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Vega Álvarez Maiztegui

TESIS DOCTORALESN.o 56

ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO Y EXPERIMENTAL

DE LA TRANSMISIÓN Y CONTROL DEL

VIRUS MAEDI-VISNA EN OVINO LECHERO

DE RAZA LATXA DEL PAÍS VASCO

Trabajo presentado por la Licenciada Vega Alvarez Maizteguipara optar al grado de Doctor en Veterinaria

NEKAZARITZA, ARRANTZAETA ELIKADURA SAILA

DEPARTAMENTO DE AGRICULTURA,PESCA Y ALIMENTACIÓN

Vitoria-Gasteiz, 2006

Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia

Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco

UNIVERSIDAD DE LEÓN

FACULTAD DE VETERINARIA

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ALVAREZ MAIZTEGUI, VegaEstudio epidemiológico y experimental de la transmisión y control del virus Maedi-Visna en ovino

lechero de raza latxa del País Vasco / trabajo presentado por Vega Alvarez Maiztegui para optar al grado deDoctor en Veterinaria. – 1a ed. – Vitoria-Gasteiz : Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia =Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco, 2006

p. ; cm. – (Tesis doctorales ; 56)Tesis-Universidad de LeónISBN 84-457-2169-0

1. Maedi-Visna, Enfermedad del-Tesis doctorales. 2. Latxa (Raza ovina)-Enfermedades-Tesis doctorales.I. Euskadi. Departamento de Agricultura, Pesca y Alimentación. II. Título III. Serie619:616.98:578.82/.83(043)619:616/618:636.36(043)

Edición: 1.a Febrero 2006

© Administración de la Comunidad Autónoma del País VascoDepartamento de Agricultura, Pesca y Alimentación

Internet: www.euskadi.net

Edita: Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu NagusiaServicio Central de Publicaciones del Gobierno VascoDonostia-San Sebastián, 1 - 01010 Vitoria-Gasteiz

Fotocomposición: Composiciones RALI, S. A.Particular de Costa, 8-10, 7.a - 48010 Bilbao

Impresión: Lankopi, S. A.Colón de Larreategui, 16 - 48001 Bilbao

ISBN: 84-457-2169-00

D.L.: BI-472-06

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AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR DE LA TESIS PARA SU

PRESENTACIÓN

(Art. 8º 1 del R.D. 778/98)

El Dr. D. EDUARDO BERRIATUA FERNÁNDEZ DE LARREA como Director de la

Tesis Doctoral titulada “Estudio epidemiológico y experimental de la transmisión y

control del virus maedi-visna en ovino lechero de raza Latxa del País Vasco” realizada

por Doña Mª Vega Álvarez Maiztegui en NEIKER (Instituto Vasco de Investigación y

Desarrollo Agrario), autoriza su presentación a trámite, dado que reúne las condiciones

necesarias para su defensa.

Lo que firmo, para dar cumplimiento al art. 8º 1 del R.D. 778/98, en Derio a 3 de

Junio de 2005.

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RATIFICACIÓN DEL TUTOR

(Art. 8º 1 R.D. 778/98)

D. MARCELINO ÁLVAREZ MARTÍNEZ Profesor Titular1 del Departamento de

PATOLOGÍA Y SANIDAD ANIMAL y Tutor del doctorando Doña Mª VEGA

ÁLVAREZ MAIZTEGUI,

R A T I F I C O: El informe de D. EDUARDO BERRIATUA FERNÁNDEZ DE

LARREA, Director de la Tesis titulada "Estudio epidemiológico y experimental de la

transmisión y control del virus maedi-visna en ovino lechero de raza Latxa del País

Vasco" y elaborada por el citado doctorando.

Lo que firmo, para dar cumplimiento al art. 8º 1 del R.D. 778/98, en León a 13 de Junio

de 2005.

1 Profesor Titular, Catedrático Titular, etc.

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CONFORMIDAD DEL DEPARTAMENTO

(Art. 8º 2 del R.D. 778/98)

El Departamento de PATOLOGÍA Y SANIDAD ANIMAL en su reunión

celebrada el día 27 de Junio de 2005 ha acordado dar su conformidad a la admisión a

trámite de lectura de la Tesis Doctoral titulada “Estudio epidemiológico y experimental

de la transmisión y control del virus maedi-visna en ovino lechero de raza Latxa del

País Vasco”, dirigida por el Dr. D.EDUARDO BERRIATUA FERNÁNDEZ DE

LARREA y elaborada por Doña VEGA ALVAREZ MAIZTEGUI.

Lo que firmo, para dar cumplimiento al art. 8º 2 del R.D. 778/98, en León a 27 de Junio

de 2005.

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La realización de este estudio ha sido posible gracias a la fi-nanciación del Departamento de Agricultura y Pesca del Go-bierno Vasco a través del proyecto “Estudio de la transmisióndel maedi-visna en la especie ovina; importancia relativa de latransmisión lactógena y aerógena”.

Asimismo, la autora de esta memoria ha disfrutado de una becapara la Formación de Tecnólogos e Investigadores en el SectorAgropesquero Vasco del Departamento de Agricultura y Pescadel Gobierno Vasco (1999-2001). Posteriormente, ha disfruta-do de un contrato con NEIKER para el desarrollo del proyecto“Contribución a la profilaxis vacunal y el diagnóstico para elcontrol de la infección por lentivirus de pequeños rumiantes”.

El presente trabajo se ha desarrollado en el Departamento deSanidad Animal del Instituto Vasco de Investigación y Desa-rrollo Agrario NEIKER de Derio.

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A mis padres,que lo han dado todo por mi formación.

Gracias por esta herencia

Nire aittitte eta amama zirenei

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AGRADECIMIENTOS

En el transcurso de estos cinco años ha habido mucha gente que me ha ayudado en lasuperación de los obstáculos que se me han presentado tanto en la realización del trabajo la-boratorial como en la escritura de esta tesis y no quisiera dejar de agradecerles sinceramentela ayuda que me han prestado. En estas líneas trataré de acordarme de todos y si no fuera asíespero sepan perdonarme.

Agradezco a D. Eduardo Berriatua, director de esta Tesis, su ayuda en el desarrollo yelaboración de la misma y además agradezco a D. Ramón Juste, Jefe del Departamento de Sa-nidad Animal de NEIKER, el haber desarrollado la idea que dió lugar al experimento que seexpone en este trabajo.

Además, quisiera mostrar mi agradecimiento a los investigadores del antiguo SIMA,que iniciaron algunos de los trabajos que se estudian en esta tesis, especialmente a D. Loren-zo González y Dña. Ana Belén Extramiana, además de a los pastores que aportaron sus reba-ños y su tiempo en llevar adelante los programas de control de la enfermedad propuestos.

Agradezco a Nekane Kortabarria el que me iniciara en los entresijos de la PCR, que hoydía está siendo la base de mi trabajo diario.

Especialmente, quisiera agradecer a Mara su inestimable ayuda tanto en el laboratorio,como en el rebaño y decir que recordaré con agrado las discusiones a la hora de comprenderla enfermedad. Tras muchas horas de compartir trabajo y tiempo libre creo que hemos llega-do a desarrollar una amistad que no olvidaré jamás. Te echaré de menos, ahora que has vuel-to a México.

A David, Itziar, Beatriz, Josune García, Mariví Lerma, Mariví Geijo, Jesse, Marta, AnaGarcía y tantos otros de Neiker Derio que durante los duros días de la paridera en Arkaute,me echaron una mano dando biberones a los doscientos y pico corderos que formaron partedel experimento. Ese favor no lo olvidaré nunca, puesto que sin su ayuda no habría sido po-sible este trabajo.

A los pastores de Arkaute, Imanol y Juan Carlos, porque sin ellos hubiera sido imposi-ble organizarse en el trajín de un rebaño de ovejas. Gracias por enseñarme el funcionamien-to de un rebaño. A Josune Arranz que me ha sido de gran ayuda en la organización de las pa-rideras y en la obtención de material e información. Tampoco me quiero olvidar del resto degente de Arkaute, Nerea, Lourdes, Ainhoa, Aser, Ina, Eva, Luis y Feli, que participaron acti-

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vamente tambien en la vigilancia de la paridera y siempre han estado dispuestos a echarmeuna mano. Gracias a todos.

A Esmeralda, gracias por tus oportunas correcciones en el capítulo de síntomas y lesio-nes de esta enfermedad.

A Sorkunde, por transmitirme sus conocimientos de Word, que sepa que por mi parteprocuraré transmitirlos a quien me los pida.

A Javi, que ha soportado mis continuos cambios de humor a lo largo de los dos últimosaños durante el proceso de escritura de esta tesis.

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ÍNDICES Y ABREVIATURAS

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ÍNDICE DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN GENERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332.1. Aspectos históricos y distribución geográfica del VMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352.2. Etiología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.2.1. Clasificación del virus maedi-visna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362.2.2. Estructura viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

2.2.2.1. Características físico-químicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382.2.3. Organización del genoma viral: genes estructurales / genes auxiliares . . 38

2.2.3.1. Genes estructurales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392.2.3.2. Genes auxiliares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

2.3. Mecanismos patogénicos y respuesta inmune . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402.3.1. Replicación viral: in vivo e in vitro. Tropismo celular . . . . . . . . . . . . . . 412.3.2. Mecanismos patogénicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432.3.3. Respuesta inmune . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.3.3.1. Inmunidad humoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442.3.3.2. Inmunidad celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.4. Signos clínicos y lesiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462.4.1. Forma pulmonar (maedi) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462.4.2. Forma nerviosa (visna) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 492.4.3. Forma mamaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 522.4.4. Forma articular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 542.4.5. Lesiones asociadas a VMV en otras localizaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

2.5. Diagnóstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552.5.1. Métodos basados en la detección del virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

2.5.1.1. Cultivo vírico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 562.5.1.2. Microscopía electrónica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 572.5.1.3. Inmunohistoquímica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 572.5.1.4. Detección de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

2.5.1.4.1. Hibridación in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 582.5.1.4.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . . . . . . 59

2.5.2. Métodos basados en la detección de anticuerpos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 612.5.2.1. Inmunodifusion en gel de agar (IDGA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 612.5.2.2. Ensayo de inmunoabsorción enzimatica (ELISA) . . . . . . . . . . . 62

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2.6. Epidemiología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 632.6.1. Formas de transmisión natural . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

2.6.1.1. Transmisión horizontal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 632.6.1.2. Transmisión lactógena . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 642.6.1.3. Importancia relativa de la transmisión lactógena y horizontal . 65

2.6.2. Otras formas: intrauterina, venérea, iatrogénica, vectores invertebrados 662.6.3. Infección experimental de VMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 682.6.4. Factores de riesgo de la infección por VMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

2.6.4.1. Factores asociados al hospedador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 682.6.4.2. Factores asociados al agente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 702.6.4.3. Factores asociados al ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

2.7. Importancia económica y control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 732.7.1. Importancia económica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 732.7.2. Control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

2.7.2.1. Vacunas y tratamientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 742.7.2.2. Estrategias de control zoosanitario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

2.7.2.2.1. Reemplazo total del rebaño infectado por animaleslibres de infección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

2.7.2.2.2. Análisis serológicos periódicos y eliminación de to-dos los seropositivos y su progenie . . . . . . . . . . . . . . 76

2.7.2.2.3. Creación de un rebaño nuevo separado del rebañooriginal infectado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

2.7.2.2.4. Compra anual de animales de reemplazo libres deMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

2.7.2.2.5. Reemplazo a partir de hijas de hembras seropositivasjóvenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

2.7.2.2.6. Reemplazo a partir de hijas de hembras seronegati-vas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

2.7.2.2.7. Selección genética de ovejas resistentes . . . . . . . . . . 772.7.2.3 Programas de control en Europa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

3. ESTUDIO DE LA TRANSMISIÓN DEL VIRUS MAEDI-VISNA (VMV) Y POSI-BILIDADES DE CONTROL EN REBAÑOS DE OVINO LATXO DEL PAÍS VAS-CO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 813.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 833.2. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

3.2.1. Población de estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 843.2.2. Toma de muestras y análisis de anticuerpos anti-MV . . . . . . . . . . . . . . . 843.2.3. Manejo de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 853.2.4. Análisis epidemiológico y estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

3.3. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 863.3.1. Seroprevalencia en los rebaños y lactaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 863.3.2. Seroprevalencia según el modo de cría y la edad de los animales . . . . . 87

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3.3.3. Incidencia anual acumulada de seroconversión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 903.3.4. Relación entre seroconversión y el tipo de cría durante la lactancia, el

grado de contacto con animales seropositivos, el estado serológico deVMV de la madre y otras variables independientes . . . . . . . . . . . . . . . . 90

3.3.5. Número neto de ovejas seropositivas en el rebaño . . . . . . . . . . . . . . . . . 933.4. Discusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

4. CONTRIBUCIÓN RELATIVA DEL CALOSTRO DE OVEJAS INFECTADASCON EL VIRUS MAEDI-VISNA (VMV) A LA SEROPREVALENCIAA VMV ENCORDEROS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 974.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 994.2. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

4.2.1. Población y diseño del estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1004.2.2. Grupos experimentales y tratamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1004.2.3. Estabulación y manejo de los animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1024.2.4. Toma de muestras de sangre y obtención de suero y plasma . . . . . . . . . . 102

4.2.4.1. Detección de anticuerpos de VMV mediante elisa . . . . . . . . . . 1024.2.5. Análisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104

4.3. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1044.3.1. Seroprevalencia en las ovejas experimentales y del rebaño y número y

distribución de los grupos de corderos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1044.3.2. Prevalencia de corderos seropositivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1054.3.3. Relación entre el estado serológico frente a VMV a los trescientos días

de edad y el volumen de calostro ovino de oveja seropositiva ingeridocon biberón y el peso al nacimiento de los corderos criados de forma na-tural por madres seropositivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

4.3.4. Diferencias de riesgo y fracciones atribuibles aproximadas de serocon-versión a los trescientos días asociadas al amamantamiento y a la tomade biberón con calostro de ovejas seropositivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

4.3.5. Relación ajustada entre el estado serológico de los corderos a los tres-cientos días de edad y el tratamiento de los grupos . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

4.4. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

5. DETECCIÓN POR PCR-LTR DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS MAEDI-VIS-NA (VMV) ASOCIADAAL CONSUMO DE CALOSTRO Y RELACIÓN CON ELESTADO SEROLÓGICO DE LOS CORDEROS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1115.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1135.2. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

5.2.1. Población y diseño del estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1145.2.2. Toma de muestras y técnicas de laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

5.2.2.1. Obtención de células blancas de sangre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1155.2.2.2. Extracción y purificación de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . 1155.2.2.3. Medición de la concentración y pureza del ADN . . . . . . . . . . . 116

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5.2.2.4. Análisis de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1165.2.3. Análisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

5.3. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1185.3.1. Porcentaje de corderos PLTR-positivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1185.3.2. Porcentaje acumulado según la edad de corderos PLTR-positivos . . . . . 1185.3.3. Frecuencia de resultados positivos en corderos PLTR-positivos al menos

en una ocasión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1205.3.4. Relación entre resultados de ELISA y PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1215.3.5. Relación ajustada entre los resultados de PCR y los grupos experimen-

tales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1225.4. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

6. CONCLUSIONES GENERALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

7. RESUMEN / SUMMARY / LABURPENA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

8. ANEXOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Retrovirus de interés en veterinaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Tabla 2. Métodos de control del MV en varios países . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80Tabla 3. Seroprevalencia aparente de VMV en los rebaños según la lactación . . . . . . 86Tabla 4. Seroprevalencias estimadas de Rogan-Gladen a MV en los rebaños según la

lactación y seroprevalencias totales por rebaños en el periodo de estudio . . . 87Tabla 5. Prevalencia a MV en función de la edad de los animales . . . . . . . . . . . . . . . . 87Tabla 6. Porcentaje de animales seropositivos a VMV en función de la edad y según

el tipo de cría previo al destete . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88Tabla 7. Porcentaje de animales seropositivos a VMV criados artificialmente y en fun-

ción del estatus serológico frente a VMV de sus madres . . . . . . . . . . . . . . . . 89Tabla 8. Incidencia anual acumulada según los rebaños y lactaciones . . . . . . . . . . . . . 90Tabla 9. Incidencia acumulada de seroconversión (I

SC) en función de los niveles de los

factores de riesgo considerados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91Tabla 10. Estimación del efecto de las distintas variables sobre la seroconversión a MV

en el modelo de regresión logística . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92Tabla 11. Número y porcentaje de ovejas eliminadas y número real de ovejas seroposi-

tivas a MV eliminadas, número de ovejas seroconvertidas a MV y de ovejasseropositivas introducidas en el rebaño y ovejas seropositivas netas que que-dan en el rebaño (1994-1999) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

Tabla 12. Características diferenciales de los grupos experimentales y número de cor-deros en cada grupo según el año . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

Tabla 13. Seroprevalencia a VMV(%) en el rebaño y en las madres seleccionadas se-gún el año experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

Tabla 14. Seroprevalencia (%) de los corderos a los trescientos días de edad en funcióndel volumen de calostro de oveja seropositiva ingerido por biberón y del peso al nacimiento de corderos criados de forma natural con ovejas seropositivas . . 106

Tabla 15. Diferencia de riesgo (DR) y fracción atribuibble (FA) aproximadas asociadasa la toma natural o mediante biberón del calostro ovino de ovejas seropositi-vas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

Tabla 16. Estimaciones del modelo de regresión logística de la relación entre la sero-positividad a VMV a los trescientos días de edad y el tipo y modo de calos-tro ingerido, el lugar de cría durante las primeras veinticuatro horas de vida yestado serológico de la madre frente a MV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

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Tabla 17. Características diferenciales de los grupos experimentales y número de cor-deros en cada grupo según el año . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

Tabla 18. Reactivos utilizados en la PCR, sus concentraciones y volúmenes a añadir . . . 117Tabla 19. Número y porcentaje de resultados pLTR-positivos y porcentaje medio de ve-

ces que resulta positivo el cordero desde el primer resultado positivo . . . . . . 120Tabla 20. Relación entre el número de veces pLTR-positivo entre los cero y trescientos

días de edad y el estado ELISA a los trescientos días . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121Tabla 21. Estimación de los modelos de regresión logística de efectos aleatorios inves-

tigando la relación entre los resultados LTR-PCR positivos y el estado ma-terno frente a MV, fuente y modo de administración del calostro y lugar decría durante las primeras veinticuatro horas de vida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Árbol filogenético de varios retrovirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Figura 2. Virión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38Figura 3. Organización genómica del provirus lentiviral ovino . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39Figura 4. Seroprevalencia a MV en función de la edad y del tipo de cría previo al

destete . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88Figura 5. Seroprevalencia a MV en función de la edad en ovejas criadas artificial-

mente durante la lactancia según el estado de seropositividad de la madre enel momento del parto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

Figura 6. Fundamento de la técnica ELISA indirecto para la detección del anticuerpodel VMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

Figura 7. Seroprevalencia (%) de VMV por edades en 276 corderos en función deltipo y modo de calostro ingerido, lugar de cría y estado serológico maternode VMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

Figura 8. Ciclos de la reacción de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116Figura 9. Porcentajes y errores estandar de corderos pLTR-positivos según la edad y

grupo experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119Figura 10. Porcentajes acumulados y errores estandar de corderos pLTR-positivos se-

gún la edad y grupo experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

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ABREVIATURAS

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ABC: Complejos avidina-biotina-peroxi-dasa.

Ac: Anticuerpo.Ag: Antígeno.ADN: Ácido desoxirribonucleico.ADN

c: Ácido desoxirribonucleico comple-

mentario.AEC: Artritis Encefalitis Caprina.ANE: Adenocarcinoma Nasal Enzoótico.APO: Adenomatosis pulmonar ovina.ARN: Acido ribonucleico.ARNm: ARN mensajero.ARNt: ARN transferente.CA: Cápside.CAPV: Comunidad Autónoma del País

Vasco.CMH: Complejo mayor de histocompati-

blidad.CPE: Efecto citopático.DO: Densidad óptica.ELISA: Ensayo de inmunoabsorción enzi-

mática.Es: Especificidad.FACS: Selección de células por anticuerpos

fluorescentes.GM-CSF: Factor estimulante de la colonia

granulocito-monocito.HIS: Hibridación in situ.IDGA: Inmunodifusión en gel de agar.Ig: Inmunoglobulina.IL: Interleucina.I

SC: Índice de seroconversión anual acumu-lada.

JSRV: Retrovirus de Jaagsiekte de las ovejas.Kda: Kilodalton.

LSP: Leucocitos de sangre periférica.LTR: Long Terminal Repeat.LVPR: Lentivirus de los pequeños rumian-

tes.MA: Matriz.MCP-1: Proteína quimioatrayente de mo-

nocito.MV: Maedi-Visna.NC: Nucleocápside.nm: Nanómetros.NPO: Neumonía progresiva ovina.OIE: Oficina Internacional de Epizootias.ORF: Open Reading Frames (patrones de

traducción).P

A: Prevalencia aparente.

PAP: Peroxidasa-Antiperoxidasa.pb: Pares de bases.PBMC: Células mononucleares de sangre

periférica.PBS: Solución de fosfato salino.PCR: Reacción en cadena de la polimerasa.pLTR: PCR LTR.P

RG: Prevalencia real.

QC-PCR: PCR Cuantitativa Competitiva.RRE: Rev Responsive Element.RIA: Radioinmunoensayo.RIPA: Radioinmunoprecipitación.RT-PCR: PCR de Transcriptasa Inversa.SCP: Plexo coroideo ovino.SDS: Dodecil sulfato sódico.Se: Sensibilidad.SNC : Sistema nervioso central.LVPR: Lentivirus de los Pequeños Rumian-

tes.SNC: Sistema Nervioso Central.

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SU: Glicoproteína de superficie.TM : Glicoproteína de la transmembrana.UV: Ultravioleta.v:v: Volumen a volumen.VAEC: Virus de la Artritis Encefalitis Ca-

prina.VAIE: Virus de la Anemia Infecciosa Equi-

na.VANE: Virus del Adenocarcinoma nasal

enzoótico.

VIB: Virus de la Inmunodeficiencia Bovi-na.

VIF: Virus de la Inmunodeficiencia Felina.VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Huma-

na.VLF: Virus de la Leucemia Felina.VMV: Virus Maedi-Visna.VNPO: Virus de la Neumonía Progresiva

Ovina.WB: Western Blotting.

