia y anemia que síntomas leves que pueden pasar desapercibidos, si no

es tratado a tiempo el paiente, puede ser mortal, se considera que 1 de cada 10 personas que

tienen L. Visceral fallecen, ya que la enfermedad se desarrolla de manera asintomática, aguda

o crónica y se manifiesta la enferdad sin un tratamiento, la mortalidad puede ser del 100%

(Berrueta, 2010). El complejo de L. donovani, se encuentra predominando en la India, China,

África e Irak; L. Infantum se encuentra predominando en Europa y África y por último L.

Chagasi, siendo la causante de LV, se encuentra predominando en América como se observa

en la Fig 2. Dentro de la L. Visceral, existen pacientes con una infección oportunista, en

pacientes con VIH, esta se cree que es un nuevo cuadro patológico que debe ser tratado con

suma urgencia ya que los pacientes coinfectados aun siendo tratados, suelen tener recaídas

que son mortales (Olea, 2013).

Fig 3 L. Visceral

Tomada de la red de investigación colaborativa de enfermedades tropicales. (Leonardo Sánchez-Saldaña et al., 2004).

1.6.1.1. Periodo de Incubación

En las zonas consideradas endémicas, el periodo de incubación es de 10 días a 24 meses, y

se han observado pacientes que van hasta más de los dos años, con la particularidad que

entre el 30 al 100% las personas infectadas no muestran síntomas visibles (Leonardo

Sánchez-Saldaña et al., 2004).

11

1.6.1.2. Población en riesgo

Países con zonas periurbanas, niños con desnutrición y sujetos positivos con VIH son

poblaciones susceptibles para contraer LV (Leonardo Sánchez-Saldaña et al., 2004).

Anualmente se presentan aproximadamente 50.000 fallecimientos mundiales a causa de LV.

El alto % de caninos callejeros es una de las causas para la alta incidencia de la misma, ya

que los caninos infectados pueden o no presentar manifestaciones clínicas, lo que los hace

ser el principal reservorio urbano y transmisor a humanos (Lindoso JA, Cota GF, da Cruz AM,

Goto H, Maia-Elkhoury AN, Romero GA, de Sousa-Gomes ML, Santos-Oliveira JR, 2014).

1.6.1.3. Ubicación geográfica

Está presente en África Oriental, India, casos reportados en parte de México (Leonardo


1.6.2. Leishmaniasis cutánea

Es una de las formas más comunes de Leishmania, este tipo afecta la piel y a las membranas

mucosas, sobre todo ulcerosas, que van a dejar cicatriz sobre todo en el área donde se ha

producido la picadura del flebótomo (Del Rosal Rabes, Baquero-Artigao, & García Miguel,

2010).

1.6.2.1. Cuadro Clínico

Su presentación es mediante la aparición de una pápula o muchas, que va a aumentar de

tamaño que se desarrolla en un nódulo, la cual contiene macrófagos con parásitos de

Leishmania, la cual va a causar dolor y es propensa a infectarse, al cabo de un periodo de

tiempo (Berrueta, 2010). Como indica esta lesión puede cicatrizarse en una o dos semanas,

si esta persiste y no es tratada a tiempo, va a existir necrosis en el lugar de la picadura debido

a la reacción granulomatosa, debido a la respuesta inmune (Leonardo Sánchez-Saldaña et

al., 2004).

12

1.6.2.2. Periodo de incubación

Variable, desde dos semanas a seis meses o más (Del Rosal Rabes et al., 2010). Incluso

puede ser tan rápido de uno a 2 semanas; han habido reportes que las especies del Nuevo

Mundo pueden presentar un periodo de incubación de varios meses a diferencia de las

especies del Viejo Mundo (Gonzalez, U., Pinart, M., Sinclair, D., Firooz, A., Enk, C., Velez,

I.D., Esterhuizen, T.M., Tristan, M., Alvar, J., 2019).

1.6.2.3. Población en riesgo

Al ser una enfermedad endémica presente en 98 países, con una incidencia del 72 al 75% de

casos a nivel mundial; existe un alto número de población en riesgo, ya que la LC está

presente en países de escasos recursos, por lo cual no existen reportes de casos actualizados

y no hay un plan de vigilancia epidemiológica. En Argentina, se ha reportado que el pernoctar

afuera de la habitación es un factor de riesgo al igual que tener menos de tres cuartos en un

mismo hogar (Sosa-Estani et al., n.d.). Ya que, al no dormir con mosquiteros, aumenta el %

de picadura de flebótomos hembra.

1.6.2.4. Localización de las lesiones

Miembros inferiores y superiores, pabellones auriculares, cara y tronco (Leonardo Sánchez-

Saldaña et al., 2004). Sobre todo, se observa piquetes de insectos en sitios descubiertos del

cuerpo y en otros casos se pueden observar úlceras, como se indica en la Fig 3.

