UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA SEDE QUITO · micorrÍzicos presentes en la relaciÓn...

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA

SEDE QUITO

CARRERA:

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA DE LOS RECURSOS NATURALES

Trabajo de titulación previo a la obtención del título de:

INGENIERAS EN BIOTECNOLOGÍA DE LOS RECURSOS NATURALES

TEMA:

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE HONGOS ENDÓFITOS Y

MICORRÍZICOS PRESENTES EN LA RELACIÓN SIMBIÓTICA DE LA

ESPECIE Caucaea pichinchae (ORCHIDACEAE) CON SU RESPECTIVO

HOSPEDERO.

AUTORAS:

MARGARITA DE LOS ÁNGELES CAZAR IZA

DANIELA BELÉN PÉREZ REYES

TUTOR:

MARCO FERNANDO CERNA CEVALLOS

Quito, julio del 2019

Dedicatoria

A Dios por ser parte de esta travesía con su sabiduría y fortaleza logré culminar el

sueño de ser profesional.

A mis abuelitos Blanquita y Manuelito Iza que siempre estuvieron con sus consejos

oportunos brindándome seguridad en los momentos difíciles.

A mis padres en especial a mi madre Nancy por darme su apoyo incondicional,

inculcándome a ser una mejor persona y sobre todo por anhelar lo mejor para mi

vida.

A mis hermanos Fernando, Ariel por todos los momentos gratos compartidos y sus

frases motivadoras permitiéndome aumentar mi fé.

Margarita Cazar

Al creador de todas las cosas, al que me ha dado fortaleza para continuar cada día.

A mis padres Bélgica y Jorge por haberme forjado como la persona que soy,

impulsándome siempre a cumplir mis sueños.

A mis hermanas Fernanda, Priscila y a mi hermano Jorge que siempre han estado

dispuestos a ayudarme.

A mis sobrinos Brandon, Mateo y Brenda que por medio de sus alegrías me han

motivado a seguir adelante.

A David por brindarme su amor, apoyo incondicional y por siempre anhelar lo mejor

en mi vida

Daniela Pérez

Agradecimientos

Agradecemos a la Universidad Politécnica Salesiana, a toda la carrera de

Biotecnología, a nuestros docentes por compartir sus enseñanzas y experiencias

durante nuestro periodo académico permitiéndonos crecer cómo buenas profesionales.

A nuestro Tutor Marco Cerna Ph.D por darnos la oportunidad de integrar el grupo de

investigación NUNKUI WAKAN, brindándonos su conocimiento para el desarrollo

del presente proyecto de investigación y su motivación continua.

Al Ing. Alexander Hirtz por la donación de muestras y trabajo en campo, al grupo de

Investigación NUNKUI WAKAN por hacer posible la ejecución, financiamiento de

nuestro proyecto y a los ingenieros Elizabeth Yugsi, Byron Fuertes que forman parte

del personal de los Laboratorios de Ciencias de la Vida de la carrera Ing. en

Biotecnología por la colaboración oportuna.

A nuestros compañeros y compañeras por los momentos compartidos durante toda la

carrera y por su amistad incondicional.

Índice

Introducción ................................................................................................................. 1

Capítulo 1 ..................................................................................................................... 3

1. Marco conceptual .................................................................................................... 3

1.1 Familia Orchidaceae ......................................................................................... 3

1.2 Género Caucaea ............................................................................................... 4

1.2.1 Clasificación taxonómica del género Caucaea ......................................... 5

1.2.2 Descripción botánica y morfológica de Caucaea pichinchae Szlach. &

Kolan. ........................................................................................................ 5

1.3 Relación simbiótica .......................................................................................... 7

1.4 Hongos endófitos .............................................................................................. 8

1.4.1 Clasificación de los hongos endófitos: ...................................................... 9

1.5 Micorrizas/Hongos micorrízicos .................................................................... 10

1.5.1 Micorrizas de orquídeas .......................................................................... 10

1.5.2 Clasificación de hongos micorrízicos ..................................................... 11

1.6 Técnicas moleculares para la identificación ................................................... 12

1.6.1 Extracción de ADN ................................................................................. 12

1.6.2 Reacción en cadena de la polimerasa ...................................................... 12

1.6.3 Secuenciación Sanger .............................................................................. 14

Capítulo 2 ................................................................................................................... 16

2. Metodología ........................................................................................................... 16

2.1 Área de estudio de la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan. ........... 16

2.2 Recolección de las muestras del género Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan.

con su respectivo hospedero ........................................................................... 16

2.3 Aislamiento de hongos provenientes de tallos y raíz ..................................... 18

2.3.1 Preparación del medio de cultivo PDA ................................................... 18

2.3.2 Protocolo de desinfección de las muestras .............................................. 18

2.3.3 Siembra de las muestras y aislamiento de hongos .................................. 19

2.4 Identificación morfológica de los subcultivos aislados de tallo y raíz ........... 19

2.5 Identificación molecular ................................................................................. 20

2.5.1 Extracción de ADN del material fúngico ................................................ 20

2.5.2 Amplificación del ADN cloroplástico y ribosómico nuclear .................. 21

2.5.3 Secuenciación .......................................................................................... 22

2.5.4 Análisis de las secuencias ....................................................................... 23

Capítulo 3 ................................................................................................................... 24

3. Resultados y discusión .......................................................................................... 24

3.1. Recolección de las muestras del género Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan

con su respectivo hospedero ........................................................................... 24

3.2. Aislamiento de hongos de tallo y raíz ............................................................ 25

3.3. Identificación morfológica de los hongos aislados ........................................ 28

3.4. Identificación molecular ................................................................................. 46

3.4.1. Amplificación del ADN cloroplástico y ribosómico nuclear .................. 46

3.4.2 Análisis de las secuencias .......................................................................... 48

3.4.3 Análisis de la biodiversidad en los puntos de recolección......................... 57

Conclusiones .............................................................................................................. 59

Recomendaciones ....................................................................................................... 60

Bibliografía ................................................................................................................ 61

Anexos: ...................................................................................................................... 72

Índice de Tablas

Tabla 1 Puntos de recolección de las muestras de la especie Caucaea pichinchae Szlach.

& Kolan con sus coordenadas geográficas (UTM) ............................................. 16

Tabla 2 Listado de las muestras colectadas ........................................................................ 17

Tabla 3 Preparación de la disolución para PCR con el Kit Phire Plant Direct PCR Master

Mix ......................................................................................................................... 21

Tabla 4 Condiciones de temperatura para la amplificación del ADN cloroplástico y

ribosómico nuclear ................................................................................................ 22

Tabla 5 Subcultivos de los hongos endófitos aislados de las muestras de tallo ............... 26

Tabla 6 Subcultivos de hongos aislados de las muestras de raíz ....................................... 27

Tabla 7 Estructuras macroscópicas y microscópicas de hongos aislados de tallos en medio

PDA........................................................................................................................ 29

Tabla 8 Estructuras macroscópicas y microscópicas de hongos aislados de raíz en medio

PDA........................................................................................................................ 39

Tabla 9 Secuencia del ADN cloroplástico de la especie Caucaea pichinchae Szlach &

Kolan ...................................................................................................................... 49

Tabla 10 Secuencia del ADN cloroplástico de la especie Oreopanax ecuadoriensis

Seem ....................................................................................................................... 50

Tabla 11 Listado de los grupos formados del árbol filogenético de las muestras de

tallo ......................................................................................................................... 53

Tabla 12 Listado de los grupos formados del árbol filogenético de las muestras de raíz 56

Índice de Figuras

Figura 1 Descripción morfológica de Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan ............. 6

Figura 2 Identificación taxonómica de la especie de estudio y su hospedero ............ 24

Figura 3 Resultado de la amplificación de la región matK, usando como muestra la

hoja de la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan. recolectada en

cada punto geográfico. ............................................................................... 47

Figura 4 Resultados de los productos de la amplificación de la región ITS. ............. 48

Figura 5 Árbol filogenético Neighbor-Joining a partir de las secuencias obtenidas de

la región matK de las muestras recolectadas ............................................. 51


la región ITS de los hongos aislados de las muestras de tallo. .................. 52


la región ITS de los hongos aislados de las muestras de raíz. ................... 55

Figura 8 Número de especies fúngicas identificadas en los lugares de recolección .. 58

Índice de Anexos

Anexo 1 Recolección de las muestras de la especie Caucaea pichinchae Szlach. &

Kolan, con su respectivo hospedero Oreopanax ecuadoriensis Seem.

y su etiquetado. ............................................................................................ 72

Anexo 2 Proceso de desinfección de las muestras de tallo. ....................................... 73

Anexo 3 Proceso de desinfección de las muestras de raíz. ........................................ 74

Anexo 4 Siembra de las muestras y aislamientos de los hongos. .............................. 75

Anexo 5 Resultado electroforético de la extracción de ADN de los hongos

aislados. ...................................................................................................................... 76

Anexo 6 Electroferograma de las secuencias obtenidas para la región matK y la

región ITS .................................................................................................. 77

Anexo 7 Alineamiento de las secuencias obtenidas de las diez muestras recolectadas

de la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan. ................................ 78

Anexo 8 Identificación molecular de hongos aislados de tallo utilizando los primers

ITS 1 e ITS 4 .............................................................................................. 79

Anexo 9 Identificación molecular de hongos aislados de raíz utilizando los primers

ITS 1 e ITS 4 .............................................................................................. 80

Resumen

En el presente trabajo se estudiaron los hongos endófitos y micorrízicos de la especie

Caucaea pichinchae, con su respectivo hospedero en cuatro puntos de recolección

distribuidos en la Provincia de Pichincha, para el estudio molecular se tomaron

muestras de hojas y raíz de C. pichinchae y un segmento del tallo del hospedero, con

la cual se determinó que el hospedero corresponde a la especie Oreopanax

ecuadoriensis, conocido como “Pumamaqui”, para el aislamiento de las especies

fúngicas se establecieron cultivos en medio nutritivo PDA, este material se utilizó para

extraer ADN, del cual se amplificó el segmento nuclear ITS. Para la identificación del

hospedero y huésped se extrajo ADN de tejido foliar y se amplificó un segmento del

gen cloroplástico matK. Las secuencias obtenidas fueron secuenciadas y usadas para

la identificación de las especies, además se analizó la familiaridad de las especies

mediante análisis filogenético; se identificaron 25 especies de endófitos presentes en

el tallo del hospedero, del cual una especie está presente en tres de las cuatro

localidades estudiadas, en relación a las muestras aisladas de la raíz del huésped se

identificaron 18 especies fúngicas, de las cuales dos especies se repiten en dos

localidades; las demás especies son específicas para cada sitio de recolección. En

conclusión, la especie Caucaea pichinchae establece poblaciones fúngicas en su

mayoría distintas en cada sector, en muy pocas ocasiones se repiten en dos localidades.

Palabras clave: Endófitos, identificación molecular, micorrizas.

Abstract

In the present work the endophytic and mycorrhizal fungi of the Caucaea pichinchae

species will be studied, with their respective host in the four collection points

distributed in the Province of Pichincha, for the molecular study the leaves and the

root of C. pichinchae were taken and Oreopanax ecuadoriensis, known as

"Pumamaqui", for the isolation of the fungal species were established crops in

nutritious medium PDA, this material was used to extract DNA, from which the ITS

nuclear segment was amplified. For the identification of the host and guest, DNA was

extracted from leaf tissue and a segment of the chloroplastic matK gene was amplified.

The obtained sequences were sequenced and used for the identification of the species,

in addition the familiarity of the species was analyzed by phylogenetic analysis; We

identified 25 species of endophytes present in the stem of the host, of which one

species is present in three of the four localities studied, in relation to the samples

isolated from the guest root, 18 fungal species were identified, of which two species

were repeat in two locations; the other species are specific to each collection site. In

conclusion, the species Caucaea pichinchae establishes fungal populations mostly

different in each sector, very rarely are repeated in locations.

Keywords: Endophytes, molecular identification, mycorrhizae.

1

Introducción

La familia vegetal Orchidaceae ha desarrollado numerosas estrategias de colonización

en ecosistemas terrestres con el fin de hacer frente a los diversos retos bióticos y

abióticos (Camarena-Gutierrez, 2012). El potencial endófito de los hongos en las

orquídeas es un ejemplo de ello, considerando que estos habitan en las plantas sin

causar síntomas aparentes de enfermedad (Cando y Cárdenas, 2017). Las micorrizas

son una forma intrincada de asociación de las raíces con algunos grupos de hongos,

siendo el sistema de absorción de nutrientes en la mayoría de orquídeas presentes en

la naturaleza. La estrecha relación que existe entre el hospedero y huésped se considera

de gran importancia, ya que el hongo es capaz de producir metabolitos bioactivos, así

como modificar los mecanismos de defensa, permitiendo e incrementando la

sobrevivencia de ambos organismos (Sánchez-Fernández et al., 2013).

Jiang, Lee, Cubeta y Chen (2015), mencionan que los hongos aislados de raíces de

orquídeas aumentaron la germinación de las semillas entre un 44 a 91 % promoviendo

el crecimiento protocormo de las fases III a VI del cultivo in vitro en comparación con

otros tratamientos en ausencia de hongos micorrízicos. Salazar (2017), señala que la

relación entre las orquídeas y hongos endófitos es indispensable para su desarrollo,

esta relación puede ser específica o no, permitiendo relacionar la distribución

geográfica de la orquídea por los hongos endófitos presentes en el hospedero.