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1. INTRODUCCIÓN GENERAL

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El maedi-visna (MV) es una enfermedad provocada por el virus Maedi-Visna (VMV),englobado en el género Lentivirus perteneciente a la Familia Retroviridae, y más concreta-mente dentro del subgénero Lentivirus de los pequeños rumiantes (LVPR), en el que tambiénse encuentra el virus de la Artritis Encefalitis Caprina (VAEC). El VMV provoca en los ovi-nos una infección persistente, con un curso lento y una aparición tardía de los síntomas, queinevitablemente termina con la muerte del animal. El virus genera cambios linfoproliferati-vos en el pulmón, glándula mamaria, tejido nervioso y articulaciones (Radostits et al. 2000).La entrada del VMV en poblaciones previamente indemnes tiene consecuencias graves parala salud y productividad del rebaño, mientras que en poblaciones con infecciones endémicasde VMV y en determinados sistemas productivos, las pérdidas asociadas a la infección pue-den ser más difíciles de cuantificar y debido a su curso lento e insidioso, pasar incluso desa-percibidas para algunos pastores. El efecto de la infección y consiguiente daño económico enel rebaño también está asociado a otros factores tales como el manejo y la estructura de la pro-ducción ovina (Houwers 1990). El VMV es responsable de pérdidas directas como la muer-te o eliminación temprana de animales afectados, el aumento de la tasa de reposición anual yel descenso en la producción, y pérdidas indirectas por gastos en tratamiento de infeccionessecundarias y pérdida de ingresos por restricciones comerciales (Houwers 1990). Dado queno existen tratamientos ni vacunas comerciales efectivas frente a VMV, el control del VMVpasa por la eliminación de animales infectados y la aplicación de medidas para prevenir nue-vas infecciones. En este sentido, resulta crucial disponer de un buen conocimiento de la di-námica de la enfermedad y en particular de las formas de transmisión del virus y su relacióncon el sistema de producción y manejo del rebaño. Si bien se ha descrito la transmisión trans-placentaria de VMV (Cutlip et al. 1988; Brodie et al. 1994), la opinión generalizada es queesta ruta de infección tiene una importancia epidemiológica mínima y los animales se infec-tan con VMV, principalmente tras el nacimiento, por contacto con virus presente en las se-creciones respiratorias y en el calostro y leche de animales infectados, pero se desconoce laimportancia relativa de cada una de estas vías y varía dependiendo del manejo del rebaño (Ra-dostits et al. 2000).

En el País Vasco, el maedi-visna fue descrito por primera vez por González y colegas(Gonzalez et al. 1984), en un estudio sobre las enfermedades respiratorias crónicas más fre-cuentes que afectaban al ganado ovino de raza Latxa del País Vasco. En un estudio posterior,González concluyó que el 99,2% de los rebaños y el 54% de los animales de la ComunidadAutónoma del País Vasco (CAPV) estaba infectado por el VMV (Gonzalez 1989). La raza La-txa representa el 95% del ganado ovino de la CAPV, es de aptitud lechera y se explota demodo semiintensivo con un parto al año en los meses de invierno. Tras el parto los corderosse crían con la madre, la mayoría se vende para matadero con un mes de edad y el ganado dereposición se desteta a los tres meses de edad. El periodo de ordeño es de aproximadamente5 meses al año y la leche se destina a la fabricación de queso de tipo Idiazabal. Aunque lasovejas aprovechan el pasto durante la mayor parte del año, también se estabulan en mayor omenor medida en la época de los partos y durante el periodo de ordeño (Ruiz Santos 2000).Según lo expuesto anteriormente, en este sistema de producción se dan las circunstancias ne-cesarias para la transmisión del VMV, pero no existen estudios que hayan valorado la impor-

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tancia de la transmisión lactógena y horizontal y las posibilidades de control del VMV en elsistema de producción tradicional de la oveja Latxa de la CAPV.

Los objetivos de este trabajo fueron los siguientes:

1. Investigar la transmisión y control del VMV en diez rebaños comerciales de ovejasde raza Latxa en ordeño mediante un estudio epidemiológico retrospectivo de datosque incluían el resultado de análisis anuales de anticuerpos frente a VMV con la téc-nica de inmunodifusión directa en gel de agar (IDGA) realizados entre 1994 y 1999.Durante este periodo, cuatro de los rebaños habían participado en un programa decontrol de VMV basado en la cría artificial de las corderas de reposición en la lac-tancia para prevenir la infección lactógena de VMV pero sin evitar el contacto hori-zontal con animales infectados y los otros seis rebaños no habían participado en unprograma de control de VMV y habían criado las corderas de forma natural con lamadre y resto del rebaño.

2. Cuantificar la infección de VMV en corderos por consumo de calostro de ovejas se-ropositivas durante las primeras 24 horas de vida, en un estudio experimental de tresaños de duración en el rebaño experimental de NEIKER empleando técnicas dediagnóstico modernas incluidas, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) parala detección de VMV y un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) recom-binante para detectar anticuerpos anti-VMV.

ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO Y EXPERIMENTAL DE LA TRANSMISIÓN Y CONTROL DE VIRUS MAEDI-VISNA...

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2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

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2.1. ASPECTOS HISTÓRICOS Y DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DEL VMV

El VMV fue aislado y descrito por primera vez en Islandia por Sigurdsson (Sigurdssonet al. 1951) a principios de los años 1950, más de una década después de que el VMV entra-se en este país y causase la epidemia de VMV más importante descrita en la literatura. Sinembargo, los síntomas de la enfermedad habían sido descritos anteriormente por otros auto-res bajo distintas denominaciones. Así se describió la enfermedad Graaff-Reinet en Sudáfri-ca en 1915 (Mitchell 1915), la Neumonía Progresiva en EEUU en 1923 (Marsh 1923), laBouhite en Francia en 1942 (Lucam 1942) o el Zwoegerziekte en Holanda en 1943 (Koens1943). Los términos maedi y visna son de origen islandés y significan disnea y consunción,respectivamente. La disnea es producto de una neumonía intersticial crónica y la consunciónestá asociada a un deterioro progresivo del sistema nervioso central. En un principio se pen-só que el visna y el maedi eran síntomas de distintos procesos que aparecían de forma aisla-da y no fue hasta 1964 (Gudnadottir & Palsson 1964; Sigurdardottir & Thormar 1964) en quese confirmó que un único virus era el causante de ambos tipos de síntomas. Se han manteni-do los términos islandeses por la enorme labor de investigación del virus y de la enfermedadque han realizado los científicos de este país.

La epidemia de VMV en Islandia comenzó con la importación en 1933 de varios car-neros de raza Karakul procedentes de Alemania, que no presentaban sintomatología de la en-fermedad que hoy conocemos como MV. Estos animales se dispersaron por los rebaños is-landeses y ello, unido al sistema de cría del ovino del país que facilita el contacto de animalesde distintos rebaños y el intenso confinamiento de los ovinos durante el periodo invernal, fa-voreció la rápida propagación de la infección en todo el país. En las casi dos décadas que semantuvo la infección en Islandia se contabilizaron ciento cincuenta mil casos clínicos deVMV y más de seiscientos cincuenta mil ovinos fueron destruidos en un intento desesperadopor controlar la epidemia, que se consiguió en 1954 (Sigurdsson 1954). La importación deovinos infectados se ha descrito en otros lugares del mundo. En Noruega, la compra de ove-jas de raza Texel de origen danés se asoció a los primeros casos de maedi en el país (Krogs-rud & Udnes 1978), pero la prevalencia no llegó a superar el 9% y el 0,4% de los rebaños yanimales (Krogsrud 1985). En el Reino Unido, el VMV se importó del continente europeo(Dawson et al. 1979) y posteriormente se extendió entre las razas autóctonas (Pritchard et al.1984).

En la actualidad, el VMV se encuentra ampliamente distribuido por todo el mundo ex-cepto en Australia y Nueva Zelanda donde nunca se ha descrito, aunque hay que señalar queen Australia sí que se ha descrito la infección por el VAEC en ganado caprino. En Europa, laseroprevalencia en Dinamarca se estimó en 1979 en 30% de rebaños infectados y 11% de ani-males (Hoff-Jorgensen 1985) y en Holanda, la seroprevalencia se estimó en 70% de rebañosinfectados y 30% de animales (Houwers et al. 1987). Se desconoce desde cuándo está elVMV en la cabaña ovina española. González fue quien describió su presencia por primera vez(Gonzalez et al. 1984) y posteriormente se ha detectado la enfermedad en muchas otras co-munidades autónomas como Extremadura (Redondo et al. 1988), Aragón (Luján et al. 1993),La Rioja (Luján et al. 1993), Navarra (Pérez & Arriaga 1993), Castilla-León (Sotelo 1998),

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Castilla-La Mancha (Luján & Badiola 2001), Murcia (Luján & Badiola 2001), Madrid (Lu-ján & Badiola 2001) y Andalucía (Luján & Badiola 2001). En general, a la vista de estos tra-bajos, se puede concluir que la infección por VMV en España está uniformemente distribui-da, con una seroprevalencia media-alta, afectando a toda raza, explotación y sistema deproducción (Luján & Badiola 2001).

2.2. ETIOLOGÍA

2.2.1. Clasificación del virus Maedi-Visna

Los Retrovirus son una familia de virus con ácido ribonucleíco (ARN) cuya principalcaracterística es la posesión de una enzima, la transcriptasa inversa, que permite la replica-ción del virus, mediante la transformación previa del ARN genómico en ADN complementa-rio (ADN

c). Otra característica que los distingue del resto de virus es que su genoma está

constituido por tres genes estructurales, gag, pol y env y otros genes auxiliares incluidos, elvif, tat, rev, y nef. Hasta hace unos años, los retrovirus se clasificaban en tres subfamilias: On-covirinae, Lentivirinae y Espumavirinae. De unos años a esta parte, sin embargo, la familiaRetroviridae se divide en doce géneros, entre los cuales se encuentra el género Lentivirus,donde se inscribe el VMV, dentro del subgénero Lentivirus de los pequeños rumiantes(LVPR). Entre los géneros de interés para la medicina veterinaria podemos citar los Alfare-trovirus (virus de la leucosis aviar), los Betaretrovirus (virus del adenocarcinoma pulmonar


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Tabla 1. Retrovirus de interés en veterinaria

Tipo de retrovirus Virus Especie Células diana

α-retrovirus Virus leucosis aviar Aves Linfoblastos

β-retrovirus Virus del adenocarcinoma pulmonar ovino (JSRV) Ovino Linf. B, CD4+, CD8+,monocito-macrófago

δ-retrovirus Virus de la Leucemia Bovina (VLB) Bovino Linfocitos B

γ-retrovirus Virus de la Leucemia Felina (VLF) Felino Cels médula ósea

Lentivirus Virus Maedi Visna (VMV) Ovino Monocito/macrófagoVirus Artritis Encefalitis Caprina (VAEC) Caprino Monocito/macrófago

Virus de la Inmunodeficiencia Bovina (VIB) Bovino Linf. T y B,γδ celsT, monocito/macrófago

Virus de la Anemia Infecciosa Equina (VAIE) Equino Monocito/macrófago

Otros retrovirus Virus del Adenocarcinoma Nasal Enzoótico (VANE) Ovino y Células epitelialesCaprino del aparato respiratorio

Células blancasperiféricas

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ovino), los Deltaretrovirus (virus de la leucemia bovina), los Gammaretrovirus (virus de laleucemia felina) y algunos otros retrovirus no clasificados en ningún género como el Adeno-carcinoma Nasal Enzoótico (Tabla 1).

El género Lentivirus comprende múltiples patógenos que afectan a distintas especiesanimales, destacando las infecciones en gatos (VIF, virus de la inmunodeficiencia felina), ca-ballos (VAIE, virus de la anemia infecciosa equina), vacas (VIB, virus de la inmunodeficien-cia bovina), simios (VIS, virus de la inmunodeficiencia de los simios), humanos (VIH, virusde la inmunodeficiencia humana) y cabras (VAEC). Todos los lentivirus con excepción delque afecta a los caballos se caracterizan por un comienzo “lento” de la enfermedad y un cur-so de debilitamiento progresivo (Carey & Dalziel 1993). Las células principalmente afecta-das por estos virus son las células de la línea monocito/macrófago (Gendelman et al. 1986;Peluso. et al. 1985). Sin embargo a diferencia de otros retrovirus como el VIH y SIH, el VMVno infecta linfocitos T y no genera un síndrome de inmunodeficiencia.

Los lentivirus son los retrovirus de estructura genómica más compleja. Mientras que elresto de retrovirus poseen sólo tres genes estructurales, los lentivirus poseen además otros ge-nes auxiliares y Open Reading Frames (ORF) que codifican para proteínas reguladoras. Otracaracterística de los lentivirus es su gran heterogeneidad genética discernible mediante el em-pleo de técnicas biomoleculares como la PCR y la secuenciación (Woodward et al. 1994; Za-noni et al. 1992; Rosati et al. 1995; Sargan et al. 1995) y que han permitido establecer rela-ciones filogenéticas entre distintos lentivirus (Figura 1).


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Figura 1. Árbol filogenético de varios retrovirus (Chadwick et al., 1995). HTLV-1: human lympho-tropic lymphoma virus; BLV: bovine leukaemia virus; EIAV: equine infectious anemia virus; CAEV:caprine arthritis-encephalitis virus; MVV: Maedi-Visna virus; FIV: feline inmunodeficiency virus;SIVcpz: simian inmunodeficiency virus of chimpanzees; HIV-1: human inmunodeficiency virus 1;SIVagm: simian inmunodeficiency virus of African Green Monkeys; HIV-2:human inmunodeficiencyvirus 2; BIV: bovine inmunodeficiency virus; JDV:Jembrana disease virus

2.2.2. Estructura viral

Las partículas maduras del virus, los viriones, tienen forma esférica, miden 80-120 nmde diámetro, poseen una envoltura derivada de la membrana plasmática de la célula hospe-dadora con proyecciones glicoproteicas que engloba la matriz, de naturaleza proteica y unazona central icosaédrica denominada núcleo de 40 nm de diámetro rodeada de una cápsula

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(cápside) (Figura 2). En el núcleo se encuentra el genoma del virus, consistente en dos molé-culas de ARN monocatenario y diploide de unas 9,2 kb, estrechamente relacionadas con lasenzimas transcriptasa inversa, integrasa que facilita la unión covalente del ADN

cvírico

(provirus) al genoma de la célula hospedadora y proteasa que provoca la lisis de los produc-tos poliproteícos codificados por los genes estructurales (Figura 2).


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Figura 2. Virión

2.2.2.1. Características físico-químicas

La densidad de los lentivirus en gradiente de sucrosa es de 1,5-1,6g/ml, su coeficientede sedimentación es de 600s y su punto isoeléctrico de 3,8. Su composición genérica es un60% de proteínas, un 35% de lípidos, un 3% de carbohidratos y un 2% de ARN. Es sensiblea compuestos químicos como el cloroformo, éter etílico, peryodato, formaldehido, etanol yfenol, tripsina y la ribonucleasa. Por otro lado, su falta de ADN le confiere protección frentea la radiación ultravioleta y a la desoxirribonucleasa, siendo además relativamente resistentea la sonicación. El virus es inactivado en 10 minutos a temperatura de 56°C, en 24 horas a37°C, en 9 días a 20°C y en 4-5 meses a 4°C. Sin embargo a temperaturas de congelación de–80°C el virus se mantiene infectivo durante años y es capaz de soportar varios ciclos de con-gelación y descongelación (Thormar 1965). El virus se inactiva a pH inferior a 4,2 y toleramejor los pHs alcalinos, manteniendo su infectividad a pHs entre 5,1 y 10 (Thormar 1965).

2.2.3. Organización del genoma viral: genes estructurales / genes auxiliares

Además de los tres genes estructurales, que del extremo 5´al 3´son, gag (group-speci-fic-antigen), pol (polymerase) y env (envelope) y los genes auxiliares o reguladores (vif, taty rev), el ADN proviral está flanqueado por dos fragmentos denominados Long Terminal Re-peats (LTR) que participan en la transcripción, integración y poliadenilación del ARN viral.(Figura 3). Están compuestos por 3 regiones que en dirección 5’- 3’ son: U3, R y U5. Dentro

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de la región U3 aparecen secuencias diana que influyen en los niveles de transcripción del ge-noma, muchas de las cuales se encuentran localizadas dentro de un tandem de 43 pares de ba-ses (Pepin et al. 1998).


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DNA

env RRE

5' LTR tat 3´LTR

rev

1 2 3 4 5 6 7 8 9

vif

rev

pol

gag

gag

Figura 3. Organización genómica del provirus lentiviral ovino. Genes estructurales y reguladores ysus proteínas (Pepin,M.; Vitu,C.; Russo,P.; Mornex,J.F.; Peterhans,E. Maedi-visna virus infection insheep: a review. Vet Res. 1998. 29:341-67)

2.2.3.1. Genes estructurales

El gen gag es altamente conservado y codifica para tres glicoproteínas procedentes delprecursor Pr55gag: una proteína mayor, la cápside, CA, (p25) y dos proteínas menores: la nu-cleocápside, NC, (p14) y la proteína de la matriz, MA, (p17). La cápside, CA (p25) es la prote-ína mayoritaria en el virión, constituye la zona hidrofóbica del núcleo y provoca una potenterespuesta inmune en el hospedador y es por ello que se utiliza en algunos tests diagnósticos. Lanucleocápside, NC (p14) guarda en su interior el ARN del virus junto con los enzimas necesa-rios para la transcripción e integración del virus: transcriptasa inversa e integrasa, respectiva-mente. La proteína de la matriz, MA (p17) asegura la unión entre la cápside y la envoltura.

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El gen pol codifica para la transcriptasa inversa, la ADN polimerasa ARN-dependiente,que es la enzima fundamental en los retrovirus, cuya función es transcribir el ARN del genomadel virus en ADN, que será capaz de integrarse en el genoma de la célula hospedadora. Ademáscodifica para otras enzimas como la dUTPasa, la integrasa y la proteasa. La actividad de ladUTPasa se ha detectado en lentivirus de ovinos, caprinos, gatos y caballos, aunque está ausenteen lentivirus de primates (Elder et al. 1992) y parece reducir la frecuencia de mutaciones deG-A. Por su parte, la integrasa ayuda a que la doble cadena de ADN viral obtenida tras la trans-cripción inversa, se integre en el ADN de la célula hospedadora (Katzman & Sudol 1994), y laproteasa rompe los precursores de las poliproteínas codificadas por el gen gag.

El gen env codifica para las glicoproteínas de la envuelta del virus. Las glicoproteínas vi-rales son sintetizadas como un precursor, gp160, que posteriormente será dividido en dos subu-nidades por una proteasa. Estas dos subunidades son: la glicoproteína de superficie (SU, gp135)y la glicoproteína transmembrana (TM, gp44). Esta última está anclada en la bicapa lipídica dela envuelta. Las glicoproteínas de la envuelta tienen importantes funciones biológicas en los len-tivirus como son la de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes frente al VMV porparte del hospedador y la de dirigir los mecanismos de interacción virus-célula, aunque de mo-mento no se conocen con precisión los receptores celulares de superficie para el VMV, aunquesí se conocen las proteínas celulares capaces de unirse al virus (Dalziel et al. 1991).

2.2.3.2. Genes auxiliares

El gen rev codifica una proteína de 19 kDa, constituida por 4 exones y que permite eltransporte del ARNm del virus del núcleo al citoplasma de la célula hospedadora. La proteí-na rev contiene señales que le permiten atravesar la membrana del núcleo y ejercer su papelregulador gracias al Rev Responsive Element (RRE) localizado en el gen env. El gen tat co-difica una proteína de 14-15 kDa que tiene como función la transactivación del provirus me-diando un aumento en los niveles de expresión del virus en el momento de la maduración demonocitos a macrófagos (Davis & Clements 1989). El gen vif (viral infectivity factor) codi-fica una proteína de 29 kDa, que en animales infectados de forma natural induce una res-puesta inmune débil que puede ser detectada por inmunotransferencia (Western blot). En es-tudios realizados usando VAEC o VIH como modelos se ha visto que el gen vif juega un papelimportante en los últimos estadíos del ciclo de vida viral, por ejemplo durante la morfogéne-sis de la nucleoproteína viral. Es más, recientemente se ha visto que el gen vif es esencial parala capacidad infectiva del virus tanto in vivo como in vitro (Kristbjornsdottir et al. 2004).

2.3. MECANISMOS PATOGÉNICOS Y RESPUESTA INMUNE

La patogenia se define como los cambios y reacciones celulares y otros mecanismos pa-tológicos que se dan en el desarrollo de la enfermedad, comprendiendo el estudio de la relaciónentre la causa y las lesiones, y entre las lesiones y los signos clínicos (Blood & Studdert 1988).


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A continuación se describen los puntos fundamentales en la patogenia del VMV incluidos, elmodo en el que el virus penetra y se replica en las células diana, las razones que explican el cur-so lento de la infección, la persistencia del virus, la respuesta inmune por parte del hospedadory su papel en el desarrollo de la enfermedad y la naturaleza y mecanismo de las lesiones.

2.3.1. Replicación viral: in vivo e in vitro. Tropismo celular

El mecanismo de infección y replicación viral se describe en detalle en el texto deMurphy y coautores (Murphy et al. 1999). Una vez en presencia de la célula diana, la partí-cula viral a través de sus espículas se une a los receptores de superficie específicos situadosen la célula hospedadora, se produce la fusión de las envueltas viral y celular y la cápside,parcialmente cubierta por la envuelta penetra en el citoplasma de la célula. Una vez dentro,se produce la retrotranscripción del ARN

men ADN

c. Durante este proceso, las regiones R, U5

y U3 del genoma del virión son duplicadas generándose las dos copias de la región LTR quese sitúan a ambos flancos del ADN del provirus. El ADN recién formado migra hacia el nú-cleo ayudado por las proteínas de la nucleocápside y una vez dentro se integra en el genomade la célula hospedadora gracias a la acción de la integrasa. El lugar donde se integra el ADNviral parece ser aleatorio, aunque las secuencias adyacentes al provirus son siempre simila-res. Además cada célula esta infectada por un solo virión, ya que se crea un mecanismo de in-terferencia que hace que una célula infectada por un virión no pueda serlo por otro. Una vezintegrado, el ADN viral se rige por las señales de la célula hospedadora, no interfiere en la ac-tividad de la misma y sólo se expresa cuando la célula se divide. La región LTR sirve tantode señal promotora como de parada de la poliadenilación/transcripción.

La transcripción genera moléculas de ARN enteras que migran del núcleo al citoplas-ma donde se formarán las proteinas de la cápside, reguladoras y de la envuelta. La síntesis delas proteínas víricas se da en dos lugares distintos del citoplasma y a partir de dos unidadesdistintas del ARN

m. Las proteínas de la cápside y enzimas víricas constituidas como un pre-

cursor proteico gag se sintetizan en los polirribosomas libres del citoplasma celular, mientrasque las proteínas de la envuelta se sintetizan en el retículo endoplásmico rugoso. El ensam-blaje de la partícula vírica se lleva a cabo en el citoplasma al unirse el precursor gag con elARN genómico y con otras proteínas. Tras el ensamblaje, la partícula vírica se dirige hacia lamembrana celular donde por un proceso de gemación el virión sale al medio extracelular, cu-bierto ya por la envuelta constituida por la membrana plasmática, sobre la que sobresalen lasespículas antigénicas (glicoproteinas SU). Sólo tras liberarse el virión y por acción de la pro-teasa se produce la maduración final de los precursores proteicos, lo que confiere la infec-ciosidad al mismo. Se cree que el patrón básico de la transcripción inversa y la expresión degenes, ocurre de manera similar in vitro e in vivo. Sin embargo, parece que existe un bloqueode la replicación viral in vivo, ya que el virus no puede ser recuperado de homogeneizados detejidos de animales infectados, mientras que si se realiza un explante o si estos tejidos se cul-tivan en un tipo celular permisivo, entonces el virus infectante puede ser detectado (Carey &Dalziel 1993).


