UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO …...8n Nervo vestibulococlear Cb Cerebelo CB Calbindina CaBP...

1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL

ERYCK HOLMES ALVES DA SILVA

CARACTERIZAÇÃO MORFOQUANTITATIVA E NEUROQUÍMICA DO

COMPLEXO COCLEAR NO ENCÉFALO DE MORCEGO (Artibeus planirostris).

Natal-RN

2018

2

ERYCK HOLMES ALVES DA SILVA

CARACTERIZAÇÃO MORFOQUANTITATIVA E NEUROQUÍMICA DO


Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientador: Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior. Coorientador: Prof. Dr. Melquisedec Abiaré Dantas Santana.

Natal-RN

2018

3

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências

- CB

Silva, Eryck Holmes Alves da.

Caracterização morfoquantitativa e neuroquímica do complexo

coclear no encéfalo de morcego (Artibeus planirostris) / Eryck

Holmes Alves da Silva. - Natal, 2018.

62 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande

do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em

Biologia Estrutural e Funcional.

Orientador: Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior.

Coorientador: Prof. Dr. Melquisedec Abiaré Dantas Santana.

1. Morcegos - Dissertação. 2. Núcleos cocleares -

Dissertação. 3. Imunofluorescência - Dissertação. I. Nascimento

Júnior, Expedito Silva do. II. Santana, Melquisedec Abiaré

Dantas. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV.

Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 599.4

Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351

4

AUTOR: Silva, Eryck Holmes Alves da

TÍTULO: CARACTERIZAÇÃO MORFOQUANTITATIVA E NEUROQUÍMICA DO


Dissertação de Mestrado apresentada

ao Programa de Pós-graduação em

Biologia Estrutural e Funcional da

Universidade Federal do Rio Grande do

Norte

DATA DA DEFESA: 28/02/2018

BANCA EXAMINADORA:

______________________________________________________

Professora Dra Renata Figueiredo Anomal Universidade Federal do Rio Grande do Norte

______________________________________________________

Professor Drº Melquisedec Abiaré Dantas Santana Fundação Universidade Federal do Vale do São Francisco

______________________________________________________

Professor Drº Expedito Silva do Nascimento Júnior Universidade Federal do Rio Grande do Norte

5

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por ter me abençoado e me iluminado por

todo esse tempo de persistência, me fortalecendo e sempre me mostrando o

caminho certo a seguir.

Agradeço aos meus avós: Maria da Penha da Silva (in Memorian), Severino

Felinto da Silva (in Memorian), Raimundo Alves da Silva e Lindinalva Gomes Alves

por todo amor e carinho que têm por mim.

Aos meus pais, Edilson Felinto da Silva e Cristiane Alves da Silva que sempre

me deram apoio nos momentos difíceis e de indecisões, sempre me incentivando.

Essa vitória é de vocês!

À minha linda irmã, Raquel Maria que sempre foi minha companheira e faz

meus dias mais felizes.

Ao meu amigo, Igor Sales que foi de extrema importância nesse processo, me

auxiliando a melhorar em cada etapa durante esses dois anos consecutivos.

À minha família de coração, que por longos meses e anos, vieram me visitar

em Natal ou via Wi-Fi: Hanna Jarine, Heverton Melo, Lucas Bernardo, Matheus

Marley, Marcos Vinicius, Gislainy Câmara, Jonatha Gomes e Carlos Andrade todos

vocês foram um porto seguro em vários momentos.

Ao professor/orientador Expedito Júnior, por abrir o caminho da ciência, e

principalmente pelos ensinamentos, contribuições e orientações.

Ao professor/coorientador Melquisedec Santana, por ser meu braço direito

neste projeto e me ensinar a manter a calma sempre, caro jovem padawan.

Aos professores Miriam, Gilberto e Fernando por sempre estarem disponíveis

à ajudar. E a Regina que sempre auxiliou no laboratório durante todo o processo.

Aos amigos do Labneuro: Dianny, Mayara, Brenna, Naryllene, Nelyane,

Alexander, Alane, Klêydson e Raíssa pelo grande apoio, amizade, companheirismo

e por me ajudar nos experimentos.

Agradeço ao Departamento de Morfologia/UFRN e ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia Estrutural e Funcional pela disponibilização da infraestrutura

necessária, dando totais condições para a execução da pesquisa.

Ao CNPq, FAPERN e a CAPES pelo apoio financeiro.

6

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representação esquemática do sistema auditivo periférico no humano.

Figura 2. Representação esquemática das vias auditivas centrais no humano e no

rato.

Figura 3. Representação esquemática da localização do complexo coclear no

humano.

Figura 4. Representação das proteínas moduladoras de cálcio EF-hand.

Figura 5. Espécime macho de Artibeus planirostris.

Figura 6. Distribuição geográfica de Artibeus planirostris.

Figura 7. Sistema de ecolocalização de Artibeus planirostris.

Figura 8. Árvore molecular das famílias de morcegos descritas.

Figura 9. Esquemas de secções coronais, baseadas no método do Nissl, do

encéfalo de Artibeus planirostris mostrando as delimitações do complexo coclear nos

níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C). As linhas pontilhadas demarcam a

estrutura de interesse. Barra: 1000 μm.

Figura 10. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais, coradas pelo

método do Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do

CC em A. Ampliação da caixa em A, mostrando em detalhe a morfologia

arredondada das células do VCA (B). Barra: 500 μm em A e 50 μm em B.



CC em A. Ampliação da caixa em A, mostrando em detalhe a morfologia ovóide e

pequena (seta) das células do VCAGr (B) e a morfologia fusiforme e espaçada das

células do VCP (C). Barra: 500 μm em A e 50 μm em B e C.

7



CC em A. Ampliações das caixas em A, mostrando em detalhe a morfologia

pequena e granular das células do DCMo (B), a morfologia fusiforme (seta) das

células do DCFu (C) e a morfologia arredondada e maior das células do DCDp (D).

Barra: 500 μm em A e 50 μm em B, C e D.

Figura 13. Fotomicrografias da imunofluorescência de secções coronais do encéfalo

de Artibeus planirostris mostrando a expressão de CB (vermelho) nos neurônios do

CC no sentido rostrocaudal em A, D e G. Expressão de CR (verde) nos neurônios do

CC no sentido rostrocaudal em B, E e H. Sobreposição das marcações CB

(vermelho) + CR (verde) no CC nos três níveis: rostral, médio e caudal em C, F e I.

Os asteriscos representam ampliação da área para melhor visualização dos

neurônios. Barra: 100 μm.


de Artibeus planirostris mostrando a expressão de PV (verde) nos neurônios do CC

no sentido rostrocaudal em A, D, G e J. Expressão de CR (vermelho) nos neurônios

do CC no sentido rostrocaudal em B, E, H e K. Sobreposição das marcações PV

(verde) + CR (vermelho) no CC nos três níveis: rostral, médio e caudal em C, F, I e

L. Os asteriscos representam ampliação da área para melhor visualização dos


8

LISTA DE ABREVIAÇÕES

4V Quarto ventrículo

8n Nervo vestibulococlear

Cb Cerebelo

CB Calbindina

CaBP Proteínas ligantes de cálcio

CC Complexo coclear

CN Núcleo coclear

CR Calretinina

DC Núcleo coclear dorsal

DCDp Núcleo coclear dorsal, camada profunda

DCFu Núcleo coclear dorsal, camada fusiforme

DCMo Núcleo coclear dorsal, camada molecular

icp Pedúnculo cerebelar inferior

mcp Pedúnculo cerebelar médio

PV Parvalbumina

s5 Nervo trigêmio, parte sensitiva

sp5 Tracto espinal do trigêmio

SpVe Núcleo vestibular espinal

tz Corpo trapezoide

VBC Complexo vestibular

VC Núcleo coclear ventral

VCA Núcleo coclear ventral, parte anterior

VCAGr Núcleo coclear ventral, camada granular

VCP Núcleo coclear ventral, parte posterior

9

SUMÁRIO

RESUMO

1. INTRODUÇÃO_____________________________________________________ 12

1.1 Sistema auditivo periférico____________________________________________ 12

1.2 Sistema auditivo central______________________________________________ 14

1.3 Proteínas ligantes de cálcio____________________________________________ 16

1.4 Modelo experimental_________________________________________________ 20

1.4.1 – Taxonomia e filogenia__________________________________________ 22

1.5 JUSTIFICATIVA____________________________________________________ 24

2. OBJETIVOS_______________________________________________________ 25

2.1 Geral_____________________________________________________________ 25

2.2 Específicos________________________________________________________ 25

3. METODOLOGIA____________________________________________________ 26

3.1 Sujeitos___________________________________________________________ 26

3.2 Métodos de identificação taxonômica____________________________________ 26

3.3 Procedimentos______________________________________________________ 27

3.3.1 – Anestesia____________________________________________________ 27

3.3.2 – Perfusão____________________________________________________ 27

3.3.3 - Remoção dos encéfalos_________________________________________ 28

3.3.4 – Microtomia___________________________________________________ 28

3.3.5 - Método de Nissl_______________________________________________ 29

3.3.6 – Imunofluorescência____________________________________________ 29

3.4 Obtenção das imagens_______________________________________________ 31

3.5 Análise morfométrica_________________________________________________ 31

3.6 Análise estereológica________________________________________________ 32

3.7 Análise estatística___________________________________________________ 32

4. RESULTADOS_____________________________________________________ 33

4.1 - Caracterização citoarquitetônica, morfométrica e estereológica do complexo

coclear____________________________________________________________

33

5.

4.2 - Análise da distribuição das proteínas ligantes de cálcio no complexo

coclear____________________________________________________________

DISCUSSÃO_______________________________________________________

41

46

6. CONCLUSÃO______________________________________________________ 51

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS_____________________________________ 52

10

RESUMO

O sistema auditivo é de extrema importância para a sobrevivência das espécies.

Tanto os animais que vivem em seu ambiente natural, bem como aqueles criados

em condições controladas de laboratório precisam da audição para detectar perigos,

tais como predadores e veículos motorizados e responder a vocalização de animais

da mesma ou de outras espécies. A orelha é denominada de órgão vestíbulococlear,

por participar diretamente da audição e da manutenção do equilíbrio. A navegação

espacial por parte dos quirópteros está amplamente associada ao mecanismo de

ecolocalização, o qual consiste na emissão de ondas sonoras pelo aparelho fonador

e consequente reflexo em forma de eco, captado pelo aparelho vestíbulococlear.

Embora diversos estudos abordem a dinâmica funcional dos sistemas de

ecolocalização de quirópteros, poucos trabalhos se dedicam a uma análise

morfológica dos centros neurais envolvidos no processamento de tais informações.

O presente estudo tem como objetivo descrever a organização morfoquantitativa e

neuroquímica do complexo coclear no encéfalo do morcego Artibeus planirostris.

Utilizando o método de Nissl foram identificadas todas as subdivisões clássicas

descritas até o presente em outras espécies: núcleo coclear ventral (parte anterior,

parte posterior e camada granular) e núcleo coclear dorsal (camada profunda,

camada fusiforme e camada molecular). A análise neuroquímica das proteínas

ligantes de cálcio, através da técnica de imunofluorescência permitiu identificar a

presença de terminais e pericários imunorreativos a CB, CR e PV de formas

distintas, apresentando especificidades em cada porção do complexo coclear.

Traçando um comparativo entre os vertebrados, o presente estudo fornece a

primeira descrição detalhada dos aspectos morfoquantitativos do morcego Artibeus

planirostris que se mostrou bastante similar às características encontradas nos

roedores, especificamente o rato e a chinchila. A neuroquímica se mostra diferente

aos primatas humanos e não humanos, podendo ser uma relação direta com a

ecolocalização utilizada pelo modelo experimental.

Palavras-chave: sistema auditivo, ecolocalização, citoarquitetura,

imunofluorescência, morcegos.

11

ABSTRACT

The auditory system is extremely important for the survival of the species.