Fig 4 L. Cutánea

Tomada de la red de investigación colaborativa de enfermedades tropicales (González, Benito, García, & Iglesias, 2009).

13


Se ha encontrado en América de Norte, Central y del Sur, Mediterráneo, Medio Oriente y Asia

Central (Del Rosal Rabes et al., 2010; Leonardo Sánchez-Saldaña et al., 2004) .

1.6.3. Leishmaniasis Mucocutánea

Se la conoce también como espundia en América del Sur, presenta la destrucción parcial o tal

de las membranas mucosas de garganta, boca y nariz, si el cuadro es crónico, puede

involucrar el labio superior, paladar, epiglotis, cuerdas bucales, faringe, laringe y tráquea,

hasta comprometer la vida de la persona, ya que puede terminar en asfixia (OMS, 2019).

1.6.3.1. Periodo de Incubación

Desde una semana a varios meses, en algunos casos el periodo de incubación ha sido de

hasta 2 años (Gonzalez, U., Pinart, M., Sinclair, D., Firooz, A., Enk, C., Velez, I.D., Esterhuizen,

T.M., Tristan, M., Alvar, J., 1858).


Brasil, Bolivia Etiopía y Perú (Gonzalez, U., Pinart, M., Sinclair, D., Firooz, A., Enk, C., Velez,

I.D., Esterhuizen, T.M., Tristan, M., Alvar, J., 1858).

1.6.3.3. Población el riesgo

Poblaciones que vivan en malas condiciones o en lugares de hacinamiento, con poca higiene,

mal manejo de residuos, alcantarillado abierto, no usar mosquiteros, personas bajas de peso,

entre otras. Por otro lado no es usual que se presente en niños, pero si ocurre el índice de

mortalidad es alto (Gonzalez, U., Pinart, M., Sinclair, D., Firooz, A., Enk, C., Velez, I.D.,

Esterhuizen, T.M., Tristan, M., Alvar, J., 1858).

14

Fig 5 L. mucocutánea

1.7. VECTOR Como indica (Molyneux DH, 1987) la Leishmania es un género de protistas, en la que los

insectos hembras hematófagos que pertenecen a la familia Psychodidae, son transmisores

de la leishmaniosis, siendo su principal vector los mosquitos del género Phlebotomus

(Euroasia y África) y Lutzomya (América). La Leishmania se divide en 3 subgéneros, según el

sitio donde se desarrolle el parásito en el insecto transmisor: L (leishmania), L.(Viannia) y L

(Sauro leishmania) (Nourbakhsh F, Uliana RB, 1996). Mediante su biología, bioquímica,

inmunología y filogenia molecular, se puede clasificar las múltiples especies y subespecies de

la Leishmania, como se puede observar en la Tabla 4.

Tabla 4 Clasificación de Leishmania según su especie y subespecie

BIOLÓGICA BIOQUÍMICA INMUNOLOGICA FILOGENIA MOLECULAR

Crecimiento del flebótomo

en un medio de cultivo

(Nourbakhsh F, Uliana RB,

1996).

Patrones isoenzimáticos,

secuenciación de múltiples

loci (multilocus enzyme

typing) - actual "estándar de

oro" (Nourbakhsh F, Uliana

RB, 1996).

Análisis parasitario con anticuerpos

monoclonales (Nourbakhsh F, Uliana

RB, 1996).

Siendo estos los más

importantes (Nourbakhsh F,

Uliana RB, 1996).

Tomada de (Aransay A, Scoulica E, 2019)

En la Tabla 5, se muestran las principales especies y sub especies de Leishmania en Europa

y América según el tipo de Leishmania presente.

Tabla 5 Especies y subespecies de Leishmania en Europa y América según la asociación de LC, LMC y LV.

EUROPA AMÉRICA

L. cutánea se asocia a: L. cutánea escausada por los subgéneros:

Es importante recordar que todas las especies descritas pueden causar L cutánea.

L major, L. tropica y L. aethiopica. El complejo Leishmania donovani es causante de la enfermedad visceral.

Leishmania y Viannia: L. mexicana, L. braziliensis, L. panamensis, L. guyanensis, y L. peruviana.

La enfermedad mucocutánea se

asocia con mayor frecuencia a L.

15

braziliensis y L. panamensis, aunque otras especies pueden estar involucradas.

L. infantum (sín. chagasi), da

lugar a la enfermedad visceral.

Nota: L= LEISHMANIA. Tomada de (Aransay A, Scoulica E, 2019).