En el Ecuador, existen investigaciones enfocadas al estudio de la relación simbiótica

entre hongos micorrízicos y las raíces de las especies de la familia Orchidaceae, Crespo

y Ortega (2012), estudian el aislamiento de micorrizas para evaluar su actividad

simbiótica en semillas de orquídeas. Moína-Quimí, Oviedo-Anchundia, Nieto-

Barciona, Herrera-Samaniego y Barcos-Arias (2018), analizan la simbiosis entre

hongos micorrízicos arbusculares y árboles del trópico húmedo ecuatoriano. Las

2

orquídeas buscan un medio adecuado en las ramas o tallos de diferentes árboles

brindándoles estabilidad para poder desarrollarse, siendo indispensable la presencia de

microorganismos fúngicos que les proporcione nutrientes debido a la carencia de

endospermo en la semilla (Tupac y Alomia, 2015). Las orquídeas crean un vínculo con

su hospedero, pero se desconoce si presentan especificidad para adaptarse en él, ya

que las semillas de las orquídeas son transportadas por aire y agua siendo depositadas

en la superficie de los diferentes árboles sin garantizar su supervivencia (Rodríguez,

2009). Los hongos endófitos y los hongos formadores de micorrizas se encuentran

ligados entre sí por la relación mutualista que crea entre el huésped y hospedero, donde

la orquídea se puede beneficiar del endófito por: inducción de metabolitos de defensa,

secreción de fitohormonas elevando la tasa de crecimiento y movilidad de nutrientes

para la orquídea (Ordoñez, 2012).

Es así que, basándose en la importancia de la interacción fúngica para la supervivencia,

nutrición de la semilla y desarrollo de la orquídea, se realiza este estudio con el

objetivo de identificar molecularmente los hongos endófitos y micorrízicos presentes

en la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan. con su respectivo hospedero, para

ello se recolectaron individuos completos de la especie en estudio en cuatro localidades

distribuidas en la Provincia de Pichincha, incluyendo un segmento de su hospedero,

posteriormente se aisló los hongos endófitos y micorrízicos presentes en las muestras

de tallo y raíz respectivamente con el propósito de obtener subcultivos fúngicos que

permitan su identificación morfológica, además se determinó la identidad de las

especies de los hongos aislados mediante técnicas moleculares, identificando la

familiaridad de los integrantes de las relaciones simbióticas.

3

Capítulo 1

1. Marco conceptual

1.1 Familia Orchidaceae

Las orquídeas corresponden a la familia vegetal más amplia contando con 800 géneros

y alrededor de 24.000 especies distribuidas en todo el mundo, manifestando el interés

científico por los diferentes agentes polinizadores, sistemas de almacenamiento de

agua conocidos como pseudobulbos, su complejidad con respecto a las flores y sus

relaciones simbióticas con ciertos hongos de su alrededor (Mejía, Pino y Pino–Benítez,

2008). La palabra Orquídea proviene del griego ορχις (orchis) cuyo significado es

“testículo” que fue descrito por primera vez en el manuscrito de la obra De causis

plantarum del filósofo griego Teofrasto del 375 a.C. describiendo así a la forma

globosa de los pseudobulbos dobles representando la raíz y tallo de la orquídea

(Velasco, 2010).

En el Ecuador la familia Orchidaceae equivale al 24% de la flora nativa ecuatoriana,

en la naturaleza de cada diez especies silvestres cuatro son orquídeas y están

distribuidas en todos los pisos altitudinales, se estima que en Ecuador anualmente se

pierde 1.7 % de la superficie forestal por la recolección ilegal y uso del suelo para la

agricultura, ganadería o minería por lo que afecta significativamente a las especies que

habitan en estas áreas, por esta razón Ecuador establece estrategias de conservación o

concientización como la propuesta “Ecuador, País de las Orquídeas” (Cerna, Cárdenas,

Cruz, & Jácome, 2015; Ministerio de Turismo, 2013)

Las orquídeas son conocidas por las diferentes tipologías de sus flores que las

diferencian de las demás especies vegetales y por sus interacciones con otros seres

vivos como los hongos micorrízicos, hongos endófitos, árboles hospederos y agentes

4

polinizadores (Velasco, 2010). Por estas innovaciones a las orquídeas se las considera

la familia más evolucionada, según investigaciones se identificó 474 familias de genes

específicos donde demuestra que las orquídeas se diferenciaron y evolucionaron dando

origen a su alta diversidad (Zhang et al., 2017).

Se conoce que en la biodiversidad de los bosque las plantas epifitas están presentes en

un 30 %, predominando en la biomasa, reciclaje de nutrientes, refugio, reproducción

para insectos y anfibios, como hemos mencionado la principal característica es la

capacidad de crecer en otro ser vivo generando relaciones simbióticas con otros hongos

de su alrededor (Henao-Díaz, Pacheco-Fernández, Argüello-Bernal y Stevenson,

2012). Por ello, las orquídeas son responsables de la mayor diversidad y abundancia

biótica en los bosques (Granados, López, Hernández y Sánchez, 2004).

1.2 Género Caucaea

Las especies del género Caucaea crecen como plantas epifitas especialmente en

bosques montanos y en bosques nubosos andinos, este género presenta 20 especies

distribuidas entre Perú, Venezuela, Colombia y Ecuador, sin embargo, en este último

se encuentra la mayor biodiversidad observada de esta especie (Szlachetko &

Kolanowska, 2015). La familia está distribuida a partir de los 2500 m.s.n.m.

exponiéndose a una mayor captación de radiación UV, provocando varios cambios en

sus caracteres morfológicos o estructurales, permitiendo adaptarse y sobrevivir en

diferentes condiciones ambientales que dan como resultado un valor adaptativo (Chase

& Palmer, 1988). En muchas ocasiones, es sujeto de debate frente a la escasa

información científica, de igual manera, las orquídeas del género Oncidium han sido

motivo de discusión por más de 175 años, sin llegar a un consenso (Stacy, 1975).

Szlachetko y Kolanowska (2015), menciona que dicho debate se debe a la variación

fenotípica y a la similitud superficial morfológica de la flor entre ambos géneros

5

promoviendo la necesidad de delimitarlos, por ello, en los estudios moleculares

realizados se descubrió que existe una relación entre los representantes del género

Caucaea y Oncidium, en el pasado el género Caucaea era reconocido como un taxón

monoespecífico con 8 divisiones; sin embargo, a partir de dichos estudios los

investigadores propusieron la agrupación de los dos géneros en uno, con el nombre

Caucaea pero Dodson y Luer (2005), rechazaron dicha propuesta y realizaron

investigaciones de la morfología del ginostemo confirmando así la similitud que existe

en las estructuras reproductivas. Además mediante el análisis filogenética se comprobó

que existente distancia entre Caucaea con respecto a Oncidium (Neubig et al., 2012).

1.2.1 Clasificación taxonómica del género Caucaea

La taxonomía del género Caucaea se dispone de la siguiente manera: reino Plantae,

filo Tracheophyta, clase Liliopsida, orden Asparagales, familia Orchidaceae, género

Caucaea (Roskov et al., 2019).

1.2.2 Descripción botánica y morfológica de Caucaea pichinchae Szlach. &

Kolan.

Descripción Botánica

La especie Caucaea crece a partir de los 2500 m.s.n.m. presenta una gran similitud

con la especie C. cucullata (Lindl.) N.H. Williams & M.W. Chase, entre las diferencias

principales de la especie son: sépalo dorsal obtuso oval-elíptico vs. oblongo-

lanceolado agudo; callo glabro vs. piloso en la base, en forma de dos crestas paralelas

vs. uno o tres quillas (Szlachetko & Kolanowska, 2015).

Descripción Morfológica

La especie en estudio consta de las siguientes partes: un pseudobulbo de 7 cm de largo,

1.8 cm de ancho cilíndrico-ovoide, bilateralmente comprimido y bifoliado; sus hojas

6

son lineales y lanceoladas alcanzando hasta 42 cm de largo y 2.7 cm de ancho;

inflorescencia de hasta 100 cm de largo, racimosas y ramificadas con flores de color

rosa con manchas moradas; bráctea floral de 3 mm de largo ovada-triangular, aguda;

pedicelo y ovario de 27 mm de largo; sépalo dorsal nervado ovado-elíptico obtuso de

15 mm de largo y pétalos de 15 mm de largo, 8 mm de ancho, grueso, elíptico, obtuso,

algo oblicuo con márgenes ligeramente ondulados y con 7 nervaduras; sépalos

laterales que miden 15 mm de largo, 7.5 mm de ancho juntos, connados; labio 20 mm

de largo y 17 mm de ancho en el lateral. Presentan un lóbulo de 20 mm de ancho

delgado y trilobulado; los lóbulos laterales miden 3.5 mm de ancho con márgenes

crenados, ápice subagudo; istmo prominente de 7 mm largo estrecho; y el lóbulo medio

mide aproximadamente 12 mm de largo y es cordado en la base, flabelado, poco

bífidos con márgenes ondulados; el callo está formado por dos crestas paralelas en

forma de quilla que se extienden hasta aproximadamente 1/3 de la longitud del labio;

ginostemio de 7 mm de largo apicalmente dentado. Ver Figura 1 (Szlachetko &

Kolanowska, 2015).

Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan.

Figura 1 Descripción morfológica de Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan

Nota: a: fotografía tomada por las autoras, 2019 y b: descripción morfológica (A: labio, B: sépalo

dorsal, C: pétalo, D: sépalos laterales, E: ginostemios. Barras de escala = 5 mm, dibujado por N.

Olędrzyńska.)

Fuente: (Szlachetko & Kolanowska, 2015).

7

1.3 Relación simbiótica

Gracias a sus interacciones ecológicas las orquídeas han podido establecerse en ramas

o copas de los árboles hospederos o forofito creando una relación simbiótica para la

germinación de su semilla y desarrollo proporcionando soporte al huésped (orquídea)

sin recibir daño alguno excepto el del ramaje, esta relación simbiótica es obligatoria

para garantizar su supervivencia en los primeros estadios de germinación de su semilla

encontrando alrededor de 4’000.000 semillas diminutas en las cápsulas presentan un

tamaño aproximado de 1-2 mm de largo y 0.05-1 mm de ancho impidiendo almacenar

nutrientes, estas son transportadas por el aire y agua por lo cual son depositadas en la

superficie de los árboles hospederos, para dicha supervivencia necesita establecerse en

un medio adecuado con ayuda de hongos micorrízicos cuya principal función es el

intercambio de nutrientes promoviendo el crecimiento no fotosintéticos del

protocormo y hongos endófitos del hospedero, dónde estudios han demostrado que

estos hongos son organismos que viven en el tejido vegetal sin causar alguna

enfermedad o daño durante su ciclo de vida, cuya característica que los diferencian de

los hongos micorrízicos es que no forma pelotones al interior de las células del huésped

(Ruíz, Moreno, Salgado y Olivera, 2016; Salazar, 2017; Torres-Quintero, 2012).

La presencia de micorrizas favorece la absorción, solubilidad y la disponibilidad de

nutrientes como son el fósforo, zinc, potasio, hierro y calcio permitiendo a su vez la

asimilación del nitrógeno, prolongando así su tiempo de vida, creando una protección

contra posibles daños externos o microrganismos mediante la síntesis de metabolitos,

así mismo por el proceso de colonización la comunidad de hongos micorrízicos

presentes pueden variar dependiendo de las condiciones edáficas y climáticas (Barrer,

2009; León y Romero, 2017). Esta relación entre endófitos, micorrizas y orquídeas se

8

describe comúnmente como mutualista dónde todas las partes obtienen un beneficio

(Ordoñez, 2012).

1.4 Hongos endófitos

El término endófito se deriva del griego endon: dentro y phyte: planta, fue empleado

por primera vez en 1866, es utilizado para referirse a los organismos encontrados

dentro de los tejidos de plantas vivas desde patógenos foliares hasta simbiontes de

raíces micorrizales (Arnold, 2007).

Khiralla, Spina, Yagi, Mohamed y Laurin-Mattar (2016), están de acuerdo en que los

hongos endófitos colonizan raíz, tallos u hojas de las plantas sin causar daño, estos son

una herramienta biotecnológica importante ya que producen metabolitos secundarios,

pero para acceder a esta fuente de moléculas bioactivas es necesario realizar

investigaciones y catalogar las diferentes especies.

En investigaciones anteriores se ha descubierto que los hongos endófitos pueden

favorecer a la protección de su hospedero contra patógenos, herbívoros, estrés térmico

o salino y presencia de metales por tres mecanismos:

Directos: por medio de metabolitos secundarios y enzimas

Indirectos: estimular la expresión de mecanismos de defensa químicos o

fisiológicos a su planta hospedera

Ecológicos: por un nicho ecológico, hiperparasitismo y predación (Sánchez-

Fernández et al., 2013).

9

1.4.1 Clasificación de los hongos endófitos:

Los hongos endófitos han sido frecuentemente divididos considerando sus diferencias

taxonómicas, rango del huésped, patrones de transmisión de colonización,

especificidad de tejido y función ecológica, es así que los han dividido en dos grupos:

endófitos clavicipitáceos (C-endófitos) y los no anticlatos o no clavicipitáceos (NC-

endófitos) (Schaechter, 2011).

1.4.1.1 Endófitos Clavicipitáceos

Los endófitos clavicipitáceos o denominados clase I corresponde a la división de

hongos Hypocreales y Ascomycota involucrando especies de vida libre y de relaciones

simbióticas con insectos, hongos, pastos (Stone, Bacon, & White, 2000). Algunos de

las especies de esta clase produce alcaloides tóxicos para los humanos y animales, el

micelio de los C-endófitos crece en los espacios intercelulares de las vainas de las

hojas, culmos o de los rizomas cuyos efectos en la planta huésped son disuasión de

insectos, herbívoros o mamíferos, reducción de nemátodos y mejora la fisiología de

las plantas huésped (Khiralla et al., 2016).