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Los monocitos son las células diana de los LVPR por excelencia. El ciclo de vida viral

está ligado fuertemente a factores de maduración en la célula hospedadora, de forma que la

transcripción del provirus se produce cuando el monocito madura a macrófago (Gendelman

et al. 1986). Existen estudios que indican que en los monocitos hay bloqueo de la transcrip-

ción del ARN. Mediante hibridación in situ se ha comprobado la ausencia de ARN viral en

monocitos y la presencia del mismo en macrófagos (Gendelman et al. 1986). Esto indicaría

que los monocitos son meros transportadores del virus en sangre circulante. Otras células

transportadoras de VMV en sangre y linfa son las células dendríticas, aunque es difícil de

comprobar, ya que separar monocitos de esta población celular es arduo (Gorrell et al. 1992).

La replicación viral in vitro, sin embargo, no sufre este bloqueo específico del tipo de célula

hospedadora, de forma que en unas 24-36 horas se puede ver efecto citopático (CPE) en toda

una variedad de cultivos celulares, con aparición de células gigantes multinucleadas y lisis

celular (Sihvonen & Veijalainen 1981; Sigurdsson et al. 1960). Entre las líneas celulares ca-

paces de ser infectadas in vitro por el VMV se encuentran los fibroblastos de plexo coroideo

ovino (Sigurdardottir & Thormar 1964; Sihvonen & Veijalainen 1981) y membrana sinovial

de cabra (Juste et al. 1998; Juste et al. 2000), fibroblastos de pulmón ovino (Kennedy et al.

1968; Cutlip & Laird 1976), células microgliales (Baszler et al. 1994; Ebrahimi et al. 2000),

células dendríticas (Ryan et al. 2000), células epiteliales de piel (Lee et al. 1994), mama (Bo-

lea 1998) y oviducto de cabra (Lamara et al. 2002), células endoteliales (Craig et al. 1997a;

Jan et al. 2000), células de la granulosa (Lamara et al. 2001) y células corneales ovinas (Cu-

tlip et al. 1985c; Brodie et al. 1992; Brodie et al. 1995). Sin embargo, para que ocurra la in-

tegración del ADN viral in vitro es necesaria la infección productiva de las células del plexo

coroideo ovino (SCP) (List & Haase 1997).

Hasta la fecha no se conoce la identidad del receptor o receptores que utiliza el VMV

para su penetración en la célula hospedadora. A lo largo de la historia se han llevado a cabo

estudios que han propuesto posibles receptores para el virus. Así en 1991, Dalziel y colegas

propusieron que el Ag de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) consti-

tuía parte del receptor en la superficie de las células susceptibles al virus (Dalziel et al. 1991).

Ese mismo año, Crane y colegas, postularon que el receptor era una proteína de 50kDa que

se expresaba selectivamente en las células susceptibles al virus visna y que añadiendo un an-

ticuerpo policlonal (2-23) éste se unía a la proteína de la superficie celular reduciendo signi-

ficativamente la unión del virus a las células (Crane et al. 1991). Ya en el año 2000, Bruett y

colegas (Bruett et al. 2000), ampliaron el estudio llevado a cabo por Crane y colegas, de-

mostrando que la proteína de 50kDa era un proteoglicano asociado a membrana. Lyall y co-

legas (Lyall et al. 2000), por su parte, describieron las características del receptor para el

VMV que es sensible a la proteolisis concretamente por la enzima papaína pero no por la trip-

sina, indicando que el receptor era un componente proteico de la superficie celular. Los re-

ceptores se encuentran ampliamente distribuidos en distintas especies animales y el hombre,

y aunque tradicionalmente se había visto que el virus era capaz de infectar únicamente a ove-

jas de forma natural, hoy día se han detectado receptores en monos, hombre, codorniz, pollo

y hamster sirio (Lyall et al. 2000).


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2.3.2. Mecanismos patogénicos

El MV se caracteriza por un periodo de incubación largo, en el que los síntomas tardanvarios meses e incluso años en aparecer y, por producir una infección persistente y fatal(Knowles 1997), ya que la respuesta inmune que se genera frente a la infección es insuficientepara eliminar el virus (Pepin et al. 1998). Se puede hablar de seis fases desde la infección has-ta la muerte del animal: (i) breve viremia inicial, (ii) seroconversión, (iii) periodo de latencia,(iv) aparición de lesiones, (v) presencia de síntomas clínicos y (vi) muerte. En la fase de vi-remia inicial se observa VMV libre e integrado en monocitos circulantes y va acompañada dealteraciones inmunopatológicas (Begara et al. 1996; Clements & Zink 1996), que inducenuna fuerte respuesta inmune con seroconversión, que si bien no acaba con la infección sí re-duce drásticamente la replicación viral (Luján & Badiola 2001). El periodo de tiempo entrela infección y la seroconversión puede variar desde las dos semanas (Saman et al. 1999) a va-rios meses (Larsen et al. 1982; Oliver et al. 1981b), y en ocasiones puede incluso no produ-cirse (Sihvonen 1981; Johnson et al. 1992), lo cual es un aspecto muy a tener en cuenta a lahora de instaurar programas de erradicación del MV (de la Concha-Bermejillo 1997). Du-rante el periodo de latencia desde la infección hasta que aparecen lesiones significativas el vi-rus no deja de replicarse principalmente en ganglios linfáticos (Blacklaws et al. 1995). Fi-nalmente, tras la aparición de síntomas clínicos, el animal muere entre seis y doce mesesdespués del inicio de los mismos (Cutlip et al. 1988).

El mecanismo preciso por el cual el virus causa inflamación en los distintos tejidos dia-na es desconocido, aunque la alteración en la regulación de la expresión de las citokinas enlos macrófagos ha sido postulada como un posible mecanismo de mantenimiento y exacer-bación de la inflamación (Woodall et al. 1997; Lechner et al. 1997b). En los tejidos, podríaocurrir un fenómeno similar a lo que vieron Zink y colegas (1987) en cultivos celulares. Es-tos autores infectaron linfocitos de oveja con macrófagos infectados por el VMV y observa-ron que se liberaba un interferón lentiviral (IFN-LV) que tenía entre otras propiedades, la deretardar el grado de maduración de los monocitos y en consecuencia la replicación del virusen los macrófagos, y que inducía la expresión de antígenos de clase II del CMH en los ma-crófagos. Estas propiedades contribuían a la inducción de la respuesta linfoproliferativa porparte del hospedador frente al virus (Zink et al. 1987). Zhang y colegas (2002), encontraronuna asociación positiva entre el incremento en la expresión de determinadas citokinas y la se-ropositividad de los animales a VMV e incluso relacionaron positivamente el grado de lesio-nes pulmonares con la expresión de “factor estimulante de la colonia granulocito-monocito”(GM-CSF) (Zhang et al. 2002).

2.3.3. Respuesta inmune

La infección por el VMV induce una respuesta inmune celular y humoral que no sólono es capaz de eliminar la infección sino que además podría estar asociada a la persistenciade la infección (Pepin et al. 1998). Existen autores que defienden la teoría de que la persis-


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tencia del virus en el hospedador es consecuencia de la capacidad del VMV de variar antigé-nicamente y evadir de este modo la respuesta inmune del hospedador (Narayan et al. 1977;Clements et al. 1988; Cheevers et al. 1999). En un estudio llevado a cabo por Narayan y co-legas (1981), observaron que la variación antigénica del virus dependía del tipo de anticuer-po neutralizante al que se enfrentara el virus, apareciendo una mayor mutación en el virus en-frentado a anticuerpos más tardíos, es decir, con un rango de neutralización mayor (Narayanet al. 1981). Sin embargo, otros autores opinan que las variaciones antigénicas son raras eninfecciones prolongadas por virus visna in vivo (Thormar et al. 1983), y que éstas no reem-plazan al virus parental (Lutley et al. 1983). Otra explicación que se ha dado a la persistenciadel virus es que la afinidad del virus a macrófagos es muy superior a la afinidad de los anti-cuerpos al virus y los anticuerpos neutralizantes son incapaces de prevenir la propagación delvirus entre macrófagos (Kennedy-Stoskopf & Narayan 1986).

2.3.3.1. Inmunidad humoral

En infecciones experimentales se ha visto que los anticuerpos fijadores de comple-mento son los primeros en ser detectados, entre una semana y dos meses después de la ino-culación del virus y posteriormente aparecen los anticuerpos neutralizantes, entre el primer yquinto mes postinoculación (De-Boer 1970; Brahic & Haase 1981; Sihvonen 1981). Sin em-bargo, como ya se ha mencionado antes, en ocasiones hay animales con lesiones pulmonarestípicas de maedi sin anticuerpos neutralizantes detectables (Thormar et al. 1966). Al mismotiempo que aparecen los anticuerpos neutralizantes pueden detectarse anticuerpos precipitan-tes frente a la proteína p25 y la glicoproteína de la envuelta aunque en cantidades muy pe-queñas (Klein et al. 1985).

En infecciones naturales por VMV se estimula la producción de anticuerpos de tipoIgG

1, y no se detectan anticuerpos IgG

2 (Bird et al. 1995). En un estudio longitudinal de in-

fección en corderos empleando la técnica de inmunotransferencia se observó que la respues-ta inmune humoral es preferentemente frente a las proteínas p25, gp105, p16 y p14 (Kajika-wa et al. 1990). Por otro lado, Juste y colegas en un estudio de la infección en corderosdurante los primeros 4 meses de vida concluyeron que la producción de anticuerpos anti-p25fue máxima a las 5 semanas postinfección y disminuyó a partir de entonces, mientras que laproducción de anticuerpos anti-transmembrana fue aumentando progresivamente a lo largodel estudio. En este mismo estudio se detectó la presencia de anticuerpos neutralizantes a lasocho semanas postinfección (Juste et al. 1998).

2.3.3.2. Inmunidad celular

La respuesta inmune celular frente a VMV parece contribuir a la eliminación de la in-fección, aunque es poco constante (Larsen et al. 1982) y en cualquier caso no es adecuadapara fines diagnósticos (Luján & Badiola 2001). Las respuestas de las células T pueden ser


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caracterizadas determinando su tipo de actividad y el tipo de subpoblación de células T im-plicado en cada caso. Esto puede realizarse mediante técnicas ELISA que detectan las prote-ínas producidas por las células T, o bien mediante técnicas de hibridación in situ o PCR (John-son et al. 1992) y mediante selección de células por anticuerpos fluorescentes (FACS) (Lujánet al. 1993).

La aparición de una respuesta celular específica se produce entre una y cuatro semanaspostinfección dependiendo de la vía de inoculación, pero los niveles de células inmunológi-cas disminuyen hasta valores normales entre cuatro y doce semanas después (Griffin et al.1978; Sihvonen 1981; Larsen et al. 1982). En infecciones prolongadas, diferentes autores ob-servaron que la respuesta celular tardía era transitoria, con picos en diferentes momentos trasla infección (Larsen et al. 1982; Sihvonen 1984). No obstante, esta respuesta celular ha sidocaracterizada por Reyburn y colegas (1992), quienes utilizando cultivos de leucocitos de san-gre periférica de oveja marcados con timidina tritiada y estimando la proliferación de célulasT mediante un contador de centelleo, observaron que ovejas infectadas persistentemente conVMV mostraban una respuesta immune mediada por linfocitos T, CD4+ y CD8+, frente al vi-rus completo o frente a la proteína p25 del virus (Reyburn et al. 1992b). Es más, en infeccio-nes por VMV se ha observado una inversión del ratio CD4+:CD8+ (Watt et al. 1992; Begaraet al. 1995), aumentando el porcentaje de linfocitos T CD8+, que parecen tener importanciaen el control de la carga viral mediante la eliminación de las células infectadas por el virus ytambien mediante la secreción de citokinas inhibidoras. No obstante, en un estudio llevado acabo en animales vivos a los que se les eliminó los linfocitos T CD8+ de la sangre y de linfaeferente, se observó que la infección primaria por el virus no se veía afectada por la falta deestas células, de modo que la carga viral inicial no se veía modificada con respecto a anima-les control que poseían niveles normales de linfocitos T CD8+ (Eriksson et al. 1999b). Porotro lado, los linfocitos CD4+ sí son necesarios para el establecimiento de la infección porVMV en macrófagos (Eriksson et al. 1999a).

La infección por lentivirus de los pequeños rumiantes provoca una alteración en la ex-presión de las citokinas en macrófagos (Zink & Johnson 1994; Lechner et al. 1997a) y deotros factores como el interferón lentiviral y el GM-CSF. Concretamente la interleucina8 (IL-8) es secretada en mayor grado por los macrófagos alveolares de animales infectadosnatural o experimentalmente con VMV, y atrae a linfocitos y neutrófilos provocando la alve-olitis característica del maedi-visna (Legastelois et al. 1997). Lo contrario sucede con laIL-2, que ve reducida su producción en ganglios linfáticos de animales infectados con VMV(Ellis & De-Martini 1985b; Carey & Dalziel 1993), así como se reduce la expresión de re-ceptores de IL-2 en linfocitos T CD8+ (Bird et al. 1993). En la artritis encefalitis caprina tam-bién se ha observado que el VAEC altera la expresión de citokinas en los macrófagos, que se-gregan una mayor cantidad de IL-8 y proteína quimioatrayente de monocitos (MCP-1)(Lechner et al. 1997a). En cuanto a la IL-16, el VAEC incrementa su expresión tanto en cé-lulas mononucleares de sangre periférica, como en células de membrana sinovial, fluido si-novial, suero y sobrenadante de cultivos de células mononucleares de sangre periférica (Shar-mila et al. 2002).


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2.4. SIGNOS CLÍNICOS Y LESIONES

La enfermedad puede presentar cuatro manifestaciones principales que en orden decre-ciente de frecuencia de presentación son, la pulmonar (maedi), la mamaria, la nerviosa (vis-na) y la articular (Luján & Badiola 2001), aunque cabe señalar que la frecuencia de las for-mas clínicas puede variar según la zona geográfica, el tropismo de la cepa vírica, la raza delanimal, la carga genética individual, la edad y la ruta inicial de exposición (Luján & Badiola2001). En cualquier caso el sistema hemo-linfático y en particular los ganglios linfáticos re-gionales se ven afectados por la infección (Luján & Badiola 2001). Comúnmente un mismoanimal no suele presentar varias formas clínicas y la enfermedad tiende a localizarse en unsolo órgano (Luján & Badiola 2001). La alteración microscópica común en los órganos dia-na afectados es la infiltración y proliferación de células inflamatorias mononucleares.

2.4.1. Forma pulmonar (maedi)

Signos clínicos

El primer signo clínico que presenta el animal afectado es la disnea, que suele verse favo-recida por factores estresantes externos como el esfuerzo físico, la climatología adversa, la ges-tación, el parto y la lactación (González, 1989; Sigurdsson et al. 1951). En un principio, la dis-nea aparece tras la realización de un esfuerzo físico, pero en estados avanzados de la enfermedadse hace evidente incluso en reposo. El número de respiraciones por minuto (rm) puede aumentarde 30-40 rm a 80-120 rm, puede haber tos seca, y no hay aumento de la descarga nasal salvo enel caso corriente de complicación con infección bacteriana. El apetito y la temperatura corporalno se ven afectados, pero los animales afectados en fase clínica adelgazan progresivamente has-ta llegar a un estado caquéctico (Sigurdsson et al. 1951). En el animal vivo, la neumonía inters-ticial provocada por el VMV, puede ser observada mediante tomografía de alta resolución en suinicio y antes de la aparición de los primeros síntomas, observándose un engrosamiento de los ta-biques interalveolares y áreas peribronquiolares, además de aumento de la densidad del parén-quima pulmonar (Cadore et al. 1997). Una vez que aparecen los síntomas, la muerte es inevita-ble y ésta acontece 6 meses a 1 año después de la aparición de los mismos (Cutlip et al. 1988).

Lesiones

1. Lesiones macroscópicas:

Al abrir la cavidad torácica de un animal afectado, los pulmones no se colapsan y apa-recen aumentados de tamaño ocupando en ocasiones toda la cavidad torácica. Tienen formaacampanada, consistencia gomosa y un peso dos a tres veces mayor de lo normal de hasta1200-1500 g. Poseen un color amarillo grisáceo y un punteado grisáceo de 1-2 mm de diáme-tro que puede profundizar en el parénquima y que corresponde con folículos linfoides obser-


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vables microscópicamente. La superficie de corte del pulmón es seca y no se observa fluido enlos bronquios. En estados avanzados de la enfermedad pueden aparecer impresiones costalesen la superficie costal del pulmón y áreas de consolidación roja o gris como consecuencia deaparición de fibras colágenas y fibrocitos en número variable (Campbell et al. 1998; Gonzalezet al. 1984). Los ganglios linfáticos mediastínicos y traqueobronquiales también se encuentranaumentados de tamaño. Su peso es 3-5 veces superior al normal, llegando a alcanzar entre6-10g. El color es blanquecino y al corte presentan un aspecto húmedo y bastante homogéneo,no diferenciándose siempre la zona medular y la cortical (Ellis & De-Martini 1985a).

2. Lesiones microscópicas:

Histológicamente las lesiones que se presentan se corresponden con una neumonía in-tersticial crónica. El aspecto histológico de los pulmones varía mucho según se trate de áre-as consolidadas o no. En las áreas no consolidadas del pulmón, se pueden observar las si-guientes dos lesiones típicas, incluidas: (i) Engrosamiento de los tabiques interalveolaresdebido a la infiltración de linfocitos y macrófagos sobre todo y en menor medida de célulasplasmáticas e hiperplasia de fibras musculares, en principio en los bronquiolos terminales yconductos alveolares y en septos interalveolares posteriormente y (ii) Hiperplasia linfoide di-fusa en zonas perivasculares o peribronquiales o bien diseminada por el parénquima a modode agregados de linfocitos semejantes a folículos linfoides, frecuentemente con centros ger-minales activos en los que se observa mitosis (Georgsson, 1989). En las áreas consolidadasdel pulmón se observa una atelectasia alveolar total, fruto del enorme engrosamiento de lostabiques interalveolares junto a la descamación de células alveolares a la luz (Gonzalez et al.1984). La hiperplasia linfoide en estas áreas es mucho más manifiesta que en las áreas no con-solidadas y además se puede observar una hiperplasia del epitelio de bronquiolos terminalesy alveolos (Cutlip et al. 1979). Gran cantidad de linfocitos se encuentran diseminados por elparénquima, y se concentran preferentemente en torno a bronquios y bronquiolos.La altera-ción histológica primaria que se observa en los ganglios mediastínicos y traqueobronquialeses una marcada expansión de la corteza en la que aparecen numerosos folículos linfoides envarios estadios de actividad (Ellis & De-Martini 1985a).

Biopatología clínica

No se observan cambios significativos en la biopatología clínica hasta estados avanza-dos de la enfermedad. Entonces suele haber anemia hipocrómica, leucocitosis ligera y reduc-ción de la proteína total en sangre por descenso de la cantidad de albúmina, mientras que losvalores de las globulinas se mantienen cerca de su valor normal (Sigurdsson et al. 1951).

Diagnóstico diferencial

La forma pulmonar del maedi-visna debe ser distinguida de otros procesos respiratoriosy enfermedades caquectizantes como el adenocarcinoma pulmonar ovino (APO), el adeno-


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carcinoma nasal enzoótico, el estertor nasal crónico ovino (ENCO) y las neumonías parasita-rias, bacterianas y gangrenosas.

1. Adenocarcinoma pulmonar ovino (APO):

También denominado Jaagsiekte o adenomatosis pulmonar ovina, el APO es un carci-noma broncoalveolar causado por un Betaretrovirus (JSRV) (Fan 2003). Macroscópicamen-te, la localización de masas grisáceas o blanquecinas endurecidas y claramente diferenciadas,distribuidas en las áreas craneoventrales o multifocalmente por el pulmón y la presencia deabundante moco en las vías respiratorias, son signos no presentes en el MV. Microscópica-mente se observa una proliferación de células alveolares tipo II y células Clara en el epitelioalveolar, bronquiolos terminales y conductos alveolares. Dichas células proliferan hacia la luzalveolar donde existe un gran número de macrófagos alveolares activados (Fan 2003).

2. Neumonías parasitarias:

Las neumonías parasitarias están ocasionadas por especies pertenecientes a la familiaDictyocaulidae (Dictyocaulus filaria) y a la familia Protostrongylidae (Muellerius capillaris,Protostrongylus rufescens, Cystocaulus ocreatus y Neostrongylus linearis). Afectan a anima-les de cualquier edad y la sintomatología suele ser más aparente en los jóvenes. La infesta-ción por estos parásitos provoca tos persistente y, a diferencia con MV, flujo nasal mucoso omucopurulento. Además provoca disnea suave y pérdida de la condición corporal. El diag-nóstico laboratorial y la respuesta al tratamiento antiparasitario son otras características quepermiten diferenciarlo de MV (Martin 1988).

3. Neumonías bacterianas:

Las neumonías bacterianas en ovejas pueden estar producidas por agentes bacterianoscomo Mannheimia haemolytica, Mycoplasma ovipneumoniae y Corynebacterium pseudotu-berculosis. Las dos primeras afectan principalmente a animales menores de un año, provo-cando un cuadro de tos, fiebre y descarga nasal mucopurulenta, que remite con el tratamien-to antibiótico adecuado (Gonzalez 1989). Corynebacterium pseudotuberculosis, por otrolado, provoca focos de necrosis caseosa encapsulados en los ganglios linfáticos y órganos in-ternos. Los abscesos en órganos internos, generalmente el pulmón, causan el “síndrome de laoveja flaca”, y su diagnóstico pasa por el aislamiento del agente a partir del material aspira-do de un absceso. Su presentación a cualquier edad, su carácter progresivo pero no fatal y laposibilidad de la palpación de los ganglios externos tumefactos son datos que la distinguendel MV (Martin 1988).

4. Neumonía gangrenosa:

La irritación que pueden provocar los materiales aspirados, unido a la flora saprófitapresente en ellos, dan lugar a una bronquitis supurativa-ulcerativa con abscesos que en fasesmás avanzadas se transforma en cavernas llenas de material necrótico. Cursa con tos produc-tiva y pirexia a diferencia del MV (Luján & Badiola 2001).


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5. Estertor Nasal Crónico Ovino (ENCO):

El estertor nasal crónico ovino (ENCO) es un síndrome caracterizado por obstrucciónde las fosas nasales posiblemente asociado a las formas crónicas del eczema facial ovino(EFO) (González et al. 1991). Este proceso cursa clínicamente con un estertor nasal y al igualque en el MV la clínica se observa en ovejas adultas, sin embargo a diferencia del MV, elENCO sólo afecta a las fosas nasales (García-Sanmartín et al. 2002).

6. Adenocarcinoma nasal enzoótico (ANE):

El adenocarcinoma nasal enzoótico (ANE) es una enfermedad contagiosa de los pe-queños rumiantes asociada etiológicamente con los betaretrovirus, caracterizada por la trans-formación neoplásica de células epiteliales glandulares de los cornetes nasales etmoidales.Este proceso cursa con síntomas respiratorios y adelgazamiento progresivo que invariable-mente termina con la muerte del animal. El rasgo diferencial con maedi-visna es que en elANE las lesiones se localizan en las fosas nasales, no estando afectados los pulmones (De lasHeras et al. 2003; Rúa Perandones 2004).