1.8. TRANSMISIÓN Como indica (González et al., 2009) en el ser humano la Leishmania se transmite por la

picadura del flebótomos hembra infectados, el cual debe ingerir sangre para empezar con la

producción de huevos, por otro lado inyecta en la sangre la forma infecciosa denominada

promastigote los cuales van a ser fagocitados por macrófagos del huésped, luego el

promastigote va a perder su flagelo lo que le convierte en amastigote que va a multiplicarse

en las células infectadas hasta tomar otros macrófagos que van a dañar tejidos internos, lo

que va a dar lugar a las manifestaciones clínicas de la enfermedad. En la L. cutánea, va a

diseminar los macrófagos solamente en la piel, en otro tipo de Leishmania estas se van a

diseminar en la piel, mucosas o vísceras (Ricardez R, Gómez Hernández CH, 2019)

1.9. CONTAGIO

La incidencia de Leishmania ha ido aumentando, sobre todo en sectores donde existe

deforestación o en zonas donde hay pobreza, al igual que en nuevos sectores donde hay

zonas urbanizadas (Morsy TA, Khalil NM, Salama MM, Hamdi KN, al Shamrany YA, 2019).

Cada año el número de contagio en las personas aumenta, debido al desplazamiento de las

personas,procesos migratorios, cambio climáticos, baja condición social, problemas

económicos en zonas urbanas y coinfecciones con VIH (AP, 1994).

1.10. DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD.

Las manifestaciones clínicas de la Leishmania abarcan muchos síntomas por lo que es

confundida con otras enfermedades, la forma más específica de diagnosticar esta, es por el

método de laboratorio o tomando muestras del tejido infectado, para analizarlo con pruebas

moleculares o cultivos (Arce et al., 2009-2013).

16

La L. cutánea, como indican Lemrani, M., Hamdi, S., Laamrani, A., Hassar (1975), es acertada

por el médico clínico en un 80%, ya que con la ayuda de los antecedentes epidemiológicos

puede dar su diagnóstico.

Las herramientas diagnósticas para laboratorio varían de muchas formas y es necesario

realizarlas para confirmar una sospecha de Leishmania (Handman., 2019). Existen dos

métodos diagnósticos, las pruebas directas e indirectas como se ha descrito en la Tabla 6.

17

Tabla 5 Técnicas Diagnósticas para Leishmania

PRUEBA PRINCIPIO

MÉTODO

DIRECTO

FROTIS

El objetivo es visualizar las formas amastigotes de Leishmania, en frotis de lesiones de LC y LM (raspado

y biopsias) y aspirados de médula ósea, ganglio o bazo para LVA, coloreadas con tinción de Giemsa

(Sánchez García L, Berzunza Cruz M, Becker Fauser I, 2010).

BIOPSIA

El objetivo de la biopsia es la obtención de tejidos u otros materiales de cualquier organismo vivo a ser

analizado microscópicamente con el fin de obtener un diagnóstico sobre el mismo. Este método es el más

apropiado para diagnosticar enfermedades de la piel debido a que proporciona una información muy útil

para definir el diagnóstico del paciente (Berrueta, 2010).

CULTIVO

El objetivo es la observación de formas promastigotes de Leishmania que se desarrollan a partir de

muestras provenientes de pacientes sospechosos de leishmaniasis, en el medio de cultivo NNN (Sánchez

García L, Berzunza Cruz M, Becker Fauser I, 2010).

PCR

La PCR se fundamenta en la reacción específica de un fragmento conocido de ADN del parásito (o “sonda”),

con el ADN extraído de una muestra biológica, en la cual se desea averiguar la presencia del agente; y la

posterior producción de varias copias del ADN de dicho agente (amplificación), contenido en la muestra,

por intermedio de una ADN-polimerasa (Berrueta, 2010).

MÉTODO

INDIRECTO

IFI

La IFI es un método utilizado para todos los tipos de leishmaniasis, para detectar y medir los anticuerpos

(inmunidad humoral), en contra de antígenos de Leishmania sp., por medio de una reacción in vitro, que

utiliza como antígenos a formas promastigotes de Leishmania sp. Obtenidas de cultivo axénicos. En el

método se utiliza un microscopio con luz ultravioleta que incide sobre la reacción serológica, en una lámina

portaobjetos, interpretándose como positivas las muestras que emiten fluorescencia (Leonardo Sánchez-

Saldaña et al., 2004).

RK39

Esta prueba es empleada para detectar anticuerpos específicos en contra de los parásitos del género

Leishmania pertenecientes al “complejo L. donovani” (L. donovani, L. chagasi y L. infantum en las Américas)

(L. chagasi y L. infantum son genéticamente similares), agentes de leishmaniasis visceral. Se utilizan tiras

reactivas de nitrocelulosa, en las cuales se encuentra el antígeno RK39 y que por un sistema de migración

cromatográfica son revelados los anticuerpos específicos en contra de dicho antígeno (Leonardo Sánchez-

Saldaña et al., 2004).