1.4.1.2 Endófitos no-clavicipitáceos

Los endófitos no clavicipitáceos fueron clasificados de acuerdo a su grupo funcional

en tres clases (clase II, III IV), siendo en su mayoría Ascomicetos y una minoría en

Basidiomicetos (Sánchez-Fernández et al., 2013). El grupo de hongos denominado

endófitos septados oscuros pertenece en su mayoría al filo Ascomicetos, se reconocen

por poseer un grupo funcional basado en la presencia de microesclerosios melanizados

inter e intracelular en la raíz, pueden tener conidios o tener estructuras estériles como

las hifas (Tamayo, 2017).

10

Clase II

Esta clase coloniza los tallos, hojas y rizomas incrementado la biomasa de la planta

proporciona mayor tolerancia al estrés biótico y abiótico, lo protege contra hongos

patógenos por la síntesis de metabolitos secundarios (Sánchez-Fernández et al., 2013).

Clase III

La colonización es limitada por los hongos endófitos de esta clase pero puede colonizar

varios tejidos como tallos, hojas, corteza, flores y frutos lo que genera resistencia a

enfermedades y finalmente por la producción de metabolitos secundarios modifica la

sensibilidad al estrés abiótico (Sánchez-Fernández et al., 2013).

Clase IV

Coloniza solo las raíces de la planta produciendo metabolitos secundarios tóxicos para

los herbívoros e inhibe el crecimiento de patógenos (Sánchez-Fernández et al., 2013).

1.5 Micorrizas/Hongos micorrízicos

El término proviene de los vocablos griegos mike: hongo y rhiza: raíz o raíz fúngica,

fue empleado por primera vez en 1885, son microorganismos presentes en el suelo que

establecen simbiosis en un 80 % con plantas terrestres formando arbúsculos, vesículas

o hifas dentro de las células corticales de la orquídea (Barrer, 2009).

1.5.1 Micorrizas de orquídeas

La micorriza orquidioide se caracteriza por la asociación simbiótica entre los

miembros del género-forma Rhizoctonia y la raíz de las orquídeas, dónde el hongo

forma una estructura denominada “pelotón” en las células corticales de la raíz

resultando un enrollamiento hifal, ocupando el espacio intracelular; la clasificación del

género depende del número de células de las hifas jóvenes que pueden ser uni, bi y

11

multinucleadas, los principales géneros micorrízicos presentes en orquídeas

pertenecen al grupo Rhizoctonia que lo conforman Ceratobasidium, Sebacina,

Thanatephorus y Tulasnella; este grupo pertenece a la división Basidiomycota

(Mosquera, Bayman y Otero, 2010).

El género-forma Rhizoctonia reúne a hongos filamentosos heterogéneos que no

generan esporas sexuales y tienen pocas características morfológicas, por lo que se

necesita usar técnicas moleculares para su correcta identificación; ciertos géneros

crecen en materia orgánica en descomposición comportándose como saprobios

(González, 2008). En su etapa asexual presentan un micelio blanco en coloneas

jóvenes, en un lapso de diez días sus células se ramifican, su coloración se torna

amarillo o café claro en colonia de 20 días, además se forman ramilletes de células

cortas y anchas de forma oval o triangular denominadas células monilioides

consiguiendo formar esclerocios, en cambio en la etapa sexual se observa otras

características en los géneros Ceratobasidium, Sebacina, Thanatephorus y Tulasnella

diferenciándose por los basidiocarpos dónde se producen las basidiósporas (Cando y

Cárdenas, 2017).

1.5.2 Clasificación de hongos micorrízicos

1.5.2.1 Endomicorrizas

Son micelios sin tabicación que penetra las células del córtex de la raíz permitiendo

generar un contacto más directo, así mismo pueden ingresar en el interior de las células

formando vesículas como órganos de reserva por lo que no son específicas, pueden

colonizar a diferentes especies por su fácil adaptación al medio ambiente y

comprenden los hongos Zigomicetos del orden Glomales (Franco, 2002).

12

1.5.2.2 Ectomicorrizas

La característica de este tipo de micorriza es que el hongo crece alrededor de la raíz de

la planta sin penetrar sus células formando una red denominada manto fúngico, el

hongo secreta hormonas que provoca la ramificación de la raíz adoptando un aspecto

esponjoso (Guamán y Ochoa, 2011).

1.6 Técnicas moleculares para la identificación

1.6.1 Extracción de ADN

La extracción del ácido desoxirribonucleico (ADN) es el proceso mediante el cual, el

ADN se separa de las proteínas, las membranas y otros materiales celulares presentes

en la célula, la mayoría de los procedimientos de extracción de ADN sigue tres pasos:

romper la células, separar el ADN de los demás componentes y aislar el ADN (Elkins,

2013).

1.6.2 Reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una reacción enzimática que

amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN, se amplifica en tres

etapas: desnaturalización, hibridación y extensión, los elementos requeridos para la

reacción son: la enzima, oligonucleótidos o primers, desoxirribonucleótidos trifosfatos

(dNTPs), ion magnesio (Mg +), buffer y H2O, la reacción aprovecha la actividad de la

enzima ADN-polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN de

las células (Tamay-de-Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013).

Los primers utilizados para la amplificación del ADN cloroplástico presente en las

plantas es denominado matK, mientras que para la amplificación del ADN ribosómico

nuclear encontrado en los hongos se empleó los espaciadores transcriptos internos

(ITS).

13

1.6.2.1 Región matK

El gen matK del cloroplasto codifica para una enzima denominada maturasa que

colabora a la conformación y maduración de un ARN de transferencia, está ubicado

dentro del intrón trnK en el genoma con una longitud máxima de 1500 pb, tiene una

alta tasa de sustitución, se conserva en la sistemática de la planta que está involucrada

en el empalme de intrones del Grupo II, por estas condiciones es utilizado como

marcador molecular en estudios de filogenia entre varias especies (Vu, Le, Nguyen,

Tran, & Tran, 2018).

Kar, Goyal y Sen (2015), menciona en su investigación que la combinación de los dos

locus rcbL y matK como código de barras estándar para estudios filogénicos en plantas

permite obtener resultados favorables en niveles de discriminación de especies

basados en la calidad de secuencias.

1.6.2.2 Región ITS

La región espaciadora transcrita interna ribosómica nuclear (ITS) es el marcador

molecular universal para hongos por su facilidad de amplificación y alto contenido de

información, corresponde a las secuencias que intercalan secuencias codificantes para

la región ribosomal 16 S, 5.8 S y 26 S, cuya extensión varía entre 500 a 750 pb,

obteniendo excelentes resultados en la amplificación por poseer una herencia

biparental para estudios filogenéticos, se ha confirmado que determinadas secuencias

del ADN ribosómico nuclear sirven para clarificar los límites y la identidad de las

especies en hongos, siendo regiones candidatas a convertirse en códigos de barras

genéticos por su variabilidad y porque son más susceptibles de acumular mutaciones

(Fuertes y Mallitasig, 2018).

14

White, Bruns, Lee y Taylor (1990) citado por Saltos (2012), menciona que en 1990 se

diseñó los iniciadores específicos para amplificar, secuenciar fragmentos de ADNr

mitocondrial y nucleico de hongos denominándolos primer ITS 1 e ITS 4, en la

actualidad son útiles para estudios de identidad y de problemas taxonómicos por ser

universales para todas las especies fúngicas al obtener un alto número de copias en el

proceso de amplificación con resultados confiables.

1.6.2.3 Electroforesis

Es una técnica empleada en la separación de fragmentos de ADN en base a su carga y

tamaño, consiste en la migración de partículas o moléculas cargadas en un campo

eléctrico, es así que las moléculas con cargas diferentes forman zonas individuales

mientras migran para mantener la difusión, esta técnica se lleva a cabo en un medio

anticonvectivo con un fluido viscoso y una matriz de gel, por lo tanto, el

fraccionamiento de una mezcla de sustancias se logra con alta resolución

(Westermeier, 2005).

1.6.3 Secuenciación Sanger

La secuenciación del ADN consiste en determinar la posición de las bases nitrogenadas

(adenina, timina, guanina y citosina) que forman la molécula de ADN, (Instituto

Nacional de Investigación del Genoma Humano, 2015). Este método fue desarrollo

por Frederick Sanger y sus colegas en 1977, por ello se denominó Secuenciación

Sanger también conocida como dideoxinucleótidos que consiste en sintetizar una

hebra de ADNc a una hebra simple necesitando ADN polimerasa, los cuatro 2`-

deoxinucleótidos que componen la secuencia de ADN (dATP, dGTP, dCTP y dTTP)

y cuatro dideoxinucleótidos marcados (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP), dónde estos

últimos nucleótidos permiten la adición del nucleótido consecutivo (Garrigues, 2017).

Este método consiste en tres pasos:

15

Primer paso:

Reside en crear “n” fragmentos de ADN de diferentes longitudes, cada uno

terminado con un nucleótido marcado, dónde n es el número de bases de

nucleótido en la secuencia de ADN (Sigma-Aldrich, 2019).

Segundo paso:

Consiste en separar “n” secuencias de ADN en la electroforesis en un gel

capilar, dónde los fragmentos cortos migran más rápido que los fragmentos

largos y cuyo resultado son piezas de ADN (Sigma-Aldrich, 2019).

Tercer paso:

Finalmente un láser excita la etiqueta del nucleótido al final de cada secuencia,

por lo que la luz emitida por cada nucleótido excitado puede unirse a la base

correcta y genera un cromatograma con picos de los nucleótidos en el orden

correcto de la secuencia (Sigma-Aldrich, 2019). Con el fin de que la secuencia

resultante permita dar a conocer a los investigadores la clase de información

genética de un segmento específico de ADN (Instituto Nacional de

Investigación del Genoma Humano, 2015).

16

Capítulo 2

2. Metodología

2.1 Área de estudio de la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan.

Se ubicaron cuatro puntos de recolección distribuidos en los cantones Pedro Moncayo,

Mejía y Rumiñahui perteneciente a la Provincia de Pichincha. Ver Tabla 1.

Tabla 1

Puntos de recolección de las muestras de la especie Caucaea pichinchae Szlach. &

Kolan con sus coordenadas geográficas (UTM)

Cantón Lugar de

recolección Coordenadas geográficas Altitud

Mejía

Aloasí 0°29'48.1"S 78°34'05.7"W 2800

Pasochoa 0º28'24.6''S 78º31'01''W 3100

Pedro

Moncayo Cochasquí 0°04'35.4"N 78°14'39.3"W 2900

Rumiñahui Rumipamba 0º29'10.5''S 78º26'05.1''W 3000

Elaborado por: Las Autoras, 2019

2.2 Recolección de las muestras del género Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan.

con su respectivo hospedero

Las muestras fueron recolectadas en un rango altitudinal de 2800 a 3100 m.s.n.m.,

cuyas formaciones vegetales de acuerdo a la información del Ministerio del Ambiente

del Ecuador (2013), corresponden a Bosque montano pluviales de los Andes del Norte

y los Bosques altimontanos norte-andinos siempreverdes. En los puntos seleccionados

se recolectaron muestras completas de individuos silvestres de la especie Caucaea

pichinchae Szlach. & Kolan, incluyendo un segmento del tallo de su hospedero que

contienen a los respectivos hongos endófitos, los cuales fueron almacenados y

transportados en cajas de plástico apilables al Laboratorio de Ciencias de la Vida de la

Universidad Politécnica Salesiana. Ver Anexo 1.

17

Posteriormente se extrajo el tejido vegetal de hoja, tejido de raíz de las orquídeas y

segmento del tallo de los hospederos para su respectivo análisis, cada muestra fue

almacenado en sobres de papel y etiquetados con el código asignado en el libro de

campo de Marco Cerna 2017. Ver Tabla 2.

Tabla 2

Listado de las muestras colectadas

Especie Código Lugar de colección

Caucaea pichinchae Szlach. &

Kolan 3805

Aloasí

Hospedero 3805 3T


Kolan 3806

Hospedero 3806 4T


Kolan 3807

Hospedero 3807 5T


Kolan 3994

Cochasquí

Hospedero 3994 3994-T


Kolan 3995

Hospedero 3995 3995-T


Kolan 4087

Pasochoa

Hospedero 4087 4088


Kolan 4091

Hospedero 4091 4092


Kolan 4095

Hospedero 4095 4096


Kolan 4106

Cuenca Alta

del

Río Pita

Hospedero 4107 4107


Kolan 4110

Hospedero 4110 4111


18

2.3 Aislamiento de hongos provenientes de tallos y raíz

Todo el procedimiento de aislamiento de hongos se realizó dentro de la cámara de flujo

laminar Forma Scientific logrando de esta manera un ambiente aséptico. El proceso

inicia con la preparación del medio de cultivo.

2.3.1 Preparación del medio de cultivo PDA

El medio de cultivo empleado fue Potato Dextrosa Agar (PDA) óptimo para el

crecimiento de hongos, cuya preparación consistió en añadir 39 g de PDA en 1 litro de

agua destilada, se esterilizó a 121 ºC durante 15 minutos, técnica descrita por Neogen

(2015). Finalmente se colocó 25 mL de medio de cultivo PDA en cada caja Petri las

cuales fueron selladas con Parafilm y almacenadas a -4 ºC.