2.4.2. Forma nerviosa (visna)

Signos clínicos

Los síntomas nerviosos aparecen generalmente en animales mayores de dos años deedad (Brahic & Haase 1981). En principio aparece una incoordinación motora en los cuartostraseros que afecta la marcha del animal. También se puede observar temblor de los labios einclinación anormal de la cabeza. A medida que avanza la enfermedad, evoluciona hacia unaparálisis fláccida del tercio posterior, que culmina con tetraparálisis y coma. Hasta llegar alestado comatoso, el animal se encuentra atento, sin fiebre y no pierde el apetito, observándo-se un adelgazamiento progresivo y caquexia. La duración de los síntomas es de 6 meses a unaño, e invariablemente termina con la muerte del animal (Dawson 1980).

Lesiones


Las lesiones macroscópicas son poco frecuentes en los casos de visna y en caso de pro-ducirse se limitan al sistema nervioso central. En casos avanzados de la enfermedad es posi-ble observar una atrofia muscular del tercio posterior, uni o bilateral, unida a un estado deemaciación generalizado en el animal (Dawson 1980).


Microscópicamente, la forma nerviosa está caracterizada por leucoencefalomielitis cró-nica y desmielinización, llegando a la destrucción de la sustancia blanca en el cerebro, cere-


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belo y médula espinal (Sigurdsson et al. 1957). Las lesiones se localizan predominantemen-te en las áreas periventriculares, plexos coroideos y leptomeninges (Cutlip et al. 1979; Ge-orgsson et al. 1976). Raramente se observa destrucción neuronal (Sigurdsson & Palsson1958). La infección de oligodendrocitos y astrocitos por el VMV ha sido confirmada in vivo(Stowring et al. 1985).

Biopatología clínica

El único signo clinicopatológico detectable es una pleocitosis de 103-106 células mono-nucleares/ml y un incremento en los niveles de proteínas en el líquido cefalorraquídeo (Na-rayan & Cork 1985).


1. Scrapie:

El scrapie o prurigo lumbar es una enfermedad degenerativa que afecta al SNC de ove-jas y cabras adultas, caracterizada clínicamente por prurito y alteración en la marcha ademásde por un largo periodo de incubación. Está producida por un prión y se clasifica dentro delas encefalopatías espongiformes transmisibles, siendo su incidencia muy baja (Radostits etal. 2000). El visna, en su primera aparición en Islandia, fue confundido con scrapie (Gudna-dottir 1974). El prurito sin embargo no se produce en visna y la parálisis progresiva del ter-cio posterior, característica de visna, no es una constante en el scrapie (Dawson 1980). Porotra parte los casos clínicos de scrapie en un rebaño suelen aparecer de forma aislada y losanimales afectados se encuentran en un estado mental ausente, presentando hiperestesia fren-te a estímulos táctiles, sonoros o visuales y mordisqueos de la zona sacra con pérdida de lanaen el perineo y cola (Luján & Badiola 2001). En cuanto a las lesiones microscópicas, en elscrapie se observa degeneración vacuolar neuronal y del neuropilo, principalmente en el tron-co del encéfalo (Martin 1988).

2. Listeriosis:

El agente etiológico de la listeriosis es Listeria monocytogenes, que provoca un cuadronervioso frecuentemente asociado al consumo de alimentos ensilados en mal estado y que ge-neralmente aparece en otoño-primavera. Su curso es muy rápido y suele afectar a un mayornúmero de animales y de todas las edades a diferencia del visna. En cuanto a las lesiones, és-tas son de carácter purulento y localizadas en el tronco del encéfalo (Luján & Badiola 2001).

3. Cenurosis:

La cenurosis está producida por la fase larvaria (Coenurus cerebralis) del cestodo Tae-nia multiceps, localizada preferentemente en el cerebro, provocando una afección clínica de-


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nominada torneo. El animal presenta la cabeza hacia un lado, caminando en círculos en elmismo sentido que el lado afectado. Los trayectos del parásito o los quistes que forma enel cerebro, son a menudo observables a simple vista (5-6 cm diámetro) (Martin 1988).

4. Infecciones bacterianas inespecíficas:

Las infecciones bacterianas inespecíficas del sistema nervioso central (SNC) son pro-ducidas mayoritariamente por bacterias piógenas que provocan lesiones supurativas. Estosmicroorganismos alcanzan el SNC bien por un traumatismo, por una infección adyacente obien a través de la circulación sanguínea. Los síntomas dependen de la extensión de la infec-ción y de las estructuras afectadas. Así la meningitis difusa cursa con obnubilación, cegueray rigidez de cuello. Por otro lado la meningitis focal presenta diferentes síntomas dependien-do de las estructuras afectadas. Por ejemplo, la lesión vestibular por extensión de una otitismedia-interna provoca inclinación de la cabeza, pérdida de equilibrio, nistagmo horizontal yparálisis facial. La afección no altera el apetito del animal, que permanece despierto. Los abs-cesos espinales frecuentemente cursan con claudicación del tercio posterior. Los signos pue-den revertir con el tratamiento adecuado en cada uno de los casos (Martin 1988).

5. Louping ill:

El louping ill es una enfermedad provocada por un virus del género Flavivirus trans-mitido a través de la garrapata de las ovejas (Ixodes ricinus). A diferencia de MV la enfer-medad cursa de forma aguda y aparece principalmente en corderos y primalas. Los síntomasse caracterizan por fiebre difásica, ataxia, incoordinación de movimientos que progresa a pa-rálisis posterior, coma y muerte. Las lesiones, detectadas sólo a nivel microscópico, consis-ten en una meningoencefalitis no purulenta con necrosis neuronal a nivel del tronco del en-céfalo y médula espinal (Gonzalez Angulo et al. 1990).

6. Intoxicación por falaris:

Se han diagnosticado casos de intoxicación por gramíneas, particularmente por alpistes(Phalaris spp.) en pequeños rumiantes. El proceso cursa principalmente con cuadros clínicoscaracterizados por temblores y convulsiones, o con debilidad y parálisis, que suelen desem-bocar en un cuadro de profunda depresión terminal. Macroscópicamente, a la sección, el en-céfalo presenta una coloración grisácea-verdosa, principalmente en los cuerpos geniculadoslaterales. Microscópicamente se aprecia acúmulo de pigmento en el citoplasma de las neuro-nas, además de gliosis, desmielinización y manguitos perivasculares (Fernandez de Luco etal. 1991).

7. Enfermedad de Aujeszky:

La enfermedad de Aujeszky o pseudorrabia es una encefalomielitis difusa no supurati-va y ganglioneuritis causada por el Herpesvirus suis I y afecta principalmente a cerdos. Enovinos se presenta de forma esporádica y en rebaños que mantienen contacto con ganado por-cino o que pastan en zonas abonadas con purín de cerdos portadores del virus. A diferencia


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de MV cursa con prurito y de una forma más aguda. Macroscópicamente, se pueden observarerosiones cutáneas como consecuencia del rascado y congestión pulmonar. Microscópica-mente, en el SNC las lesiones más características consisten en manguitos perivasculares, glio-sis y necrosis neuronal en médula oblonga y médula espinal cervical (De la Hunta 1983; Ra-dostits et al. 2000).

8. Necrosis cerebrocortical:

Se trata de una enfermedad característica de los rumiantes que cursa con alteracionesnerviosas debidas a la interferencia en el metabolismo cerebral a nivel celular, que se asociacon una deficiencia de tiamina (vitamina B1). Se presenta en animales menores de un año deedad a diferencia del MV, manifestándose con ceguera, temblores y finalmente, postración,nistagmo, opistótonos, pedaleo e hiperexcitabilidad y muerte. La lesión macróscopica con-siste en una coloración amarillenta de las circunvoluciones cerebrales, fluorescente a la luzultravioleta y de distribución bilateral (Radostits et al. 2000).

2.4.3. Forma mamaria

Signos clínicos

La infección se caracteriza por la aparición de ovejas con una induración difusa en am-bas mamas (Van der Molen et al. 1985). Sin embargo, los signos son poco específicos y lasmodificaciones en la morfología mamaria no son muy evidentes, pasando a menudo desa-percibidas para el ganadero (Luján et al. 1991; Smith 1992). En rebaños que crían los corde-ros con sus madres, la sospecha de maedi se produce cuando se observan corderos que pre-sentan retraso en el crecimiento o incluso mueren por inanición como consecuencia de lamamitis indurativa que sufren sus madres tras el parto (Anderson et al. 1985; Van der Molenet al. 1985; Dawson 1987).

Lesiones


Como se ha comentado en los signos, macroscópicamente en ocasiones puede obser-varse una induración difusa en ambas mitades de la mama (Van der Molen et al. 1985; An-derson et al. 1985). Al corte desaparece la textura granular típica del tejido mamario, paraconvertirse en una superficie homogénea y lisa. En las formas clínicas, la producción láctease encuentra reducida, aunque las características organolépticas de la leche no se ven altera-das. Además, los ganglios mamarios se encuentran aumentados de tamaño (Van der Molen etal. 1985).


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La lesión más característica que se puede observar en las mamas afectadas por el VMVes la proliferación linfoide con formación de nódulos linfáticos, que en ocasiones contienen cen-tros germinales (Van der Molen et al. 1985; Cutlip et al. 1985; Cross et al. 1975; Anderson etal. 1985; Oliver et al. 1981). Estos nódulos pueden encontrarse periductalmente, incluso for-mando protrusiones hacia el interior de la luz de los conductos, comprimiéndolos, pero tambiénpueden situarse en los lóbulos mamarios. Al lado de los nódulos linfáticos aparece una infiltra-ción difusa de linfocitos con algunos linfoblastos activados, además de algunas células plasmá-ticas (Deng et al. 1986). El epitelio ductal puede estar hiperplásico, pero frecuentemente pre-senta signos de degeneración, llegando a necrosarse, desprendiéndose hacia la luz del conducto(Cutlip et al. 1984). En glándulas en lactación, aparece una infiltración difusa de los lóbulos condestrucción de los acinis, que pueden contener restos de secreción láctea, además de existir ungrado variable de fibrosis (Van der Molen et al. 1985; Anderson et al. 1985).

Cutlip y colegas, infectaron experimentalmente 18 ovejas con el virus de la neumoníaprogresiva ovina (NPO), y tras 10 años de seguimiento, el 77,8% (14/18) de las ovejas pre-sentaron lesiones en la mama compatibles con NPO. Además el virus fue aislado, mediantecultivo celular de tejido mamario de 4/8 ovejas (Cutlip et al. 1984). En otro estudio experi-mental, van der Molen y colegas observaron que el 62,5% (5/8) de las ovejas infectadas ex-perimentalmente con el VMV, desarrollaron mamitis (Van der Molen & Houwers 1987). Losniveles del virus en el tejido mamario pueden verse afectados por el estado de lactación enque se encuentre el animal, correlacionándose positivamente la inducción de la lactación conla expresión del virus (Lerondelle et al. 1989).


1. Mamitis bacterianas:

Las mamitis bacterianas en ovejas están producidas por diferentes agentes bacterianosde los géneros Staphylococcus, Streptococcus, Pasteurella y otros (Radostits et al. 2000) en-tre los que destaca Mycoplasma agalactiae que causa la agalaxia contagiosa, que produce uncuadro mamítico además de queratoconjuntivitis y artritis. En la fase aguda, las mamitis clí-nicas de origen bacteriano suelen cursar con fiebre y depresión del estado general. General-mente son unilaterales, con induración focal de la mama, que produce una secreción lácteaalterada en sus características organolépticas y se acompaña de exudados purulentos de lamama afectada (Luján & Badiola 2001). El diagnóstico diferencial viene dado por el aisla-miento de la bacteria en el laboratorio y por la respuesta positiva, en algunos casos, al trata-miento con antibióticos adecuados.

2. Agalaxia contagiosa:

La agalaxia contagiosa está producida por Mycoplasma agalactiae que produce uncuadro mamítico además de provocar atritis y queratoconjuntivitis. El cuadro mamítico que


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produce es similar al producido por el VMV, sin embargo se diferencia en que en el primercaso las características organolépticas de la leche se ven alteradas, pudiéndose diagnosticarmediante el aislamiento del Mycoplasma e incluso el diagnóstico serológico de ambas enfer-medades. Microscópicamente, las lesiones necróticas que aparecen en la agalaxia no apare-cen en el caso de MV. A diferencia del MV, es de difusión rápida y generalmente remite conel tratamiento antibiótico adecuado (Radostits et al. 2000).

2.4.4. Forma articular

La forma articular es poco corriente en ovejas afectadas por VMV de forma natural(Oliver et al. 1981), detectándose cojeras en animales mayores de dos años de edad (Cutlipet al. 1985c).

Signos clínicos

La artritis producida es una artritis no supurativa, evidenciada por una inflamación delas articulaciones, generalmente el carpo o el tarso, acompañada por edema periarticular(Oliver et al. 1981a). Radiológicamente se observa mineralización de los tendones y de lacápsula articular, consistente en concreciones de 1-5mm dentro de la cápsula (Oliver et al.1981a).

Lesiones


La articulación presenta mayor cantidad de fluido sinovial, que puede aparecer viscosoy turbio. También se puede observar fibrina pero no pus. La cápsula articular y el tejido pe-riarticular se presentan engrosados por la formación de tejido conectivo fibroso. Se observanprotuberancias vellosas de la línea sinovial, que además está hiperémica. El cartílago articu-lar presenta áreas de necrosis y erosión, encontrándose restos en la cavidad articular (Oliveret al. 1981a; Cutlip et al. 1985c).


Microscópicamente, las lesiones más destacables son la proliferación de la membranasinovial y la infiltración subsinovial de linfocitos y células plasmáticas, formando centrosgerminales, a menudo alrededor de los vasos. Se produce proliferación del pannus y cuandola lesión está avanzada, se llega a observar necrosis del cartílago y el hueso subyacente (Na-rayan & Cork 1985).


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1. Agalaxia contagiosa:

La agalaxia contagiosa cursa con afección mamaria, ocular y articular, y a diferenciadel MV, es de difusión rápida y generalmente remite con el tratamiento antibiótico adecuado(Radostits et al. 2000).

2. Otros procesos:

Existen otros procesos bacterianos que pueden provocar inflamación de las articulacio-nes, sin embargo el diagnóstico etiológico bacteriano determinará la causa concreta de la en-fermedad. Si esto no es posible, y el problema persiste aún con tratamiento antibiótico ins-taurado, el diagnóstico diferencial se basará en la histopatología de las articulacionesafectadas (Luján & Badiola 2001).

2.4.5. Lesiones asociadas a VMV en otras localizaciones

Algunos autores han observado lesiones asociadas a maedi-visna en localizaciones di-ferentes a las ya descritas. Así, Sigurdsson y colegas (1951), observaron infiltrados difusosde linfocitos y células plasmáticas sin aparente conexión con los vasos del hígado en algunoscasos avanzados de maedi (Sigurdsson et al. 1951). También se han observado lesiones pa-tológicas en testículos de carneros infectados con VMV (Palfi et al. 1989) consistentes en unainfiltración de linfocitos, histiocitos y células plasmáticas en el intersticio, viéndose afecta-dos los tubos seminíferos y la espermatogénesis, aunque no el epidídimo. Más recientemen-te se ha demostrado que el VMV puede afectar al epidídimo aparentemente como conse-cuencia de la infección concurrente con Brucella ovis (Preziuso et al. 2003). Cutlip y colegas(1985) observaron vasculitis en pequeñas arterias musculares y arteriolas de ovejas infecta-das de forma natural o experimental con el virus de la neumonía progresiva ovina (NPO). Laslesiones arteriales se apreciaron, en orden de frecuencia decreciente, en la cápsula articulardel carpo, riñones, meninges, cerebro, pulmón y traquea (Cutlip et al. 1985a).

2.5. DIAGNÓSTICO

La aparición de los signos anteriormente descritos hace sospechar del MV, sin embar-go la confirmación se realiza bien mediante la detección del virus, libre o integrado como pro-virus, o bien mediante la detección de anticuerpos específicos producidos por el animal in-fectado. De esta manera, es posible detectar animales infectados en fase preclínica, lo cual esesencial en el control de la enfermedad. A las técnicas de diagnóstico se les exige una seriede requisitos entre los que destacan una elevada sensibilidad, que es la capacidad de un en-sayo de detectar animales infectados y, especificidad que es su habilidad para discriminar en-


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tre enfermos y sanos (Amorena et al. 1997). En las próximas páginas se describirán las dis-tintas técnicas diagnósticas utilizadas a lo largo del tiempo por los distintos autores.

2.5.1. Métodos basados en la detección del virus

Estos métodos tratan de descubrir la presencia del virus, bien sea la partícula viral com-pleta como el cultivo vírico y microscopía electrónica, su material genético como la hibrida-ción in situ y reacción en cadena de la polimerasa o sus proteínas estructurales como la in-munohistoquímica.

2.5.1.1. Cultivo vírico

El cultivo del VMV se lleva a cabo en líneas celulares, a las que se les añade células(leucocitos, lavados broncoalveolares o macerados de tejidos) de los animales sospechosos ysi hay infección las células sufren el efecto citopático tras 2-3 semanas de incubación (Sih-vonen et al. 1980a; Sihvonen 1984). El efecto citopático consiste en la formación de célulasgigantes multinucleadas (sincitios), aunque en algunos casos puede no observarse, bien por-que la cepa viral no induce un claro efecto citopático o bien porque el virus permanece latente(Chebloune et al. 1996).

Las líneas celulares más utilizadas para el cultivo del virus son los fibroblastos de ple-xo coroideo de corderos o fetos ovinos (Sigurdardottir & Thormar 1964; Sihvonen & Veija-lainen 1981), de pulmón ovino (Kennedy et al. 1968; Cutlip & Laird 1976) y membrana si-novial de cabra (Juste et al. 1998; Juste et al. 2000). Otro tipo celular que también se ha usado,ha sido el de las células corneales ovinas (Cutlip et al. 1985c; Brodie et al. 1992). Sin em-bargo, las células de plexo coroideo y membrana sinovial tienen una capacidad limitada dedivisión en cultivo y rápidamente alcanzan un estado no proliferativo y de envejecimiento ce-lular. Es por ello, que Da Silva y colegas (1997) inmortalizaron 3 líneas celulares de fibro-blastos caprinos obtenidos a partir de membrana sinovial de fetos caprinos y permisivos a lainfección in vitro por lentivirus de los pequeños rumiantes (Da Silva et al. 1997).

La naturaleza vírica del MV fue puesta de manifiesto mediante el aislamiento del vis-na a partir de tejido nervioso (Sigurdsson et al. 1960) y del maedi a partir de tejido pulmonar(Sigurdardottir & Thormar 1964). Poco después en Estados Unidos se logró aislar el virus dela neumonía progresiva ovina (NPO), en cultivos de líneas celulares de pulmón de ovejas ycabras sanas, tras la inoculación con suspensiones de tejido pulmonar de ovejas afectadas(Kennedy et al. 1968). Desde entonces se ha logrado aislar el VMV del pulmón (Sigurdardo-ttir & Thormar 1964; Gudnadottir et al. 1968; Oliver et al. 1981a), ganglios mediastínicos(Gudnadottir et al. 1968; Oliver et al. 1981a), bazo (Gudnadottir et al. 1968; Oliver et al.1981a), mama (Cutlip et al. 1985b), plexo coroideo (Gudnadottir et al. 1968; Oliveret al. 1981a) y membrana sinovial (Oliver et al. 1981a; Cutlip et al. 1985c). Por otra parte,los fluidos en los que se ha aislado el virus de forma rutinaria han sido la sangre (De-Boer


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1975; Narayan et al. 1977), líquido cefalorraquídeo (Gudnadottir et al. 1968), líquido sino-vial (Brodie et al. 1995), leche (Ouzrout & Lerondelle 1990) y semen (de la Concha-Berme-jillo et al. 1996) y ocasionalmente a partir de saliva y secreciones nasales (Gudnadottir &Palsson 1965).

Aunque el aislamiento del virus permite dar un diagnóstico definitivo, este procedi-miento es caro y necesita un periodo de tiempo largo para su realización (Knowles 1997).Otro inconveniente de esta técnica es la necesidad de disponer de tejidos frescos del animalinfectado. Por ello, los laboratorios, para la realización de trabajos in vitro, utilizan líneas ce-lulares establecidas (Sihvonen et al. 1980a; Sihvonen 1984).

2.5.1.2. Microscopía electrónica

La microscopía electrónica permitió detectar el virus en cultivos de plexo coroideocomo unas formas esféricas sobresaliendo de la superficie de células infectadas, que termi-nan por desprenderse formando partículas extracelulares (Thormar 1961) de dos tipos, unasmás grandes que las otras, siendo las más pequeñas, con un centro electrodenso, las partícu-las infectivas, mientras que las grandes constituían partículas inmaduras del virus (Coward etal. 1970).

2.5.1.3. Inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se define como la detección de un antígeno específico por unanticuerpo marcado directamente en tejidos que se visualiza por medio de una reacción quí-mica colorimétrica (Lawrence 1990). Para marcar el anticuerpo se utiliza la fluoresceína o en-zimas como la peroxidasa. La fluoresceína va unida al anticuerpo primario (técnica directa)o al anticuerpo secundario (técnica indirecta), y emite una luz visible a determinada longitudde onda cuando el anticuerpo se une al antígeno. Por otra parte, la peroxidasa se usa median-te la técnica peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) donde el anticuerpo primario hace de “puente”entre el antígeno y un anticuerpo secundario que contiene la peroxidasa, o bien mediantecomplejos avidina-biotina-peroxidasa (ABC), en cuyo caso el antígeno se une a un anticuer-po primario no marcado que a su vez se combina con un anticuerpo secundario marcado conbiotina. Ésta reacciona con complejos avidina-biotina-peroxidasa presentes en el medio y laperoxidasa revelada con un sustrato puede ser observada al microscopio óptico.

Esta técnica utiliza anticuerpos monoclonales y policlonales. El uso de anticuerpos mo-noclonales mejora la especificidad y la sensibilidad de esta técnica. Un estudio llevado a cabopor Gelmetti y colegas (2000), concluyó que el uso combinado de los anticuerpos monoclo-nales 1A7, 4B3 y 1B6, dirigidos frente a proteínas virales de la envuelta (gp105) y la cápsi-de (p27) del virus, puede aumentar la sensibilidad del diagnóstico inmunohistoquímico (Gel-metti et al. 2000).


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Los primeros estudios inmunohistoquímicos en MV se combinaban con la hibridaciónin situ, de manera que se podía identificar el tipo celular infectado mediante inmunohisto-química y detectar el ARN viral mediante hibridación in situ. Gendelman y colaboradores de-mostraron la presencia de ARN viral en precursores de monocitos/macrófagos en médulaósea, confirmando la replicación viral en la zona (Gendelman et al. 1985). Stowring detectóproteínas virales y ARN viral al mismo tiempo en una misma célula (Stowring et al. 1985).Más tarde, Georgsson y colegas utilizando sólo inmunohistoquímica, relacionaron la presen-cia de antígeno viral con los tipos celulares infectados y con la intensidad lesional (Georgs-son et al. 1989). Otros autores también han conseguido descifrar mediante la inmunohisto-química las distintas subpoblaciones de células inflamatorias presentes en las lesionesprovocadas por el virus (von Bodungen et al. 1998; Cordier et al. 1992; Ebrahimi et al. 2000).Por su parte, Luján y colegas (1994) observaron mediante inmunohistoquímica con anticuer-pos monoclonales que un 40% de animales seropositivos a maedi presentaba proteínas vira-les p15, p25 y env en macrófagos alveolares (Luján et al. 1994).