Those that live in your natural environment, as well as those created under controlled

conditions of laboratory need the hearing to detect dangers such as predators and

motor vehicles, respond to vocalizations of animals of the same or other species. The

ear is called a vestibulocochlear organ, because it participates directly in hearing and

in maintaining balance. Spatial navigation by chiroptera is widely associated with the

mechanism of echolocation, which consists of the emission of sound waves by the

vocal apparatus and consequent echo reflex, captured by the vestibulocochlear

apparatus. Although several studies address the functional dynamics of the

chiroptera echolocation systems, few papers are dedicate to a morphological

analysis of the neural centers involved in the processing of such information. The

present study aims to describe the morphoquantitative and neurochemical

organization of the cochlear complex in bat Artibeus planirostris brains. Using the

Nissl’s method all classical subdivisions described up to the present in other species

were identified: ventral cochlear nucleus (anterior part, posterior part and granular

layer) and dorsal cochlear nucleus (deep layer, fusiform layer and molecular layer).

The neurochemical analysis of the calcium binding proteins by means of the

immunofluorescence technique allowed to identify the presence of immunoreactive

terminals and pericals to CB, CR and PV in different ways, presenting specificities in

each part of the cochlear complex. Comparing vertebrates, the present study

provides a first detailed description of the morphoquantitative aspects of the bat

Artibeus planirostris, which was very similar to the characteristics found in rodents,

specifically the rat and the chinchilla. The neurochemistry is different to human and

non-human primates, and may be a direct relation with the echolocation used by the

experimental model.

Key words: auditory system, echolocation, cytoarchitecture, immunofluorescence,

bats.

12

1. INTRODUÇÃO

1.1 SISTEMA AUDITIVO PERIFÉRICO

O sistema auditivo é essencialmente importante na sobrevivência das

espécies, pensando nos animais que vivem em seu ambiente natural, bem como

aqueles domesticados e criados em ambiente humanizado. Existe a necessidade do

auxílio da audição para detectar alguns perigos, tais como predadores e veículos

motorizados e responder a vocalização de animais da mesma ou de outras espécies

(STRAIN e MYERS, 2006).

O sistema auditivo periférico é representado pela orelha, denominada de

órgão vestibulococlear, por participar diretamente da audição e da manutenção do

equilíbrio (DYCE et al., 2010; LIEBICH e KÖNIG, 2011). Anatomicamente a orelha

se divide em externa, média e interna (Figura 1). Caracterizando-as, a orelha

externa consiste em aurícula e meato acústico externo. A aurícula (formada de

cartilagem articular recoberto por pele) apresenta uma forma tortuosa e tem função

de captar os sons e transportar até o meato acústico externo (LIEBICH e KÖNIG,

2011), que é uma espécie de canal que se alonga até a membrana timpânica. Sua

função é direcionar o som captado pela aurícula até a membrana, a qual separa o

meato acústico externo da orelha média (STRAIN e MYERS, 2006).

A orelha média se caracteriza como uma cavidade preenchida por ar no osso

temporal, a qual se comunica com a faringe através da tuba auditiva (GETTY, 1986).

A tuba auditiva apresenta como função equilibrar a pressão dos dois lados da

membrana timpânica (DYCE et al., 2010). A cavidade timpânica encontra-se no

interior do osso temporal (porção petrosa) e é onde estão presentes os três

ossículos auditivos: martelo, bigorna e estribo, importantes na condução sonora.

Estes se comunicam com a janela do vestíbulo, conectando-se assim à orelha

interna (LIEBICH e KÖNIG, 2011).

A orelha interna consiste de dois labirintos: o membranoso, com a presença

de um líquido (endolinfa) e o ósseo. Os dois labirintos estão separados por um

espaço, chamado perilinfático, o qual é preenchido por um líquido, a perilinfa

(GETTY, 1986). A orelha interna consiste em duas porções: coclear e vestibular,

conforme a sua respectiva função. A porção coclear recebe inervação do ramo

13

coclear do VIII par craniano (nervo vestibulococlear) relacionado ao sentido de

audição. A porção vestibular funciona principalmente para o equilíbrio e apresenta

inervação pelo ramo vestibular do VIII par craniano (FRANDSON, 1979).

Figura 1. Representação esquemática do sistema auditivo periférico no humano.

(Fonte: Anatomy Organ, 2016).

A cóclea é um órgão com característica espiralada que se assemelha a um

caracol. Apresenta divisão em três ductos: rampa vestibular, rampa média e rampa

timpânica (STRAIN e MYERS, 2006; LIEBICH e KÖNIC, 2011). O número de

espirais na cóclea varia entre as espécies. Os seres humanos têm 2,75 espirais,

cães 3,25 e equinos 2,5 espirais (STRAIN e MYERS, 2006). O Órgão Espiral é a

porção da cóclea sensível ao som. Essa estrutura é encontrada sobre a membrana

basilar da rampa média e é dotada de células ciliadas internas, as quais detectam o

som e células ciliadas externas, as quais amplificam o som (MOYES e SCHULTE,

2010). Em cada porção espiralada ao longo do eixo da cóclea existe a presença de

um gânglio espiral, representação de um aglomerado de células, de onde saem

axônios dos neurônios que formam o nervo coclear, o qual se une ao nervo

vestibular formando o nervo vestibulococlear (HENKEL, 2006).

14

1.2 SISTEMA AUDITIVO CENTRAL

A detecção do som começa na cóclea, onde a codificação neural das

informações de frequência sonora é relativamente simples (LUO, 2009). Com isso,

os nervos vestibulococleares penetram no sistema nervoso central na altura do

bulbo (Figura 2), próximos à saída dos nervos facial e trigêmio, e realizam sinapses

no complexo coclear (CC) (DEWEY, 2006).

O CC, representado pelos núcleos cocleares (CN), recebe a informação

auditiva, a qual inicialmente foi processada na cóclea. Com isso apresentam-se

importantes em termos de seu papel na decodificação neural das informações de

frequência sonora e a transformação dessa informação de forma mais simples até

mais complexa. Além disso, devido ao fato de a via de projeção ascendente se

originar dos CN e que os CN enviam axônios para núcleos em nível superior de

forma tonotópica (RYUGO et al., 1981), o mapa tonotópico do CN representa uma

plataforma de trabalho da função auditiva no sistema auditivo central. O CC de

mamíferos consiste em duas divisões, isto é, núcleo coclear ventral (VC) subdividido

em porção anterior (VCA) e porção posterior (VCP) e núcleo coclear dorsal (DC). A

representação neural de frequências de som no CC foi estudada em várias

espécies, como gatos (BOURK et al., 1981), morcegos (FENG e VATER, 1985) e

ratos (YAJIMA e HAYASHI, 1989; KALTENBACH e LAZOR, 1991; WILLOTT et al.,

1982).

Os axônios de neurônios do VC cruzam formando o corpo trapezoide e se

projetam para o complexo olivar superior na ponte, onde realizam sinapses. A partir

desse complexo, são emitidos axônios que formam um feixe chamado de lemnisco

lateral (localizado na ponte) e se projetam ao colículo inferior. Os neurônios do DC

não fazem sinapse no complexo olivar superior, seguem direto e realizam sinapse

no colículo inferior no mesencéfalo (DEWEY, 2006; FERNÁNDEZ et al., 2010; LENT,

2010). O colículo inferior recebe todas as fibras auditivas originadas em níveis mais

baixos. As fibras nervosas saem do mesencéfalo para o núcleo geniculado medial,

localizado no tálamo, que emite fibras nervosas corticais até o lobo temporal do

córtex cerebral, onde se situam as áreas auditivas (DEWEY, 2006; FERNÁNDEZ et

al., 2010, LENT, 2010).

15

O DC, que corresponde ao tubérculo acústico, localiza-se dorso-lateralmente

ao pedúnculo cerebelar inferior (icp), e o VC localiza-se ventralmente ao icp (Figura

3). A organização tonotópica que surge na cóclea é preservada tanto no VC quanto

no DC, de modo que neurônios localizados na porção dorsal respondam a

frequências mais agudas e aqueles localizados mais ventralmente respondam a

frequências mais graves (RYUGO e PARKS, 2003; MACHADO, 2003; SNELL,

2003).

Figura 2. Representação esquemática das vias auditivas centrais no humano, lado

esquerdo, e no rato, lado direito. (BUTLER e LOMBER, 2013; CASPARY et al.,

2008).

16

Figura 3. Representação esquemática da localização do complexo coclear no

humano. (KOMUNE et al., 2015).

Em roedores, o DC apresenta-se estratificado, com a presença de uma

camada molecular superficial, caracterizada pelo seu conteúdo em zinco (FÉRES e

CAIRASCO, 2003). Os principais neurônios de projeção são as células fusiformes,

apresentando orientação radialmente à camada superficial (HUDSPETH, 2000;

MACHADO, 2003). Já o VC, apresenta as células estreladas e as células em

arbusto (HUDSPETH, 2000) e a marcação por zinco é limitada à periferia do VC

(FÉRES e CAIRASCO, 2003).

Vale salientar que existem evidências de correlação entre os aspectos

morfológicos do neurônio e a sua resposta funcional, sendo assim importante no

aspecto da manutenção da tonotopia coclear, resolução temporal, codificação de

intensidade e tons complexos (AQUINO e ARAÚJO, 2002).

1.3 PROTEÍNAS LIGANTES DE CÁLCIO

O cálcio desempenha um papel decisivo na regulação de uma grande

variedade de processos celulares, incluindo metabolismo celular, expressão de

genes, dinâmica do citoesqueleto, ciclo celular, morte celular, neurotransmissão e

processos de transdução de sinal (BRAUNEWELL e GUNDELFINGER, 1999). Por

exemplo, uma elevação descontrolada de cálcio intracelular leva a uma excessiva

ativação celular, injúria e até mesmo a morte da célula (CELIO, 1990).

17

Proteínas ligantes de cálcio (CaBP) servem frequentemente como proteínas

efetoras ou moduladoras para traduzir sinais de cálcio em respostas fisiológicas

adequadas. Ao longo dos anos um grande número destas moléculas de ligação de

cálcio tem sido identificado, refletindo a importância do cálcio e a sua função

reguladora na célula (BRAUNEWELL e GUNDELFINGER, 1999). Funcionalmente as

proteínas efetoras de cálcio podem ser agrupadas em diferentes famílias, baseando-

se nas características estruturais distintas dos seus sítios de ligação ao cálcio. As

CaBP podem ser subdivididas em três grupos: os domínios C2, as proteínas EF-

hands e as anexinas (GERKE et al., 2005).

O domínio C2 é um motivo de ligação de cálcio que foi reconhecido pela

primeira vez como o segundo domínio conservado da proteína cinase C, sendo de

onde o termo 'C2' deriva. Acredita-se que o domínio C2 esteja envolvido na ligação

fosfolipídica dependente de cálcio (DAVLETOV e SUDHOF, 1993). Desde que os

domínios relacionados ao domínio C2 foram encontrados também em proteínas que

não se ligam ao cálcio, outras funções putativas para o domínio C2, como por

exemplo, ligação a inositol-1,3,4,5-tetrafosfato tem sido sugerido (BRAUNEWELL e

GUNDELFINGER, 1999).

O segundo grupo é formado pelas CaBP que exibem como característica

estrutural o motivo EF-hand. Este é um motivo de ligação de cálcio que contém duas

hélices orientadas praticamente perpendiculares uma a outra, flanqueando uma alça

que é tipicamente de 12 resíduos de comprimento. O íon Ca2+ ligado é coordenado

por sete ligantes de oxigênio em um arranjo de bipirâmide pentagonal (GERKE et

al., 2005). Essa estrutura lembra uma mão direita com o polegar e indicador abertos,

representando as duas α-hélices e o terceiro dedo fechado, representando a alça

(CELIO, 1990) (Figura 4).