2.3.2 Protocolo de desinfección de las muestras

Desinfección de las muestras de tallo

Las muestras de tallos recolectados fueron cortados en segmentos de 1 a 2 cm, se

colocaron en tubos Falcon® de 50 mL, teniendo cada muestra una solución de

penicilina 20 ppm durante 48 horas a una temperatura de 24 °C técnica descrita por

Hoyos y Rodríguez (2013). A continuación los tallos fueron desinfectados siguiendo

el protocolo para aislamiento de hongos endófitos detallada por Deng y colaboradores

(2011), en el cual las muestras fueron lavadas en etanol al 95 % durante 1 minuto,

sumergidas en hipoclorito de sodio 4 % durante 3 minutos, etanol al 95 % durante 30

segundos y finalmente las muestras fueron lavadas en agua destilada estéril tres veces

Ver Anexo 2.

19

Desinfección de las muestras de raíz

Las muestras de raíz fueron cortadas en segmentos de 1 cm, se las colocó en tubos

Eppendorf de 1.5 mL con una solución de penicilina, técnica descrita por Hoyos y

Rodríguez (2013). A continuación las raíces fueron desinfectados siguiendo el

protocolo descrito por Otero, Ackerman y Bayman (2002), en el cual las muestras

fueron lavadas con agua destilada estéril por 2 minutos, alcohol al 70 % por 2 minutos,

agua destilada estéril por 2 minutos, hipoclorito de sodio al 3 % por 1 minuto y

finalmente agua destilada estéril por 2 minutos Ver Anexo 3.

2.3.3 Siembra de las muestras y aislamiento de hongos

Las muestras de raíz desinfectadas se cortaron en segmentos de 5 mm, a su vez las

muestras desinfectadas de tallo se cortaron en fragmentos de 10 mm, para cada muestra

se dividió longitudinalmente en 4 segmentos, distribuyéndolos en cada caja Petri con

medio de cultivo PDA, una vez realizadas las siembras se almacenaron en una

incubadora Memmert a 26 °C, aproximadamente a los ocho días se visualizó la

presencia y desarrollo de micelios, realizando subcultivos de los hongos obtenidos

mediante el uso de agujas hipodérmicas estériles para conseguir material fúngico puro

y homogéneo, asignando a cada subcultivo de la muestra un código, técnica descrita

por Fuertes-Flores, Mallitasig-Quishpe, Cerna-cevallos y Gutiérrez (2018) Ver Anexo

4.

2.4 Identificación morfológica de los subcultivos aislados de tallo y raíz

A partir de la obtención de lo subcultivos puros procedentes de las muestras de tallo y

raíz se obtuvo una muestra de los micelios y conidios de cada subcultivo usando una

cinta adhesiva, los cuales fueron colocados en un portaobjetos que contenía una gota

de azul de lactofenol para este procedimiento se utilizó mecheros bunsen, finalmente

20

se procedió a tomar fotos como evidencia para la identificación microscópica, técnica

descrita por Fuertes-Flores y colaboradores (2018).

2.5 Identificación molecular

2.5.1 Extracción de ADN del material fúngico

En la cámara de flujo laminar se tomó aproximadamente 50 mg de material fúngico de

las cepas aisladas en tubos eppendorf, en los cuales se realizó la extracción de ADN

bajo la adaptación de la técnica descrita por Paredes y Yugsi (2016), que consistió en:

añadir 500 µL de buffer de lisis, se incubó en el termobloque AccuBlockTM por 20

minutos a 37 °C, se agregó 500 µL de fenol cloroformo a 4 °C, se homogenizó por 5

minutos, se centrifugó a 13000 rpm por 30 minutos, se trasladó la fase acuosa a un

nuevo tubo de 1.5 mL, se añadió 400 µL de cloroformo a -20 °C, se centrifugó a 13000

rpm por 5 minutos, el sobrenadante se transfirió un nuevo tubo de 1.5 mL, se añadió

500 µL de isopropanol a 4°C, se almacenó las muestras a -20 °C por 15 minutos, se

centrifugó por 5 minutos a 13000 rpm, se desechó el sobrenadante, se colocó 500 µL

de etanol al 70 % a -20 °C, se centrifugó por 5 minutos a 13000 rpm, se desechó el

sobrenadante obteniendo un pellet, se secó la muestra en un termobloque Labnet

durante 35 minutos a 37 ºC, se agregó 50 µL de TE (Tris-EDTA) y almacenó a -20 °C.

Se comprobó la presencia o ausencia de ADN mediante la técnica de electroforesis en

gel de agarosa al 1 % con 5 µL de SYBR® Safe DNA Gel Stain por cada 50 mL de TBE

1X (TBE 10X: Tris base 54 g, ácido bórico 27.5 g y 2.93 g de EDTA 0.5 M).

Cada muestra se preparó con 4 µL de ADN, 4 µL de tampón de carga 2X Blue Juice y

se corrió a 90 voltios por 45 minutos en la cámara de electroforesis Labnet, técnica

descrita por Lee, Costumbrado, Hsu y Kim (2012). El gel se visualizó en un

fotodocumentador Bio-imaging systems ® Ver Anexo 5.

21

2.5.2 Amplificación del ADN cloroplástico y ribosómico nuclear

Para la identificación de las orquídeas se amplifico el ADN cloroplástico usando los

primers matK 2.1a. (F) (5ÁCCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3´) y matK

2.1a. (R) (5ĆGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3´), para los hongos de raíz y

tallo se usó los primers ITS 1 (F) (5ĆCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) e ITS 4 (R)

(5´TCCTCCGCTTATTGATATGC3´).

La técnica PCR se desarrolló en un termociclador MultiGene™ OptiMax Thermal

Cycler, se utilizó el Kit Phire Plant Direct PCR Master Mix de Termo Fisher

Scientific, las muestras fueron preparadas en tubos de PCR 0.2 mL Ver Tabla 3.

Tabla 3

Preparación de la disolución para PCR con el Kit Phire Plant Direct PCR Master

Mix

Reactivo/Concentración Cantidad para 1 muestra (µL)

Agua libre de ARNasas 9.75

Disolution Buffer 1.25

Primer Forward (10µM) 0.5

Primer Reverse (10µM) 0.5

Phire Plant Direct PCR Master Mix 12

ADN

1uL ADN (ITS)

3 punch (matK)

Volumen total 25

Fuente:(Thermo Fisher Scientific, 2018)

Las condiciones de temperatura para la amplificación del ADN ribosómico nuclear y

cloroplástico respectivamente, se detalla en la Tabla 4.

22

Tabla 4

Condiciones de temperatura para la amplificación del ADN cloroplástico y

ribosómico nuclear

Etapas/Condiciones

Temperatura

para matK

(ºC)

Tiempo Temperatura

para ITS (ºC) Tiempo

Desnaturalización

inicial 94 1 minuto 94 1 minuto

Desnaturalización

final 94

30

segundos 94

30

segundos

Hibridación 53 40

segundos 56 1 minuto

Extensión inicial 72 40

segundos 72

40

segundos

Extensión final 72 5 minutos 72 5 minutos

Fuente: (Iza, 2018; Montalvo y Vargas, 2019)

Los resultados de PCR fueron evidenciados mediante la técnica de electroforesis

horizontal en gel de agarosa al 1 % teñido con el fluoróforo SYBR® Safe bajo las

condiciones descritas por Thermo Fisher Scientific (2018), dónde cada pocillo del gel

se inóculo con 2 µL de producto de PCR y para el marcador Ladder Express DNA se

colocó 2 µL, una vez cargadas las muestras en la cámara de electroforesis se programa

la cámara a un voltaje de 90 voltios a 40 min. Por último el gel fue revelado en un

fotodocumentador de acuerdo a lo descrito por Iza, (2018); Montalvo y Vargas (2019).

2.5.3 Secuenciación

Se diluyó al producto de PCR a una concentración 20 ng/µL con agua libre de

ARNasas obteniendo un volumen final de 20 µL, dispensado en un tubo eppendorf de

1.5 mL respectivamente etiquetados, envueltos con Parafilm, finalmente fueron

23

empaquetados en fundas ziploc al vacío, para su purificación y secuenciación mediante

la técnica Sanger Automatizada en la empresa Macrogen Inc. (Seoul, Korea).

2.5.4 Análisis de las secuencias

Se analizó la calidad de las secuencias obtenidas de la amplificación de la región matK,

e ITS mediante el programa FinchTV versión 1.4.0 Ver Anexo 6. Posteriormente se

utilizó la herramienta BLAST (Basic Local Aligment Search Tool) de GenBank para

determinar el grupo taxonómico más cercano, técnica descrita por Iza (2018).

Filogenia

Las secuencias obtenidas de la región matK y la región ITS fueron alineadas con el

programa Muscle del programa Mega 7, elaborando un árbol filogenético mediante el

método Neighbor-joining, con el propósito de determinar la familiaridad entre las

especies aisladas, técnica descrita por Fuertes-Flores y colaboradores (2018).

Se eligió como grupo externo para la región matK a la especie Caucaea phalaenopsis

y para la región ITS se optó por la especie Tremella flava y Penicillium glabrum, las

secuencia fueron descargadas del banco de datos GenBank, permitiendo compararlas

con las secuencias obtenidas para verificar el correcto alineamiento de las secuencias

analizadas, de acuerdo a lo descrito por Carrión (2009).

24

Capítulo 3

3. Resultados y discusión

3.1. Recolección de las muestras del género Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan

con su respectivo hospedero

Se recolectaron 10 individuos completos y fértiles de la especie Caucaea pichinchae

Szlach. & Kolan. en los cuatro puntos seleccionados: Aloasí 3 muestras, Cochasquí 2

muestras, Pasochoa 3 muestras y Rumipamba 2 muestras, además se recolectó 10

muestras de tallo de la especie hospedera Oreopanax ecuadoriensis “Pumamaqui”.

Los especímenes fueron identificados en base a su morfología, utilizando como

referencia el texto: “STUDIES IN THE GENUS ONCIDIUM. I” de Stacy (1975) y, la

muestra de Cuamacas y Gudiño 667 (2000) referida en Tropicos (2019) Ver Figura 2.

Identificación Taxonómica

Figura 2 Identificación taxonómica de la especie de estudio y su hospedero

Nota: a y b: Oreopanax ecuadoriensis Seem. “Pumamaqui” (a: archivos Tropicos, y b fotografía

tomada por las autoras, 2019); c, d y e: Caucaea pichinchae Szlach & Kolan (c: archivos Trópicos,

d y e fotografía tomada por las autoras, 2019)


b c d e a

25

Los rangos de altitud de recolección de las muestras de este estudio fueron de 2800 a

3100 m.s.n.m., coincidiendo con la altura de colección de 3000 m.s.n.m., registrada en

la muestra de herbario de Cuamacas y Gudiño N.º 667 del 2000, imagen almacenada

en la base de datos Tropicos (2019). Además, se evidenció que la especie en estudio

se encuentra en las ramas del hospedero,

3.2. Aislamiento de hongos de tallo y raíz

Se aislaron 30 subcultivos de hongos endófitos de tallos pertenecientes a la especie

hospedera Oreopanax ecuadoriensis Seem Ver Tabla 5, y 22 subcultivos de hongos

puros obtenidos de las raíces de la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan, ver

Tabla 6. Se aislaron hasta cuatro especies de hongos endófitos de cada muestra de tallo

del hospedero, al igual que de las muestras de raíces, al respecto Salazar (2017), logró

identificar hasta diez especies de hongos endófitos en orquídeas epífitas; mientras que

para la muestras de raíces de orquídeas Hoyos y Rodríguez (2013), también aislaron

una especie de hongo micorrízico para cada uno de los géneros Oncidium,

Pleurothallis, Stelis, Prostechea y Epidendrum, por otra parte, Pecoraro, Huang,

Caruso, Perotto, Girlanda, Cai y Liu (2017), en su investigación del género

Cephalanthera aislaron hasta 9 taxones de hongos presentes en sus raíces.

26

Tabla 5

Subcultivos de los hongos endófitos aislados de las muestras de tallo

Lugar de

recolección

Código de

hospedero Subcultivos

Aloasí

3T 3T-1

3T-2

4T 4T-1

4T-2

5T

5T-1

5T-2

5T-3

5T-4

Cochasquí

3994T 3994-1

3994-2

3995T

3995-1

3995-2

3995-3

Pasochoa

4088

4088-1

4088-2

4088-3

4088-4

4092

4092-1

4092-2

4092-3

4092-7

4096

4096-1

4096-2

4096-3

4096-4

Cuenca Rio Pita –

Rumipamba

4107 4107-1

4111

4111-1

4111-5

4111-6

4111-9


Nota: En la muestra codificada con 4107 se aisló un solo hongo, en las muestras codificadas con 3T, 4T

y 3994T se evidenciaron dos hongos en cada muestra y para el resto de las muestras presentaron más

de 3 hongos aislados.

27

Tabla 6

Subcultivos de hongos aislados de las muestras de raíz

Lugar de recolección Código de

raíz Subcultivos

Aloasí

3805 3805-A

3806 3806-C

3806-F

3807

3807-A

3807-B

3807-C

Cochasquí

3994 3994-B

3995 3995-B

Pasochoa

4087

4087-A

4087-B

4087-C

4087-D

4091 4091-A

4095

4095-A

4095-C

4095-D

4095-F

Cuenca Rio Pita –

Rumipamba

4106 4106-C

4110

4110-A

4110-B

4110-C

4110-D


Nota: En las muestras codificadas con 3805, 3994, 3995, 4091 y 4106 se aisló un solo hongo, en la

muestra codificada con 3806 se evidenciaron 2 hongos en cada muestra y para el resto de las muestras

presenta más de 3 hongos aislados.