La inmunohístoquímica también ha servido para poner de manifiesto las distintas loca-lizaciones del VMV y VAEC en el aparato reproductor de machos y hembras. Así, Bolea ycolegas (1998), utilizando técnicas de inmunohistoquímica doble, describieron la presenciade proteínas virales in vivo en células epiteliales y macrófagos de la mama de ovejas infecta-das con VMV (Bolea 1998). Por otro lado, Lerondelle y colegas (1999) lograron detectar lapresencia de la proteína p30 de VAEC en células epiteliales de la glándula mamaria a partirde cultivos primarios (Lerondelle et al. 1999). También mediante esta técnica se han puestode manifiesto proteínas del virus VAEC en el oviducto de cabras (Lamara et al. 2002). Re-cientemente, Preziuso utilizando un anticuerpo monoclonal frente a la proteína p28 del nú-cleo del VMV, detectó esta proteína tanto en células intersticiales como en células epitelialesdel epidídimo de machos que a su vez presentaban inmunohistoquímica positiva frente a Bru-cella ovis (Preziuso et al. 2003).

A pesar de los avances aportados por la inmunohistoquímica en el conocimiento de lainfección por LVPR, la técnica es cara y laboriosa y presenta reacciones inespecíficas, espe-cialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales. Por todo ello, su empleo se restringesobre todo a estudios experimentales y no se emplea en estudios epidemiológicos amplios.

2.5.1.4. Detección de ácidos nucleicos

2.5.1.4.1. Hibridación in situ

La hibridación in situ se basa en la detección de ADN/ARN viral en cortes de tejidos opreparaciones celulares a partir de secuencias complementarias, denominadas sondas, mar-cadas con substancias radiactivas o colorimétricas (Amorena et al. 1997). Las técnicas colo-rimétricas, que usan digoxigenina o biotina, son las más usadas por ser de menor riesgo parael manipulador, más rápidas y poseer una buena sensibilidad y especificidad. En MV esta téc-


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nica se usó en 1985 combinada con la inmunohistoquímica por Gendelman y colegas (Gen-delman et al. 1985). Asimismo Roy y colegas (Roy et al. 1992) describieron una técnica mássencilla fijando los tejidos con acetona en vez de formaldehído y sin pretratamiento celular,lo que permitía la realización de inmunohistoquímica e hibridación in situ combinadas, sinperder señal en la hibridación. Por su parte, Johnson llegó a detectar un 70% de animales po-sitivos de un año de edad mediante técnicas de PCR, hibridación in situ y cocultivo, mientrasque sólo el 10% de esos animales fue seropositivo (Johnson et al. 1992). La hibridación insitu permitió la detección de ADN proviral en células epiteliales de la mama (Bolea et al.1997; Vitali et al. 1997). Al igual que la técnica anterior, su empleo se restringe a estudios ex-perimentales.

2.5.1.4.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La técnica de PCR consiste en la amplificación de una región de ADN fundamental-mente mediante la aplicación de series de tres ciclos de desnaturalización del ADN diana, hi-bridación con oligonucleótidos específicos (cebadores) que se unen a los extremos 5´ y 3´ delfragmento diana y extensión con una enzima polimerasa y nucleótidos libres. El número decopias de ADN generadas es de 2n copias siendo n el número de series de ciclos. Tras com-pletar la reacción, se separa y visualiza el producto específico amplificado del resto del ADNmediante electroforesis en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio (Sambrook et al.1989).

Mediante PCR se ha detectado LVPR libre y asociado a células en muestras de fluidosy tejidos de animales infectados (Johnson et al. 1992; Zanoni et al. 1990b; Extramiana 2002).Sin embargo para detectar el virus libre es necesario realizar un proceso de retrotranscripcióndel ARN y la PCR se denomina entonces “PCR transcriptasa inversa (RT-PCR)” (Luján &Badiola 2001). En general, existen dos inconvenientes a la hora de desarrollar una técnica dePCR con alta sensibilidad diagnóstica de la infección por LVPR, la heterogeneidad genéticaentre cepas y la baja carga viral in vivo. La variabilidad en la secuencia de nucleótidos es de-bida fundamentalmente a la frecuencia de errores asociados retrotranscriptasa inversa que esdel orden de una base por cada 105 nucleótidos durante la replicación viral (Pasick 1998). Porotro lado, sólo 1 de cada 106 leucocitos portan el provirus en sangre y cantidades tan bajaspueden reducir la sensibilidad de la PCR (Haase 1986).

Los cebadores usados hasta la fecha han sido derivados de diferentes regiones del ge-noma del VMV: genes gag (Zanoni et al. 1990b; Woodall et al. 1994; Wagter et al. 1998), pol(Zanoni et al. 1990b; Brodie et al. 1993; Woodall et al. 1994; Vitu et al. 1997), env (Rosati etal. 1995) y LTR (Zanoni et al. 1990b; Brodie et al. 1993; Johnson et al. 1992; Vitu et al. 1997;Extramiana 2002).

Zanoni y colegas (1990) desarrollaron una PCR dirigida a la región gag del VMV (Za-noni et al. 1990a) y posteriormente para las regiones LTR de VMV y pol de VAEC. La PCRgag permitió amplificar dos cepas diferentes de VMV y una cepa de VAEC, mientras que la


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PCR pol amplificó una cepa de VMV y dos cepas de VAEC. La PCR LTR por su parte per-mitió amplificar todas las cepas tanto de VMV como de VAEC, demostrando su superioridadfrente a gag y pol (Zanoni et al. 1992).

La PCR puede ser útil para detectar animales infectados por VMV antes de que sero-conviertan. Así 1,2% (1/85) de animales procedentes de rebaños pertenecientes al programade control de VMV/VAEC holandés fueron positivos a PCR dentro de un grupo de animalesseronegativos por la técnica IDGA (Wagter et al. 1998). Rimstad y colegas (1993) encontra-ron 20 animales PCR positivos entre 81 animales seronegativos a ELISA. Sin embargo, 10de ellos seroconvirtieron en los 8 meses siguientes (Rimstad et al. 1993). Recientemente sevio que la sensibilidad de una PCR frente a las regiones LTR de VMV en muestras de sangre,leche y tejidos comparada con los resultados de las técnicas ELISA e IDGA combinadas, fuede un 84%, 67% y 88% respectivamente, y conjuntamente de 98% y la especificidad el 100%(Extramiana 2002). Sin embargo, Vitu observó una mayor sensibilidad de la PCR frente a lastécnicas serológicas en animales experimentalmente infectados, presumiblemente porque loscebadores usados para la reacción fueron totalmente complementarios a la secuencia de nu-cleótidos del virus seleccionado para infectar los animales (Vitu et al. 1997). El mismo autorobservó el resultado contrario en animales infectados de forma natural (Vitu et al. 1997). Encualquier caso, es posible aumentar la sensibilidad de la PCR en muestras celulares previocultivo de las mismas.

El diagnóstico por PCR ha sido mejorado por la utilización de cebadores degeneradosque incluyen nucleótidos modificados capaces de hibridar con varios nucleótidos distintos ypor procedimientos de PCR anidada, semi-anidada y doble-anidada basados en realizar unasegunda PCR sobre el producto amplificado en una PCR inicial (Leroux et al. 1995; Lerouxet al. 1997; Celer et al. 2000; Barlough et al. 1994). También aumenta la sensibilidad y es-pecificidad de la PCR transfiriendo el producto amplificado a láminas de nitrocelulosa me-diante Southern-blotting e hibridándolo con sondas complementarias (Russo et al. 1997).

El empleo de la PCR previo a la realización de otras técnicas diagnósticas puede au-mentar la sensibilidad de éstas. Así, Hasse y colegas realizaron hibridación in situ sobre pro-ducto amplificado de PCR y observaron un mayor número de copias del genoma viral en lascélulas hospedadoras y estimaron un aumento en la sensibilidad de 100-300 veces al compa-rar la señal de la hibridación in situ sobre muestras amplificadas con respecto a las no ampli-ficadas (Haase et al. 1990). En cultivos infectados la PCR es capaz de detectar la infeccióncuatro días antes que la detección de proteínas virales mediante inmunoblotting y seis díasantes que la formación de sincitios en el cultivo (Zanoni et al. 1990b).

El empleo de la RT-PCR para la detección de lentivirus de los pequeños rumiantes hasido descrito en muestras de leche (Leroux et al. 1997; Russo et al. 1997; Vitu et al. 1997).En su investigación, Leroux y colegas (1997), desarrollaron un modelo de RT-PCR para de-tectar la infección lentiviral en leche de ovejas y cabras infectadas natural y experimental-mente usando parejas de cebadores pol degenerados procedentes de cepas virales locales ydetectaron 100% (9/9) de cabras infectadas naturalmente con VAEC, y 100% (8/8) de ovejas


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infectadas naturalmente con VMV. Además, esta técnica detectó un animal seronegativo pro-cedente de un rebaño que había sido considerado libre de AEC (Leroux et al. 1997).

Mediante el empleo de una PCR semianidada dirigida a la región gag, Celer y colegasdetectaron producto amplificado en 21/30 (70%) ovejas seropositivas y en 6/68 (8,8%) ove-jas seronegativas, pudiéndose confirmar la naturaleza lentiviral de los productos amplifica-dos mediante secuenciación (Celer et al. 2000)

Hasta la fecha se han descrito dos protocolos de PCRs cuantitativas. Zhang y colegas(2000) desarrollaron una PCR cuantitativa competitiva (QC-PCR) dirigida a una región con-servada del gen pol, aplicándola sólo a estudios in vitro (Zhang et al. 2000). También en en-sayos in vitro se ha desarrollado una PCR a tiempo real para VMV (Gudmundsson et al.2003).

2.5.2. Métodos basados en la detección de anticuerpos

A lo largo de la historia se han descrito varios métodos para la detección de anticuerposfrente a VMV, incluidas la seroneutralización (Sigurdardottir & Thormar 1964), la fijación decomplemento (Gudnadottir & Kristinsdottir 1967), la hemoaglutinación pasiva (Karl &Thormar 1971), la inmunofluorescencia indirecta (De-Boer 1970), la radioinmunoprecipita-ción (RIPA) (Gogolewski et al. 1985), el radioinmunoensayo (RIA) (Torfason et al. 1992), elWestern blotting o inmunotransferencia (WB) (Houwers & Nauta 1989), la IDGA (Winwardet al. 1979) y el ELISA (Houwers et al. 1982). Sin embargo, los métodos de diagnóstico se-rológico más utilizados actualmente son la IDGA y el ELISA porque permiten realizar grannúmero de muestras de forma rápida y barata. No obstante, la técnica de WB, se ha utilizadocomo técnica confirmatoria para resultados dudosos a las técnicas ELISA e IDGA (Saman etal. 1999; Varea et al. 2001; Ozyoruk et al. 2001). Asimismo, la técnica RIPA (Gogolewskiet al. 1985) y la técnica RIA, se han utilizado para estudiar la puesta a punto de los ELISAs(Vander et al. 1994).

2.5.2.1. Inmunodifusion en gel de Agar (IDGA)

La IDGA es quizás todavía la técnica serológica más usada en el diagnóstico de LVPRy es la recomendada por la OIE para el diagnóstico en programas de control de LVPR. Fuedescrita por primera vez por Cutlip y colegas en 1977 (Cutlip et al. 1977), y mejorada porWinward y colegas en 1979 (Winward et al. 1979). La IDGA se lleva a cabo en una placa dePetri cubierta de agar gel en el que se disponen una serie de pocillos en forma de roseta encuyo centro se deposita el antígeno concentrado de la cepa WLC1 de VMV y en los pocillosde alrededor se alternan los sueros problema con los controles positivos. El antígeno poseelas dos proteínas estructurales de mayor tamaño, la p25 y la gp135. Las placas se incuban atemperatura ambiente y en un lugar húmedo y la lectura se realiza a las 24 h y 48 h. El antí-geno es soluble y no fraccionado y en presencia de anticuerpos específicos da lugar a dos ban-


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das de precipitado, que se corresponden con cada una de las proteínas presentes en el antíge-no (Cutlip et al. 1977; Klein et al. 1985).

La ventaja de la IDGA es su alta especificidad, próxima al 100%, aunque su sensibili-dad fue estimada en un 80,9% por Winward y colegas (1979) (Winward et al. 1979). En unestudio reciente, sin embargo la sensibilidad de la IDGA respecto a un ELISA recombinantey al WB fue 76,3% (Varea et al. 2001). Otro inconveniente de esta técnica es que la interpre-tación de los resultados tiene un componente de subjetividad importante (Luján & Badiola2001). Además de en muestras de suero, la IDGA se ha empleado para la detección de anti-cuerpos en muestras de calostro (Alkan & Tan 1998).

2.5.2.2. Ensayo de inmunoabsorción enzimatica (ELISA)

El ELISA para la detección de LVPR desarrollado más frecuentemente es el de tipo in-directo (Houwers et al. 1982; Zanoni et al. 1994; Keen et al. 1995; Saman et al. 1999) quecomo se describe en detalle en el capítulo 4, consiste en la detección de anticuerpos con unacombinación de antígeno y anticuerpos marcados con una enzima que al añadir un substratoprovoca una reacción colorimétrica cuantificable medible espectrofotometría. La técnica seemplea sobretodo en muestras de suero y leche (Zanoni et al. 1994; Motha & Ralston 1994;Keen et al. 1996) y en general, es más sensible que la IDGA y permite una valoración semi-cuantitativa de los anticuerpos (Vitu et al. 1982; Houwers et al. 1982; Russo et al. 1988; Sim-mard & Briscoe 1990).

A lo largo de su historia, los ELISAs desarrollados se han catalogado como de prime-ra, segunda o tercera generación, según usen como antígeno virus enteros, proteínas recom-binantes y péptidos u oligopéptidos sintéticos respectivamente. Los ELISAs de primera ge-neración, utilizan preparaciones de virus enteros parcial o totalmente purificados yconjugados de enzimas policlonales (Houwers & Gielkens 1979; Houwers et al. 1982; Vituet al. 1982; Zanoni et al. 1994; Celer et al. 1998). Los antígenos, frecuentemente contamina-dos con proteínas celulares, generan falsos positivos, que pueden reducirse con dilucioneselevadas del suero pero esto disminuye la sensibilidad del test (Pepin et al. 1998). La segun-da generación de tests ELISA se basa en la utilización de anticuerpos monoclonales (Houwers& Schaake 1987) y antígenos de gran pureza obtenidos mediante técnicas de recombinaciónde ADN en cultivos bacterianos de Escherichia coli, incluidos la p25, la proteína transmem-brana (TM), la glicoproteína gp 46 y la glicoproteína externa de envoltura (Kwang & Cutlip1992; Kwang et al. 1993; Zanoni et al. 1991; Reyburn et al. 1992a; Power et al. 1995; Keenet al. 1995). Estos ensayos son generalmente más sensibles y específicos que los ensayos convirus enteros (Pepin et al. 1998). Finalmente, los ensayos de tercera generación se basan enel uso de oligopéptidos sintéticos de la envuelta viral que forman parte de epítopos inmuno-dominantes TM (gp 40) (Kwang & Torres 1994), con mayor pureza estructural. Estos oligo-péptidos mejoran la especificidad, sin embargo su sensibilidad puede verse reducida y paraevitar esta limitación frecuentemente se incluyen además proteínas recombinantes del núcleoviral. Un ELISA de tercera generación reciente desarrollado por Saman y colegas (1999)


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combina la proteína mayor de la cápside p25 con un péptido de la proteína transmembranagp46 y su sensibilidad y especificidad estimada es 99,4% y 99,3%, respectivamente (Samanet al. 1999).

Finalmente, como se ha comentado anteriormente, la técnica ELISA es más sensibleque la IDGA y se estima que es capaz de detectar entre 7-12% de animales infectados y ne-gativos a la IDGA (Houwers et al. 1982; Vitu et al. 1982; Simmard & Briscoe 1990; Celer etal. 1998). Sin embargo existen excepciones y De Martini y colegas (1999), observaron unasensibilidad menor de un ELISA basado en una proteína de fusión CA-TM frente a la IDGA,aunque al usar un ELISA basado en un virus entero, la sensibilidad fue mayor (De Martini etal. 1999).

2.6. EPIDEMIOLOGÍA

La epidemiología se define como el “estudio de la enfermedad en las poblaciones y delos factores que determinan su aparición y evolución” (Thrusfield 1995). En la propia defini-ción de epidemiología, aparece el concepto de factor de riesgo, como un factor que determi-na la aparición y evolución de la enfermedad. En este apartado se tratará de recopilar la in-formación disponible sobre las diferentes formas de transmisión del VMV, así como de losfactores de riesgo que influyen en la aparición de la enfermedad.

2.6.1. Formas de transmisión natural

Como se mencionó en el resumen inicial de la tesis, los corderos pueden infectarse an-tes del destete por la ingestión de calostro o leche con el VMV (transmisión lactógena), mien-tras que ovinos de todas las edades pueden infectarse por contacto directo o indirecto con ove-jas infectadas que eliminan virus en sus secreciones respiratorias (transmisión horizontal)(Radostits et al. 2000) pero se desconoce la importancia epidemiológica relativa de estos dosmodos de infección. Ocasionalmente se ha descrito la transmisión in utero y se ha compro-bado que el virus puede ser eliminado en el semen de carneros con leucospermia pero no seha demostrado la transmisión vía coital (Radostits et al. 2000).

2.6.1.1. Transmisión horizontal

La transmisión horizontal puede producirse de forma directa por contacto con anima-les infectados, o bien de forma indirecta por inhalación de aerosoles y materiales contamina-dos con el virus. Sin embargo, algunos autores piensan que la transmisión indirecta a travésde establos contaminados es rara (Palsson 1976) y nunca se ha comprobado la importancia dela transmisión del VMV a través de utensilios contaminados con virus (Houwers 1990). Ensu artículo, este último autor considera que es improbable que el virus permanezca infeccio-


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so fuera del hospedador durante largos periodos de tiempo y como ya se ha mencionado an-tes se sabe que el virus es capaz de sobrevivir 24 horas a 37°C, 9 días a 20°C y 4-5 meses a4°C (Thormar 1965). Más aún, cabe señalar que Sigurdsson y colegas (1953) (Sigurdsson etal. 1953) fueron capaces de infectar con VMV cuatro de cinco corderos a los que adminis-traron agua contaminada con heces de cuatro animales infectados y con sintomatología acha-cable a MV. Sin embargo, nunca se ha descrito el aislamiento del VMV de heces de animalesinfectados (Gudnadottir et al. 1965) y los resultados de aislamiento del virus de orina de ani-males infectados son inconsistentes (de Boer, mencionado por Houwers, 1990). Por otro ladose ha aislado VMV de la saliva de dos de dieciséis ovejas y de secreciones nasales de una dedieciséis ovejas, todas ellas habiendo sido previamente infectadas experimentalmente con elVMV (Gudnadottir et al. 1965). Se desconoce si el virus está presente en otras secreciones.

La eficacia de la transmisión horizontal del VMV quedó patente en la epidemia deVMV ocurrida en Islandia mencionada anteriormente y se asoció al sistema de manejo de losrebaños islandeses que facilita el contacto estrecho entre animales infectados y no infectados(Palsson 1976). Además del manejo, alguno de los animales que importaron el VMV en Is-landia era portador del virus causante de la APO que como se menciona después es un factorde riesgo de la diseminación horizontal del VMV. Además de la experiencia islandesa, la efi-cacia de la vía horizontal ha quedado patente en otros países del mundo como por ejemplo enHolanda (Houwers & Van der Molen 1987), Finlandia (Sihvonen et al. 1999) y Gran Breta-ña (Dawson et al. 1979; Pritchard & Dawson 1987). También existe evidencia de la eficaciade la vía horizontal en la transmisión del VAEC sobre todo en rebaños lecheros estabuladoscon una alta densidad de cabras (Adams et al. 1983; East et al. 1987; Rowe et al. 1992b). Pe-retz y colegas investigaron el contagio entre animales infectados y no infectados según suproximidad. Observaron una correlación positiva entre el riesgo de seroconversión y la dis-tancia entre los animales de modo que la seroconversión fue mayor en animales estabuladosen la misma nave y el mismo corral que en animales estabulados en la misma nave pero se-parados por una valla o por una pared, y mayor en estos que en animales estabulados en na-ves distintas (Peretz et al. 1994).

El contagio horizontal es eficaz incluso entre ovejas y cabras en contacto y Vogt y co-legas, observaron cómo cabras pertenecientes a rebaños en el programa de erradicación delVAEC en Suiza, seroconvertían tras haber participado en una feria ganadera junto a ovejasque padecían la infección por VMV y las secuencias del virus aislados de las cabras tenía ma-yor similitud con el prototipo de VMV que con las cepas de VAEC (Vogt et al. 1999).

2.6.1.2. Transmisión lactógena

El calostro de las ovejas infectadas con VMV puede portar el virus y por tanto facilitarla infección de los corderos durante el primer día de vida (Palsson 1978, refiriéndose a DeBoer-1970 y Gudnadottir-1974). Sihvonen y colegas, lograron cultivar el virus a partir de cé-lulas de leche obtenida entre la tercera y octava semana postparto de ovejas infectadas expe-rimentalmente con el VMV tres años antes (Sihvonen 1980). Ouzrout, logró aislar el VMV


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mediante cultivo a partir de células de calostro de una oveja gestante seropositiva a VMV(Ouzrout & Lerondelle 1990). En este estudio, sus autores llegaron a la conclusión de que elvirus se aislaba más fácilmente a partir del calostro producido inmediatamente tras el parto.Esto lo atribuyeron a que en el calostro existe una mayor cantidad de macrófagos, aunquetambién señalaron que podría deberse a la acción de los corticoides liberados al final de lagestación que podrían favorecer la expresión del virus dentro de las células diana. Además delos macrófagos, las células epiteliales en calostro y leche pueden ser también una fuentede infección. Así, Bolea y colegas, demostraron que las células epiteliales alveolares de laglándula mamaria son permisivas a la infección y replicación del VMV tanto in vivo como invitro (Bolea 1998). De modo similar, Mselli-Lakhal y colegas comprobaron que las célulasepiteliales derivadas de la leche de una cabra infectada por VAEC estaban infectadas y per-mitían la expresión del virus en cultivo (Mselli-Lakhal et al. 1999). Además, las células epi-teliales de leche no infectadas, fueron totalmente permisivas a la infección in vitro por VAEC.Lerondelle y colegas, usando técnicas de doble tinción, observaron que células epitelialesmamarias in vivo fueron positivas a VAEC en 8/8 cabras infectadas (Lerondelle et al. 1999).