18

Figura 4. O motivo EF-hand consiste em uma α-hélice (simbolizada pelo dedo

indicador), uma alça em torno do íon Ca2+ (representada pelo dedo médio fechado)

e uma segunda α-hélice (simbolizada pelo polegar). (YÁÑEZ et al., 2012)

As proteínas anexinas, cujos membros interagem com fosfolipídios e

membranas celulares na presença de cálcio formam uma família do tipo não EF-

hand por seu sítio de ligação ao cálcio ser diferente (HEIZMANN e HUNZIKER,

1991). Os sítios de ligação de cálcio das anexinas diferem fundamentalmente do tipo

EF-hand porque somente cinco dos sete sítios de ligação são fornecidos por

oxigênios e porque nenhuma estrutura EF-hand do tipo hélice-alça-hélice é

discernível (GERKE et al., 2005).

Algumas proteínas EF-hand possuem papéis regulatórios, interagindo com

outras proteínas, sendo comumente denominadas 'proteínas sensores de cálcio',

como por exemplo a calmodulina e a troponina C (SCHWALLER, 2010). Outras

estão envolvidas com as funções de tamponamento e transporte de cálcio, e são

denominadas 'proteínas ligantes de cálcio', como é o caso da parvalbumina (PV),

calbidina (CB) e calretinina (CR). Essa classificação foi primeiramente proposta por

Silva e Reinach (1991) e promovem uma boa correlação entre suas características

estruturais e funcionais. Entretanto, se presente em concentrações suficientemente

altas, proteínas sensores podem funcionar como proteínas tampões (SCHWALLER,

2010).

As proteínas tampões, como a PV, CB e CR, representam um sistema mais

passivo responsável pela diminuição da amplitude dos sinais de cálcio (HOF et al.,

1999). Um tampão intracelular, como a CB, precisa somente ligar o cálcio

19

eficientemente, e não requer mudanças conformacionais e exposição hidrofóbica,

como a calmodulina e a troponina C (SKELTON et al., 1994).

A PV foi originalmente purificada a partir de músculo de peixes e devido ao

seu baixo peso molecular (12 kDa) e uma elevada solubilidade em água, foi

chamada de parvalbumina (parvusis em latim significa pequeno), embora ela não

tenha nenhuma semelhança funcional com soro de albumina (YÁÑEZ et al., 2012). A

primeira estrutura prototípica de um domínio EF-hand foi determinada em PV, que

curiosamente é uma proteína EF-hand atípica. PV possui um número ímpar de

domínios EF-hand (3), e os sítios de ligação de Ca2+ são sítios mistos para Ca2+ e

Mg2+ (SCHWALLER, 2010). Trabalhos com imunoistoquímica já confirmaram que

PV além de estar presente no músculo, também está bem distribuído em tecidos não

musculares como ossos, dentes, pele, encéfalo, próstata, glândulas seminais,

testículos e ovários de ratos (ARIF, 2009).

A CB foi extraída a partir do duodeno de aves, onde facilita o transporte do

cálcio através da mucosa, e em seguida foi detectada e mapeada no encéfalo (HOF

et al., 1999). CB possui 6 domínios EF-hand, quatro dos quais ligam Ca2+ com

média ou alta afinidade (SCHWALLER, 2010).

A CR foi inicialmente descoberta na retina de aves, de onde surgiu seu nome

(ROGERS, 1987). É a proteína ligante de cálcio descrita mais recentemente, sendo

abundantemente expressa no sistema nervoso, e possui sequências de aminoácidos

homólogas a CB (JACOBOWITZ e WINSKY, 1991). CR tem 6 domínios EF- hands,

cinco dos quais são capazes de ligar íons Ca2+ (SCHWALLER, 2010).

Essas três CaBP são particularmente interessantes de um ponto de vista

morfológico, uma vez que elas ocorrem somente em certas subpopulações de

células nervosas no sistema nervoso central e periférico. Assim, elas podem ser

usadas seletivamente para visualizar células, vias e núcleos encefálicos

(ANDRESSEN et al., 1993).

20

1.4 MODELO EXPERIMENTAL

Um grupo de mamíferos, os quirópteros, apresenta estruturas

caracteristicamente diferenciadas de orientação sensório-motora, através de um

sistema sonar, capaz de detectar a presença de barreiras físicas ou até mesmo

presas no ambiente (SCHNITZLER e KALKO, 2001). Com isso, este grupo de

mamíferos apresenta um sistema auditivo muito mais integrado ao sistema motor

quando comparado ao sistema visual.

O Artibeus planirostris (Chiroptera, Phyllostomidae) é um morcego que

apresenta pelagem de coloração castanho-acinzentada e listras faciais pouco

evidentes (Figura 5). É uma espécie de tamanho médio, com comprimento do corpo

variando de 7,5 a 11 cm, e massa corporal entre 40 e 69 g (REIS et al., 2013).

Apresenta ampla distribuição geográfica, ocorrendo em zonas tropicais de diversos

países ao longo da metade norte da América do Sul (HOLLIS, 2005). É um morcego

comum em muitas regiões do Brasil (Figura 6) (ZORTÉA, 2007).

Figura 5. Espécime macho de Artibeus planirostris. (Foto: Marília Barros).

21

Figura 6. Distribuição geográfica do Artibeus planirostris, destacada em

amarelo. (Fonte: The IUCN Red List).

Como animais noturnos, os morcegos têm uma menor proporção de cones na

retina, uma estrutura responsável pela percepção de cores. No entanto, não são

cegos e, utilizam de um processo chamado ecolocalização, ilustrado na figura 7,

para se orientar num dado espaço e/ou seu habitat. Por utilizar primariamente do

sistema de ecolocalização, os olhos são pequenos, as orelhas são grandes, o tragus

bem desenvolvido e na maior família brasileira, Phyllostomidae, a folha nasal

proeminente toma parte importante no direcionamento dos ultrassons que saem

pelas narinas (NEUWEILER, 2000). Durante este processo, eles transmitem sons de

alta frequência pela boca e nariz, os quais refletem por superfícies dos ambientes,

indicando a direção e distância relativa dos objetos (FENTON, 1992).

q

Figura 7. Sistema de ecolocalização do Artibeus planirostris. (Baseado em

REIS et al., 2013; HOLLIS, 2005).

22

1.4.1 TAXONOMIA E FILOGENIA

Os morcegos, mamíferos placentários, pertencem à ordem Chiroptera, a qual

tem sido tradicionalmente dividida, com base em caracteres morfológicos de

espécies fósseis e atuais, em duas subordens monofiléticas: Megachiroptera e

Microchiroptera (SIMMONS, 1994; SIMMONS e GEISLER, 1998) e composta por

cerca de 1.100 espécies (KUNZ e LUMSDEN, 2003). Os megaquirópteros

correspondem a uma única família (Pteropodidae), à qual pertencem as espécies de

raposas-voadoras que ocorrem exclusivamente nas zonas tropicais do Velho Mundo

(NEUWEILER, 2000). Já os microquirópteros são cosmopolitas e englobam as 17

demais famílias (SIMMONS, 1998), incluindo a família Phyllostomidae à qual

pertence A. planirostris. Os microquirópteros desenvolveram um complexo sistema

de ecolocalização laringeal ausente nas raposas-voadoras, que apresentam apenas

algumas espécies cavernícolas (gênero Rousettus) capazes de utilizar um sistema

rudimentar de ecolocalização a partir de estalidos da língua (ALTRINGHAM, 1996).

Atualmente, porém, esta classificação tem sido contrariada por estudos

filogenéticos baseados em dados moleculares, que indicam que alguns grupos de

morcegos com ecolocalização sofisticada compartilham um ancestral comum com as

raposas-voadoras (TEELING et al. 2005; TEELING, 2009; VAN DER BUSSCHE e

HOOFER, 2004). Dessa forma, a família Pteropodidae e mais cinco famílias de

microquirópteros foram agrupados na subordem Yinpterochiroptera, e as famílias

restantes, incluindo a Phyllostomidae, na subordem Yangochiroptera (Figura 8)

(JONES e TEELING, 2006; TEELING et al., 2012).

23

Figura 8. Árvore molecular das famílias de morcegos descritas. Família do modelo

experimental em destaque no tracejado em vermelho. (Adaptado de JONES e

TEELING, 2006).

Dentre os diferentes táxons de morcegos, a família Mormoopidae é a mais

filogeneticamente próxima da família Phyllostomidae (DATZMANN et al., 2010;

JONES e TEELING, 2006). Muito provavelmente, o ancestral comum de ambas as

famílias foi um insetívoro, uma vez que a insetivoria estrita é a estratégia de

forrageio adotada pelos mormoopídeos e pela maciça maioria das espécies de

morcegos. Morcegos filostomídeos especializados no consumo de frutos, como o

gênero Artibeus, representam condições mais derivadas e recentes em relação às

espécies insetívoras/onívoras, hematófagas, carnívoras e nectarívoras da família

(BAKER et al., 2012). As relações filogenéticas entre as diferentes espécies de

Artibeus têm sido amplamente debatidas nos últimos anos (LIM et al., 2004;

MARQUES-AGUIAR, 1994; VAN DEN BUSSCHE et al., 1998). Estudos recentes

indicam que A. planirostris é espécie irmã de A. amplus e estreitamente relacionada

à A. obscurus (REDONDO et al., 2008), porém a filogenia do gênero ainda não é

consensual.

24

1.5 JUSTIFICATIVA

O sistema auditivo do morcego está envolvido em seu dia a dia devido ao

processo chamado ecolocalização, emitindo ondas sonoras as quais refletem e

retorna em forma de eco, conectando assim diversas áreas do sistema nervoso,

entre elas o complexo coclear.

Levando em consideração a importância fisiológica e comportamental do

sistema auditivo, como no caso do gênero Artibeus, é fundamental aprofundar o

conhecimento acerca da organização desse sistema, uma vez que alguns núcleos

do complexo coclear podem apresentar localização, citoarquitetura e neuroquímica

distintas de outras espécies já estudadas. Adicionalmente, a ausência de estudos

mais detalhados sobre a anatomia quantitativa do complexo coclear em quirópteros

impedem uma análise comparativa refinada entre as espécies com o intuito de

fornecer maior clareza sobre as rotas evolutivas do sistema auditivo ao longo do

tempo.

O presente trabalho visa preencher lacunas importantes na compreensão da

filogenia do complexo coclear, através da utilização de técnicas para caracterização

citoarquitetônica e neuroquímica, associadas a ferramentas de neuroanatomia

quantitativa.

25

2. OBJETIVOS

2.1 GERAL

Caracterizar a organização morfológica do complexo coclear no encéfalo de

morcego A. planirostris.

2.2 ESPECÍFICOS

Delimitar citoarquitetonicamente e por imunofluorescência para CaBP, os

núcleos cocleares no encéfalo do morcego A. planirostris;

Estimar o volume total do complexo coclear;

Estimar o comprimento rostrocaudal do complexo coclear;

Comparar a média das áreas dos corpos neuronais dos núcleos cocleares.

26

3. METODOLOGIA

3.1 SUJEITOS

Cinco animais adultos foram utilizados no experimento. Os exemplares de A.

planirostris utilizados no estudo foram capturados no campus da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, Natal (RN), Nordeste do Brasil (Licença

SISBIO Nº 25233-2).

Os procedimentos de coleta aconteceram em quatro diferentes ocasiões:

18/10/2012, 21/11/2012 e 26/02/2013 em um fragmento de vegetação, no Centro de

Biociências (coordenadas em UTM: 25M 256251 / 9353764), e no dia 13/06/2013

num agrupamento arbóreo, nas proximidades da Reitoria da UFRN (coordenadas

em UTM: 25M 256226 / 9354214).

Em relação às capturas, foram utilizadas de uma a três redes de neblina

Ecotone® de nylon, com dimensões 12 x 3 m e tamanho de malha 19 x 19 mm. As

redes foram armadas no nível do solo e, em cada noite de captura, foram abertas

logo após o pôr do sol e permaneceram expostas por duas horas consecutivas.