ELISA

Detecta anticuerpos específicos contra Leishmania en sangre. Se realiza en laboratorio y la lectura de la

prueba se hace en un espectrofotómetro. La muestra se considera positiva cuando la densidad óptica es

igual o superior a la densidad óptica media de los sueros controles negativos más dos desviaciones

estándar (Leonardo Sánchez-Saldaña et al., 2004).

18

IDR

Mide la respuesta de inmunidad celular retardada. Es un valioso auxiliar diagnóstico en apoyo de la clínica

durante el trabajo de campo, junto con ésta, llega a tener una sensibilidad de 95% para los casos de LCL y

de 80-90% para los casos de LMC. Desafortunadamente, no permite diferenciar infección pasada o

presente. Es negativa en los casos de LCD y en los casos activos de LV, volviéndose positiva en ésta última

después del tratamiento (Berrueta, 2010).

ESTUDIOS

COMPLEMENTAR

IOS

ESTUDIOS

PARASITOS

CÓPICOS

Impronta sobre el borde activo de la úlcera del paciente o exudado (Arce, A., Estirado, A., Ordobas, M.,

Sevilla, S., Garcia, N., Moratilla, L., de la Fuente, S., Martinez, A.M., Perez, A.M., Aranguez, E., Iriso, A.,

Sevillano, O., Bernal, J., Vilas, F., 2006).

CULTIVO

Si se necesita determinar el agente etiológico para observar la fase de promastigote del parásito se debe

realizar un cultivo. Su única desventaja es que este procedimiento es costoso y su sensibilidad es del

70%. Este método es recomendado para conocer la especie y subespecie de Leishmania presente

(González et al., 2009).

NOTA: LC= Leishmaniasis cutánea; LV= Leishmaniasis visceral; LM=Leishmaniasis mucocutánea; PCR= Reacción en cadena de la polimerasa; IFI= Inmunofluorescencia indirecta; rK39= Inmunocromatográfico con antígeno; ELISA= Ensayo por

inmunoabsorción ligado a enzimas; IDR= intradermoreacción con leishmanina.

L. visceral debe ser tratada a un nivel hospitalario, ya que se necesita la aspiración e la médula

ósea con una sensibilidad del 100% o bazo del paciente con una sensibilidad del 80-95%.

Todos estos procedimientos se los debe hacer con la asepsia debida (González et al., 2009).

1.11. VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA Y TRATAMIENTO

En caso de un brote se debe comunicar a la jurisdicción sanitaria competente del país, y se

coordine con el Departamento de Vigilancia Epidemiológica para realizar estudios y

determinar el área de transmisión, el grupo familiar. Todos los casos son de reporte obligatorio

al Organismo encargado del Sistema de Salud Nacional (OPS, 2015).

El tratamiento va a depender de la presentación de la enfermedad, la afección comórbida y la

especie del parásito y la ubicación geográfica donde ha sido infectado el paciente. El sistema

inmunitario de cada paciente va a reflejar el riesgo de recidiva en caso de inmunosupresión

19

puesto que los medicamentos no son capaces de eliminar el parásito del organismo (Berrueta,

2010).

Todos los tratamientos son emitidos bajo un criterio médico o por una casa de salud

competente. En el caso de LC, se usa antimoniales por una o dos veces en la lesión y su

contorno. En el caso de LV, a dosis diarias por 30 días 20 mg Sb+5/Kg, se puede usar el

mismo tratamiento por un mínimo de 30 días para LM (OMS, 2019).

Cuando se presenta una persona con VIH y con leishmaniasis, el tratamiento indicado es

fármacos antirretrovirales para ayudar la respuesta inmune de la persona (Ricardez R, Gómez

Hernández CH, 2019).

1.12. LEISHMANIASIS EN CANINOS

La leishmaniasis en caninos es una enfermedad causada por el parásito Leishmania infantum,

que se transmite a través de la picadura de un mosquito del género Phlebotomus. A diferencia

de los humanos contagiados con Leishmaniasis, en los caninos resulta ser muy grave e

incurable, incluso mortal; existe antropozoonosis y zooantroponosis con este parásito

(Ricardez R, Gómez Hernández CH, 2019).

1.12.1. Transmisión

Como indican Sánchez García L, Berzunza Cruz M, Becker Fauser I (2010), la leishmaniasis

canina tiene como vector el insecto del género Phlebotomus, que al momento de picar a

inyecta el parásito de la leishmania infantum siendo este un protozoo intracelular obligado,

que, al no ser tratado, va a deteriorar los órganos internos progresivamente, causando una

afección sistemática (González et al., 2009).