En todos los estudios anteriormente citados se demuestra la presencia de los LVPR encalostro y leche y la posibilidad de infectar distintos tipos celulares presentes en la leche conLVPR. Estos hechos, unido a la elevada permeabilidad del intestino a las células maternas du-rante las primeras horas de vida, hace pensar a muchos autores que la transmisión lactógenade los LVPR es de gran importancia en la epidemiología de la infección por estos virus (Hou-wers 1997; Tuboly & Bernath 2002; Ouzrout & Lerondelle 1990). Además, existen algunosestudios experimentales que corroboran la posibilidad de infectar corderos y cabritos me-diante la administración de calostro y leche con LVPR. De este modo, Schipper y colegas,comprobaron que tras administrar calostro de vaca con virus libre de neumonía progresivaovina (NPO) a un grupo de corderos, el 22% fue seropositivo a los 2 meses de edad según latécnica de IDGA (Schipper et al. 1983). En ese mismo año, se confirmó la posibilidad de in-fectar cabritos administrándoles calostro y leche de cabras infectadas (Adams et al. 1983) yestos mismos autores demostraron que el virus estaba presente tanto en células como en so-brenadante lácteo y que era posible evitar la infección calentando el calostro a 56°C durante60 minutos antes de administrarlo a los cabritos (Adams et al. 1983). La posibilidad de trans-misión lactógena del VAEC en cabritos fue confirmada posteriormente por Ellis (Ellis et al.1986).

2.6.1.3. Importancia relativa de la transmisión lactógena y horizontal

A pesar de la evidencia de la posibilidad de infección vía lactógena y horizontal de cor-deros y cabritos con LVPR, apenas existe información sobre la eficacia relativa de ambas ru-tas. Sin embargo, éste es un aspecto fundamental de la epidemiología y control de la enfer-medad y como ya se ha mencionado es uno de los dos objetivos principales de esta tesis.

Sin embargo la importancia relativa de la transmisión lactógena y horizontal ha sidoabordada por diversos autores. De Boer, llevó a cabo un experimento en un rebaño en esta-


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bulación para investigar la relación entre el riesgo de infección en corderos y el tiempo quepermanecieron con sus madres y observó que el porcentaje de infección fue 0% para los cor-deros que se separaron de la madre y del rebaño infectado inmediatamente después del naci-miento, 11% en corderos que permanecieron con la madre en el rebaño durante las primeras10 horas de vida y 47% y 64% en los permanecieron 6 semanas y 1 año con madre en el senodel rebaño, respectivamente (De-Boer & Houwers 1979). El autor concluyó que la transmi-sión lactógena debía ser de gran importancia y que existía una estrecha correlación entre laexposición a VMV y el riesgo de infección. Sin embargo, estos resultados no permitieron es-tablecer la importancia relativa de la transmisión horizontal y lactógena puesto que todos loscorderos que permanecieron con la madre y el rebaño estuvieron expuestos a ambos modosde infección. Los resultados de este trabajo contrastan con los del realizado por Straub y co-legas. Estos autores llevaron a cabo un estudio de transmisión en corderos de un rebaño conuna seroprevalencia de VMV elevada. Al nacimiento, los corderos se separaron en cuatro gru-pos según el tipo de amamantamiento y el tiempo de permanencia con la madre. Tras dos añosde estudio, no observó seroconversiones en los corderos que habían sido separados de la ma-dre inmediatamente tras el parto ni en los que habían permanecido junto a la madre durantedos meses, pero si en los corderos que se habían criado con la madre durante 3 a 6 meses(Straub 1985). Sin embargo, los autores no especificaron si las madres de los corderos expe-rimentales estaban infectadas de VMV.

Houwers, llevó a cabo un experimento que aporta cierta información sobre la impor-tancia relativa de la infección lactógena y horizontal. En un estudio epidemiológico de cincoaños de duración en un rebaño experimental en estabulación, observó que la descendencia jo-ven de ovejas seropositivas a VMV tenía mayor probabilidad de seroconvertir que la de ove-jas seronegativas aunque esta diferencia desaparecía con el tiempo (Houwers et al. 1989).Este resultado indicaría que con el paso de tiempo en rebaños estabulados, el contagio hori-zontal del VMV reduce las diferencias iniciales en la tasa de infección probablemente debi-das a la transmisión lactógena. East y colegas, obtuvieron un resultado similar en cabras in-fectadas con el VAEC. De este modo, observaron que si bien al año de edad existíandiferencias en la tasa de seropositividad en cabritos criados con calostro de vaca o de cabrapasteurizado (20%) y cabritos criados con calostro de cabra (50%), a los tres años de edad es-tas diferencias ya no eran significativas, de modo que la seroprevalencia fue 50% en los ca-britos criados con calostro de vaca o de cabra pasteurizado y 65% en los criados con calostrode cabra. El autor concluyó que la pasteurización por sí sola es sólo parcialmente efectiva enla prevención de la infección por VAEC (East et al. 1987). De modo similar Rowe y colegas,observaron que el riesgo de seroconversión a VAEC en cabras de 2-3 años de edad criadascon calostro de cabra sin pasteurizar era el mismo que en cabras de la misma edad criadas concalostro pasteurizado (Rowe et al. 1992a).

2.6.2. Otras formas: intrauterina, venérea, iatrogénica, vectores invertebrados

La transmisión intrauterina fue descrita por primera vez por Cross y colegas en 1975,que observaron lesiones pulmonares constituidas macroscópicamente por focos de consoli-


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dación gris en los pulmones y microscópicamente por acúmulos de linfocitos en alveolos pul-monares en 2 de 11 corderos nacidos por histerectomía a partir de madres con lesiones de neu-monía progresiva crónica (Cross et al. 1975). Posteriormente, en 1981, Cutlip y colegas lo-graron aislar el virus en 2 de 35 recién nacidos de madres seropositivas a VMV y en 1 feto de17 obtenidos a partir de ovejas seronegativas que habían estado en contacto con ovejas sero-positivas (Cutlip et al. 1981). Además de estos trabajos descritos, recientemente, Brodie y co-legas, lograron detectar secuencias del virus integrado mediante PCR en un 11% de corderosrecién nacidos que habían sido separados inmediatamente de la madre tras el parto (Brodie etal. 1994). Por el contrario, en el estudio de De Boer y colegas (1979) citado anteriormenteninguno de los corderos separados al nacimiento de sus madres infectadas seroconvirtió pos-teriormente y los autores concluyeron que de ocurrir, la transmisión intrauterina era de bajasignificación en la epidemiología de la enfermedad.

La capacidad del VMV de infectar tejidos del feto ha sido puesta en evidencia por al-gunos autores de modo experimental mediante inoculación de VMV directamente sobre elfeto (Tuboly et al. 1991) o en el saco amniótico (Cutlip et al. 1982). En ambos casos, los au-tores hallaron acúmulos de células linfoides típicos de la infección por VMV en los pulmo-nes de los fetos (Tuboly et al. 1991; Cutlip et al. 1982), y lograron aislar el virus de los teji-dos (Cutlip et al. 1982). Recientemente, Lamara y colegas comprobaron que las células de lagranulosa y del oviducto de la cabra, eran susceptibles a la replicación in vitro de VAEC (La-mara et al. 2001; Lamara et al. 2002a). Sin embargo, estos autores también demostraron quela zona pelúcida intacta del embrión temprano protege a las células del mismo de la infecciónpor VAEC (Lamara et al. 2002b).

La transmisión venérea de VMV ha sido poco estudiada. El uso de carneros infectadoscon VMV para el cruce con ovejas no infectadas, sin estabularlos con las hembras, no pro-vocó seroconversión en las ovejas (Krogsrud & Udnes 1978) y Adams y colegas realizaronuna observación similar con machos cabríos infectados con VAEC (Adams et al. 1983). Sibien está por demostrar que los LVPR puedan transmitirse vía coital, se han observado lesio-nes en los testículos de carneros infectados con VMV (Palfi et al. 1989) y De la Concha-Ber-mejillo y colegas, demostraron que la epididimitis inducida por Brucella ovis facilitaba la eli-minación del VMV en el semen (de la Concha-Bermejillo et al. 1996). PosteriormentePreziuso y colaboradores obtuvieron resultados similares en diez carneros infectados conVMV y B. ovis y hallaron VMV en células intersticiales y epiteliales del epidídimo (Preziu-so et al. 2003) y sugirieron que la descamación de células epiteliales infectadas facilitaría lapresencia de VMV en semen. También se ha detectado la presencia de VAEC en fluido semi-nal y células no espermáticas en machos cabríos infectados experimentalmente con VAEC(Travassos et al. 1998).

Se desconoce la importancia de la transmisión iatrogénica de los LVPR y Dawson y co-legas realizaron infecciones experimentales sin éxito inyectando subcutáneamente a ovejassanas sangre heparinizada de ovejas infectadas (Dawson 1987). Igualmente algunos autoreshan intentado sin éxito demostrar la posibilidad de transmisión de VMV a través de vectoresinvertebrados y De Boer y colegas (1979) no detectaron anticuerpos frente a VMV en corde-


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ros a los que se les pusieron en la boca babosas de la especie Agriolimax agrestis infestadasde larvas de Muellerius capilaris, obtenidas de heces de animales infectados por VMV (De-Boer et al. 1979).

2.6.3. Infección experimental de VMV

Se ha demostrado la posibilidad de infectar experimentalmente pequeños rumiantes conLVPR por gran variedad de rutas incluidas la intranasal, la intrapulmonar, la digestiva, la in-travenosa (Sigurdsson et al. 1953; Gudnadottir & Palsson 1964; Sihvonen et al. 1980b), laintracerebral (Sihvonen 1980) y la intraarticular (Oliver et al. 1981b).

2.6.4. Factores de riesgo de la infección por VMV

Los factores de riesgo que determinan la aparición y evolución de la enfermedad se aso-cian al hospedador, al agente patógeno y al medio ambiente, formando lo que se llama la trí-ada de la enfermedad (Thrusfield 1995). Rara vez un solo factor es capaz de provocar una en-fermedad y ésta es el resultado de la interacción de varios factores y el MV es un claroejemplo de enfermedad multifactorial.

2.6.4.1. Factores asociados al hospedador

Genotipo

Aunque el genotipo del hospedador puede influir en la susceptibilidad y resistencia a lasinfecciones, hasta hoy no se ha demostrado dicha influencia en la infección por VMV. No obs-tante, se han descrito mecanismos de susceptibilidad y resistencia genética en otras infeccionesretrovirales. De este modo, en la infección por el VAEC, entre los antígenos de clase I del MHC,los Be1 y Be14 se asocian a susceptibilidad a la infección y el Be7 a la resistencia a la infeccióny entre los antígenos de clase II los BeD2 y D5 se relacionan con una mayor susceptibilidad ala infección que otras variantes (Ruff et al. 1993). Además, en vacunos infectados por el VLEBse ha demostrado una asociación positiva entre la linfocitosis y la presencia de aminoácidosGlu-Arg (ER) en la posición 70-71 del exón 2 del gen BoLA-DRB3 (Xu et al. 1993).

Especie y raza

Tradicionalmente se ha considerado que el VMV afecta de forma natural a las ovejas yque las cabras eran menos susceptibles a la infección natural por VMV. Sin embargo, comose ha mencionado anteriormente en Suiza se demostró que las cabras pueden infectarse fácil-


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mente de forma natural por contacto con ovejas infectadas con VMV (Vogt et al. 1999) y másrecientemente se ha demostrado la transmisión natural del subtipo A4 de los LVPR de cabrasa ovejas y viceversa (Shah et al. 2004). Además, en varias ocasiones se ha demostrado la ca-pacidad de los LVPR de atravesar la barrera de la especie y Banks y colaboradores y Cutlipy colaboradores infectaron cabras con VMV (Banks et al. 1983; Cutlip et al. 1991) yCutlip y colaboradores infectaron conejos con VMV pero no fueron capaces de infeccionessimilares en otras especies domésticas como el pollo, la vaca, el caballo, el cerdo, el perro yel hamster ni en especies salvajes como el ciervo, la rata y el ratón (Cutlip et al. 1991).

Numerosos autores han sugerido la existencia de un componente de susceptibilidad oresistencia asociado a la infección por LVPR. Algunos autores holandeses sostienen que laraza Texel es particularmente susceptible a padecer MV y la morbilidad de MV clínico en re-baños Texel llega a alcanzar el 10-20% (De-Boer et al. 1979). Por su parte, Cutlip y colegas(1986), en un estudio retrospectivo en ovejas de las razas Border Leicester (BL) y Columbia,infectadas natural o experimentalmente, observaron una mayor frecuencia y severidad de sín-tomas clínicos y lesiones atribuibles al VMV entre las ovejas BL que en las otras ovejas (Cu-tlip et al. 1986b). Estudios en Islandia indican que los cruces entre ovinos islandeses y ovi-nos BL parecen más resistentes a la infección que otros ovinos (Palsson 1976). Houwers ycolegas (1989), observaron una menor susceptibilidad a la infección de las ovejas Ile de Fran-ce (IF) respecto a las de raza Finnish Landrace (FL) (Houwers et al. 1989). Contrastando conestos resultados, Snowder y colegas (1990), observaron que la susceptibilidad a la infecciónera la misma en las razas Rambouillet, Targhee, Columbia y Polypay pertenecientes a un mis-mo rebaño (Snowder et al. 1990b). Por otro lado, según Perk y colaboradores, las ovejas depura raza Awassi son muy susceptibles a la infección por VMV pero resistentes al desarrollode cuadros clínicos de MV (Perk 1995).

Edad

Los fetos ovinos y las ovejas de todas las edades son susceptibles a la infección por elVMV (Radostis 1994) (Cutlip et al. 1982) (Gudnadottir & Palsson 1964; Sihvonen et al.1980b). En muchos estudios se ha observado que el riesgo de infección aumenta con la edadpero se desconoce si existe un componente de susceptibilidad o resistencia asociado a la edady los autores que han investigado esta relación coinciden en señalar que la correlación posi-tiva entre la edad y la prevalencia de VMV es debida al mayor tiempo de contacto con ani-males infectados de los animales viejos comparado con los jóvenes (Cutlip et al. 1992; Do-hoo et al. 1987; Light et al. 1979; Snowder et al. 1990a; Gonzalez 1989; Keen et al. 1997b;Simmard & Morley 1991; Schaller et al. 1995).

Sexo

Nunca se ha demostrado una asociación entre el sexo y la susceptibilidad o resistenciaa la infección por VMV. En algunos estudios no se observó relación entre el sexo y la sero-


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positividad a VMV (Cutlip et al. 1992; Schaller et al. 1995) mientras que en otros sí se ob-servó una asociación entre el sexo y la seropositividad a VMV y los autores de estos trabajosatribuyeron las diferencias al distinto manejo de los machos y las hembras en la mayoría delos rebaños (Simmard & Morley 1991; Ayelet et al. 2001).

Enfermedades concomitantes

La infección concomitante con VAPO y VMV favorece la propagación de éste últimoprobablemente porque los animales afectados de APO tienen una mayor presencia de macró-fagos alveolares susceptibles de infectarse con VMV y eliminan abundante moco bronquialcargado de macrófagos infectados que podría favorecer la formación de aerosoles con VMV(González et al. 1993; Pritchard & Done 1990; Dawson et al. 1990). De igual modo es posi-ble que la presencia de otras infecciones secundarias en el pulmón y la mama faciliten la eli-minación y transmisión de VMV (Houwers 1990; Zink & Johnson 1994). En este sentido, re-cientemente se ha observado en mujeres infectadas con el VIH una asociación entre lamamitis y la carga de VIH en leche que podría aumentar el riesgo de transmisión lactógenade VIH de madre a hijo (Semba 2000).

2.6.4.2. Factores asociados al agente

Cepa vírica

Se han descrito cepas víricas de lentivirus ovinos que difieren en citopatogenicidad ycapacidad replicativa (Lairmore et al. 1986; Lairmore et al. 1987) y tanto la cepa como la do-sis viral podría influir en la expresión de la enfermedad (Quérat et al. 1984; Lairmore et al.1986; Lairmore et al. 1987; Smith 1992).

En ovinos infectados naturalmente se aislaron cepas con diferente capacidad lítica encultivos celulares, pero estas cepas pertenecían a distintos individuos y en ningún caso se ais-laron cepas distintas en el mismo ovino (Quérat et al. 1984). Por otro lado, en cepas mante-nidas en cultivos celulares sólo las que habían tenido menos de diez pases fueron capaces deinducir lesiones y además los autores demostraron una relación positiva entre el grado lesio-nal y la dosis de virus (Lairmore et al. 1986). La patogenicidad de las cepas también varía invivo o in vitro y según el tipo de tejido en el cultivo celular. Así, Lairmore observó que doscepas que causaban una infección altamente lítica en cultivos de células de membrana sino-vial de cabra diferían en su efecto citopático sobre los macrófagos alveolares en cultivo. Unode los aislados causaba rápida y severa fusión de las células y era altamente patogénico in vivomientras que la otra cepa mostraba poco efecto citopático sobre los macrófagos alveolares, yningún efecto patogénico in vivo (Lairmore et al. 1987). Estos autores sugirieron que la ex-tensión de la replicación viral y el grado de citopatogenicidad podían ser importantes marca-dores de la virulencia de las distintas cepas del virus y consideraron la existencia de cepas “rá-


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pidas (replicación)/altas (virulencia)” y “lentas/bajas” (Lairmore et al. 1988; Lairmore et al.1987).

Tropismo de la cepa vírica

Atendiendo a la patología que provocan las distintas cepas, se ha visto que hay cepascon tropismo por el sistema nervioso, mientras que otras tienen mayor afinidad por el pul-món, las articulaciones o la mama. Así, en infecciones experimentales Andrésdóttir y colegas(1998), observaron una mayor virulencia en el SNC de cepas de VMV aisladas de un animalcon Visna que de cepas de VMV de origen pulmonar. Además las cepas de origen nerviosocrecieron más rápidamente en cultivos de plexo coroideo que las cepas aisladas del pulmón,pero ambas cepas crecieron de modo similar en cultivos de macrófagos (Andresdottir et al.1998). Sin embargo, Craig y colaboradores lograron obtener una cepa neurovirulenta a partirde un aislado de campo no neurovirulento, tras varios pases in vivo, por inoculación intrace-rebral pero no obtuvieron este resultado cuando inocularon la cepa por vía intravenosa, sub-cutánea o en la médula ósea, sugiriendo que la cepa era neuropatógena pero no neuroinvasi-va (Craig et al. 1997b).

2.6.4.3. Factores asociados al ambiente

Dentro de los factores ambientales que pueden favorecer la diseminación de la enfer-medad, podríamos hablar del macroclima asociado a una zona geográfica particular y del mi-croclima en el establo. Ninguno de estos aspectos se ha investigado en detalle pero cabe es-perar que ambos tengan influencia por ejemplo en la formación de aerosoles y ladiseminación del virus. Además las condiciones meteorológicas condicionan el manejo delrebaño, por ejemplo el tiempo en que el ganado permanece estabulado. Otros factores de ries-go asociados a la estabulación serían el grado de ventilación del establo y de hacinamiento delos animales y la disposición de comederos y abrevaderos que faciliten el contacto directo en-tre animales infectados y no infectados. En cualquier caso, la seroprevalencia en el rebaño esun factor crítico asociado al efecto del medio ambiente en la infección por VMV.

Clima

Las condiciones climáticas marcan el tipo de manejo que se emplea en un rebaño, encuanto a que las bajas temperaturas en invierno obligan a mantener estabulados los animalesdurante un periodo más o menos largo, llegando a ser necesaria la cría de los corderos en lacuadra. Como ya se ha señalado, no existen datos sobre la influencia del microclima de la cua-dra en la transmisión de la infección pero parece razonable pensar que condiciones de húme-dad relativa elevada y ventilación pobre serían condiciones ideales para facilitar la transmi-sión horizontal (ver apartado siguiente) (Houwers 1990). Sin embargo, algunos autores


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mencionan que en lugares secos y calurosos como los Monegros en Aragón la transmisión ho-rizontal podría verse facilitada al juntarse los animales en zonas sombrías o para evitar la luzsolar directa (Ferrer 1996).

Modo de cría

1. Estabulación:

El confinamiento de los animales en establos cerrados durante el invierno, fue uno delos factores que contribuyó a la grave epidemia de MV en Islandia (Palsson 1976). Otros au-tores comprobaron que la estabulación durante largos periodos de tiempo y en condiciones demasificación, con mala ventilación, especialmente en la época de partos, es un factor asocia-do positivamente a la prevalencia de VMV (Dawson 1980; Houwers 1990; Schaller et al.1995).

Keen y colegas (1997), describieron una asociación entre el nacimiento y la cría de loscorderos en confinamiento y una mayor seroprevalencia a MV en ovejas. Los autores postu-laban que las condiciones intensivas de cría de los corderos (especialmente la alta densidadde animales y la mala ventilación) probablemente incrementarían la frecuencia de contactodirecto entre ovejas infectadas y no infectadas, facilitarían el cambio de fluidos corporales(leche y secreciones nasales y pulmonares que contendrían el virus libre o unido a macrófa-gos) y proveerían unas condiciones ambientales adecuadas para la supervivencia del virus enel medio (Keen et al. 1997b).

Manejo

1. Tipo de cría antes del destete:

Como ya se ha explicado en detalle, el calostro y la leche de ovejas infectadas puede seruna fuente de VMV para los corderos que lo ingieran y la cría de corderos durante la lactanciacon calostro y leche libre de LVPR reduce el riesgo de infección al menos a corto plazo.

2. Estado serológico materno y edad al destete:

Houwers y colegas (1989) encontraron una asociación estadística significativa entre larelación madre-cordero en el periparto y la transmisión del VMV. Así, observó que los cor-deros nacidos de madres seropositivas y criados de forma natural, seroconvertían durante elprimer año de vida en una mayor proporción (36,5%) que los corderos nacidos de madres se-ronegativas (20%) (Houwers et al. 1989). Asimismo, Scheer-Czechowski y colegas, en un es-tudio prospectivo llevado a cabo en varios rebaños de ovejas de raza Walliser Schwarzna-senschafen, concluyeron que corderos nacidos de ovejas seropositivas tenían 7,6 veces másriesgo de seroconvertir en los dos primeros años de vida, que aquellos nacidos de ovejas se-ronegativas. (Scheer-Czechowski et al. 2000). Más aún, hay autores que afirman que la des-


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cendencia de animales seropositivos adultos tiene un mayor riesgo de seroconvertir que ladescendencia de animales seropositivos más jóvenes (Sihvonen et al. 1980b).

Por otro lado, se ha visto que un aumento en la edad al destete está asociado positiva-mente a la seropositividad a maedi (De-Boer et al. 1978; Keen et al. 1997b).

3. Otras prácticas de manejo:

Prácticas tales como el uso de ovejas infectadas como nodrizas para amamantar corde-ros y en general, permitir que los corderos tengan contacto con ovejas infectadas se asocia amayores porcentajes de seroprevalencia a MV en rebaños de Ontario (Canadá) (Campbell etal. 1994). Esto mismo fue descrito por Houwers en Holanda en 1990 (Houwers 1990). Esteautor también incide en la importancia de la política de desvieje del rebaño y destaca la ne-cesidad de realizar un desvieje precoz de los animales afectados clínicamente de cara a limi-tar la propagación de la infección y menciona el riesgo que podría suponer el intercambio demachos infectados entre rebaños (Houwers 1990).

4. Tamaño de rebaño:

Mientras que algunos autores han observado una relación positiva entre el tamaño delrebaño y la seroprevalencia a VMV (Cutlip et al. 1992; Simmard & Morley 1991; Keen et al.1997b; Arsenault et al. 2003) Campbell y colegas (1994) en Canadá no encontraron una re-lación entre el tamaño del rebaño y la seroprevalencia a VMV(Campbell et al. 1994).