Cada indivíduo capturado foi analisado quanto ao sexo e à faixa etária. Foram

mantidos em sacos de algodão até o término da amostragem e transporte até o

laboratório. Os demais indivíduos foram soltos no mesmo local de captura. Todos os

animais capturados para o estudo foram perfundidos imediatamente após a coleta

no Laboratório de Neuroanatomia – Departamento de Morfologia – DMOR/UFRN.

Para o presente estudo, todos os cuidados foram tomados no sentido de evitar

dor e sofrimento aos animais durante os procedimentos experimentais, seguindo

estritamente às normas e princípios da Lei Arouca, a qual versa sobre o tratamento

de animais em pesquisas e atividades científicas e às normas estabelecidas pelo

Comitê de Ética para uso de Animais da UFRN (CEUA). O projeto referente a este

estudo foi aprovado pelo CEUA (protocolo N.º 009/2012 – anexo).

3.2 MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA

Todos os espécimes capturados e utilizados no estudo foram identificados por

uma especialista em quirópteros (Msc. Marília Abero Sá de Barros). Em campo, a

27

identificação até o nível de espécie foi baseada em um conjunto de características

morfológicas externas de acordo com os estudos propostos por Aguirre et al. (2009),

Haynes e Lee Jr. (2004), Hollis (2005), Miranda et al. (2011), Reis et al. (2013) e

Simmons e Voss (1998).

Para diferenciação de espécies do gênero Artibeus, estes estudos levam em

consideração, especialmente, padrões da pelagem, das listras faciais e da

morfologia da folha nasal. A espécie foi identificada como Artibeus planirostris por

apresentar: 1. Pelagem castanho-claro ou cinza-clara, curta, pouco densa e áspera;

2. Listras faciais pouco evidentes; 3. Borda inferior da folha nasal completamente

livre; 4. Antebraço com poucos pelos; 5. Pontas das asas esbranquiçadas; 6. Bordas

das orelhas e trago de coloração não diferenciada; 7. Ausência de máscara escura

ao redor dos olhos.

Para confirmação da identificação taxonômica em laboratório, um indivíduo da

espécie foi sacrificado para retirada e exame detalhado do crânio. A confirmação da

espécie com base na morfometria craniana foi realizada segundo os estudos de

Barquez et al. (1999), Haynes e Lee Jr. (2004), Hollis (2005) e Simmons e Voss

(1998). Esta análise confirmou a identificação do indivíduo como A. planirostris,

devido à ocorrência das seguintes características morfológicas: 1. Constrição pós-

orbitária ampla (> 7,3 mm); 2. Arco supraorbital pouco acentuado; 3. Processo pós-

orbital pouco desenvolvido; 4. Presença de terceiro molar superior; 5. Largura do

canino (> 8,4 mm); 6. Maior comprimento do crânio (> 29.5 mm).

3.3 PROCEDIMENTOS

3.3.1 ANESTESIA

Os animais foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal de ketamina

(5mg/Kg), xilazina (0,5mg/Kg), diazepam (0,5mg/Kg) e cloridrato de tramadol

(5mg/Kg).

3.3.2 PERFUSÃO

Depois de anestesiados, cada animal foi submetido à perfusão transcardíaca,

compreendendo os seguintes passos:

28

I- Posicionamento do animal em decúbito dorsal sobre tela de arame e sob

ponto de água;

II- Toracotomia, com incisão de pele, músculos e arco costal, sendo estes

removidos em bloco, para exposição do coração;

III- Cardiopunção no ventrículo esquerdo, utilizando uma agulha 16G (1,5 x

10 mm), a qual foi direcionada para a aorta ascendente, seguindo uma

incisão no átrio direito. A agulha foi conectada a uma bomba peristáltica

(Cole-Parmer), passando-se 150 ml de solução salina a 0,9% em tampão

fosfato 0,1M, pH 7,4 com heparina (Parinex, Hipolabor, 2ml/1000ml de

solução salina) a um fluxo de 60 ml/min, seguida de 300 ml de solução de

paraformaldeido 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, dos quais 150 ml a

um fluxo inicial de 60 ml/min e 150 ml o fluxo final de 30 ml/min, durando

todo o procedimento de perfusão aproximadamente em média 30 minutos.

3.3.3 REMOÇÃO DOS ENCÉFALOS

Após perfundidos, os encéfalos foram retirados da cavidade craniana, com

uso de um osteótomo. Em seguida, foram pós-fixados na mesma solução

fixadora utilizada na perfusão por duas horas e então colocados em solução

sacarose 30% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, a 4 ºC, até serem submetidos à

microtomia.

3.3.4 MICROTOMIA

Os encéfalos foram congelados através de gelo seco e depois seccionados

utilizando um micrótomo de deslizamento (Leica SM 2000R). Foram obtidas

secções coronais de 30 μm de espessura, as quais foram distribuídas

sequencialmente em 6 compartimentos, em um meio líquido contendo tampão

fosfato 0,1M, pH 7,4, de maneira cíclica e sequenciada. A distância entre uma

secção e a outra imediatamente seguinte de um mesmo compartimento é de

aproximadamente 180 μm. Os cortes de um compartimento foram montados em

lâminas de vidro e submetidos à coloração de Nissl, o que permitiu a

demarcação das estruturas. Os cortes selecionados dos demais compartimentos

restantes (cinco) foram armazenados em solução anticongelante (sacarose,

29

etileno glicol e tampão fosfato 0,05M pH 7,4) e conservados a -20 ºC para

utilização posterior em procedimentos de imunofluorescência.

3.3.5 MÉTODO DE NISSL

Para o estudo da citoarquitetura foi utilizado à coloração pelo método de

Nissl, utilizando o corante thionina. Através do método de Nissl, foram corados: o

retículo endoplasmático rugoso, o núcleo e o nucléolo das células, podendo ser

elas tanto neurônios como células da glia, tornando assim possível a

identificação de seu tamanho, forma e localização. A cor da marcação é azul-

arroxeada. Foram montados em lâminas de vidro gelatinizados os cortes de uma

das séries de cada encéfalo.

Os cortes foram montados em lâminas gelatinizadas e deixados secar por

aproximadamente uma semana. Em seguida, foram submetidos à coloração de

Nissl, passando inicialmente por uma desidratação dos cortes em concentrações

crescentes de alcoóis etílicos (1x 70% por 2h, 2x 95% por 3 minutos cada, 2x

100% por 3 minutos cada) sendo posteriormente diafanizadas em xilol (1x por 3

minutos e 1x por 30 minutos). Os cortes foram reidratados em concentrações

decrescentes de alcoóis etílicos por 2 minutos cada, chegando a thionina onde

ficou por 40 segundos. Foram então mergulhados 15 vezes em água destilada e

novamente desidratados (álcool 50% 1x, 1x 70%, 2x 95%, 3x 100% por 2

minutos cada) e diafanizados (2x em xilol por 2 minutos cada), sendo, ao final,

cobertos com lamínula utilizando como meio de montagem o Entellan.

3.3.6 IMUNOFLUORESCÊNCIA

As demais séries dos encéfalos dos animais foram submetidas para

imunofluorescência com o objetivo de identificar neurônios imunorreativos às

proteínas ligantes de cálcio (CaBP): Calbindina (CB), Calretinina (CR) e

Parvalbumina (PV). Os anticorpos que foram utilizados nesse estudo foram os

mesmos utilizados previamente em outros estudos nesse laboratório, e por não

apresentarem nenhuma reação cruzada e por terem sido testados, dispensaram

a necessidade de haver um grupo controle.

30

As reações da imunofluorescência foram realizadas com os cortes

mergulhados em solução e foram utilizados anticorpos contra cada uma das

substâncias supracitadas. Utilizamos o protocolo a seguir:

1- Os cortes foram submetidos a 5 lavagens durante 5 minutos cada,

em solução de tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, em agitador orbital.

2- Pré-tratados com boridreto de sódio 1%, durante 20 minutos.

3- Seguiram em 5 lavagens em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, de 5

minutos cada.

4- Foi realizado o bloqueio com 150µl de albumina de soro bovino

(BSA) e 2.850 µl de Triton X-100, durante 1 hora.

5- 5 lavagens em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, de 5 minutos cada.

6- Incubação do anticorpo primário: 3µl de anticorpo primário diluído

em 60µl de BSA e 2.937µl de Triton X-100 a 0,4%, overnight, à

temperatura ambiente, em rotor. Diluição 1:1000.

7- 5 lavagens em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, de 5 minutos cada.

8- Incubação do anticorpo secundário fluorescente: 6µl de anticorpo

secundário diluído em 2.994µl de Triton X-100 a 0,4%, durante 120

minutos, à temperatura ambiente, em rotor. Diluição 1:500.

9- 3 lavagens em solução tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, de 5 minutos

cada.

10- Montagem dos cortes em lâminas de vidro previamente

gelatinizadas e secagem à temperatura ambiente.

11- Após a secagem, as lâminas foram cobertas com lamínulas

utilizando como meio de montagem ERV-Mount (Erviegas Ltda),

estando prontas para serem examinadas ao microscópio de

fluorescência.

Os anticorpos que foram utilizados com suas respectivas diluições e

fabricantes são expostos na tabela a seguir:

31

Tabela 1. Substâncias, anticorpos e soro normal com diluições utilizadas:

Substância

Anticorpo primário (diluição)

Anticorpo secundário fluorescente (diluição)

CR Rb α CR (1:1000) SIGMA Gt α Rb 488 (1:500) ABCAM

CB Ms α CB (1:1000) SIGMA Dk α Ms 594 (1:500) ABCAM

CR Rb α CR (1:1000) CHEMICON Gt α Rb 594 (1:500) ABCAM

PV Ms α PV (1:1000) SIGMA Dk α Ms 488 (1:500) ABCAM

3.4 OBTENÇÃO DAS IMAGENS

As secções do encéfalo montados em lâminas histológicas foram analisadas

através de microscópio óptico e de fluorescência (Nikon Ni-U) e então selecionadas.

As imagens digitais foram obtidas através de uma câmera de vídeo (Nikon DS-Ri1)

acoplada ao microscópio, ajustado com as objetivas de 2X, 4X, 10X, 20X e 40X, e

conectada a um computador com o software NIS instalado. As imagens foram

analisadas e, com o auxílio do software Canvas 12, transformadas em escala de

cinza e ajustadas para brilho, contraste e resolução. O software Canvas 12 também

foi utilizado para a construção dos esquemas, tomando como base o atlas

estereotáxico do cérebro do rato (PAXINOS e WATSON, 2007) e atlas do morcego

Desmodus rotundus murinus (BHATNAGAR, 2008).

3.5 ANÁLISE MORFOMÉTRICA

Em relação à mensuração das células, foram utilizadas secções frontais do

encéfalo dos cinco exemplares de A. planirostris submetidos à coloração de Nissl.

Todos os cortes que representavam a região de interesse foram amostrados para

cada núcleo, a fim de obter o perfil celular em toda a extensão rostrocaudal dos

núcleos estudados. Foi utilizado o software NIS ELEMENTS AR para medir a área

das células, bem como para selecionar as células que foram mensuradas. As

medições foram realizadas nas objetivas de 10X e 20X.

32

Para seleção das células, o software gerou uma grade com linhas verticais e

horizontais distantes em 100µm, onde as células que estavam dentro dos quadrados

e que estavam na região de interesse foram selecionadas. Para o CC, foram

selecionadas 50 células por corte em cada subdivisão. Ao final de cada sessão de

contagem, uma tabela de áreas celulares foi disponibilizada pelo software NIS. Estes

dados foram exportados para o Excel e utilizados em posterior análise no software

estatístico.

Para calcular o comprimento rostrocaudal do complexo coclear, foi utilizado o

seguinte cálculo: Nº de cortes por compartimento * distância entre os cortes.

Chegando assim ao valor do comprimento da estrutura estudada.