28

3.3. Identificación morfológica de los hongos aislados

De las diez muestras de la especie Oreopanax ecuadoriensis se aislaron 30 subcultivos

de hongos endófitos de los cuales se identificaron 25 morfotipos a nivel morfológico

y molecular. Ver Tabla 7. A su vez, de los diez individuos de la especie Caucaea

pichinchae se aislaron 22 subcultivos de los cuales se identificaron 18 morfotipos a

nivel morfológico y molecular Ver Tabla 8. Mosquera, Bayman y Otero (2010),

mencionan que los hongos en cultivos artificiales no pueden esporular, dificultando su

identificación por lo cual se los agrupan en morfotipos y la mayoría de los hongos que

crecen en medios de cultivo no presentan diferencias morfológicas macroscópicas o

microscópicas visibles, por ello, es necesario identificarlos por técnicas moleculares.

29

Tabla 7

Estructuras macroscópicas y microscópicas de hongos aislados de tallos en medio

PDA

Vista macroscópica /

Secuencia

Vista microscópica/

Taxonomía

3T-1

SECUENCIA: MARCADOR MOLECULAR ITS 1 e ITS 4

ATAAGGGTGGAGAGACCACTCCCAACCCATGTGAACATACCTACTGTTGCTTCGGCGGGATTGCCCC

GGGCGCCTCGTGTGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCTAGGAAACTTAACTCTTGTTTTATTTTGGAATCT

TCTGAGTAGTTTTTACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAA

GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACG

CACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGATCGGCCAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGAC

CCGTCGTGGCCTCCTCTGCGAAGTAGTAATATTCCGCATCGGACAGCGACGAGCCCCTGCCGTTAAA

CCCCCA

Familia: Bionectriaceae

Especie: Clonostachys solani


Secuencia


Taxonomía

3T-2


TGGCTTCGCGGCCGGCTGAAATATTTTTTCACCCATGTCTTTTGCGCACTTGTTGTTTCCTGGGCGGG

TTCGCCCGCCACCAGGACCAAACCATAAACCTTTTTCTTATGCAGTTTCCATCAGCGTCAGTAAAAACAATGTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAA

ATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCT

TTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCTTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCG

TTTTTGTCTCCCTCTTTCTGGGAGACTCGCCTTAAAACGATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGC

GCAGCACATTTTTTGCGCTTTGTATCAGGAGAAAAGGACGGTACTCCATCAAGACTTTTACAATTTTA

ACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAAGCGGGAGGAG

Orden: Pleosporales

Familia: Pleosporaceae

Especie: Bipolaris sp.


Secuencia


Taxonomía

4T-1


GGAGGAGGTCCTCGGGGTCCACCTCCCACCCGTGTTTAACGAACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCC

TCACGGCCGCCGGGGGGCATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCCACCTGTGAACGCTGTCTG

AAGTATGCAGTCTGAGACAATTATTAAATTAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGC

ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGT

CTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTC

CAGCCCGGCTGGTGTGTTGGGCCCCGCCCCCCTTCCCAGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGG

CACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTTGTAGGCCCGGCCGGCGTCAGC

CGACCCCCTCAATCTATTTTTTCAGGTTGA

Orden: Eurotiales

Familia: Trichocomaceae

Especie: Penicillium waksmanii

30


Secuencia


Taxonomía

4T-2


CGAGTGCGGCTGCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCTTGACTACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGG

AGCCCTCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGTC

TGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAG

CGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCG

CCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTG

TTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGA

GCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGATTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGACGTCTCCAACCATTT

TTTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATA

Orden: Eurotiales

Familia: Hypocreaceae

Especie: Trichoderma sp.


Secuencia


Taxonomía

5T-1


ACATCGCGTAGTTCGTCGGGGTCGCTCCCAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGG

GGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTT

TTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTT

TCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAAT

TGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATG

CCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCC

CTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTT

GCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACC

TCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAAAGGGGG



Secuencia


Taxonomía

5T-2


ATTATTAAATTAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCG

AAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCC

CTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCCAGCCCGGCTGGTGTGTTGG

GCCCCGCCCCCCTTCCCGGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAG

CGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTTGTAGGCCCGGCCGGCGTCAGCCGACCCCCTCAATCTATTTTT

TCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGACGGAGGATG

A

Orden: Eurotiales


Especie: Penicillium ubiquetum

31


Secuencia


Taxonomía

5T-3


GTAACAAAGGAGTAAATCTCCCAACCCGTGTGAACATACCTACTGTTGCTTCGGCGGGATTGCCCCG

GGCGCCTCGTGTGCCCCGGATCAAGCGCCCGCCTAGGAAACTTAACTCTTGTTTTATTTTGGAATCTT

CTGAGTAGTTTTTACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAG

AACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGC

ACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAG

GGCGTGGTGTTGGGGATCGGCCAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACC

CGTCGTGGCCTCCTCTGCGAAGTAGTAATATTCCGCATCGGACAGCGACGAGCCCCTGCCGTTAAAC

CCCCAACTTTCCAAGGTTGAC

Orden: Hypocreales


Especie: Clonostachys solani


Secuencia


Taxonomía

5T-4


TCTTGGTTGTAGCTGGCTCCTCGGAGCAATGTGCACGCCCGCCATTTTTATCTTTCCACCTGTGCACC

GACTGTAGGTCTGGATACCTCTCGCCCTAGGGCGGATGCGAGGGTTGCTCGTAAGGGCTCCCCTCGA

ACTTCCAGGCTCTACGTCTTTTTACACACCCCAATAGTATGATGCAGAATGTAGTCAATGGGCTTCTA

AGCCTATAAAACACTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAG

CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCG

CTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAACCTCACCAGTTTTCTGA

ACTGGACGAGGCTTGGATGTGGGGGTTTGTGCAGGCTGCCTCACGGCGGTCTGCTCCCCTGAAATGC

ATTAGCGAGGTTCATGCTGAACTTCCGTCTATTGGTGTGATAATTATCTACGCCGTGGACGAGGATC

AGACTCGCTTCTAACCGTCCGCGAGGACAATACCTTGACAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTAC

CCGCTGAACTTAAGCATATCTAAACG

Agaricaceae sp.


Secuencia


Taxonomía

3994-1


GCCCTTCGGGGTGCCCGCCGGTGGCTTACGTAAACTCTTTTGTATTTTAGTGGACTCTCTGAGAAAAC

AAGCAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA

AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCC

GCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCTGCTTGGTGTTGGGG

TCCTACGGCTGCCGTAGGCCCTGAAAGCTAGTGGCGGGCTCGCTACAACTCCGAGCGCAGTAATGTA

TCTCGCTAGGGAAGTGTTGCGGGTTCCGGCCGTTAAACCCCCCAATTTTAACAAGGTTGACCTCGGA

TCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA

Especie: Coniochaeta sp.

32


Secuencia


Taxonomía

3994-2


GGAGGTGCGCTCCAAGCCCCCCGGTGGACCGCTAAATTCTATTTTAATACTGTATCTCTGAATGCT

TCAACGTAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAG

CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTG

CGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTATTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTCAGCTGCT

TAGCGTTGGGAATCTGCCCTGTATTTATAGGGCAGTTCCTTAAAGTGATTGGCAGAGTTAGGGCA

TACTCTAAGCGTAGTACTATTCTTCTCGCTTTTGTAGTTGTCCTGGCGGCTTGCCGTTAAAACCCTT

ATATTTCTCGTGGGTGACCTCGGATTAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGG

CGGAGGA

Especie: Daldinia sp.


Secuencia


Taxonomía

3995-1


TCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGG

GTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAA

TAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA

TAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTCGCCCTTTGGT

ATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCT

TGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCG

CAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGA

CCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT

Orden: Pleosporales


Especie: Alternaria alternata


Secuencia


Taxonomía

3995-2


TCTTGGTTGTAGCTGGCTCCTCGGAGCAATGTGCACGCCCGCCATTTTTATCTTTCCACCTGTGCA

CCGACTGTAGGTCTGGATACCTCTCGCCCTAGGGCGGATGCGAGGGTTGCTCGTAAGGGCTCCCC

TCGAACTTCCAGGCTCTACGTCTTTTTACACACCCCAATAGTATGATGCAGAATGTAGTCAATGG

GCTTCTAAGCCTATAAAACACTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATG

AAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG

AACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAACC

TCACCAGTTTTCTGAACTGGACGAGGCTTGGATGTGGGGGTTTGTGCAGGCTGCCTCACGGCGGT

CTGCTCCCCTGAAATGCATTAGCGAGGTTCATGCTGAACTTCCGTCTATTGGTGTGATAATTATCT

ACGCCGTGGACGAGGATCAGACTCGCTTCTAACCGTCCGCGAGGACAATACCTTGACAATTTGAC

CTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCTAAACG

Orden: Agaricales

Familia: Psathyrellaceae

Especie: Coprinellus radians

33


Secuencia


Taxonomía

3995-3


CCTTAACGGGGGCGCCGCAGCCCTGCCTCTCCGGAGGTTCGGGGCGCCCGCCGGAGGTACGAAACT

CTGTATTATAGTGGCATCTCTGAGTATAAAACAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGG

TTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATC

ATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGGTAGTACTCTACCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTC

AACCCTCAAGCCCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACGGCTGCCGTAGGCCCTGAAAGGAAGTGGCGGGC

TCGCTACAACTCCGAGCGTAGTAATTCATTATCTCGCTAGGGAGGTTGCGGCGTGCTCCTGCCGTTA

AAGACCCATCTTTAACCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA

Especie: Scytalidium sp.


Secuencia


Taxonomía

4088-1


TGCGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCTTCTGCCCCCGGGTCCGCGCGCACCGGAGACACTATTGA

ACTCTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGCATAAACTAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT

GGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAA

TCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATT

GCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCCGTCCCCCCGGGGACGGGTCCGAAAGGCAGCGGC

GGCACCGAGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCAG

CCGACAACCAATCATCCTTTTTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGC

AT

Orden: Eurotiales


Género: Penicillium glabum


Secuencia


Taxonomía

4088-2


CTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACC

AAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGG

CGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAG

CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCG

CCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGT

CGGCGTTGGGGATCGGCCCTCCCTTAGCGGGGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGGCTCGCCGCAG

CCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCC

AACTTCTGAAATGGTGACCTCGGATCAGGGAAGAATACCCGCTGAACTTA

Orden: Hypocreales


Especie: Trichoderma inhamatum

34


Secuencia


Taxonomía

4088-3


GTCTTGGTTGTAGCTGGCTCCTCGGAGCAATGTGCACGCCCGCCATTTTTATCTTTCCACCTGTGCAC

CGACTGTAGGTCTGGATACCTCTCGCCCTTCACGGGGCGGATGCGAGGGTTGCTCGTAAGGGCTCCC

CTCGAATTTCCAGGCTCTACGTCTTTTTACACACCCCAATAGTATGATGTAGAATGTAGTCAATGGGC

TTCATAGCCTATAAAACACTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAA

CGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACC

TTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAACCTCACCAGTTT

TCTGAACTGTTCTTCGAGGCTTGGATGTGGGGGTTTGTGCAGGCTGCCTCGCGGCGGTCTGCTCCCCT

GAAATGCATTAGCGAGGTTCATGCT

Orden: Agaricales


Especie: Coprinellus radians


Secuencia


Taxonomía

4088-4


TCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCA

AAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGC

GTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC

GAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC

CCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTC

GGCGTTGGGGATCGGGCCTCCCTTAGCGGGGG

Orden: Hypocreales


Especie: Trichoderma inhamatum


Secuencia


Taxonomía

4092-1


TCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCA

AAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGC

GTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC

GAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC

CCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTC

GGCGTTGGGGATCGGGCCTCCCTTAGCGGGGG


35


Secuencia


Taxonomía

4092-2


CCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAG

CAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGC

AGCGAAATGCGATAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGC

GCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGT

CCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCC

GCAGCCTCTCATGCGCA

Orden: Hypocreales


Especie: Trichoderma viride


Secuencia


Taxonomía

4092-3


CAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAG

CTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGA

AGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAAC

GCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCC

TCCGGGGGTCCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGC

GGTCTCGCCGCAGCCTCTCATGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACG

TCCGTAAAAACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCA

TAT

Orden: Hypocreales


Especie: Trichoderma trixae


Secuencia


Taxonomía

4092-7


CAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAG

CTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGA

AGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAAC

GCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCC

TCCGGGGGTCCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGC

GGTCTCGCCGCAGCCTCTCATGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACG

TCCGTAAAAACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCA

TAT

Orden: Hypocreales


Especie: Trichoderma olivascens

36


Secuencia


Taxonomía

4096-1


ACGGGCCGCCCCCGCCAGAGGACCCCTAACTCTCTGTTGCTATGTGTGTTTTTCTGAGTAAAACAAG

CAAATAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG

CGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCA

GTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGG

ATCGGCGAGGCGCCCCCTGCGGGCACGCGCCGTCCCCCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTC

CATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCACTGGAGAAGCGGCGCGGCCATGCCGTGAAACACCCAACTTC

TGAATGGTGACCTCGAATCAGGGAGGAATACCCGCTGAACTTA

Orden: Hypocreales

Familia: Nectriaceae

Especie: Fusarium solani


Secuencia


Taxonomía

4096-2


CCCCTAACTCTCTGTTGCTATGTGTGTTTTTCTGAGTAAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACA

ACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGA

ATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTC

GAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCGGCGAGGCGCCCCCTGCGGG

CACGCGCCGTCCCCCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTC

GCACTGGAGAAGCGGCGCGGCCATGCCGTGAAACACCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGAATCAGG

GAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA

Orden: Hypocreales


Especie: Fusarium solani


Secuencia


Taxonomía

4096-3


TTGGGCAGTCGCTGGCTCCTCGGAGCAGTTGTGCACGCCCACACCATTTTTATCTATCCACCTGTGCA

CCGACTGTAGGTCTGGATACCTCTCGCCCTTCATTGGGCGGATGCGAGGATTGCCCTCCTGGGGCTCT

CCTCGAATTTCCAGGCTCTACGTCTTTTTACACACCCCAAGTAGTATGATGCAGAATGTAGTCAGTGG

GCTTTACAGCCTATAAAACACTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAG

AACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGC

ACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAACCTCACCAG

TTTTCTGAACTGCCTGAGGCTTGGATGTGGGGGTTTGTGCAGGCTGCCTTTGGCGGGCTGCTCCCCTG

AAATGCATTAGCGGGGTCATACTGAACCTCCG

Orden: Agaricales


Especie: Coprinellus xanthothrix

37


Secuencia


Taxonomía

4096-4


CCTAACTCTCTGTTGCTATGTGTGTTTTTCTGAGTAAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACAAC

GGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAA

TTCAGTGAATCATCGATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGA

GCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCGGGAGGCGCCCCCTGCGGGCAC

GCGCCGTCCCCCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCA

CTG

Orden: Hypocreales


Especie: Fusarium sp.