2.7. IMPORTANCIA ECONÓMICA Y CONTROL

2.7.1. Importancia económica

Las pérdidas económicas atribuibles al MV pueden ser producidas por efectos directoscomo la muerte y desvieje precoz de ovinos afectados de MV, el aumento de la tasa de repo-sición anual y la disminución del crecimiento de corderos de ovejas afectadas y por efectosindirectos como la propensión a sufrir infecciones secundarias, la reducción en el valor demercado de los animales de rebaños infectados y la imposibilidad de comercializar animalesde estos rebaños (Houwers 1990). Diversos estudios han valorado las pérdidas económicasasociadas a la infección por VMV. Así, Dohoo y colegas (1987) observaron que las ovejas se-ropositivas tenían un menor porcentaje de concepción que las ovejas seronegativas y que elpeso al nacimiento de los corderos de ovejas seropositivas de 3-4 años era menor que el delos corderos de las ovejas seropositivas más jóvenes o más viejas (Dohoo et al. 1987). Snow-der y colaboradores no observaron relación entre la infección subclínica por VMV y la pro-ducción de corderos o de lana (Snowder et al. 1990a) ni entre estado serológico a VMV delas ovejas y la composición de la leche entre los 0 y 98 días postparto (Snowder et al. 1990c).Sin embargo, en este mismo estudio observaron, que las ovejas seronegativas a MV tendíana producir más leche que las seropositivas. En 1991 Pekelder y colegas observaron una co-


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rrelación negativa entre el número de folículos linfoides asociados a la infección por VMVen la mama y el peso al destete del cordero (Pekelder et al. 1991; Pekelder et al. 1994). Keeny colegas también observaron que la tasa de natalidad y el peso de los corderos al destete eramayor en las ovejas seronegativas a VMV que en las seropositivas (Keen et al. 1997a). Másrecientemente, Ploumi y colegas (2001) comprobaron que las ovejas seropositivas producíanmás leche que las ovejas seronegativas, tanto en la primera como en la segunda lactación,pero que la diferencia era menos evidente en la cuarta y posteriores lactaciones (Ploumi et al.2001). Por último, en un estudio epidemiológico sobre el impacto de la seropositividad a MVen la productividad de los rebaños de ovejas en Quebec se concluyó que los corderos criadospor ovejas seropositivas de cuatro o más años de edad tenían menor peso al destete que loscorderos criados por otras ovejas y que la mortalidad perinatal era mayor en los corderos na-cidos de ovejas seropositivas de cualquier edad que en los hijos de las ovejas seronegativas(Arsenault et al. 2003).

2.7.2. Control

Diversos autores han llevado a cabo estudios para desarrollar y evaluar la posibilidadde control de las infecciones por LVPR mediante vacunación y tratamientos terapéuticos,aunque el éxito de estos abordajes ha sido limitado y actualmente no existen vacunas comer-ciales capaces de prevenir las infecciones por LVPR y la mejor medida de control se consi-dera que es la erradicación mediante la aplicación de medidas zoosanitarias basadas en la eli-minación de animales infectados.

2.7.2.1. Vacunas y tratamientos

En la producción experimental de vacunas frente a los LVPR, las creadas con virus en-teros inactivados no han sido exitosas a la hora de estimular una respuesta protectora en elhospedador y el empleo de virus sin inactivar tiene un elevado riesgo de inducir la enferme-dad. Además, se han desarrollado vacunas compuestas por subunidades víricas, vacunas re-combinantes, vacunas de antiidiotopos y vacunas de péptidos sintéticos (Pearson et al. 1989).Las vacunas de subunidades emplean antígenos virales, las recombinantes usan segmentos deADN del virus insertados en el genoma de un vector por ejemplo el virus vaccinia, las de an-tiidiotopos inyectando antiidiotopos que mimetizan la estructura del antígeno original y lasde péptidos sintéticos que utilizan péptidos creados mediante ingeniería genética.

Cutlip y colegas (1987) desarrollaron vacunas de virus inactivado mediante calor, for-malina, o etilenamina, sin adyuvante o con adyuvante incompleto de Freund o de hidróxidode aluminio, que si bien indujeron anticuerpos precipitantes contra el virus no confirieron su-ficiente protección contra la infección experimental de VMV (Cutlip et al. 1987). McGuire ycolaboradores tampoco consiguieron una vacuna protectora a partir de VAEC inactivadoy tras inocular cabras con una dosis infectiva, las vacunadas desarrollaron artritis de forma


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más severa y rápida que las vacunadas con medio de cultivo tisular libre de VAEC (McGui-re et al. 1986). Según cita Pearson y colaboradores (Pearson et al. 1989), Poss y colaborado-res obtuvieron distinta eficacia vacunal según el adyuvante empleado en un estudio en el quese valoró el efecto protector frente a una infección experimental con VAEC de una vacunacon VAEC inactivado con adyuvante completo de Freund o con dipéptido de treonil-mura-mil. Los autores observaron que si bien todas las cabras desarrollaron anticuerpos precipi-tantes frente a VAEC, en la necropsia las lesiones en el carpo fueron menos severas en las ca-bras que recibieron vacuna con dipéptido de treonil-muramil, que en las que se vacunaron conla preparación de adyuvante completo de Freund y que en las cabras no vacunadas.

El uso de virus atenuados obtenidos por supresión de determinados genes, como porejemplo vif, tat y dUTPasa, ha tenido cierto éxito. Zhang y colegas (2003) crearon medianteingeniería genética un virus que contenía el gen de la proteína verde fluorescente, lo inyecta-ron en corderos a los que posteriormente infectaron con el virus NPO y observaron que loscorderos vacunados presentaban títulos más bajos del virus en sangre que los corderos no va-cunados (Zhang et al. 2003).

La producción de vacunas recombinantes a partir de vectores bacterianos o virales seha convertido en otra posibilidad a explorar. Así, se han realizado estudios con virus vacciniaque expresan glicoproteínas codificadas por el gen env de VAEC (Cheevers et al. 1994; Be-yer et al. 2001; Sanchez et al. 2002), con mutantes del VAEC a los que les falta el gen tat(Harmache et al. 1998) y con plásmidos que expresan el gen env de VAEC (Beyer et al.2001). Todos ellos han tenido resultados más o menos prometedores pero en ningún caso seha conseguido una protección total.

Entre los tratamientos terapéuticos empleados frente a los LVPR destaca el uso de inter-ferón-tau que es una sustancia producida por células del trofoblasto de oveja con gran actividadantiviral in vitro (Juste et al. 1996). En un experimento basado en dos tratamientos diferentes coninterferón-tau en corderos infectados experimentalmente con lentivirus ovino, se observó que eltratamiento temprano de las infecciones lentivirales era altamente efectivo en reducir la viremiay en prevenir el desarrollo de la enfermedad lentiviral (Juste et al. 1997; Juste et al. 2000).

2.7.2.2. Estrategias de control zoosanitario

Ante la ausencia de tratamientos y vacunas eficaces, el control de la infección porLVPR en los rebaños pasa por la aplicación de medidas dirigidas a erradicar la enfermedaddel rebaño. A continuación se describen los distintos métodos de erradicación cuya eficaciaha sido probada en diversos países.

2.7.2.2.1. Reemplazo total del rebaño infectado por animales libres de infección

Este método utilizado en la epidemia de VMV en Islandia consistió en el sacrificiocompleto de rebaños en los que apareció uno o más animales enfermos. Tras la eliminación


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de los animales, la granja se sometió a un periodo de vacío sanitario, tras el cual se reintro-ducían ovejas de áreas no infectadas (Palsson 1978). El método fue efectivo, ya que desde en-tonces la cabaña ovina islandesa está libre de VMV, sin embargo este abordaje es inviable enpaíses como España donde la infección está ampliamente diseminada con elevada prevalen-cia dentro de los rebaños (Luján et al. 1993) y sería muy difícil conseguir suficientes anima-les para reposición (De-Boer et al. 1978). Este método supone la pérdida de determinadas lí-neas de alto valor genético (Houwers 1990).

2.7.2.2.2. Análisis serológicos periódicos y eliminación de todos los seropositivos y su pro-genie

La eficacia de este método ha sido corroborada tanto en estudios experimentales (De-Boer & Houwers 1979) como en estudios de campo (Houwers et al. 1984; Cutlip et al.1986a). Cutlip y colegas (1986), eliminando periódicamente los animales seropositivos, lo-graron erradicar el VMV de un rebaño en 6-7 años (Cutlip et al. 1986a). Sin embargo, elimi-nar además la progenie de ovejas seropositivas acelera el proceso de erradicación. Utilizan-do este método, Houwers y colegas (1984) lograron prevalencia cero en dos años y, en tresaños cuando eliminaron sólo los corderos lactantes de los ovinos seropositivos además de es-tos últimos (Houwers et al. 1984). Este método también estaría indicado en rebaños con bajaprevalencia, menor de 30%, aunque puede implicar la eliminación de líneas familiares inte-resantes desde el punto de vista productivo.

En los trabajos citados se empleó la técnica serológica de IDGA para la detección delos animales seropositivos y puesto que la sensibilidad de esta técnica es limitada fue nece-sario realizar los ensayos cada seis meses y mantener la vigilancia serológica durante variosaños para asegurarse la completa eliminación del VMV del rebaño, dada la naturaleza de larespuesta inmune humoral detectable por esta técnica (Williams-Fulton & Simard 1989). Esposible que actualmente empleando un ELISA recombinante altamente sensible no sea nece-sario analizar los rebaños con tanta frecuencia.

2.7.2.2.3. Creación de un rebaño nuevo separado del rebaño original infectado

En rebaños con prevalencia de VMV elevada, dónde no es práctico eliminar todos losanimales infectados, tradicionalmente el abordaje de control más indicado ha sido la creaciónen la explotación de un nuevo rebaño separado del original a partir de corderos de éste se-gregados de la madre al nacimiento y criados artificialmente durante la lactancia con calos-tro y leche libre de VMV (Houwers 1990). Este abordaje es laborioso e implica disponer deinstalaciones para alojar el segundo rebaño en muchos casos. Sin embargo, tiene las ventajasde que posibilita el mantenimiento en la explotación de líneas genéticas interesantes y que noconlleva el sacrificio inmediato de animales buenos productores infectados.


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Además de estos abordajes para erradicar el VMV de rebaños infectados, cuya eficaciaha sido probada, diversos autores han propuesto la aplicación de ciertas medidas para reducirla prevalencia de VMV, pero está por probar que su aplicación de modo exclusivo permita laerradicación del VMV de rebaños infectados. Entre las prácticas dirigidas a reducir la preva-lencia de los LVPR en rebaños infectados destacan las siguientes:

2.7.2.2.4. Compra anual de animales de reemplazo libres de MV

La compra de animales de rebaños libres para reposición evitaría la transmisión lactó-gena de madres infectadas a su descendencia. La aplicación exclusiva de este método no hasido evaluada en campo, aunque teóricamente la infección podría ir diluyéndose a medida queanualmente se fueran añadiendo nuevos animales no infectados (Houwers 1990).

2.7.2.2.5. Reemplazo a partir de hijas de hembras seropositivas jóvenes

Se ha comprobado experimentalmente que las ovejas en estadíos tempranos de in-fección por VMV transmiten el virus en menor grado y sus corderos tienen menor proba-bilidad de infectarse que la descendencia de ovejas en estadíos tardíos de la infección y, eneste sentido, sería ventajoso evitar seleccionar la reposición de estas últimas (Sihvonen1980).

2.7.2.2.6. Reemplazo a partir de hijas de hembras seronegativas

Seleccionar la recría exclusivamente de hembras seronegativas evitaría la transmisiónlactógena del virus y quizás seleccionaría líneas genéticas más resistentes a la infección, aun-que esto está sin demostrar. Ferrer empleó este método junto con la aplicación de desvieje se-lectivo de animales con signos de neumonía crónica o sin leche en ambas mamas en rebañosextensivos y semi-extensivos de Rasa Aragonesa y consiguió reducir la prevalencia (Ferrer1996).

2.7.2.2.7. Selección genética de ovejas resistentes

Algunos autores proponen la selección y propagación natural o transgénica de razas deovejas naturalmente resistentes a los lentivirus ovinos (DeMartini et al. 1991). Para ello, esnecesario la identificación de marcadores genéticos de resistencia al virus, pero como ya seha indicado anteriormente sólo se han descubierto marcadores para otros lentivirus, incluidosel VAEC y el VLEB.


77

01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 77

2.7.2.3. Programas de control en Europa

Varios países han puesto en marcha programas de control y erradicación de LVPR (Ta-bla 2). Dichos programas tienen en común el análisis serológico periódico y el sacrificio deanimales infectados, aunque los protocolos se adaptan a la prevalencia inicial de la infeccióny al patrón de propagación. En Noruega, donde la prevalencia de rebaños y animales infecta-dos de VMV era baja, 9% y 0,4%, respectivamente, se inició en 1975 una campaña de sane-amiento que consistió en la inmovilización de animales de rebaños positivos o de rebaños quehubieran tenido contacto con positivos y sacrificio progresivo de los mismos. En 1985 el paísse consideró libre de la enfermedad (Krogsrud 1985). En Dinamarca, donde había 30% de re-baños infectados y 11% de animales infectados, comenzó en 1979 un programa de control vo-luntario basado inicialmente en análisis serológicos anuales, con eliminación de animales se-ropositivos y su progenie hasta alcanzar el rebaño un estado “libre”. Posteriormente losrebaños se analizaron durante dos años y los rebaños que fueron negativos a éstos ensayos sevigilaron serológicamente cada tres años. En 1983 los rebaños positivos habían descendido a21% (Hoff-Jorgensen 1985). En el Reino Unido, en 1982 tras estimar que la prevalencia erabaja se inició un programa voluntario para acreditar a los rebaños libres de infección mediantela realización de análisis serológicos a intervalos de 6-9 meses. En rebaños con ovejas autóc-tonas se conseguía la acreditación tras dos análisis serológicos negativos mientras que en re-baños con ovejas importadas eran necesarios tres análisis negativos consecutivos. Para man-tener esta acreditación se realizaban análisis serológicos anuales. En rebaños infectados losanimales seropositivos eran enviados inmediatamente a matadero. Un total de 2.500 rebañosobtuvieron la acreditación. En Holanda, en 1982, se inició un programa de control voluntarioen 1.711 rebaños de selección racial, que representaban el 70% de los rebaños registrados, ytenían una seroprevalencia de 79%. El programa se basó en la acreditación de los rebaños quehubieran obtenido dos análisis serológicos negativos en un intervalo de seis meses en anima-les mayores de seis meses de edad. Para mantener la acreditación se realizaron análisis cadadoce meses de todos los animales del rebaño mayores de un año. Se sacrificaron todos los ani-males positivos y su progenie y se aplicaron medidas de restricción de movimientos a los re-baños acreditados impidiéndoles el contacto o compra de animales de rebaños no acredita-dos. Tras cuatro años de programa, el 71% (1212/1711) de los rebaños del programaconsiguió la acreditación (Houwers et al. 1987). Tras el éxito de la experiencia, se decidió re-lajar las medidas para obtener la acreditación y realizar la vigilancia de los rebaños acredita-dos a intervalos de 24 meses (Houwers 1990).

Según lo expuesto, la puesta en práctica de un plan de control a nivel nacional o regio-nal incluye tres aspectos fundamentales: i) establecer las bases para la monitorización sero-lógica de la población, definiendo el ensayo diagnóstico a utilizar y la periodicidad con la quese realizarían los muestreos, ii) establecer un sistema de identificación, protección y certifi-cación de rebaños negativos y iii) eliminar la infección de los rebaños infectados empleandolos abordajes antes descritos según la prevalencia y las posibilidades materiales del rebaño.

Finalmente, tras lo descrito en esta introducción general de la tesis, no cabe duda de quedesde que se describió la enfermedad conocida con los nombres de La Bouhite, Graaff-Rei-


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01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 78

net, Zwogerziekte, maedi-visna, etc., numerosos investigadores han dedicado sus esfuerzos adilucidar su etiología, patogénesis, diagnóstico, epidemiología y control. Los avances reali-zados sobre todo en los últimos 40 años han sido espectaculares y han servido para limitar losefectos de la enfermedad y eliminar el VMV de áreas geográficas extensas. Sin embargo, lasmedidas de control más eficaces son en muchos casos drásticas, caras, no son practicables enmuchos rebaños y no tienen en cuenta el bienestar animal. Es necesario por tanto seguir in-vestigando nuevas alternativas de control más idóneas y basadas en criterios racionales fun-damentados en el buen conocimiento de la dinámica del VMV en los diversos sistemas pro-ductivos. Con este fin, esta tesis centra sus esfuerzos en el estudio de la infección y controldel VMV en rebaños lecheros en régimen semiintensivo de raza Latxa. En el próximo capí-tulo se describen aspectos epidemiológicos y de control del VMV en rebaños latxos comer-ciales y en los siguientes dos capítulos experimentales se investiga específicamente el papeldel calostro en la transmisión del VMV y sus implicaciones en el control de la enfermedad.


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3. ESTUDIO DE LA TRANSMISIÓNDEL VIRUS MAEDI-VISNA (VMV)Y POSIBILIDADES DE CONTROLEN REBAÑOS DE OVINO LATXO

DEL PAÍS VASCO

01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 81

3.1. INTRODUCCIÓN

En España las infecciones por el VMV se han descrito en la mayoría de las Comunida-des Autónomas (Luján & Badiola 2001) y concretamente en la Comunidad Autónoma delPaís Vasco (CAPV), González (1989) estimó que la infección estaba presente en el 99,2% delos rebaños y dentro de éstos el 54% de los animales mayores de un año de edad era seropo-sitivo (Gonzalez 1989). En otro estudio llevado a cabo en el País Vasco, se concluyó que elmaedi-visna era la segunda causa más común de desvieje tras la mamitis bacteriana (Gómezet al. 2001). Estos datos reflejan la importancia del MV en la zona y la necesidad de implan-tar medidas que reduzcan la incidencia de esta enfermedad que provoca pérdidas en la renta-bilidad de los rebaños.

Como se ha explicado, la erradicación se considera la forma óptima de control delVMV y se ha demostrado que es posible eliminar el VMV de rebaños infectados identifican-do y eliminando periódicamente los animales seropositivos y su progenie o creando un reba-ño nuevo libre de VMV separado del rebaño infectado (Houwers 1990). Sin embargo, estosabordajes de control son caros y probablemente no aplicables en muchos rebaños. No obs-tante en España y más concretamente en Aragón, Ferrer (1996) observó una disminución pro-gresiva de la seroprevalencia de VMV en rebaños extensivos de Rasa mediante una combi-nación de eliminación de animales seropositivos de modo más gradual que el descrito porHouwers (1990) y reemplazo de estos con descendencia de ovejas seronegativas (Ferrer1996).

Es posible que existan igualmente formas alternativas de eliminar el VMV de rebañosen otros sistemas de producción y para ello es esencial tener un conocimiento preciso de laepidemiología del VMV y su modo de transmisión. En este sentido, se sabe que el virus setransmite principalmente tras el nacimiento por vía lactógena por consumo de calostro y le-che con VMV y por vía horizontal por contacto directo e indirecto con animales infectadosde VMV, pero no existe información sobre la importancia relativa de los modos de transmi-sión. A pesar de la falta de información algunos autores consideran que la transmisión lactó-gena es fundamental y de mayor importancia que la transmisión horizontal en muchos siste-mas productivos (Keen et al. 1997b; Pepin et al. 1998). En base a esta opinión, en la CAPVse desarrolló durante la década de 1990s un programa de control del VMV basado exclusiva-mente en prevenir la infección lactógena de VMV mediante cría artificial de los corderos concalostro bovino y lacto-reemplazantes, sin evitar la transmisión horizontal entre los animalescriados artificialmente durante la lactancia y otros animales infectados del rebaño.

En este capítulo se lleva a cabo un análisis retrospectivo de la seroprevalencia, inci-dencia de seroconversión y de las posibilidades de control del VMV en cuatro rebaños de ovi-no lechero de raza Latxa adscritos al citado programa de control de VMV y en otros seis re-baños similares que no participaron en el programa y criaron a la reposición de forma naturalcon la madre. El sistema de producción de los rebaños ovinos lecheros de raza Latxa del PaísVasco es un sistema que puede considerarse como semiintensivo, con un parto al año e ínti-mamente ligado al pastoreo pero con periodos variables de estabulación, principalmente du-

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01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 83

rante los meses invernales (Ruiz Santos 2000). La raza Latxa representa el 80% de las 300-350 mil ovejas de la CAPV y el 88% de los rebaños latxos tienen menos de 100 cabezas ypertenecen a pastores sin dedicación exclusiva, mientras que el 11,5% de los rebaños latxostienen entre 100-600 ovejas y entre estos se incluyen la gran mayoría de los rebaños de la re-gión manejados por pastores profesionales con dedicación exclusiva.

3.2. MATERIALES Y MÉTODOS

3.2.1. Población de estudio

En este estudio retrospectivo se analizaron datos de diez rebaños lecheros de oveja La-txa de la CAPV, con una media (rango) de 268 (156-504) ovinos mayores de seis meses deedad, analizados serológicamente para detectar anticuerpos frente a VMV anualmente entre1994 y 1999. Cuatro rebaños (rebaños B1, B2, B3 y B4) separaron las corderas de reposiciónde la madre inmediatamente después del parto y las criaron con calostro de vaca durante lasprimeras 24 horas de vida y lacto-reemplazante hasta el destete a las 5-7 semanas de vida paraevitar la transmisión lactógena de VMV y los otros seis rebaños (rebaños O1, O2, O3, O4, O5y O6) no participaron en el programa de control de VMV y criaron a la reposición con la ma-dre hasta los tres meses de edad. Se seleccionaron estos seis rebaños por ser los únicos conun sistema productivo similar a los otros rebaños y de los que se disponía de al menos dosanálisis serológicos de VMV completos en años consecutivos.

El régimen de explotación de los rebaños del estudio fue típico de los rebaños lecherosprofesionales de raza Latxa, con un parto al año y el 96% de los partos entre noviembre y mar-zo. Tras el parto las ovejas se ordeñaron durante aproximadamente cinco meses y la produc-ción lechera media osciló entre 120-1.90l por lactación. Aunque los animales permanecieronla mayor parte del año en pastoreo también estuvieron estabulados durante periodos relativa-mente largos, sobre todo por la noche en el último mes de gestación y durante la lactación. Elperiodo de estabulación varió entre un rebaño que solo estabuló el ganado de noche duranteaproximadamente un mes poco antes y después de los partos y un rebaño que mantuvo lasovejas estabuladas durante la mayor parte del día a lo largo de seis meses desde un mes antesdel parto hasta el final del periodo de ordeño. Las corderas criadas artificialmente (rebañosB1-B4) permanecieron estabuladas en corrales independientes pero en la misma cuadra queel rebaño adulto infectado, y tras el destete las corderas de reposición de todos los rebaños secriaron como un rebaño separado, hasta incorporarse al rebaño adulto tras el primer parto.