3.6 ANÁLISE ESTEREOLÓGICA

Para estimar o volume de ambos os núcleos (direito e esquerdo), foram

selecionados entre 6 a 7 imagens, na coloração de Nissl de cinco espécimes,

contendo os núcleos em um aumento de 40 vezes. A amostragem de cada área foi

sistemática e uniformemente aleatória (SURS) (GUNDERSEN et al., 1999). Essas

imagens foram analisadas com o auxílio do software Canvas 12, utilizando sempre o

mesmo computador e o mesmo zoom a fim de evitar equívocos na análise.

A partir da imagem, posicionamos um grid de contagem, respeitando os limites

da figura a ser analisada, contendo pontos equidistantes e com área conhecida.

Para o CC foi utilizado grid de 100 µm com área por ponto de 35.061 µm2. Em cada

imagem, os pontos que tocavam toda a dimensão do CC foram contados. O método

para calcular o volume foi o de Cavalieri com o seguinte cálculo: V= Σp * a/p * t * F-1,

onde Σp é a soma dos pontos que tocam o núcleo, a/p é a área dos pontos, t é a

espessura do corte e F-1 é o inverso da distância entre os cortes (HOWARD e REED,

2010). Para testar a confiabilidade dos dados, foi realizado o teste de coeficiente de

erro, onde se observou um valor de 2%, sendo menor do que o limite de 15%

(GUNDERSEN et al., 1999).

3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para todos os testes, foi realizada previamente a análise de normalidade dos

dados, através do teste de Kolmogorov-Smirnov. Os dados obtidos foram expressos

33

em média ± desvio padrão (DP). Foi realizado o Test t Student para amostras

independentes. Para análise de múltiplas comparações foi utilizado análise de

variância (ANOVA) de uma via seguido do pós-teste de Bonferroni. Um valor de

p<0,05 foi considerado como estatisticamente significativo. O software estatístico

utilizado foi o GraphPad Prism 6.0.

4. RESULTADOS

O presente estudo fornece a primeira descrição detalhada da avaliação

citoarquitetônica pelo método de Nissl e imunoistoquímica para CaBP (PV, CR e CB)

do CC de morcego Artibeus planirostris. Os dados foram organizados em duas

sessões obedecendo à ordem rostrocaudal das secções coronais.

4.1. CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA, MORFOMÉTRICA E

ESTEREOLÓGICA DO COMPLEXO COCLEAR

Entre os exemplares analisados, o comprimento do encéfalo variou entre

16,1 e 21,5mm, com um valor médio de 17,65mm, do polo frontal do córtex cerebral

ao limite bulbo-espinal. A análise das secções coronais do encéfalo do A. planirostris

coradas pelo método de Nissl revelaram que o CC estende-se desde a porção

média da ponte até o nível mais rostral do bulbo ao longo do eixo rostrocaudal. O

CC destaca-se como um conjunto celular heterogêneo citoarquitetônicamente,

disposto látero-inferiormente ao pedúnculo cerebelar inferior (icp) e lateralmente ao

nervo vestibulococlear (8n), tracto espinal do trigêmio (sp5) e corpo trapezoide (tz)

ao longo da maior parte de sua extensão (Figura 9). Adicionalmente, é possível

verificar que o CC em A. planirostris aparentemente sofre um aumento em seu

tamanho ao longo do eixo rostrocaudal, ocupando toda a porção lateral do bulbo nos

níveis médios e finalmente apresentando uma aparente redução em seu tamanho,

assumindo uma posição mais dorsal nas secções caudais. Assim, verificamos

quanto à topografia, uma dorsalização do complexo em relação à parede lateral do

tronco encefálico ao longo de sua extensão rostrocaudal (Figura 9A, B e C).

34

Figura 9. Esquemas de secções coronais, baseadas no método do Nissl, do

encéfalo de Artibeus planirostris mostrando as delimitações do CC nos níveis rostral,

médio e caudal. As linhas pontilhadas demarcam a estrutura de interesse. Barra:

1000 μm.

35

O método de Nissl permitiu identificar todas as subdivisões clássicas

descritas até o presente (Figura 10, 11 e 12). O núcleo coclear ventral porção

anterior (VCA) surge nas secções rostrais como um pequeno aglomerado de células

predominantemente arredondadas (Figura 10A e B). Nas secções médias, o CC

sofre um pequeno aumento no seu tamanho, sendo possível verificar a presença do

núcleo coclear ventral porção posterior (VCP) com células fusiformes mais

esparsamente distribuídas em posição mais inferior (Figura 11A e C). Neste mesmo

nível é possível verificar a presença de uma fina camada celular densamente corada

pelo método de Nissl, lateral e dorsalmente posicionada ao VCP, a qual

denominamos de núcleo coclear ventral anterior porção granular (VCAGr) (Figura

11A e B). A sequência rostrocaudal do CC de A. planirostris apontou o surgimento

do núcleo coclear dorsal (DC), superiormente ao VCP nos níveis médios do

complexo (Figura 11A).



CC em A. Ampliação da caixa em A, mostrando em detalhe a morfologia

arredondada das células do VCA (B). Barra: 500 μm em A e 50 μm em B.

36

Adicionalmente, foi possível verificar a gradativa diminuição no tamanho

relativo do VCA ao longo da extensão rostrocaudal (Figura 11A). O DC foi

caracterizado por subpopulações celulares distintas citoarquitetonicamente, sendo

possível identificar a presença de três lâminas celulares dispostas obliquamente em

relação ao plano mediano, tendo sido essas classificadas do plano mais profundo ao

superficial tanto nas secções médias quanto nas secções caudais: núcleo coclear

dorsal profundo (DCDp) (Figura 12A e D); núcleo coclear dorsal fusiforme (DCFu)

(Figura 12A e C) e núcleo coclear dorsal molecular (DCMo) (Figura 12A e C). Nas

secções em nível caudal do CC, o icp delimita-o medialmente em quase todo o seu

eixo dorsoventral, bem como, foi possível verificar a manutenção da laminação

celular do DC (Figuras 9C e 12A).



CC em A. Ampliação da caixa em A, mostrando em detalhe a morfologia ovóide e

pequena (seta) das células do VCAGr (B) e a morfologia fusiforme e espaçada das

células do VCP (C). Barra: 500 μm em A e 50 μm em B e C.

37



CC em A. Ampliações das caixas em A, mostrando em detalhe a morfologia

pequena e granular das células do DCMo (B), a morfologia fusiforme (seta) das

células do DCFu (C) e a morfologia arredondada e maior das células do DCDp (D).

Barra: 500 μm em A e 50 μm em B, C e D.

A análise morfométrica permitiu caracterizar os perfis celulares do CC, onde

observamos a predominância de células arredondadas distribuídas

heterogeneamente por toda a extensão do complexo. A morfometria viabilizou a

organização do CC em distintas subdivisões. A subdivisão ventral (VC) e dorsal (DC)

do complexo foram caracterizadas por células arredondadas e ovóides,

apresentando média de área de 127,4±6,7 μm2 e 115,6±8,8 μm2 respectivamente.

Em geral, os neurônios no VC apresentaram-se distribuídos de forma difusa dentro

dos limites citoarquitetônicos do núcleo comparadas à distribuição neuronal no DC.

38

Em conjunto, foi observada diferença significativa entre as médias das áreas

celulares do VC e do DC (p<0,05). Os dados por animais encontram-se descritos na

Tabela 2.

Tabela 2. Análise morfométrica. Valores expressos como média ± desvio padrão da

área celular em casos investigados por subdivisão no CC.

CC

VC DC

Animalm / Peso (g) Média ± DP (μm2) Média ± DP (μm2)

M1 / 45,50 127 ± 22 126 ± 33

M2 / 46,00 122 ± 16 108 ± 37

M3 / 47,00 132 ± 22 115 ± 49

M4 / 39,50 120 ± 15 123 ± 36

M5 / 43,00 136 ± 18 106 ± 38

Média 127,4 ± 6,7a 115,6 ± 8,8a

Legenda: a VC vs DC p < 0.05; teste t; m morcego.

A análise citoarquitetônica confirmou a existência da subdivisão do VC em

uma porção anterior denominada VCA caracterizada por formas celulares

arredondadas e média de área celular de 138,2±8,2 μm2. Além disso, identificamos

a porção posterior denominada de VCP caracteristicamente com formatos neuronais

fusiformes e distribuídos mais difusamente em relação ao VCA. As médias de área

celular no VCP foi de 138,2±8,9 μm2, não havendo diferenças significativas entre

essas duas subdivisões do complexo por esse parâmetro. Por fim, foi possível

identificar VCAGr com células pequenas e ovóides. A média da área celular na

porção citada equivale a 27±5,8 μm2. Em conjunto, quando analisados os dados

observou-se uma diferença significativa do VCAGr entre as duas outras porções,

VCA e VCP (p<0,001). Os valores individuais por animais podem ser observados na

Tabela 3.

39

Tabela 3. Análise morfométrica. Valores expressos como média ± desvio padrão da área celular em casos investigados por

subdivisão do CN.

Legenda: a DCMo vs DCFu p < 0.001; b DCMo vs DCDp p < 0.001; c DCFu vs DCDp p < 0.001; d VCAGr vs VCA p < 0.001;

e VCAGr vs VCP p < 0.001; ANOVA + Bonferroni post hoc; m morcego.

DC VC

DCMo DCFu DCDp VCA VCAGr VCP

Animalm / Peso (g) Média ± DP

(μm2)

Média ± DP

(μm2)

Média ± DP

(μm2)

Média ± DP

(μm2)

Média ± DP

(μm2)

Média ± DP

(μm2)

M1 / 45,50 23 ± 8 79 ± 40 121 ± 42 141 ± 25 24 ± 10 138 ± 32

M2 / 46,00 27 ± 10 62 ± 25 120 ± 52 130 ± 4 37 ± 19 133 ± 23

M3 / 47,00 28 ± 11 92 ± 34 134 ± 46 139 ± 5 24 ± 10 150 ± 20

M4 / 39,50 28 ± 9 91 ± 30 110 ± 32 131 ± 20 23 ± 8 127 ± 19

M5 / 43,00 24 ± 10 97 ± 32 123 ± 43 150 ± 22 27 ± 11 143 ± 25

Média 26,0 ± 2,3a, b 84,2 ± 14,1a, c 121,6 ± 8,6 b, c 138,2 ± 8,2d 27 ± 5,8 d, e 138,2 ± 8,9 e

40

Quando analisadas as laminações do DC, observou-se da camada mais

profunda à superficial, diferenças na morfologia celular. O DCDp apresentou uma

morfologia de células maiores e mais espaçadas entre si, esta porção possui média

de área celular de 121,6±8,6 μm2. O DCFu localizado entre as duas laminações,

apresentou uma fina camada de células achatadas súpero-inferiormente. A média da

área celular desta porção foi de 84,2±14,1 μm2. Por conseguinte, o DCMo é a

laminação mais superficial do núcleo, apresentando morfologia de células pequenas,

ovóides e granulares. A média da área celular desta porção foi de 26,0±2,3 μm2. Em

conjunto, observou-se diferenças entre as três laminações quando comparadas

entre si, sendo a camada do DCDp a que apresentou maiores áreas celulares

(p<0,001). Maiores detalhes podem ser observados na Tabela 3.

A partir da análise estereológica, foi possível calcular a estimativa de

volume total para o CC, onde a média do volume para o CC direito foi de 1,84±0,29

mm³ e a média do volume para o CC esquerdo foi de 1,98±0,20 mm³. Os antímeros

apresentaram volumes semelhantes não havendo diferença significativa entre eles

(p=0,4). O volume do CC foi dado a partir da média entre os dois antímeros,

totalizando o valor de 1,91±0,10 mm³. Posteriormente foi calculado o coeficiente de

erro para a estimativa do volume, apresentando média geral de 2%. Também foi

realizado o cálculo do comprimento rostrocaudal do CC, sendo este 7,2 mm. Análise

por animal descrita completamente na Tabela 4.