Secuencia


Taxonomía

4107-1


TCGCGGACGTTATTTTTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGAT

CTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGT

GAATCATCGAATCTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTC

ATTTCTACCCTCGAACC

Orden: Hypocreales




Secuencia


Taxonomía

4111-1


CCTGCGGCATATCAATAAGCGGAGGATCCGCTATGTGTACCTGCGGCCATATCTCTATACGCGAGGA

TCCCCTATATGTGCCCCCCGGCATATCTCTACACGCAGATAGATCTATATCCCCTCGCGGGTTTTTTA

TAATCTCAGACTACTCTCTCTCCGCTCGTGGGCCCTTACGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGG

ATCTCTTGGTTCTGGTCATCTATGAAAAACGCACCTAAATGCGATAAGTACCCGTGCCATTGCAGAA

TTCAGTGAATCCTCTATATCTTTGCAACGCACACTTGTCACCCGCCCCCTACTCTGGTCGGTGAATGC

CCTGTCCGAAGCTGTCATTGTCAACCCCTCCCTATCCTCTCCAGGGGGCGTCGG

Orden: Hypocreales


Especie: Trichoderma harzianum

38

Nota: Las muestras fueron observadas con microscopio "Nikon Elipse E100" a 100x con aceite de

inmersión. La secuencia molecular se presenta en la misma tabla. La identificación se encuentra en el

anexo 8.


Fuente: (Arias y Piñeros, 2008; Barnett, 1967; Hoyos y Rodríguez, 2013).


Secuencia


Taxonomía

4111-5


TGGCTTCGCGGCCGGCTGAAATATTTTTTCACCCATGTCTTTTGCGCACTTGTTGTTTCCTGGGCGGG

TTCGCCCGCCACCAGGACCAAACCATAAACCTTTTTCTTATGCAGTTTCCATCAGCGTCAGTAAAAA

CAATGTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAA

ATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCT

TTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCTTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCG

TTTTTGTCTCCCTCTTTCTGGGAGACTCGCCTTAAAACGATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGC

GCAGCACATTTTTTGCGCTTTGTATCAGGAGAAAAGGACGGTACTCCATCAAGACTTTTACAATTTTA

ACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAAGCGGGAGGAG

Orden: Pleosporales


Especie: Bipolaris sp.


Secuencia


Taxonomía

4111-6


AGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA

GTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCC

ATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGC

CTC

Especie: Colletotrichum sp.


Secuencia


Taxonomía

4111-9


GCACACTTTAACATACCCCTTACGAAGTATCTGAATGTACCTTGCGTTAACTCGCACAAATACAACTT

TCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAAT

TGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGCATTCCGAGGGGCACG

CCTGTTCGAGTGTCGTGAACTCCTCCACCCTCTACCTTTTTCGAAGGGTTACTGGGCTGGGATTTGGG

AGCTTGCGGGTCCCTGGCCGATCCGCTCTCCTTGAATACATTAGCGAAGCCCTTGCGGCCTTGGTGTG

ATAGTCATCTACGCC

Especie: Peniophora sp.

39

Tabla 8

Estructuras macroscópicas y microscópicas de hongos aislados de raíz en medio

PDA


Secuencia


Taxonomía

3805-A


TCAGTAAGCCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCA

ATAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCAATA

AGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGC

GGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGA

GGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGA

GCATATCAATAAGCGGAGGAGCATATCCATAAGCGGAGGAGCATATCAATAAGCGGAGGAGCAT

ATCAATGCCCGCAGGAAAATATCCATAAGGGGAAGAACATGTCTCTCTCTCGATGAACATATCACTACCCCCAATAACATCTCAT

Orden: Hypocreales

Familia: Clavicipitaceae

Especie: Beauveria bassiana


Secuencia


Taxonomía

3806-C


TGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTAAAAGCCCCGGAACC

AGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAG

CTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGAT

GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT

GAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCG

AACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACCGGGTGCCGGCCCTGAAATACA

GTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGC

GTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATACATAAACGGGGGAAGGAATTATTTTTTTCCGCGTGTTGCCTCTTCGTTGC

Orden: Hypocreales


Especie: Trichoderma hamatum


Secuencia


Taxonomía

3806-F

SECUENCIA: MARCADOR MOLECULAR ITS 1 e ITS 4 TGGGCTCAATGGGTGAGACCTCGGGGTCCACCTCCCACCCGTGTTTAACGAACCTTGTTGCTTCG

GCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCCACCT

GTGAACGCTGTCTGAAGTATGCAGTCTGAGACAATTATTAAATTAATTAAAACTTTCAACAACGG

ATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAAT

TCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTC

CGAGCGTCATTGCTGCCCTCCAGCCCGGCTGGTGTGTTGGGCCCCGCCCCCCTTCCCGGGGGGGC

GGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTC

TTGTAGGCCCGGCCGGCGTCAGCCGACCCCCTCAATCTATTTTTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGT

AGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT

Orden: Eurotiales


Especie: Penicillium glabrum

40


Secuencia


Taxonomía

3807-A


TCGGGGTGGCGGACCACTTCCCAACCCATGTGAACTTACCTATTGTTGCTTCGGCGGGATTGCCC

CGGGCGCCTCGCGTGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCTAGGAACTTTAACTCTTGTTTTATTTTGAA

TCTTCTGAGTAGTTTTTACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA

TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT GAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCA

TGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGATCGGCCAAAGCCCGCAAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCT

AGTGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGAAGTAGTGATATTCCGCATCGGAGAGCGATGAGCC

CCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTC

Orden: Hipocreales


Especie: Clonastachys sp.


Secuencia


Taxonomía

3807-B


CATGTGAACATACCTATTGTTGCTTCGGCGGGATTGCCCCGGGCGCCTCGCGTGCCCCGGATCAG

GCGCCCGCCTAGGAACTTTAACTCTTGTTTTATTTTGAATCTTCTGAGTAGTTTTTACAAATAAAT

AAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA

GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGA

TCGGCCAAAGCCCGCAAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTC

TGCGAAGTAGTGATATTCCGCATCGGAGAGCGATGAGCCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCTA

AGGTTGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT

Orden: Hipocreales


Especie: Clonastachys byssicola


Secuencia


Taxonomía

3807-C


TACCTATTGTTGCTTCGGCGGGATTGCCCCGGGCGCCTCGCGTGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCT

AGGAACTTTAACTCTTGTTTTATTTTGAATCTTCTGAGTAGTTTTTACAAATAAATAAAAACTTTC

AACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAA

TTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGC

ATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGATCGGCCAAAG

CCCGCAAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGAAGTAG

TGATATTCCGCATCGGAGAGCGATGAGCCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCTAAGGTTGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAG

Orden: Hipocreales


Especie: Clonastachys byssicola

41


Secuencia


Taxonomía

3994-B


GGGAGGCCTCGCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACCCCAACATGAACGCTGTTCTGAAAG

TATGCAGTCTGAGTTTGATTATCATAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGC

ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGA

GTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTG

CCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCCGTCCCCGGTTCTCCCCGGGGACGGGCCCGAAAGG

CAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCCGC

CGGCGCCAGCCCACACCCCAACTTTATTTTTCTAAGGGTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCCTGAACTTAAGCATATC

Orden: Eurotiales

Familia: Aspergillaceae

Especie: Aspergillus sp.


Secuencia


Taxonomía

3995-B


CCTCCCACCCGTGTCTATTGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTTTTCGAACGGCCGCCGGG

GAGGCCTCGCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACCCCAACATGAACGCTGTTCTGAAAGTA

TGCAGTCTGAGTTTGATTATCATAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCAT

CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGT

CTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCC

CTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCCGTCCCCGGTTCTCCCCGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCG

GCGCCAGCCGACACCCCAACTTTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGA

TACCCGCTGAAC

Orden: Eurotiales


Especie: Aspergillus hiratsukae


Secuencia


Taxonomía

4087-A


CTCCCCCCGTGTCTATTGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTTTTCGAACGGCCGCCGGGGA

GGCCTCGCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACCCCAACATGAACGCTGTTCTGAAAGTATGC

AGTCTGAGTTTGATTATCATAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGA

TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTT

GAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCA

AGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCCGTCCCCGGTTCTCCCCGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGG

CGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGC

CAGCCGACACCCCAACTTTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC

TTAAGCATATC

Orden: Eurotiales


Género: Aspergillus sp.

42


Secuencia


Taxonomía

4087-B


CGGGGCGACCCTGCCTTCGGGCGGGGGCTCCGGGTGGACACTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCA

GTCTGAGTAAACTTAATTAATAAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATG

AAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG

AACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCACTCAA

GCCTCGCTTGGTATTGGGCAACGCGGTCCGCCGCGTGCCTCAAATCGACCGGCTGGGTCTTCTGT

CCCCTAAGCGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAGGGTGTTCGGGAGGCTACGCCGTAAAACAACCCC

ATTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATC

Orden: Capnodiales

Familia: Davidiellaceae

Especie: Cladosporium sp.


Secuencia


Taxonomía

4087-C


CGCCACAGCCGCCGCCGGCCCACAATTCTGAGTAACGTGAAGTTTGTGACCCAACCATTAAATGA

AAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCAGGCAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA

TAAGTAATGCGAATTGCAGAATCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCTCCTGGT

ATTCCGGGAGGCACGCCTGTTCTATCGCCATTACACACCC

Especie: Fusicladium rhodense


Secuencia


Taxonomía

4087-D


ACCCATGTGAACTTATCTCTTTGTTGCCTCGGCGCAAGCTACCCGGACCCAGCGCCCCGGGCGGC

CCGCCGGCGGACAAACCAAACTCTTGTTATCTTAGTTGATTATCTGAGCGTCTTATTTAATAAGTC

AAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTC

TAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCTAAGCACAGCTTACTGTTGGGACTCTACG

GCCTCCGTAGTTCCCCAAAGCGATTGGCGGAGTGGCAGTAGCCTCTGAGCGTAGTAATTCTTTAT

CTCGCTTTTGTTAGGTGCTGCCCCCCCGGCCGTTAAACCCCCAATTTTTTCTGGTTGACCTCGGAT

CAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATAT

Orden: Trichosphaeriales

Género: Nigrospora

Especie: Nigrospora sp.

43


Secuencia


Taxonomía

4091-A


CTCCCACCCTTGTGTATTCTATGTTTGTGTTGCTTTGGCAGGCCGTGGGCCTCGCCCACCACCGGC

TCTCGGGCTGGTGCGCGCCTGCCAGAGGACTCTTTAAACTCTGTTTGTTAGTGTCGTCTGAGTATG

ATAACAATCGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA

AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC

CCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCTCAAGCCTTAGCTTGGTG

TTGGGCCGTGCCACTGCCCTCGCGGCGCCGGCAGGCCTTAAAATCAGTGGCGGTGCCCGCTGTGG

TTCCAAGCGTAGTAATCTTTCTCGCTCTGGAGACCTGGCGGCTGCTTGCCAGACAACCCCATCTTC

TCAAAGTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATA

Orden: Agaricomycetes

Género: Rhizoctonia

Especie: Rhizoctonia callae


Secuencia


Taxonomía

4095-A


TGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTAAAAGCCCCGGAACC

AGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAG

CTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGAT

GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT

GAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACCGGGTGCCGGCCCTGAAATACA

GTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGC

GTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTG

AACTTAAGCATACATAAACGGGGGAAGGAATTATTTTTTTCCGCGTGTTGCCTCTTCGTTGC

Especie: Trichoderma hamatum


Secuencia


Taxonomía

4095-C


ACCCATGTGAACTTATCTCTTTGTTGCCTCGGCGCAAGCTACCCGGACCCAGCGCCCCGGGCGGC

CCGCCGGCGGACAAACCAAACTCTTGTTATCTTAGTTGATTATCTGAGCGTCTTATTTAATAAGTC

AAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGT

AATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTC

TAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCTAAGCACAGCTTACTGTTGGGACTCTACG

GCCTCCGTAGTTCCCCAAAGCGATTGGCGGAGTGGCAGTAGCCTCTGAGCGTAGTAATTCTTTAT

CTCGCTTTTGTTAGGTGCTGCCCCCCCGGCCGTTAAACCCCCAATTTTTTCTGGTTGACCTCGGAT

CAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATAT


Género: Nigrospora

Especie: Nigrospora sp.