Para la transmisión, se necesita que el mosquito Phlebotomus, pique a un perro infectado y

este mismo mosquito pique a uno sano; el sistema inmunológico del perro, después de ser

infectado, su sistema circulatorio detecta al parásito y se empieza a controlar la infección por

los anticuerpos, y si no se controla, su cuerpo va a seguir fabricando anticuerpos (Petcare,

20

s.f.). Esta enfermedad es considerada endémica y va a depender de la estación climática

presente en la zona, lo que determinará la probabilidad de que se contagie. Los caninos que

viven en zonas húmedas o en una estación caliente, tienen mayor probabilidad de contagio

(Arce, A., Estirado, A., Ordobas, M., Sevilla, S., Garcia, N., Moratilla, L., de la Fuente, S.,

Martinez, A.M., Perez, A.M., Aranguez, E., Iriso, A., Sevillano, O., Bernal, J., Vilas, F., 2006).

1.12.2. Signos Clínicos.

La leishmaniasis es una enfermedad crónica que, de no ser tratada a tiempo, puede causar la

muerte sin importar la raza o sexo del perro (Arce, A., Estirado, A., Ordobas, M., Sevilla, S.,

Garcia, N., Moratilla, L., de la Fuente, S., Martinez, A.M., Perez, A.M., Aranguez, E., Iriso, A.,

Sevillano, O., Bernal, J., Vilas, F., 2006). Esta enfermedad se divide en dos tipos: cutánea y

visceral (los órganos afectados son hígado y riñones principalmente) (Del Rosal Rabes et al.,

2010).

Los signos más comunes son:

Dermatitis: En ojos o pabellones auriculares.

Úlceras: En cabeza, extremidades o pabellón auricular.

Inflamación: En los ojos, tornándolos rojos.

Alopesia: caspa

Heridas: Que con el pasar del tiempo no sanan

Diarrea y conjuntivitis

Atrofia muscular

Cansancio y debilidad

Fiebre y pérdida de peso

Epistaxis

Por la gran cantidad de anticuerpos producidos, estos pueden acumularse en articulaciones,

causando dolor al perro (Leonardo Sánchez-Saldaña et al., 2004).

21

1.12.3. Diagnóstico

Es importante reconocer los síntomas antes mencionados, para acudir a un veterinario y

realizar una prueba para demostrar si está presente la infección; en caso de que sea positivo,

se realizará otras pruebas para un diagnóstico asertivo (Berrueta, 2010). Si la afectación en

el canino no es muy elevada, no se verá comprometido su calidad de vida con controles

periódicos (Áurea Pereiraa, s.f.).

El reflejo de respuesta del canino se ha visto influenciado por el sistema inmunitario que

dependerá de la mejoría y respuesta al tratamiento, los cuales se han categorizados según el

área endémica donde residen de la siguiente manera:

“Caninos sanos y no infectados

Caninos infectados pero resistentes (Th1)

Caninos con leishmaniasis patente (Th2)

Caninos infectados con una respuesta Th2 que van a desarrollar la enfermedad”

(Leonardo Sánchez-Saldaña et al., 2004)

1.12.4. Tratamiento

Como indica Aransay & Leishmania (2019), el tratamiento de LC. es costoso y siempre debe

estar supervisado por un Veterinario, ya que no solo se debe aplicar un tratamiento

farmacológico, si no, también una dieta balanceada con alto contenido de antioxidantes,

proteína para la recuperación muscular con supervición por el daño a nivel renal, bajo

contenido de bases púricas (Sánchez García L, Berzunza Cruz M, Becker Fauser I, 2010).

El estado de salud del perro luego de haber pasado por esta enfermedad, va a depender del

estado de afectación de sus órganos y el grado de rapidéz de haber aplicado el tratamiento

necesario. El tratamiento de la Lc consiste en: administrar antimoniato de meglumina 75mg/kg

cada 24 horas por 4 semanas; Allopurinol 10 mg/kg cada 12 horas por 6 a 2 meses (Leonardo


22

1.13. LEISHMANIASIS EN FELINOS

La leishmaniasis en felinos es una enfermedad causada por el parásito Leishmania infantum,

que se transmite a través de la picadura de un mosquito del género Phlebotomus (Gonzalez,

U., Pinart, M., Sinclair, D., Firooz, A., Enk, C., Velez, I.D., Esterhuizen, T.M., Tristan, M., Alvar,

J., 2019).

La leishmaniasis puede ser muy grave en los felinos, todo dependerá del sistema inmunitario

del animal, si el gato se encuentra inmunodeprimido tiene mayor riesgo de presentar la

enfermedad, si el gato se encuentra sano, va a ser capaz de eliminar al parásito o puede

quedar latente en su organismo y se va a controlar la infección por el parásito leishmania

infantum (Gonzalez, U., Pinart, M., Sinclair, D., Firooz, A., Enk, C., Velez, I.D., Esterhuizen,

T.M., Tristan, M., Alvar, J., 2019).

A diferencia de los humanos contagiados con leishmaniasis, en los felinosresulta ser muy

grave e incurable, incluso mortal; no existe antropozoonosis ni zooantroponosis con este

parásito (Del Rosal Rabes et al., 2010).