41

Tabela 4. Análise estereológica. Valores brutos seguidos da expressão destes

valores como média ± desvio padrão do volume do CC em casos investigados por

antímero.

CC

Esquerdo Direito

Animalm / Peso (g) Volume (mm³) Volume (mm³) Média ± DP (mm³)

M1 / 45,50 2,27 1,86 2,06 ± 0,29

M2 / 46,00 2,04 2,20 2,12 ± 0,11

M3 / 47,00 1,98 1,65 1,81 ± 0,23

M4 / 39,50 1,75 1,48 1,61 ± 0,19

M5 / 43,00 1,85 2,01 1,93 ± 0,11

Média 1,98 ± 0,20 1,84 ± 0,29 1,91 ± 0,10 (CE: 2%)

Teste t relativo aos

antímeros

NS NS

Legenda: m: morcego; NS: não significativo; CE: coeficiente de erro.

4.2. ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS PROTEÍNAS LIGANTES DE CÁLCIO NO

COMPLEXO COCLEAR

A análise da distribuição das CaBP no complexo coclear, através da técnica

de imunofluorescência permitiu identificar a presença de terminais e pericários

imunorreativos a CB em secções médias e caudais do complexo coclear apenas no

DCMo (Figura 13D e G). Por outro lado, a distribuição de fibras imunorreativos a CR

foi observada no DCDp das secções médias e uma densa imunorreatividade a CR

foi observada nas porções VCA e VCP (Figura 13B e E). Nas secções caudais do

complexo a imunorreatividade a CR foi caracterizada pela distribuição de pequenos

neurônios envolvidos por uma densa neurópila no DCDp e DCFu. Adicionalmente,

neurônios imunorreativos a CR aparentemente maiores em relação àqueles

observados no DC foram visualizados no VCP (Figura 13H). Embora não tenhamos

realizado nenhum tipo de quantificação, a análise preliminar da marcação

imunoistoquímica para CB e CR no complexo sugere a presença de neurônios

duplamente marcados na porção DCFu (Figura 13I). O conjunto de secções

42

submetidas à imunofluorescência para PV revelaram uma maciça marcação de

neurônios apenas nas porções DCMo e DCFu. O DCDp não apresentou elementos

imunocorados para PV (Figura 14D, G e J). Por outro lado, observamos neurônios

imunorreativos a PV em ambas as subdivisões do VC (Figura 14A, D e G).

Ressaltamos que uma grande proporção de neurônios no VC apresentou dupla

marcação para PV e CR (Figura 14C, F e I). Também podemos destacar que a

laminação encontrada no DC pôde ser melhor evidenciada pela distribuição das

CaBP, onde DCDp apresenta maior imunorreatividade para CR, enquanto que as

camadas DCFu e DCMo apresentam uma mistura entre neurônios imunorreativos a

CB e PV (Figura 13D e G e Figura 14G e J).

43


de Artibeus planirostris mostrando a expressão de CB (vermelho) nos neurônios do

CC no sentido rostrocaudal em A, D e G. Expressão de CR (verde) nos neurônios do

CC no sentido rostrocaudal em B, E e H. Sobreposição das marcações CB

(vermelho) + CR (verde) no CC nos três níveis: rostral, médio e caudal em C, F e I.

Os asteriscos representam ampliação da área para melhor visualização dos


45


de Artibeus planirostris mostrando a expressão de PV (verde) nos neurônios do CC

no sentido rostrocaudal em A, D, G e J. Expressão de CR (vermelho) nos neurônios

do CC no sentido rostrocaudal em B, E, H e K. Sobreposição das marcações PV

(verde) + CR (vermelho) no CC nos três níveis: rostral, médio e caudal em C, F, I e

L. Os asteriscos representam ampliação da área para melhor visualização dos


46

5. DISCUSSÃO

5.1 CITOARQUITETURA

O CC formado pelo DC e VC recebe entrada da porção coclear do nervo

vestibulococlear, oitavo par craniano. A divisão em ventral e dorsal ocorre em todas

as espécies estudadas até o presente. Entretanto, os estudos de anatomia e a

fisiologia apresentam uma tendência a abordar mais o DC, isso ocorre nas variadas

espécies, incluindo o humano (BAIZER et al, 2014), morcego (ZOOK e

CASSEDAY,1982), o babuíno (MOORE et al., 1996), o gato (OSEN, 1969), a

chinchila (FLECKEISEN et al., 1991), a cobaia (HACKNEY et al., 1990), o hamster

(ZHANG e GUAN, 2008), o macaco (RUBIO et al., 2008), o rato (WOUTERLOOD et

al., 1984; BAZWINSKY et al., 2008), o coelho (DISTERHOFT et al., 1980), o gambá

(RYUGO et al., 1995). Se observarmos, os estudos tendem a seguir a descrição de

um núcleo específico do complexo, ao invés de relatar a descrição do complexo

total. Com base nisso, o presente estudo se propôs a analisar todas as divisões do

complexo de Artibeus planirostris.

Os neurônios nos CN os quais diferem em suas propriedades anatômicas e

fisiológicas, originam diferentes caminhos auditivos paralelos ascendentes,

relacionados com o processamento de aspectos específicos das informações

acústicas, portanto, é essencial para maior compreensão do processamento auditivo

do tronco encefálico (TYPLT et al, 2012). Para a subdivisão do VCA, três principais

tipos de células morfológicas foram descritas por Osen (1969) no gato: células

espessas esféricas, células espinhas globulares e células estreladas, onde é

descrito que os tipos celulares encontrados apresentam relação direta com a função

da cóclea e suas fibras emitidas até o complexo coclear. Se compararmos aos

achados observados em nosso estudo, é possível encontrar semelhanças com as

células esféricas e as globulares, sendo encontradas também na porção anterior do

VC. As células se apresentam de morfologia semelhante, e principalmente quando

se leva em consideração que o VCA recebe os feixes de axônios da cóclea,

apresentando assim uma possível morfologia celular associada a sua função.

Assim como observado em A. planirostris, as diferenças anatômicas são mais

óbvias na laminação celular do DC do que no VC dos CN em mamíferos. De forma

47

evolutiva, se partirmos dos mamíferos não primatas, passando pelos primatas não

humanos e chegando até o homem, há uma redução progressiva: 1) no número de

células granulares no CC; 2) a organização das células DCFu (também

denominadas bipolares ou piramidais); 3) diminuição da laminação de células

granulares associadas no DC; e 4) perda da camada granular entre o VCA e VCP

(FUSE, 1913; MOSKOWITZ, 1969; DUBLIN, 1976; MOORE e OSEN, 1979,

MOORE, 1980; HEIMAN-PATTERSON e STROMINGER, 1985). Sendo assim, a

relação da utilização do sistema auditivo com a organização celular está

completamente envolvida com os aspectos comportamentais e evolutivos de cada

espécie.

Um estudo em Macaca mullata indica que o DC de primata não humano

contém uma arquitetura de células granulares apropriada para realizar a integração

de entrada acústica e somatossensorial usada por não primatas para se orientar

para sons, argumentando que as características neuronais entre os DC são

semelhantes (RUBIO et al., 2008). Sabemos que este processo das células

granulares se repete na nossa espécie estudada, encontradas no VCAGr e DCMo,

tendo em vista a utilização de seu aparelho auditivo como importante meio de

localização e orientação espacial. No VC dos primatas, os mesmos tipos de células

anatômicas são encontrados em outros mamíferos. As células arbustivas são mais

comuns anteriormente, enquanto as células multipolares são mais comuns

posteriormente (ADAMS, 1986; ADAMS, 1997; RHODE et al,. 2010).

5.2 ESTEREOLOGIA

O CC se apresenta distinto em várias espécies entre os vertebrados, podendo

ter relação direta com seu estilo de vida e principalmente em alguns casos pela

utilização do sistema auditivo no seu cotidiano. Um exemplo disso, os morcegos,

possuem um DC relativamente bem desenvolvido, ligeiramente laminado e, em

contraste com os golfinhos, que mesmo utilizando um sistema de ecolocalização no

ambiente aquático, possuem um DC muito pouco desenvolvido (MALKEMPER et al.,

2012). Nas focas, como os golfinhos, a orelha externa é muito reduzida e seu DC

apresentam os padrões celulares menos organizados como em humanos (HALL et

al., 1974). Essas características são refletidas quando pensamos em volume e

tamanho do CC de cada espécie. O estudo proposto por Glendenning e Masterton

48

(1998), trouxe um panorama entre mais de 50 espécies de mamíferos e suas

características auditivas, dentre elas o volume do CC. Pensando nisso, podemos

observar a grande semelhança entre o volume do CC do modelo experimental,

morcego Artibeus planirostris, com os roedores e lagomorfos. Quando comparamos

com outra espécie de quiróptero, uma espécie de porte menor, observamos que o

nosso modelo experimental apresentou volume relativamente maior ao morcego little

brown (Myotis lucifugus), significando assim que os aspectos anatômicos, físicos,

hábitos, alimentação e estilo de vida são alguns dos dados que interferem nessa

questão de volume estrutural dos núcleos estudados e avaliados. Alguns dos dados

comparativos podem ser visualizados na tabela 5.

Tabela 5. Volume do complexo coclear de 10 espécies de mamíferos com peso

corporal de cada exemplar (em gramas).

Nome comum Gênero e espécie Peso corporal

(gramas)

Volume CC

(mm³)

Morcego Artibeus planirostris 44,2 1,91

Morcego (little brown)* Myotis lucifugus 8,61 0,78

Gato* Felis catus 3,068 15,44

Chinchila* Chinchila laniger 580 5,52

Humano* Homo sapiens 64,922 45,62

Macaco* Macaca mulatta 3,300 3,39

Camundongo* Mus musculus 27 0,75

Coelho* Oryctolagus cuniculus 5,230 3,71

Rato (Norway)* Rattus norvegicus 226 2,76

Golfinho* Delphinus delphis 61,000 99,54

* Dados comparativos retirados de estudos anteriores (GLENDENNING e

MASTERTON, 1998; MALKEMPER et al., 2012).

49

5.3 IMUNOISTOQUÍMICA

No estudo desenvolvido em rato e várias outras espécies proposto por Baizer

e colaboradores (2014), a imunorreatividade para CB foi relativamente uniforme com

corpos celulares dispersos na camada molecular do DC. Na imunorreatividade para

CR, as camadas mais externas têm menos elementos marcados, apresentando

imunomarcação apenas nas camadas DCDp do dorsal e VCA e VCP do ventral.

Imunorreatividade para PV foi observada na camada externa, molecular, do DC

(BAIZER et al, 2014). Podemos analisar tais resultados se apresentando muito

similares a distribuição de CaBP encontrada em A. planirostris, entretanto o que

apresenta maior proximidade morfológica é o rato. Este dado corrobora com os

aspectos anatômicos do nosso modelo experimental, onde se mostra mais próximo

do rato do que do camundongo, por exemplo. E o padrão se repete quando é

analisado a imunorreatividade celular e suas populações neuronais. Mesmo fugindo

um pouco da escala evolutiva e os morcegos se apresentando mais próximos dos

primatas, é curioso sua similaridade com os roedores, o que pode ser pensado como

estilo de vidas similares ou algum aspecto comportamental envolvido influenciando

diretamente na anatomia e neuroquímica dos quirópteros.

A imunorreatividade para CB foi descrita em três populações de células:

cartwheels cells (ovóides e pequenas) da camada molecular do morcego (ZETTEL

et al., 1991), da chinchila (FRISINA et al., 1995), da cobaia e o rato (SPATZ, 1997)

e do macaco (RUBIO et al., 2008), células de Purkinje do rato e da cobaia (SPATZ,

1997, 2003) e células unipolar brush cells no sagui (SPATZ, 2000). No estudo

proposto por Baizer e colaboradores (2014), não foram observados os perfis que se

assemelham às cartwheels cells nas seções imunorreativas a CB em humanos. Foi

verificado as células de Purkinje no ser humano, sugerindo que há expressão CB e

que os métodos são suficientes para detectá-la. Em contraste, muitos neurônios

imunorreativos a CB foram observados várias vezes nas camadas mais externas do

DC, sendo encontrados em todas as outras espécies. Alguns ou todos esses

neurônios provavelmente correspondem às cartwheels cells. Em A. planirostris a

imunorreatividade para CB, foi encontrada muito bem marcada nas camadas mais

externas do DC, prioritariamente na camada molecular, sendo assim classificada

como células pequenas e granulares, como as cartwheels cells.