44


Secuencia


Taxonomía

4095-D

SECUENCIA: MARCADOR MOLECULAR ITS 1 e ITS 4 CAAACTCTGTTATCTTAGTTGATTATCTGAGTGTCTTATTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGG

ATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAT

TCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTC

GAGCGTCATTTCAACCCCTAAGCATAGCTTACTGTTGGGACTCTACGGCCTCCGTAGTTCCCCAA

AGCCATTGGCGGAGTGGCAGTAGTCCTCTGAGCGTAGTAATTCTTTATCTCGCTTTTGTTAGGTGC

TGCGCGTACCATCTGTGAC


Género: Nigrospora

Especie: Nigrospora oryzae


Secuencia


Taxonomía

4095- F


TGTTATCTTAGTTGATTATCTGAGTGTCTTATTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT

GGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTG

AATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGT

CATTTCAACCCCTAAGCATAGCTTACTGTTGGGACTCTACGGCCTCCGTAGTTCCCCAAAGCCATT

GGCGGAGTGGCAGTAGTCCTCTGAGCGTAGTAATTCTTTATCTCGCTTTTGTTAGGTGCTGCCCCC

CCGGCCGTTAAACCCCCCCATTTTTTCTGGTTGACCTCCGATCAAGGAGGAATACCCGCTGAACTT

AAGCAT


Género: Nigrospora

Especie: Nigrospora oryzae


Secuencia


Taxonomía

4106-C


CATTTGCAGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAAACTTAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTT

GGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTG

AATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGT

CATTTGTACCTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTCTGCGTGTACACTCGGCTTA

AAACAATTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCGCTCT

Orden: Pleosporales

Familia: Didymellaceae

Especie: Phoma sp.

45


Secuencia


Taxonomía

4110-A


ATTTGCAGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAAACTTAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTG

GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGA

ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTC

ATTTGTACCTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTCTGCGTGTAGACTCGCCTCA

AAACAATTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCGCTCTGCACTCACAACG

ACGGCGTCCAAAA

Especie: Nothophoma quercina


Secuencia


Taxonomía

4110-B


AGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT

AAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGT

ATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTT

GTCTCGCCTC

Orden: Pleosporales

Familia: Didymellaceae

Especie: Didymella sp. Vista macroscópica /

Secuencia


Taxonomía

4110-C


CAGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAAACTTAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCT

GGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCAT

CGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTG

TACCTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTCTGCGTGTAGACTCGCCTCAAAACA

ATTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCGCTCTGCACTCACAACGACGGC

GTCCAAAAGTACATTTTTACACTCTTGACCTCGGATCAGGTAAGGATACCCGCTGAACTTAAACA

TATCAATAAGCGGAG

Especie: Peyronellaea glomerata

46

Nota: Las muestras fueron observadas con microscopio "Nikon Elipse E100" a 100x con aceite de

inmersión. La secuencia molecular se presenta en la misma tabla. La identificación se encuentra en el

anexo 9.


Fuente: (Barnett, 1967; Fuertes y Mallitasig, 2018; Núñez, 2017).

3.4.Identificación molecular

3.4.1. Amplificación del ADN cloroplástico y ribosómico nuclear

Región matK de la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan.

Después de realizar la amplificación de la región matK por método directo con la

técnica de PCR se comprobó mediante electroforesis la presencia de bandas sobre los

750 pb. para cada fenotipo aislado. Ver Figura 3. Este resultado es similar al obtenido

por Albán y Toapanta, (2019) en su trabajo “Identificación molecular del género

Caucaea (ORCHIDACEAE) mediante el sistema BARCODE y análisis químico de

los aromas florales”, al igual que los resultados descritos por Montalvo y Vargas,

(2019) en su investigación “Revisión de las especies latinoamericanas de orquídeas

del género Dracula mediante la técnica molecular BARCODE”.


Secuencia


Taxonomía

4110-D


CGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAAACTTAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTG

GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC

GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGT

ACCTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTCTGCGTGTAGACTCGCCTCAAAACAA

TTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCGCTCTGCACTCACAACGACGGCG

TCCAAAAGTACATTTTTACACTCTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCCCTGAACTTAAGCAT

ATCAATAAGCGGA

Especie: Peyronellaea glomerata

47

Resultado electroforético de la amplificación de la región matK

Figura 3 Resultado de la amplificación de la región matK, usando como muestra la hoja de la especie

Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan. recolectada en cada punto geográfico.

Pocillos: MM: Marcador Molecular de 5000 pb. Código de las muestras: 4087A, 4087B, 4091A,

4091B,4095A, 4095B, 4106A, 4106B, 4107.

Nota: Se visualiza bandas con una media aproximada de 750 pb.


Región ITS de los hongos aislados

Se extrajo el ADN de los 52 subcultivos fúngicos aislados para realizar su respectiva

amplificación mediante la técnica de PCR, las bandas de los productos de PCR

obtenidos presentaron un estimado de 625 pb para cada fenotipo aislado. Ver Figura

4. De acuerdo con el estudio de Fuertes y Mallitasig (2018), la extensión de la región

ITS varía entre 500 a 750 pb, donde estos resultados son similares a los obtenidos en

este estudio.

48

Resultado electroforético de la amplificación de la región ITS

Figura 4 Resultados de los productos de la amplificación de la región ITS.

Pocillos: MM: Marcador Molecular de 5000 pb. Código de las muestras: 3805-A, 3805-B, 3t-1, 3t-

2, 3806-C, 3806-F, 4t-1,4t-2, 3708-A, 3807-B, 3807-C, 5t-1 y 5t-2.

Nota: Se visualiza bandas con una media de 625 pb.


3.4.2 Análisis de las secuencias

Mediante el análisis molecular se determinó que las diez muestras recolectadas de la

especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan son iguales entre sí, lo que indica que

las muestras recolectadas corresponden a la especie en estudio. Ver Anexo 7. En la

Tabla 9. se detalla una secuencia representativa de las diez muestras recolectadas.

49

Tabla 9

Secuencia del ADN cloroplástico de la especie Caucaea pichinchae Szlach & Kolan

Fotografía

Secuencia Secuencia MARCADOR MOLECULAR matK 2.1a. (F) e matK 2.1a. (R)

ACGAATCTCATAATTTGAATAATCTCATTACTTCAAATAAATTTATTTACGTCTTTTCAAAAATAAAGAAAAGATTCTTTTGGTTCCTACATAATTCTTATG

TATATGAATTCGAATATCTATTCCTGTTTATTCGTAAACAGTCTTTTACGATCAATATCTTCTGGAGTATTTTTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAG

AATATCTTATAGTCATGTGTTGTAATTCTTTTCAGAGGATCCTATGGTTCCTCAAATATACTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGGAAAAGCAATTTTGG

CTTCAAAAGGAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAAATTTCACTGTGAATTTTTGGCAATCTTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCATATA

AAGCAATTACCTAACTATTCCTTCTCTTTTCTGGGTATTTTTCAAGTGTACTAAAGAATCCTTTGATAGTAAGAAATCAAATGCTAGAGAATTCATTTCTAA

TAAATACTCTGACTAATAATTAGATACCATAGTCCCAGTTATTTATCTTATTGGATCATTGTCAAAAGCTCAATTTTGTACTGTATCGGGTCATCCTATTAG

TAAACCGATCTGGACCGATTTATCGGATTCTGATATTCTTGATCGATTTTGTCGGATATGTAGAAATATTTGTCGTTATCACAGCGGATCCTCAAAGAAGC

AGGTTTTGTATCGTATAAAGTATATACTTCGACTTTCGTGTGCTAG

Accesión Cobertura Identidad

gil223371034IFJ565013.1 100 % 100 %


Cabe mencionar que la secuencia obtenida se encuentra registrada en GenBank como

perteneciente a la especie Caucaea cucullata, esto se debe a que Caucaea pichinchae

Szlach. & Kolan. es una nueva especie que se la confundía con C. cucullata, con este

estudio se puede hacer el nuevo registro en GenBank. Corroborando esta información

con Szlachetko y Kolanowska (2015), dónde indican que la especie en estudio presenta

una gran similitud con la especie Caucaea cucullata, pero son dos especies distintas.

En la Tabla 10 se presenta la secuencia obtenida de la especie Oreopanax

ecuadoriensis Seem, luego de comparar con las secuencias de la base de datos

GenBank se determinó que no está registrada, por lo cual se puede hacer un nuevo

registro.

50

Tabla 10

Secuencia del ADN cloroplástico de la especie Oreopanax ecuadoriensis Seem

Fotografía

Secuencia Secuencia MARCADOR MOLECULAR matK 2.1a. (F) e matK 2.1a. (R)

AGGCACGCGAGAAGGCTTCATGCAGTCTTCTTTGTATGTTGTTACAGACATACTTTCTCCACGAGTATTGTAATTGGAATACTCCAAATAAAGCCGGTTC

TTCTTTTTCAAAAATAAATCAAAGACTATTCTTCTTCCTATATAATTCTCATCTATGTGAATACGAATCCATCTTCATCTTTCTCCGTAACCAATCTTCTCA

TTTACGCTCAACATCTTCTGGAACCCTTCTTGAACGAATATATTTCTATGGAAAAATAAAATATCTTGTAAAAGTCTTTGTTAAGGCTTTTCAAGTCAATC

TATTGTTGTTGAAGGATCCTTTCATGCATTATGTTAGGTATCAAGGAAAATCAATTCTCGCTTCAAAAGGGACGCCCTTTTTGATGAAAAAATGGACATAT

TACTTTGTTAATTTATGGCAATGTCATTTTTACCTGTGGTCTCAACCGGGA


Las secuencias obtenidas de los hongos aislados se evidencian en la Tabla 7 y Tabla 8

respectivamente, para su identificación molecular las secuencias fueron analizadas en

la base de datos del BLAST arrojando como resultado la identidad de la especie más

cercana donde se consideró el porcentaje más alto de cobertura e identidad, en el

Anexo 8 se presenta dichos datos para los hongos aislados de las muestras de tallo y

en el Anexo 9 para los hongos aislados de las muestras de raíz. Los parámetros

considerados en este estudio están correctos para la identificación molecular de

acuerdo a lo mencionado por Paredes y Yugsi (2016), dónde indican que los

parámetros aceptados para determinar la especie de un microorganismo están entre 97

- 100 % identidad y QC 99 - 100 %.

3.3.4.1 Análisis filogenético

Utilizando las secuencias obtenidas se elaboraron tres árboles filogenéticos bajo el

modelo estadístico de Neighbor-Joining, correspondiendo a las muestras de Caucaea

pichinchae, las secuencias de los hongos de las raíces y las secuencias los endófitos de

51

Oreopanax ecuadoriensis, la información de las secuencias fue complementada con

datos de los sitios de colección.

Análisis filogenético de la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan.

El árbol filogenético se elaboró con las diez secuencias obtenidas de la especie en

estudio y una secuencia de la especie Caucaea phalaenopsis tomada del GenBank

como grupo externo, después de realizar el análisis filogenético las secuencias se

alinearon en base a su género afirmando que la identificación molecular fue correcta,

a partir de este análisis se corroboró que todas las especies recolectadas corresponden

a la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan. de igual manera, en concordancia

con la descripción morfológica descrita en la Figura 1.

Árbol filogenético Neighbor-Joining de las muestras recolectadas de Caucaea

pichinchae Szlach. & Kolan.

Figura 5 Árbol filogenético Neighbor-Joining a partir de las secuencias obtenidas de la región matK

de las muestras recolectadas

Nota: Datos procesados con el programa MEGA 7. Se utilizó como grupo externo a una secuencia

del género Caucaea phalaenopsis tomada del GenBank.

Fuente: (Kumar, Stecher, & Tamura, 2016).

52

Análisis filogenético de los hongos aislados de las muestras de tallo

Para el análisis molecular con respecto a los hongos aislados de las muestras de tallo

se elaboró el árbol filogenético con 30 secuencias, se añadió como grupo externo a la

secuencia de Tremella flava tomada del GenBank Ver Figura 6.

Árbol filogenético Neighbor-Joining de los hongos aislados de las muestras

de tallo

Figura 6 Árbol filogenético Neighbor-Joining a partir de las secuencias obtenidas de la región ITS

de los hongos aislados de las muestras de tallo.

Nota: Datos procesados con el programa MEGA 7. Se utilizó la secuencia Tremella flava como

grupo externo y la secuencia Penicillium glabrum tomadas del GenBank para verificar el correcto

alineamiento.

Fuente: (Kumar et al., 2016).

53

Nuestros resultados se ratifican con lo presentado por Dearnaley, Martos y Selosse

(2012), quienes encontraron hongos endófitos de las divisiones Ascomycota y

Basidiomycota presentes en relaciones simbióticas de las orquídeas. En la Tabla 11 se

indica los integrantes de los nueve grupos formados del árbol filogenético.

Tabla 11

Listado de los grupos formados del árbol filogenético de las muestras de tallo

N.º grupo Especie Lugar de recolección

Grupo I

Trichoderma sp. Rumipamba – Aloasí

Trichoderma olivascens Pasochoa

Trichoderma trixae Pasochoa

Trichoderma viride Pasochoa

Trichoderma sp. Pasochoa

Trichoderma inhamatum Pasochoa

Trichoderma sp. Pasochoa

Trichoderma harzianum Rumipamba

Colleotrichum sp. Rumipamba

Trichoderma sp. Aloasí

Grupo II

Penicillium waksmanii Aloasí

Penicillium ubiquetum Aloasí

Penicillium glabum Pasochoa

Grupo III Clonastachys solani Aloasí

Grupo IV Coniochaeta sp. Cochasquí

Grupo V Scytalidium sp. Cochasquí

Grupo VI Fusarium solani Pasochoa

Fusarium sp. Pasochoa

Grupo VII

Peniophora Rumipamba

Coprinellus xanthothrix Pasochoa

Coprinellus radians Pasochoa – Cochasquí

Grupo VIII Daldinia sp. Cochasquí

Grupo IX Bipolaris sp. Rumipamba – Aloasí

Grupo X Alternaria alternata Cochasquí

Grupo XI Agaricaceae sp. Aloasí


54

El género Trichoderma está presente en tres lugares Aloasí, Pasochoa y Rumipamba,

predominando en Pasochoa la mayor cantidad de especies pertenecientes a este género.