1.13.1. Transmisión

La leishmaniasis felina (LFel) es una enfermedad parasitaria que tiene como vector el insecto

del género Phlebotomus spp (Del Rosal Rabes et al., 2010). El mismo de la LCan y la LHum,

que al momento de picar a inyecta el parásito de la leishmania infantum. Esta enfermedad es

endémica del Mediterráneo, y con una incidencia en aumento en diferentes partes de España.

La enfermedad está activa con determinadas condiciones ambientales: temperatura cálida con

humedad (Fleta et al., 2001).

1.13.2. Sígnos Clínicos

Como indica (Fleta et al., 2001) la Leishmania en felinos es muy difícil de ser diagnosticada,

ya que los felinos no suelen presentar signos clínicos, porque su sistema inmunitario controla

la infección o bien la elimina. Existen felinos inmunodeprimidos con infecciones virales que

comprometen su estado de salud como es Sida y/o Leucemia felina (Ricardez R, Gómez


23

La presentación de la Leishmania se divide en dos:

Leishmaniasis cutánea: Esta forma afecta la piel y mucosas del gato, sobre todo en:

ojos y mucosas con nodulaciones bajo la piel dolorosas en cuello, párpados y orejas

(Leonardo Sánchez-Saldaña et al., 2004)

Leishmaniasis visceral: Esta forma de presentación es la más peligrosa y es común en

caninos no tanto en felinos. Si se llegara a presentar se observaría: baja de peso en

poco tiempo, diarrea, vómito, fiebre, epistaxis (Leonardo Sánchez-Saldaña et al.,

2004).

1.13.3. Tratamiento

No existe un tratamiento para Leishmania en felinos, solo se tratan los signos para controlar

la enfermedad con un correcto seguimiento por parte del Veterinario para prevenir cualquier

rebrote (Leonardo Sánchez-Saldaña et al., 2004). El pronóstico de un gato con LFC, va a ser

mas alentador que un gato con LFV, y en los dos casos se necesita cuidado especial. El

contagio y diseminación de la LFe Se puede prevenir con el uso de antiparasitarios externos

como collares o pipetas, de igual manera, se debe tener cuidado con los felinos que están en

semilibertad, sobre todo a las primeras horas del día y al atardecer (Ricardez R, Gómez


24

CAPÍTULO II.

MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. DISEÑO DEL ESTUDIO

Se realizó una búsqueda sistemática de la bibliografía sobre la seroprevalencia de la

Leishmania en caninos, felinos y humanos en diferentes países endémicos alrededor del

mundo durante el período de 1991 a 2019. Con el fin de tener datos comparables, esta

búsqueda se centró en los artículos que se obtuvieron datos utilizando las siguientes técnicas:

Prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes (IFAT), ensayo inmunoabsorbente ligado a

enzimas (ELISA) la detección de anti-Leishmania spp, prueba de anticuerpos de

inmunofluorescencia indirecta, anticuerpos de inmunoglobulina IgG, Prueba de aglutinación

modificada, Western Blot, Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), Prueba de

aglutinación directa (DAT). Las pruebas debían tener un rango de sensibilidad del 95 a 98%

con una especificidad entre 97 a 100% para detectar anticuerpos de Leishmania.

La restricción de idioma se aplicó cuando el artículo se escribió en un idioma distinto al hablado

o comprendido por los autores de la revisión. Los idiomas considerados fueron: inglés,

español y francés.

Las bases de datos seleccionadas para esta investigación fueron: PubMed

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/, LILACS (Literatura latinoamericana y caribeña de

ciencias de la salud, lilacs.bporalud.org / en /). La búsqueda se realizó desde el 01 de marzo

de 2019 al 08 de junio de 2019.

2.2. BÚSQUEDA

Se aplicaron las siguientes estrategias de búsqueda: en PubMed, utilizando el operador

booleano y se introdujeron las palabras “Leishmania” y “seroprevalencia” en la barra de

búsqueda principal y los filtros se activaron durante el período del 1983/08/01 a 2019/01/01,

que fueron las fechas de reportes científicos encontrados en PubMed. En LILCAS se utilizaron

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

25

los mismos criterios de búsqueda, tomando en cuenta que LILACS es una base de datos más

pequeña y específica en comparación con PubMed.

Además, se incluyeron artículos relevantes que no se encontraron con esta estrategia de

búsqueda, pero coincidieron con los criterios de selección después de la búsqueda manual o

la recomendación de un experto.

Los artículos fueron pasados por la aplicación Rayyan (https://rayyan.qcri.org/ ) que es una

aplicación web gratuita para ayudar a los autores de revisiones sistemáticas a realizar su

trabajo de una manera rápida, confiable y se puede colaborar entre ellas para obtener

sugerencias de la inclusión de artículos.