50

Em estudos realizados com rato, a expressão de CR foi observada em corpos

celulares dispersos nas camadas fusiforme e profunda do DC (ARAI et al., 1991,

FLORIS et al., 1994; SPATZ, 2000; MANOHAR et al., 2012). Em humano, os

processos marcados com CR funcionam ao longo do DC na camada mais externa,

molecular. O padrão de imunomarcação para CR variou entre as outras espécies.

No gato, muito poucos corpos celulares são marcados, enquanto que em ratos e

cobaias existem muitos corpos celulares dispersos. Na chinchila, CR está presente

em uma ampla faixa de células abaixo da camada molecular, precisamente na

camada fusiforme (CHUNG et al., 2009; BAIZER et al., 2014). Analisando os

achados é possível observar que o nosso modelo experimental apresenta padrão de

imunomarcação para CR semelhante ao encontrado em rato e em chinchila.

Os resultados encontrados em relação a distribuição de PV são

inconsistentes entre as espécies. Celio (1990) não encontrou PV em corpos

celulares nos CN de rato, embora ele descrevesse axônios e terminais

imunorreativos a PV. Em contraste, Bazwinsky e colaboradores (2008) relataram que

no rato houve a imunorreatividade para PV em todos os neurônios do DC. Já Baizer

e colaboradores (2014) relataram que foram encontradas grandes diferenças entre

as espécies na coloração para PV, onde em seres humanos, o PV também marcou

fibras longas na camada molecular e fusiforme. Em gato, o PV não marcou fibras,

mas corpos celulares espalhados em toda a largura do DC. Em cobaia, corpos de

células fusiformes são imunorreativos a PV. Em chinchila e em rato, há PV nos

corpos celulares na camada molecular. Isto mais uma vez corrobora com os

achados em nossa espécie, trazendo um padrão de distribuição das CaBP similar

aos roedores.

51

6. CONCLUSÃO

Poucos estudos abordam a organização citoarquitetônica e o padrão de

distribuição de proteínas ligantes de cálcio no sistema auditivo de quirópteros. Nosso

estudo é o primeiro realizado em morcego Artibeus planirostris que descreve

características morfométricas e estereológicas. Estes parâmetros nos permitiram

concluir que o CC apresenta duas divisões principais (CN ventral e dorsal)

evidenciadas pela análise com o método de Nissl. As médias de área celular

observadas entre DCDp, DCFu, DCMo, VCA, VCAGr e VCP são significativamente

diferentes entre si, onde os neurônios do VCA e VCP apresentaram as maiores

médias de área celular. O CC apresenta estimativa de volume e comprimento de

1,91 mm³ e 7,2 mm, respectivamente. A interferência da ecolocalização nas

características morfológicas no encéfalo do nosso modelo experimental pode

esclarecer as especificidades neuroquímicas relacionados à distribuição das CaBP.

Contudo, mais estudos morfológicos, comportamentais e fisiológicos são

necessários para elucidar melhor a proximidade anatômica e hipoteticamente

funcional do nosso modelo experimental com os roedores, sobretudo os ratos.

52

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS*

Adams JC. 1986. Neuronal morphology in the human cochlear nucleus. Arch

Otolaryngol Head Neck Surg 112:1253–1261.

Adams JC. 1997. Projections from octopus cells of the posteroventral cochlear

nucleus to the ventral nucleus of the lateral lemniscus in cat and

human. Auditory Neurosci 3:335–350.

Aguirre, LF, Vargas A, Solari S. 2009. Clave de campo para la identificación de

los murciélagos de Bolivia. Cochabamba. Centro de Estudios en

Biología Teórica y Aplicada.

Altringham JD. 1996. Bats: Biology and Behaviour. Oxford: Oxford University

Press.

Andressen C, Blümcke I, Celio MR. 1993. Calcium-binding proteins: selective

markers of nerve cells. Cell and Tissue Research 271:181–208.

Aquino AMCM, Araújo MS. 2002. As vias auditivas: periférica e central. In:

Processamento auditivo – Eletrofisiologia e psicoacústica. São Paulo:

Lovise 17-31.

Arai R, Winsky L, Arai M, Jacobowitz DM. 1991. Immunohistochemical

localization of calretinin in the rat hindbrain. J Comp Neurol 310:21–44.

Arif SH. 2009. A Ca (2+)-binding protein with numerous roles and uses:

parvalbumin in molecular biology and physiology. BioEssays 31:410–

21.

Baizer JS., Wong KM, Paolone NA, Weinstock N, Salvi RJ, Manohar S, Hof PR.

2014. Laminar and neurochemical organization of the dorsal cochlear

nucleus of the human, monkey, cat, and rodents. The Anatomical

Record 10: 1865-1884.

Baker RJ, Bininda-Emonds ORP, Mantilla-Meluk H, Porter CA, Van den Bussche

RA. 2012. Molecular time scale of diversification of feeding strategy and

morphology in New World Leaf-Nosed Bats (Phyllostomidae): a

* De acordo com as normas da revista The Journal of Comparative Neurology.

53

phylogenetic perspective. In: Gunnell GF, Simmons NB, editor.

Evolutionary History of Bats: Fossils, Molecules, and Morphology.

Cambridge: Cambridge University Press. p. 385-409.

Barquez RM, Mares MA, Braun JK. 1999. The Bats of Argentina. Lubbock,

Special Publications of the Museum of Texas Tech University Number

42.

Bazwinsky I, Hartig W, Rubsamen R. 2008. Characterization of cochlear nucleus

principal cells of Meriones unguiculatus and Monodelphis domestica by

use of calcium-binding protein immunolabeling. J Chem Neuroanat

35:158–174.

Bhatnagar KP. 2008. The brain of the common vampire bat, Desmodus rotundus

murinus (Wagner, 1840): a cytoarchitectural atlas. Brazilian Journal of

Biology, 68(3), 583-599.

Bourk TR, Mielcarz JP, Norris BE. 1981. Tonotopic organization of the

anteroventral cochlear nucleus of the cat. Hear 4:215–241.

Braunewell KH, Gundelfinger ED. 1999. Intracellular neuronal calcium sensor

proteins: a family of EF-hand calcium-binding proteins in search of a

function. Cell and Tissue Research 295:1–12.

Butler BE, Lomber SG. 2013. Functional and structural changes throughout the

auditory system following congenital and early-onset deafness:

implications for hearing restoration. Frontiers in systems neuroscience.

Caspary DM, Ling L, Turner JG, Hughes LF. 2008. Inhibitory neurotransmission,

plasticity and aging in the mammalian central auditory system. Journal

of Experimental Biology 11:1781-1791.

Celio MR. 1990. Calbindin D-28k and parvalbumin in the rat nervous system.

Neuroscience 35:375–475.

54

Chung S-H, Marzban H, Watanabe M, Hawkes R. 2009. Phospholipase Cbeta4

expression identifies a novel subset of unipolar brush cells in the adult

mouse cerebellum. Cerebellum 8:267–276.

Datzmann T, von Helversen O, Mayer F. 2010. Evolution of nectarivory in

phyllostomid bats (Phyllostomidae Gray, 1825, Chiroptera:

Mammalia). BMC Evolutionary Biology, 1:165.

Davletov BA, Sudhof TC. 1993. A single C2 Domain from synaptotagmin-I is

sufficient for high affinity Ca2+/phospholipid binding. Journal of

Biological Chemistry 268:26386–26390.

Dewey CW. 2006. Neurologia de cães e gatos-Guia prático. Editora Roca.

Disterhoft JF, Perkins RE, Evans S. 1980. Neuronal morphology of the rabbit

cochlear nucleus. J Comp Neurol 192:687–702.

Dublin WB. 1976. Fundamentals of sensorineural auditory pathology. Thomas.

Dyce KM, Wensing CJG, Sack WO. 2004. Tratado de anatomia veterinária.

Elsevier Brasil.

Feng AS, Vater M. 1985. Functional organization of the cochlear nucleus of

rufous horseshoe bats (Rhinolophus rouxi): frequencies and internal

connections are arranged in slabs. J Comp Neurol 235:529–553.

Fenton MB. 1992. Bats. New York: Facts on File. Inc (265).

Féres MCL, Cairasco NG. 2003. Descrição anatômica da presença do íon zinco

nos núcleos cocleares. Rev Bras Otorrinolaringol 2:208-13.

Fernández VL, Bernardini M. 2010. Neurologia em cães e gatos. São Paulo:

MedVet.

Fleckeisen CE, Harrison RV, Mount RJ. 1991. Cytoarchitecture of cochlear

nucleus in the chinchilla. Acta Otolaryngol Suppl 489: 12–22.

55

Floris A, Diño M, Jacobowitz DM, Mugnaini E. 1994. The unipolar brush cells of

the rat cerebellar cortex and cochlear nucleus are calretinin-positive: a

study by light and electron microscopic immunocytochemistry. Anat

Embryol 189:495–520.

Frandson RD. 1979. Anatomia e fisiologia dos animais domésticos. Guanabara

Koogan.

Frisina RD, Zettel ML, Kelley PE, Walton JP. 1995. Distribution of calbindin D-28k

immunoreactivity in the cochlear nucleus of the young adult chinchilla.

Hear Res 85:53–68.

Fuse G. 1913. Das Ganglion ventrale und das Tuberculum acusticum bei einigen

Säugern und beim Menschen; Die Randgebiete des Pons und des

Mittelhirns. JF Bergmann 7:1–210.

Gerke V, Creutz CE, Moss SE. 2005. Annexins: linking Ca2+ signalling to

membrane dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology 6:449–

461.

Getty R. 1986. Sisson/Grossman anatomia dos animais domésticos. Vol. 2. Rio

de janeiro. Koogan.

Glendenning KK, Masterton RB. 1998. Comparative morphometry of mammalian

central auditory systems: variation in nuclei and form of the ascending

system. Brain, behavior and evolution 51:59-89.

Gundersen HJG, Jensen EBV, Kieu K, Nielsen J. 1999. The efficiency of

systematic sampling in stereology—reconsidered. Journal of

microscopy 3:199-211.

Hackney CM, Osen KK, Kolston J. 1990. Anatomy of the cochlear nuclear

complex of guinea pig. Anat Embryol 182:123–149.

Hall JG, Lindeman HH, Mathisen H. 1974. The cochlea and the cochlear nuclei in

the seals Cystrophora cristata and Phocida groenlandica. Neurobiology

4:105-115.

56

Haynes MA, Lee Jr TE. 2004. Artibeus obscurus. Mammalian species 752:1-5.

Heiman‐Patterson TD, Strominger NL. 1985. Morphological changes in the

cochlear nuclear complex in primate phylogeny and

development. Journal of morphology 3:289-306.

Heizmann CW, Hunziker W. 1991. Intracellular calcium-binding proteins: more

sites than insights. Trends in Biochemical Sciences 16:98–103.

Henkel CK. 2006. Sistema Auditivo. In: HAINES, D. E. Neurociência Fundamental

para Aplicações Básicas e Clínicas. Elsevier 3:391-408

Hof PR, Glezer II, Condé F, Flagg RA, Rubin MB, Nimchinsky EA, Weisenhorn

DMV. 1999. Cellular distribution of the calcium-binding proteins

parvalbumin, calbindin, and calretinin in the neocortex of mammals:

phylogenetic and developmental patterns. Journal of chemical

neuroanatomy 16:77-116.