Durante mucho tiempo se consideró que este género era una micorriza, pero en la

actualidad se determinó que es un hongo endófito que habita en la raíces de las

orquídeas, usándolo como agente biocontrolador por su eficacia contra patógenos

foliares y del suelo (Cobos, 2010).

Se identificó a dos especies de Penicillium en Aloasí y la especie Penicillium glabrum

está Pasochoa, este resultado se corroboró con lo citado por León y Romero (2017)

dónde indican que este género es considerado clave en la microbiota del suelo.

Del mismo modo, en Cochasquí y Pasochoa se encuentra el género Coprinellus. Por

otro lado, Aloasí y Rumipamba comparten la misma especie del género Bipolaris.

Análisis filogenético de los hongos aislados de las muestras de raíz

Se elaboró el árbol filogenético con 22 secuencias de los hongos aislados de las

muestras de raíz, del mismo modo se añadieron la secuencia descargada del GenBank

para verificar el correcto alineamiento de las secuencias Ver Figura 7.

55

Árbol filogenético Neighbor-Joining de los hongos aislados de las muestras de

raíz

Figura 7 Árbol filogenético Neighbor-Joining a partir de las secuencias obtenidas de la región ITS

de los hongos aislados de las muestras de raíz.

Nota: Datos procesados con el programa MEGA 7. Se utilizó la secuencia Tremella flava como grupo

externo y la secuencia Penicillium glabrum tomadas del GenBank para verificar el correcto

alineamiento.

Fuente: (Kumar et al., 2016).

56

Se obtuvieron 18 especies fúngicas para las muestras de raíz, los resultados indican

que las especies son específicas para cada lugar, todas las especies identificadas

pertenecen a la división Ascomycota. Según Ordoñez (2012), estos géneros pueden ser

patógenos para otras plantas pero para las orquídeas son beneficiosas actuando de

manera similar a una micorriza es decir, proporcionando nutrientes.

En la Tabla 12 se indica los integrantes de los nueve grupos formados del árbol

filogenético.

Tabla 12

Listado de los grupos formados del árbol filogenético de las muestras de raíz

N.º grupo Especie Lugar de recolección

Grupo I Clonastachys byssicola Aloasí

Clonastachys sp. Aloasí

Grupo II Trichoderma hamatum Aloasí – Pasochoa

Grupo III

Nigrospora sp. Pasochoa

Nigrospora sp. Pasochoa

Nigrospora oryzae Pasochoa

Grupo IV

Phoma sp. Rumipamba

Nothophoma quercina Rumipamba

Didymella sp. Rumipamba

Peyronellaea glomerata Rumipamba

Grupo V

Aspergillus sp. Cochasquí

Aspergillus hiratsukae Cochasquí

Aspergillus sp. Pasochoa

Penicillium glabrum Aloasí

Grupo VI Rhizoctonia callae Pasochoa

Grupo VII Cladosporium sp. Pasochoa

Grupo VIII Fusicladium rhodense Pasochoa

Grupo IX Beauveria bassiana Aloasí


57

Se identificó a la especie Trichoderma hamatum en dos lugares diferentes, Aloasí y

Pasochoa.

La especie Penicillium glabrum se alineó con la secuencia tomada de GenBank

comprobando la identificación de la especie al alineamiento, se identificó a dos

especies de Aspergillus en Cochasquí y una especie de Aspergillus en Pasochoa,

considerando al género beneficioso ya que proporciona nutrientes a la planta para su

desarrollo, esta información se comprueba de acuerdo a lo mencionado por León y

Romero (2017), donde son definidos como patógenos descomponedores de materia

orgánica o como hospederos en plantas.

Se identificó a la especie Rhizoctonia callae, este resultado es similar al estudio

realizado por León y Romero (2017), donde mencionan que este género empieza la

simbiosis proporcionando nutrientes a la semilla para su desarrollo, manteniendo dicha

relación con la plántula.

3.4.3 Análisis de la biodiversidad en los puntos de recolección

En la Figura 8. se indica el número de los hongos aislados para las muestras de tallo y

raíz en cada lugar de recolección, determinando que Aloasí presento una mayor

cantidad de especies identificadas, por lo contrario, el lugar con menos especies

identificadas es Cochasquí, determinando que la localidad de Aloasí presenta mayor

biodiversidad. La cantidad de hongos identificados en cada punto de recolección puede

ser considerado como un indicador de biodiversidad de acuerdo a lo mencionado por

Larrea y colaboradores (2015), dónde indican que los indicadores de biodiversidad

pueden ser valores numéricos y representarse por medios de gráficos estadísticos que

proporcionen información adecuada sobre la evaluación de factores abióticos y

bióticos presente en un lugar.

58

Número de especies fúngicas identificadas en los lugares de recolección

Figura 8 Número de especies fúngicas identificadas en los lugares de recolección

NOTA: Aloasí (12 especies fúngicas de las muestras de tallo y 5 especies fúngicas de las muestras

de raíz), Cochasquí (5 especies fúngicas de las muestras de tallo y 2 especies fúngicas de las muestras

de raíz), Pasochoa (5 especies fúngicas de las muestras de tallo y 8 especies fúngicas de las muestras

de raíz) y Cuenca Rio Pita - Rumipamba (5 especies fúngicas de las muestras de tallo y 4 especies

fúngicas de las muestras de raíz).


59

Conclusiones

Se obtuvo en los cuatro puntos distribuidos en la provincia de Pichincha un total de

diez individuos de la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan incluyendo una

muestra de tallo de su hospedero, las muestras fueron colectadas en un rango altitudinal

de 2800 a 3100 m.s.n.m. se determinó que el árbol hospedero para la especie en estudio

es Oreopanax ecuadoriensis Seem. el cual fue identificado a nivel morfológico y

molecular.

Se aislaron 30 subcultivos fúngicos de las muestras de tallo identificando a 25 especies

de hongos presentes en el árbol hospedero Oreopanax ecuadoriensis Seem, para las

muestras de raíz se aisló 22 subcultivos identificando 18 especies en las muestras

colectadas de la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan.

Se desarrolló un estudio filogenético con los hongos identificados de las muestras de

tallo, donde se identificó que la especie Penicillium está presente en Aloasí y

Pasochoa, la especie Coprinellus se encuentra en Cochasquí y Pasochoa y Aloasí y

Rumipamba comparte la misma especie de Bipolaris, mientras que el género

Trichoderma está presente en Aloasí, Pasochoa y Rumipamba. En lo que se refiere a

las muestras de raíz se determinó que el género Aspergillus está presente en Cochasquí

y Pasochoa, a su vez la especie Trichoderma hamatum se encuentra en Aloasí y

Pasochoa. En otras palabras, la especie en estudio establece su relación simbiótica con

las poblaciones fúngicas existentes en cada sector.

De acuerdo al estudio filogenético se determinó que Aloasí presenta mayor

biodiversidad en comparación con las otras localidades de acuerdo a la cantidad de

especies identificadas.

60

Recomendaciones

Buscar otras localidades intermedias de recolección en la provincia de Pichincha para

la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan, con el fin de identificar nuevas

especies fúngicas.

Elaborar un proceso de aislamiento exhaustivo, ya que es posible que esté presente

mayor cantidad de hongos como se evidencia en las otras muestras.

Utilizar como referencia a la cantidad de especies identificadas para cada localidad

como indicador de la calidad ambiental de los ecosistemas.

61

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72

Anexos:

Anexo 1 Recolección de las muestras de la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan., con su

respectivo hospedero Oreopanax ecuadoriensis Seem. y su etiquetado.

Nota: a Recolección de las muestras de la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan, con su respectivo

hospedero. b: Etiquetado de cada muestra recolectada.


73

Anexo 2 Proceso de desinfección de las muestras de tallo.

Nota: a Las muestras de tallo fueron desinfectadas y cortados en segmentos de 1 a 2 cm, todo el procedimiento se lo realizó dentro

de la cámara de flujo laminar.


74

Anexo 3 Proceso de desinfección de las muestras de raíz.

Nota: b Las muestras de raíz fueron desinfectadas y cortados en segmentos de 1 cm, todo el procedimiento se lo realizó dentro de la

cámara de flujo laminar.


75

Anexo 4 Siembra de las muestras y aislamientos de los hongos.

Nota: Las muestras de raíz desinfectadas se cortaron en segmentos de 5 mm, cada muestra se dividió longitudinalmente en 4

segmentos, distribuyéndolos en cada caja Petri con medio de cultivo PDA


76

Anexo 5 Resultado electroforético de la extracción de ADN de los hongos aislados.


77

Anexo 6 Electroferograma de las secuencias obtenidas para la región matK y la región ITS

Nota: a: secuencia obtenida de la región matK para la especie Caucaea pichinchae Szlach. & Kolan, presenta una longitud

de 810 pb. b: secuencia obtenida de la región matK para la especie Oreopanax ecuadoriensis Seem. con una longitud

de 823pb. y c: secuencia obtenida para la región ITS con una longitud de 530 pb.


78

Anexo 7 Alineamiento de las secuencias obtenidas de las diez muestras recolectadas de la especie Caucaea pichinchae

Szlach. & Kolan.

Elaborado por Las Autoras, 2019

79

Anexo 8 Identificación molecular de hongos aislados de tallo utilizando los primers

ITS 1 e ITS 4

Código Identificación Cobertura Identidad Accesión

3T-1 Clonostachys solani 97 % 99.57 % MH855181.1

3T-2 Bipolaris sp. 99 % 99.63 % KX867789.1

4T-1 Penicillium waksmanii 98 % 99.59 % AY373940.1

4T-2 Trichoderma sp 100 % 99.60 % MK198883.1

5T-1 Trichoderma sp. 94 % 100.00 % MG198883.1

5T-2 Penicillium glabrum 99 % 99.75 % KT192279.1

5T-3 Clonostachys solani 96 % 99.37 % MH855181.1

5T-4 Agaricaceae sp. 99 % 99.20 % JQ312164.1

3994-1 Coniochaeta sp. 100 % 100.00 % MG098277.1

3994-2 Daldinia sp. 98 % 97.61 % LR585032.1

3995-1 Alternaria alternata 100 % 99.80 % MN134489.1

3995-2 Coprinellus radians 99 % 98.41 % AY461815.1

3995-3 Scytalidium sp. 100 % 100.00 % EU214321.1

4088-1 Penicillium glabum 100 % 100.00 % MK910051.1

4088-2 Trichoderma inhamatum

100 % 99.23 % MH549016.1

4088-3 Coprinellus radians 99 % 98.99 % KU761146.1

4088-4 Trichoderma inhamatum

100 % 99.73 % MH549016.1

4092-1 Trichoderma sp. 100 % 100.00 % MK871236.1

4092-2 Trichoderma viride 100 % 99.72 % MK290390.1

4092-3 Trichoderma trixae 100 % 99.79 % MH158556.1

4092-7 Trichoderma

olivascens 100 % 100.00 % DQ677650.1

4096-1 Fusarium solani 100 % 97.76 % MK209114.1

4096-2 Fusarium solani 100 % 97.91 % MK209115.1

4096-3 Coprinellus radians 98 % 94.04 % AY461815.1

4096-4 Fusarium sp. 100 % 97.95 % JQ086549.1

4107-1 Trichoderma sp. 100 % 98.18 % MN105468.1

4111-1 Trichoderma harzianum

71 % 83.15 % AB856604.1

4111-5 Bipolaris sp. 98 % 99.81 % MF154608.1

4111-6 Colletotrichum sp. 100 % 100.00 % MK089264.1

4111-9 Peniophora sp. 100 % 99.72 % MF136595.1


80

Anexo 9 Identificación molecular de hongos aislados de raíz utilizando los primers

ITS 1 e ITS 4

Código Identificación Cobertura Identidad

Accesión

3805 – A Beauveria

bassiana

90 % 100 % J573517.1

3806 – C Trichoderma

hamatum

92 % 99,81 % MF408311.1

3806 – F Penicillium

glabrum

96 % 99,81 % MH864296.1

3807- A Clonastachys sp 96 % 99.13 % MK793776.1

3807-B Clonastachys

byssicola

100 % 100.00 % KC806269.1

3807-C Clonastachys

byssicola

100 % 100.00 % KC806269.1

3994-B Aspergillus sp 100 % 99.15 % MK367491.1

3995-B Aspergillus

hiratsukae

100 % 100.00 % MH142469.1

4087-A Aspergillus sp. 100 % 99.81 % MK367491.1

4087-B Cladosporium sp 100 % 100.00 % MF327373.1

4087-C Fusicladium

rhodense

74 % 97.14 % EU035440.1

4087-D Nigrospora sp 100 % 99.39 % JN207335.1

4091-A Rhizoctonia callae 91 % 99.78 % MH268087.1

4095-A Trichoderma

hamatum

94 % 99.27 % KT314293.1

4095-C Nigrospora sp. 100 % 99.19 % MF435144.1

4095-D Nigrospora oryzae 95 % 100.00 % MH003486.1

4095- F Nigrospora oryzae 100 % 99.00 % MH844777.1

4106-C Phoma sp. 99 % 99.04 % MK102705.1

4110-A Nothophoma

quercina

100 % 99.12 % MN049540.1

4110-B Didymella sp. 100 % 100.00 % MK715322.1

4110-C Peyronellaea

glomerata

100 % 99.01 % MK715322.1

4110-D Peyronellaea

glomerata

99 % 99.01 % KF512825.1


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