La ventaja de esta aplicación es que se puede ingresar una estructura de revisión en capas,

permitiendo a los investigadores seleccionar artículos y revisar el resumen de cada uno de

ellos, se puede colocar etiquetas para designar razones de exclusión que van a facilitar el

trabajo para la revisión en cuestión.

Se utilizó las guías PRISMA como punto de inicio, para evitar sesgos, las cuales contaron de

tres fases:

2.2.1. Fase uno:

Consistió en la eliminación de los estudios repetidos de la selección del título y todos los

estudios realizados antes de 1989.

2.2.2. Fase dos:

Consistió en la exclusión de los artículos del título y la revisión del resumen en cuanto a los

siguientes criterios de exclusión:

1) Especies de parásitos incorrecta

2) Estudios realizados en otras especies que no sean caninos, felinos ni humanos

3) Estudios realizados en pequeñas poblaciones de animales

4) Estudios clínicos

5) Estudios que no tenían seroprevalencia

26

6) Estudios realizados en tipos específicos de individuos (por ejemplo, niños de la

escuela, refugiados o soldados)

7) Artículos escritos en idiomas distintos a los hablados o entendidos por los autores de

esta revisión

8) Entrevistas, cartas, reseñas o editoriales que presenten datos originales y / o las

técnicas y protocolos realizados en sus estudios

9) Estudios no relacionados con epidemiología de Leishmania. Ver Anexo 2

2.2.3. Fase tres:

Se aplicó cuando se leyó los textos completos y consistió en la selección del estudio de

acuerdo con los siguientes criterios de selección:

1) Estudios basados en caninos, felinos y humanos,

2) Protocolos aplicados para el diagnóstico de LV, L.C, LVC.

2.3. RECOPILACIÓN DE DATOS

Con los estudios que cumplían el protocolo se realizó una síntesis cualitativa de las variables de

cada artículo seleccionado, se recopilaron los siguientes elementos y se introdujeron en una

base de datos: Autor (es), año en que se publicó el artículo, país, continente, número de

participantes, prevalencia aparente, prevalencia estimada expresada en porcentaje.

Además, el estudio se realizó en paralelo de tres especies, humana, felina y canina, también

se recopiló la prevalencia y el método utilizado para diagnosticar la Leishmania.

Estas variables se consignaron en una base de datos diseñada en RStudio versión 1.2.1335.

2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se realizó un metaanálisis, que es un análisis estadístico de estudios, obtenidos en una

variedad de estudios relacionados al tema con el fin de integrar resultados; en este estudio se

utilizó esta técnica, para identificar las variaciones en la seroprevalencia de Leishmania spp.

27

según la distribución geográfica y métodos diagnósticos, y para identificar patrones

epidemiológicos de la enfermedad

Los componentes claves de un metaanálisis son:

Población específica: Se debe definir qué población es de interés. En este estudio

fueron humanos, caninos y felinos que sean positivos a Leishmania.

La exposición de interés: Puede ser un factor de riesgo, test diagnóstico, intervención

o tratamiento. En este artículo se buscó que la población presente Leishmania.

Evento de interés: Ejemplo: mortalidad, natalidad, entre otros. En este estudio se

utilizó la prevalencia de Leishmania (Ferreira González, Urrútia, & Alonso-Coello,

2011).

Por lo que en este estudio se utilizó el paquete "meta" en R para estimar la prevalencia de

antígenos circulantes para L. visceral, L. canina, L. infantum y la seroprevalencia de

anticuerpos en cada continente con base en un modelo de efectos aleatorios. No se realizó

una estimación de la prevalencia global ya que no era la intención de este estudio.

Se calculó Intervalos de confianza binomiales exactos al noventa y cinco por ciento de

confianza (IC 95%) para cada prevalencia informada. Las diferencias significativas en las

prevalencias estimadas se evaluaron utilizando sus intervalos de confianza del 95%. La

diferencia en la prevalencia entre dos regiones se consideró estadísticamente significativa si

sus intervalos de confianza del 95% no se superponen (Aransay A, Scoulica E, 2019). De

igual manera se analizó el I2, que mide la variabilidad entre estudios, indicando cómo de

comparables son los estudios analizados (Conejero Casares, 2001). Se analizó el valor de T2,

para ver la homogeneidad, igual se interpretó el p valor.