Hollis L. 2005. Artibeus planirostris. Mammalian Species 775:1-6.

Howard CV, Reed MG. 2010. Unbiased Stereology. Three-Dimensional

Measurement in Microscopy. Liverpool, QTP Publications 39–56.

Hudspeth AJ. 2000. Sensory transduction in the ear. In: Kandel ER, Schwartz JH,

Jessel TM, editors. Principles of neural science. New York: Mcgraw-Hill

p 614-624.

Jacobowitz DM, Winsky L. 1991. Immunocytochemical localization of calretinin in

the forebrain of the rat. The Journal of Comparative Neurology

304:198–218.

Jones G, Teeling EC. 2006. The evolution of echolocation in bats. Trends in

Ecology & Evolution 3:149-156.

Kaltenbach JA, Lazor J. 1991. Tonotopic maps obtained from the surface of the

dorsal cochlear nucleus of the hamster and rat. Hear. Res 51:149–160.

57

Komune N, Yagmurlu K, Matsuo S, Miki K, Abe H, Rhoton Jr AL. 2015. Auditory

brainstem implantation: anatomy and approaches. Operative

Neurosurgery 2:306-321.

Kunz TH, Lumsden LF. 2003. Ecology of cavity and foliage roosting bats. In:

Kunz, T.H., Fenton, M.B., Bat Ecology. Chicago and London. The

University of Chicago 3-89.

Lent R. 2010. Os Sons do Mundo, Estrutura e Função do Sistema Auditivo. In:

Cem Bilhões de Neurônios? Conceitos Fundamentais de Neurociência.

2 ed. Atheneu 265-295.

Liebich HG, König HE. 2011. Órgão Vestibulococlear. In: Anatomia dos Animais

Domésticos. 4 ed. Artmed 613-628.

Lim BK, Engstrom MD, Lee TE, Patton JC, Bickham JW. 2004. Molecular

differentiation of large species of fruit-eating bats (Artibeus) and

phylogenetic relationships based on the cytochrome b gene. Acta

Chiropterologica 1:1–12.

Luo F, Wang Q, Farid N, Liu X, Yan J. 2009. Three-dimensional tonotopic

organization of the C57 mouse cochlear nucleus. Hearing research

1:75-82.

Machado SF. 2003. Processamento auditivo: uma nova abordagem. São Paulo:

Plexus 36-47.

Malkemper EP, Oelschläger H, Huggenberger S. 2012. The dolphin cochlear

nucleus: Topography, histology and functional implications. Journal of

morphology 273:173-185.

Manohar S, Paolone NA, Bleichfeld M, Hayes SH, Salvi RJ, Baizer JS. 2012.

Expression of doublecortin, a neuronal migration protein, in unipolar

brush cells of the vestibulocerebellum and dorsal cochlear nucleus of

the adult rat. Neuroscience 202:169–183.

58

Marques-Aguiar SA. 1994. A systematic review of the large species of Artibeus

Leach, 1821 (Mammalia: Chiroptera), with some phylogenetic

inferences. Boletim Do Museu Paraense Emílio Goeldi, Zoologia 1:3–

83.

Miranda JMD, Bernardi IP, Passos FC. 2011. Chave ilustrada para determinação

dos morcegos da Região Sul do Brasil. Curitiba: João MD Miranda.

Moore JK, Osen KK, Storm-Mathisen J, Ottersen OP. 1996. gamma-Aminobutyric

acid and glycine in the baboon cochlear nuclei: an immunocytochemical

colocalization study with reference to interspecies differences in

inhibitory systems. J Comp Neurol 369:497–519.

Moore JK, Osen KK. 1979. The cochlear nuclei in man. Am. J. of Anat 154:393–

418.

Moore JK. 1980. The primary cochlear nuclei: loss of lamination as a phylogenetic

process. J. Comp. Neurol 193:609–629.

Moskowitz N. 1969. Comparative aspects of some features of the central auditory

system of primates. Ann. N.Y. Acad. Sci 167:357–369.

Moyes CD, Schulte PM. 2010. Princípios da Fisiologia Animal. 2 ed. Artmed:

Porto Alegre 268-280.

Neuweiler, G. 2000. The Biology of Bats. Oxford, Oxford University Press.

Osen KK. 1969. Cytoarchitecture of the cochlear nuclei in the cat. J Comp Neurol

136:453–484.

Paxinos G, Watson, C. 2007. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (6th ed).

San Diego: Academic Press. Record. Science, 307:580-584.

Redondo RAF, Brina LPS, Silva RF, Ditchfield AD, Santos FR. 2008. Molecular

systematics of the genus Artibeus (Chiroptera: Phyllostomidae).

Molecular Phylogenetics and Evolution 49:44–58.

59

Reis NR, Fregonezi MN, Peracchi AL, Shibatta OA. 2013. Morcegos do Brasil –

Guia de Campo. Rio de Janeiro, Technical Books.

Rhode WS, Roth GL, Recio-spinoso A. 2010. Response properties of cochlear

nucleus neurons in monkeys. Hearing research 1:1-15.

Rogers JH. 1987. Calretinin: a gene for a novel calcium-binding protein

expressed principally in neurons. The Journal of Cell Biology 105:1343–

1353.

Rubio ME, Gudsnuk KA, Smith Y, Ryugo DK. 2008. Revealing the molecular layer

of the primate dorsal cochlear nucleus. Neuroscience 154:99–113.

Ryugo DK, Pongstaporn T, Wright DD, Sharp AH. 1995. Inositol 1,4,5-

trisphosphate receptors: immunocytochemical localization in the dorsal

cochlear nucleus. J Comp Neurol 358:102–118.

Ryulgo DK, Parks TN. 2003. Primary innervation of the avian and mammalian

cochlear nucleus. Brain research bulletin 5:435-456.

Ryulgo DK, Willard FH, Fekete DM. 1981. Differential afferent projections to the

inferior colliculus from the cochlear nucleus in the albino mouse. Brain

research 1:342-349.

Schnitzler HU, Kalko EKV. 2001. Echolocalization by insect-eating in bats. Biosci

51: 557- 569.

Schulmeyer FJ, Adams JC, Oelschläger HH. 2000. Specialized sound reception

in dolphins—A hint for the function of the dorsal cochlear nucleus in

mammals. Historical Biology 14:53-56.

Schwaller B. 2010. Cytosolic Ca 2+ Buffers. Cold Spring Harb Perspect Biol 2:1–

20.

Silva ACR, Reinach FC. 1991. Calcium binding induces conformational changes

in muscle regulatory proteins. Trends in biochemical sciences 16:53-57.

60

Simmons NB, Geisler JH. 1998. Phylogenetic relationships of Icaronycteris,

Archaeonycteris, Hassianycteris, and Palaeochiropteryx to extant bat

lineages, with comments on the evolution of echolocation and foraging

strategies in Microchiroptera. Bulletin of the American Museum of

Natural History, 235: 1-182.

Simmons NB, Voss RS. 1998. The mammals of Paracou, French Guiana: a

Neotropical lowland rainforest fauna - Part 1: Bats. Bulletin of the

American Museum of Natural History 237:1–219.

Simmons NB. 1994. The case for chiropteran monophyly. American Museum

Novitates 3103:1-54.

Simmons NB. 1998. A reappraisal of interfamilial relationships of bats. Pp. 3-26.

In: T.H. Kunz & P.A. Racey (Eds.). Bat Biology and Conservation.

Washington Smithsonian Institution Press.

Skelton NJ, Kördel J, Akke M, Forsén S, Chazin WJ. 1994. Signal transduction

versus buffering activity in Ca2+–binding proteins. Nature Structural and

Molecular Biology 1:239.

Snell RS. 2003. Os núcleos dos nervos cranianos, suas conexões centrais e

distribuição. Neuroanatomia clínica para estudantes de medicina.

Guanabara 194-202.

Spatz WB. 1997. Differences between guinea pig and rat in the dorsal cochlear

nucleus: expression of calcium-binding proteins by cartwheel and

Purkinje-like cells. Hear Res 107:136–146.

Spatz WB. 2000. Unipolar brush cells in marmoset cerebellum and cochlear

nuclei express calbindin. Neuroreport 11:1–4.

Spatz WB. 2003. Purkinje-like cells in the cochlear nucleus of the common tree

shrew (Tupaia glis) identified by calbindin immunohistochemistry. Brain

Res 983:230–232.

61

Strain GM, Myers LJ. 2006. Audição e equilíbrio. In: Reece W. Dukes Fisiologia

dos animais domésticos I. 12 ed. Guanabara Koogan: Rio de Janeiro.

Teeling EC, Dool S, Springer MS. 2012. Phylogenies, fossils and functional

genes: The evolution of echolocation in bats, p. 1-21. In: Gunnell, G.F.

& N.B. Simmons (Eds.). Evolutionary History of Bats: Fossils,

Molecules, and Morphology. Cambridge, Cambridge University Press.

Teeling EC, Springer MS, Madsen O, Bates P, O’Brien SJ, Murphy WJ. 2005. A

Molecular Phylogeny for Bats Illuminates Biogeography and the Fossil.

Teeling EC. 2009. Hear: the convergent evolution of echolocation in bats? Trends

in Ecology & Evolution 7:351-354.

Typlt M, Englitz B, Sonntag M, Dehmel S, Kopp-Scheinpflug C, Ruebsamen R.

2012. Multidimensional characterization and differentiation of neurons in

the anteroventral cochlear nucleus. PLoS One, 1:e29965.

Van Den Bussche RA, Hoofer SR. 2004. Phylogenetic relationships among recent

Chiropteran families and the importance of Choosing appropriate out-

group taxa. J Mammal 2:321 – 330.

Van Den Bussche RA, Hudgeons JL, Baker RJ. 1998. Phylogenetic accuracy,

stability, and congruence: relationships within and among the New

World bat genera Artibeus, Dermanura and Koopmania. In T. H. Kunz &

P. A. Racey (Eds.), Bat Biology and Conservation 85:43–58.

Willott JF, Demuth RM, Lu SM, Van Bergem P. 1982. Abnormal tonotopic

organization in the ventral cochlear nucleus of the hearing-impaired

DBA/2 mouse. Neurosci Lett 34: 13–17.

Wouterlood FG, Mugnaini E, Osen KK, Dahl AL. 1984. Stellate neurons in rat

dorsal cochlear nucleus studies with combined Golgi impregnation and

electron microscopy: synaptic connections and mutual coupling by gap

junctions. J Neurocytol 13:639–664.

62

Yajima Y, Hayashi Y. 1989. Response properties and tonotopical organization in

the dorsal cochlear nucleus in rats. Exp Brain Res 75:381–389.

Yáñez M, Gil-Longo J, Campos-Toimil M. 2012. Calcium Binding Proteins. In:

ISLAM, M. S. (Ed.). Calcium Signaling. [s.l.] Springer Netherlands 461–

482.

Zettel ML, Carr CE, O’Neill WE. 1991. Calbindin-like immunoreactivity in the

central auditory system of the mustached bat, Pteronotus parnelli. J

Comp Neurol 313:1–16.

Zhang J, Guan Z. 2008. Modulatory effects of somatosensory electrical

stimulation on neural activity of the dorsal cochlear nucleus of

hamsters. J Neurosci Res 86:1178–1187.

Zook JM, Casseday JH. 1982. Cytoarchitecture of auditory system in lower

brainstem of the mustache bat, Pteronotus parnellii. J Comp Neurol

207:1–13.

Zortéa, M. 2007. Subfamília Stenodermatinae, p. 107-128. In: Reis, N.R.,

Peracchi, A.L., Pedro, W.A., Lima, I.P. (Eds). Morcegos do Brasil.

Londrina, Nelio R. dos Reis.

63

ANEXO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO …...8n Nervo vestibulococlear Cb Cerebelo CB Calbindina CaBP...

Documents

Transcript of UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO …...8n Nervo vestibulococlear Cb Cerebelo CB Calbindina CaBP...