28

CAPÍTULO III

RESULTADOS

3.1. PRISMA

Se recolectó los elementos basados en evidencia para utilizarla en la revisión sistemática

actual, con la recolección a base información científica. En La Fig 6 se describe el proceso

de revisión y el número de artículos seleccionados en cada etapa de la revisión. De un total

de 388 artículos, solo se incluyeron 146 estudios en esta revisión; de los que se obtuvieron 66

artículos de la región de África, 53 artículos de la región de Asia, 86 artículos de la región de

Europa y 37 artículos de la región de América. Los cuales fueron divididos en felinos, caninos

y humanos. En la especie felina se incluyó 16 artículos, de los cuales 1 artículo fue de la región

de África, 3 artículos de América, 1 artículo de Asia, 11 artículos de Europa. En la especie

canina, se incluyó 102 artículos, los cuales 12 artículos de África, 38 artículos de América, 8

artículos de Asia, 44 artículos de Europa y en humanos se incluyeron 33 artículos de los cuales

9 artículos fueron de África, 5 artículos de América, 8 artículos de Asia y por último 11 artículos

de Europa.

29

PRISMA 2009 Diagrama de Flujo

Fig 6 Diagrama de flujo que describe la búsqueda bibliográfica y la selección de estudios

Fuente: Moher D, Liberati A, Tetzlaff J, Altman DG, The PRISMA Group (2009). Preferred Reporting Items for Systematic

Reviews and Meta Analyses: The PRISMA Statement. PLoS Med 6(6): e1000097. doi:10.1371/journal.pmed1000097

Número de registros identificados mediante

búsquedas en bases de datos

Pubmed= (356); Lilacs= (53)

Total (409)

Cri

bad

o

Incl

usi

ón

Id

on

eid

ad

Iden

tifi

caci

ón

Número de registros adicionales identificados

mediante otras fuentes

(n = 0)

Número de registros tras eliminar citas duplicadas

(n = 388 )

Número de registros cribados

(n =388 )

Número de registros excluidos

(n = 212)

Otro tema=125

Estudios no relacionados a

Leishmaniasis=22

No seroepidemiología=13

Otro idioma (portugués)=17

Diseño de estudio equivocado=

22

Diseño de estudio equivocado=

13

Número de artículos de texto completo evaluados

para su elegibilidad

(n = 176)

Número de artículos de texto completo

excluidos, con sus razones

(n = 30)

Tipo de individuos (soldados, niños de 3 años,

etc) =10

Otra especie de animales (zorros, ratas,

burros, conejos, caballos, zarigüeya) = 15

Revisiones sistemáticas de felinos y en

humanos donantes de sangre=5

Número de estudios incluidos en la

síntesis cualitativa

(n = 146)

Número de estudios incluidos

en la síntesis cuantitativa

(metaanálisis)

(n = 146)

30

3.2. METODOLOGÍA

Para cada estudio se dividió en 3 especies (felinos, caninos y humanos) y en cada uno se

dividió por regiones con la misma prueba diagnóstica. Se usó el programa RStudio versión

1.2.1335, usando el paquete meta, se corrió la prueba Q de Cochran (valor p

31

3.2.1.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en felinos en la región de Europa

Como se indica en la Fig 8 se puede observar que los 3 artículos fueron realizados en

diferentes partes de Europa, con un total de 428 participantes, su heterogeneidad del 78%, t2

del 0.7650 y p=0.01.

Fig 8 Técnica de PCR en felinos en Europa

Se encontró 3 artículos, de los cuales el artículo de Spada E. realizado en el año 2016 y Sherry

K. realizado en el año 2011, presenta una prevalencia alta e igual del 9% y el peso de los

efectos aleatorios de Spada E. de 39.6%, y de Sherry K. de 40.3%; el artículo de Ayllon T.

presenta una prevalencia baja del 1% y el peso de los efectos aleatorios es de 20.2%, lo que

nos confirma que existe diferencias entre los estudios en cuanto a características de los

pacientes incluidos, la localización geográfica, metodología, etc. En conjunto dan una

estimación de la prevalencia de 5%, intervalo de confianza que va del 2% al 14%.

3.2.1.3. Prueba de anticuerpos por inmunofluorescencia indirecta (IFAT) en felinos en

la región de Europa


diferentes partes de Europa, con un total de 2100 participantes, su heterogeneidad del 96%,

t2 del 0.8460 y p

32

Fig 9 Técnica de IFAT en felinos en Europa

Se encontró 5 artículos, de los cuales el artículo de Spada E. realizado en el 2016, presenta

una prevalencia alta del 30% y el peso de los efectos aleatorios es de 20.8%; el artículo de

Ayllon T. realizado el año 2008 presenta una prevalencia baja del 1% y el peso de los efectos

aleatorios es de 15.8%, lo que nos confirma que existe diferencias entre los estudios en cuanto

a características de los pacientes incluidos, la localización geográfica, metodología, etc. En

conjunto dan una estimación de la prevalencia de 10%, intervalo de confianza que va del 4%

al 20%.

3.2.2. Caninos

3.2.2.1. Prueba de anticuerpos por inmunofluorescencia indirecta (IFAT) en caninos en

la región de África.


diferentes partes de África, con un total de 936 participantes, con heterogeneidad del 90%, t2

del 0.4113 y p

33

Se encontró 5 artículos, de los c

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