3.2.2. Toma de muestras y análisis de anticuerpos anti-MV

Se tomaron muestras anuales de sangre de todos los animales del rebaño mayores deseis meses de edad entre agosto de 1994 y enero de 1999, excepto en la campaña 1996-97 enel rebaño O6 donde se tomaron muestras de 75/502 animales del rebaño, de edades com-


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01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 84

prendidas entre 2 y 6 años. Se realizaron un total de 35 visitas y la media (rango) fue 4 (2-6)visitas por rebaño a intervalos de 365 (313-457) días. Se recogió sangre mediante punción yu-gular en tubos de vacío y se analizó la presencia de anticuerpos VMV en suero mediante latécnica de inmunodifusión en gel de agar (IDGA), usando el kit MAEDITEC (Veterinary La-boratories Agency, UK). La IDGA es todavía la técnica de referencia de la Oficina Interna-cional de Epizootías (OIE) para el diagnóstico serológico de VMV y la más empleada hastala reciente aparición de ELISAs recombinantes de mayor sensibilidad. La sensibilidad (Se) yla especificidad (Es) de la técnica IDGA comparada con un ELISA recombinante y un Wes-tern blotting son de 76,3% (95% intervalo de confianza [IC], 72,8-78,9%) y 98,3% (95% IC,97,3-98,9%) respectivamente (Varea et al. 2001).

3.2.3. Manejo de datos

El estudio retrospectivo se llevó a cabo en datos almacenados en una tabla de Micro-soft Access que incluía la fecha de muestreo, la identificación del rebaño y del animal, el re-sultado del análisis serológico, la fecha de nacimiento y de baja, el sexo, el modo de cría du-rante la lactancia y las relaciones genealógicas de los animales. A partir de estos datos seidentificó el estado serológico de las madres en el momento del parto y al final de su vida pro-ductiva o al final del estudio (“estado serológico materno en vida”) y se calculó para cada ani-mal y periodo entre dos análisis consecutivos, el grado de contacto con animales seropositi-vos multiplicando los días en el rebaño por la seroprevalencia media en el rebaño durante elperiodo (“días-oveja seropositivos (DOS)”. La variable “estado serológico materno en vida”se empleó como una medida indirecta para valorar la existencia de un componente heredablede susceptibilidad o resistencia a la infección como se describe a continuación.

3.2.4. Análisis epidemiológico y estadístico

Para cada rebaño y muestreo se calculó la seroprevalencia (porcentaje de animales se-ropositivos) aparente (P

A) y se estimó la seroprevalencia real (P

RG) empleando el estadístico

de Rogan-Gladen que ajusta la prevalencia según la Se y Es de la técnica IDGA (Greiner &Gardner 2000), según la fórmula:

PRG

= (PA+ Es-1) / (Se+Es-1)

Además se estimó la incidencia acumulada de seroconversiones entre dos análisis con-secutivos (porcentaje de seroconversiones entre las ovejas seronegativas al comienzo del pe-riodo de estudio) y se analizó la relación entre la seroconversión y diversos factores de ries-go (tablas 5 y 6) incluidos la edad (años), el modo de cría durante la lactancia (artificialmenteo con madre seropositiva o seronegativa), el grado de contacto con animales seropositivos oDOS (tres niveles de bajo a alto) y la edad y estado serológico (seropositiva o seronegativa)de la madre al parto y en vida. En un primer estadio se comparó la proporción de serocon-

3. ESTUDIO DE LA TRANSMISIÓN DEL VIRUS MAEDI-VISNA (VMV) Y POSIBILIDADES DE CONTROL...

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01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 85

Tabla 3. Seroprevalencia aparente de VMV en los rebaños según la lactación

Rebaño Lactación (Octubre-Julio)

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versiones para los distintos niveles de los factores de riesgo empleando la técnica de chi2 deYates (Kirkwood 1988) en Epi Info 6.0 (CDC Atlanta).

A continuación se llevó a cabo un análisis multivariable de la seroconversión empleandoun modelo de regresión logística en SAS (SAS Institute). En el modelo de regresión logística seanalizó la interacción entre el grado de contacto con animales seropositivos y la edad del animaly entre la edad y el estado serológico de VMV de la madre. Se comenzó creando un modelo sa-turado que incluyó todas las interacciones y variables independientes consideradas y seguida-mente se fueron eliminando gradualmente aquellas variables no asociadas significativamentecon la variable dependiente. El método de estimación empleado fue el de máxima verosimilitud(maximum likelihood) y se tomó un nivel de significación del 5% (p< 0,05). Finalmente comomedida específica de riesgo se calcularon los Odds Ratios (OR) exponenciando los coeficientesde regresión (b) de las distintas categorías de las variables incluidas en el modelo final. El OddsRatio es una medida de riesgo basada en el odds, siendo el odds el cociente entre la probabili-dad de que ocurra un evento y la probabilidad de que no ocurra, de manera que este cociente in-dica cuánto más probable es la ocurrencia del evento que la no ocurrencia. Así, el Odds ratio esel cociente entre el odds en el grupo en riesgo y el odds en el grupo no en riesgo.

3.3. RESULTADOS

3.3.1. Seroprevalencia en los rebaños y lactaciones

Se analizaron datos correspondientes a 8679 análisis de 4003 animales de los cuales el94% fueron de hembras y el 6% de machos. La edad media (rango) de los ovinos analizadosfue de 3,5 (0,5-14 años) años y en conjunto el porcentaje e IC 95% de resultados seropositi-vos fue 35% (34-36).


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01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 86

Las tablas 3 y 4 muestran la PA

y PRG

por rebaño y año (lactación). La seroprevalenciareal (P

RG) de VMV osciló entre 76% en el rebaño O6 en la lactación 1996-97 y 4% en el re-

baño B4 en la lactación 1998-99 (p<0,05). Globalmente, la PRG

descendió significativamenteen los rebaños B4 y O2 a lo largo del estudio (p<0,05), aumentó significativamente en los re-baños B1, B2 y O4 (p<0,05), aumentó marginalmente en el rebaño O3 (p = 0,075) y no variósignificativamente en los demás rebaños (p>0,05).


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Tabla 4. Seroprevalencias estimadas de Rogan-Gladen a MV en los rebaños según la lactación y se-roprevalencias totales por rebaños en el periodo de estudio

Rebaño Lactación (Octubre-Julio)

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3.3.2. Seroprevalencia según el modo de cría y la edad de los animales

En los rebaños que criaron la reposición artificialmente, la PA

fue 41% (1387/3379) yla P

RGfue 53%, mientras que en los que lo hicieron de modo natural con madre, la P

Afue 32%

(1670/5300) y la PRG

40% (p<0,05) y coincide con que los rebaños que criaron artificialmen-te la reposición tuvieron un régimen productivo más intensivo y con mayor estabulación quelos que hicieron cría natural.

Según la edad la seroprevalencia aumentó de un 8% en animales de un año de edad aun 58% a los 6 años de edad (Tabla 5).

Tabla 5. Prevalencia a MV en función de la edad de los animales

Edad (Años) Total animales Positivos Prevalencia

1 1.862 139 8 %2 1.673 377 23 %3 1.396 534 38 %4 1.029 481 47 %5 863 465 54 %6 724 422 58 %

01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 87

Sin embargo, la relación entre la seroprevalencia y la edad varió según el modo de críadurante la lactancia (Tabla 6 y Figura 4). Al año de edad la seroprevalencia fue 3% (16/582)en los criados con madres seronegativas, significativamente menor que en otros corderos enlos que la seroprevalencia fue 8% (29/363) en los criados con ovejas seropositivas y 10%(77/762) en los criados artificialmente. Durante los siguientes dos años, la seroprevalencia


88

Tabla 6. Porcentaje de animales seropositivos a VMV en función de la edad y según el tipo de críaprevio al destete

Tipo de cría/Edad (años) Total animales N° positivos % positivos

Cría artificial1 año 762 77 10%2 años 651 198 30%3 años 451 229 51%4 años 187 109 58%5 años 64 42 66%Cría con madre seronegativa1 año 582 16 3%2 años 448 35 8%3 años 317 49 16%4 años 203 49 24%5 años 123 37 30%6 años 63 20 32%Cría con madre seropositiva1 año 363 29 8%2 años 300 71 24%3 años 193 72 37%4 años 72 24 33%5 años 23 8 35%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6

Edad (años)

Se

rop

reva

len

cia

(%)

cria�artificial

cría�con�madre�seronegativa

cría�con�madre�seropositiva

Figura 4. Seroprevalencia a MV en función de la edad y del tipo de cría previo al destete

01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 88

aumentó a 51% (229/451) en los criados artificialmente y a 37% (72/193) en los criados conmadre seropositiva y fue 15% (49/317) en los criados con madre seronegativa. A partir de los3 años de edad la seroprevalencia no varió significativamente en los animales criados con ma-dre seropositiva y aumentó a 66% (42/64) en animales de 5 años de edad criados artificial-mente y a 32% (20/63) en animales de 6 años de edad criados con ovejas seronegativas(p<0,05). Las diferencias en seroprevalencia entre corderos criados con madres seropositivasy seronegativas no fueron significativas a partir de los 4 años de edad (p>0,05).

Más aún, la seroprevalencia según la edad en los corderos criados artificialmente varió sig-nificativamente según el estado de seropositividad de la madre en el momento del parto y fue su-perior en los hijos de seropositivas, sobre todo a partir de los 3 años de vida (Tabla 7 y Figura 5).


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0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5

Edad (años)

Se

rop

rev

ale

nc

ia(%

)

madre�seronegativa madre�seropositiva

Figura 5. Seroprevalencia a MV en función de la edad en ovejas criadas artificialmente durante lalactancia según el estado de seropositividad de la madre en el momento del parto.

Tabla 7. Porcentaje de animales seropositivos a VMV criados artificialmente y en función del esta-tus serológico frente a VMV de sus madres

Tipo de cría y estatusTotal animales N° positivos % positivos

serológico materno a VMV

Artificial y seronegativa1 año 176 13 7%2 años 155 33 21%3 años 11 46 41%4 años 43 17 40%5 años 6 2 33%Artificial y seropositiva1 año 404 51 13%2 años 307 97 32%3 años 184 96 52%4 años 73 46 63%5 años 23 17 74%

01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 89

3.3.3. Incidencia anual acumulada de seroconversión

La incidencia anual acumulada de seroconversión corregida para la sensibilidad y es-pecificidad de la IDGA y analizada en 4786 muestras de 1392 ovejas fue del 20% (18-22),oscilando entre 0% en los rebaños B4 y O2 en la lactación 1998-99 y 47% en el rebaño B1 enla lactación 1998-99 (p<0,05). A lo largo del estudio la incidencia acumulada de seroconver-sión (I

SC) disminuyó en el rebaño B4 y O2 y aumentó en los rebaños O4 y O5 (p<0,05).


90

Tabla 8. Incidencia anual acumulada según los rebaños y lactaciones

Lactación

Rebaño 1994-1995 1995-1996 1996-1997 1997-1998 1998-1999

B1 – – – – 46,5B2 – – 37,8 40,5 32,3B3 – 29,6 38,2 39,4 –B4 – 23,4 7,5 1,7 0,1O1 – 20,6 15,8 – –O2 – 3,4 4,6 1,1 0,1O3 – – – – 20,1O4 – 19,7 10,1 24,7 –O5 – 14,6 27,3 – –O6 – 32,7 16,4 – –

3.3.4. Relación entre seroconversión y el tipo de cría durante la lactancia, el grado decontacto con animales seropositivos, el estado serológico de VMV de la madre yotras variables independientes

En la Tabla 9 se presenta la ISC

, en función de la edad, modo de cría en la lactancia, gra-do de contacto con ovinos seropositivos, estado serológico y edad de la madre en vida, mesde nacimiento y lactación.

Se observaron diferencias en la ISC

según los niveles de todas las variables consideradas(p<0,05). Así, la I

SCaumentó de 8% en animales de un año de edad a 26% en los de 3 años

de edad y disminuyó a 14% en animales de 5-9 años de edad. ISC

fue 7% en los ovinos cria-dos con madres seronegativas, 19% en los criados con madre seropositiva y 26% los criadosartificialmente. La I

SCaumentó progresivamente al aumentar el grado de contacto con anima-

les seropositivos y varió entre 2% en animales expuestos a un grado bajo de contacto (22-77 DOS*) y 33% en animales expuestos un grado alto de contacto (136-249 DOS). La I

SCfue

24% en los hijos de madres seropositivas frente a 8% en los de madres seronegativas pero seobservaron diferencias en este último grupo según la edad de la madre de modo que la I

SCfue

5% en los hijos de madres de 5-6 años de edad y 13% en los hijos de madres de 2-4 años de

* DOS: días oveja seropositivos

01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 90

edad. Finalmente, la ISC

osciló entre 3% para los animales nacidos en octubre-noviembre y27% para los nacidos en febrero y entre 13-18% según el año de estudio.


91

Tabla 9. Incidencia acumulada de seroconversión (ISC

) en función de los niveles de los factores deriesgo considerados

Variable N° de ovejas susceptibles % seroconvertidas

Edad (años):1 1.049 82 888 203 587 264 271 215-9 188 14

Modo de cría en lactaciónArtificial 1.145 26MadreSero – 1.243 7Sero +, 1 a 3 años de edad 139 22Sero +, 4 a 5 años de edad 359 16Sero +, 6 a 11 años de edad 97 27

Grado de contacto con ovinosseropositivosBajo 1.004 2Medio 967 15Alto 1.012 33

Estado serológico de VMV y edadde la madre en el último muestreoSero +, todas las edades 1.636 24Sero – 2-4 años 217 13Sero – 5-6 años 553 5Sero – 7-14 años 577 8

Mes de nacimientoOct-nov. 685 3 Diciembre 379 9Enero 559 20Febrero 927 27Marzo-Julio 433 17

Lactación1995-96 751 181996-97 706 171997-98 692 131998-99 834 17

En el modelo de regresión logística la seroconversión se asoció a las interacciones en-tre la edad de la madre y su estado serológico en el último muestreo (“en vida”) y entre laedad y el grado de contacto con animales seropositivos, al año y al rebaño. La seroconversiónno se asoció significativamente al modo de cría durante la lactancia y al mes de nacimiento(Tabla 10).

01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 91

Como se puede observar, el riesgo de seroconversión aumentó con el grado de contac-to con animales seropositivos pero este efecto varió según la edad de los animales y fue ma-yor al aumentar la edad hasta los 4-9 años. Asimismo los animales nacidos de madres sero-positivas en vida tuvieron más riesgo de seroconvertir que los hijos de madres seronegativasde más de 4 años de edad. Finalmente, el riesgo de seroconversión fue máximo en la campa-ña 1995-1996 y mínimo en la campaña 1998-1999 y semejante al rebaño O2 en el rebaño B4,aunque mayor en el resto de rebaños.


92

Tabla 10. Estimación del efecto de las distintas variables sobre la seroconversión a MV en el mode-lo de regresión logística

Variable Odds ratio (OR) 95% IC P

Edad (años); contacto1; bajo 1,00 - -1; medio 2,85 0,6-13,3 0,00011; alto 3,24 0,67-15,7 0,0052; bajo 2,31 0,41-12,9 0,0432; medio 6,36 1,37-29,4 0,852; alto 9,6 2,04-45,1 0,0883; bajo 9,53 2,05-44,2 0,343; medio 8,19 1,74-38,5 0,443; alto 19,7 4,15-93,3 <0,00014-9; bajo 10,16 2,18-47,3 0,264-9; medio 13,5 2,91-62,6 0,0094-9; alto 27 5,43-134 <0,0001

Edad madre (años); estado MVen último test

Todas las edades; seropositiva 1,00 - -2-4; seronegativa 1,04 0,64-1,69 0,0195-6; seronegativa 0,41 0,27-0,62 0,0037-14; seronegativa 0,46 0,31-0,67 0,018

Campaña1996-1997 1,00 - -1995-1996 1,25 0,90-1,73 0,0041997-1998 0,95 0,68-1,33 0,3611998-1999 0,44 0,25-0,78 0,001

Rebaño:O2 1,00 - -B1 21,02 6,51-67,8 <0,0001B2 10,6 3,88-28,8 <0,0001B3 5,03 1,84-13,7 0,89B4 1,42 0,56-3,6 <0,0001O1 5,44 2,01-14,7 0,64O3 10,7 3,25-35,4 0,03O4 3,42 1,50-7,8 0,14O5 6,5 2,30-18,3 0,24O6 3,9 1,30-11,6 0,36

01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 92

3.3.5. Número neto de ovejas seropositivas en el rebaño

El número neto de ovejas seropositivas presentes en el rebaño durante el periodo de es-tudio (obtenido de restar las ovejas seropositivas desviejadas de la suma de ovejas que sero-convirtieron y de ovejas seropositivas introducidas en el rebaño) fue negativo en los rebañosB4 y O2 y positivo en el resto de rebaños (Tabla 11). Sin embargo, excepto en los rebaños B1y B2 el número de ovejas que seroconvirtieron fue menor o similar al número total de ovejasdesviejadas y el porcentaje de desvieje osciló entre 14-25% según los rebaños (Tabla 11).


93

Tabla 11. Número y porcentaje de ovejas eliminadas y número real de ovejas seropositivas a MV eli-minadas, número de ovejas seroconvertidas a MV y de ovejas seropositivas introducidas enel rebaño y ovejas seropositivas netas que quedan en el rebaño (1994-1999)

Ovejas eliminadas N° ovejas N° ovejas N° neto deRebaño seroconvertidas seropositivas ovejas

N° % N° seropositivas introducidas seropositivas

B1 48 14 37 100 29 +92B2 104 17 97 156 3 +62B3 197 22 183 215 3 +35B4 206 25 144 48 3 -93O1 143 22 93 87 10 +4O2 167 15 72 18 0 -54O3 49 15 21 45 4 +28O4 106 14 68 109 1 +42O5 91 22 60 55 20 +15O6 113 18 104 97 20 +13

3.4. DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en este estudio indican que el tipo de cría durante la lactanciano influyó en el riesgo de seroconversión a VMV y por tanto en estos rebaños y quizás en estesistema productivo el calostro y la leche no son la ruta principal de transmisión de VMV. Porel contrario la seroconversión se asoció fuertemente y de modo positivo al contacto horizon-tal con animales infectados y a la edad y fue menor en las hijas de madres seronegativas envida y mayores de 4 años de edad que en las hijas de otras madres.

Es posible que la importancia relativa de la transmisión lactógena y horizontal varíe se-gún el tropismo celular de la cepa de VMV y otros factores como la raza de la oveja y la pre-sencia de otras enfermedades (Radostis 1994). La adenomatosis pulmonar ovina es preva-lente en los rebaños vascos y aumenta el riesgo de infección horizontal por VMV (Gonzálezet al. 1993). Varios autores consideran que el pulmón es el órgano diana principal del VMVpero en varios estudios fueron más frecuentes las lesiones asociadas a VMV en la mama queen el pulmón (Houwers et al. 1988; Luján et al. 1991) y el virus se replica eficientemente tan-to en macrófagos mamarios como en células epiteliales mamarias (Bolea 1998). Sin embar-

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go, el hallazgo del estudio de que la transmisión lactógena del VMV no aumentó el riesgo deseroconversión, puede inferirse de otro estudio realizado por Houwers y colegas (1989) enovejas estabuladas en el momento del parto. En el citado estudio la proporción de ovejasde menos de un año seropositivas fue mayor entre las hijas de madres seropositivas de másde 3 años de edad que en las hijas de madres seronegativas pero la proporción en estos gru-pos se igualó cuando las ovejas tuvieron más de un año de edad. En el presente estudio se tuvotambién en cuenta la edad de la madre durante la lactancia pero no se observó una asociaciónsignificativa con el riesgo de seroconversión en la descendencia. Sin embargo la seroconver-sión si se asoció significativamente al estado de seropositividad de la madre en vida y esta va-riable no se ha considerado en ningún estudio anterior. La asociación entre la seroconversióny el estado de seropositividad de la madre sugiere que existe un importante componente ge-nético de susceptibilidad y resistencia a la infección por VMV o a la capacidad de generar an-ticuerpos frente a VMV. En varios trabajos anteriores se han observado diferencias de sus-ceptibilidad a VMV entre razas ovinas (Cutlip et al. 1986b; Snowder et al. 1990b) e inclusoentre líneas familiares dentro de una raza (Houwers et al. 1989). Además como se mencionóen la introducción de la tesis se ha descrito resistencia genética a otras infecciones retrovira-les de los rumiantes, incluido el CAEV (Ruff et al. 1993) y la leucosis enzoótica bovina(Mirsky et al. 1998) asociadas a moléculas clase I y II del CMH. No existe información so-bre diferencias en los ovinos relativas a su capacidad de generar respuestas humorales frentea VMV. La mayoría de las ovejas generan anticuerpos frente a VMV poco después de produ-cirse la infección pero en algunos casos la detección de anticuerpos puede retrasarse durantemeses o años y en ocasiones no ser detectables a pesar de que los animales desarrollen lesio-nes (Houwers & Van der Molen 1987; Saman et al. 1999). Este fenómeno de latencia seroló-gica es una característica de los lentivirus y como han comentado otros autores podría estarrelacionado con la capacidad del virus de eludir la respuesta inmune del organismo en las fa-ses iniciales de la infección (Peluso.R. et al. 1985; Juste et al. 1998). Finalmente, reiterar quela inmunosupresión no es una característica de la infección por VMV (Pepin et al. 1998).

La relación entre la edad y la seroconversión observada en este estudio es similar a ladescrita por otros autores (Houwers & Van der Molen 1987; Keen et al. 1997b). La interac-ción entre la edad y el grado de contacto con animales seropositivos sugiere que la suscepti-bilidad a la infección depende de la edad y aumenta hasta los 4 años de edad. Esto podría de-berse a que las ovejas mayores están sujetas a un mayor estrés productivo que las hace másvulnerables a la infección. Alternativamente este hallazgo podría ser consecuencia de la li-mitada sensibilidad del ensayo de anticuerpos empleado (Varea et al. 2001). La observaciónde que el riesgo de seroconversión no varió a partir de los 4 años de edad podría estar rela-cionada con diferencias de susceptibilidad de las ovejas y el hecho de que las ovejas más re-sistentes a seroconvertir sobreviviesen más que las otras. Está claro que el estudio de la rela-ción entre la infección, la edad y el grado de exposición al virus mejorará con el empleo deherramientas de diagnóstico más sensible como los ELISAs recombinantes de última gene-ración y con ensayos que no miden anticuerpos sino presencia de virus como la PCR. Asi-mismo, sería útil llevar a cabo un estudio longitudinal amplio que permitiese tener en cuentano sólo la exposición a VMV durante el año en el que se produce la seroconversión sino tam-bién la exposición durante toda la vida.


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Los resultados de este estudio tienen implicaciones importantes desde el punto de vis-ta del control del VMV. Por un lado el hecho de que en la mayoría de los rebaños el númerode animales que seroconvirtió fue similar o menor al número de ovejas eliminadas por des-vieje indica que sería posible reducir gradualmente la seroprevalencia sin aumentar la tasa dedesvieje del rebaño. Además el hallazgo de que las hijas de ovejas mayores de 4 años sero-negativas tienen menor probabilidad de seroconvertir que las hijas de otras ovejas, justificala recomendación de que es beneficioso dejar la reposición de las anteriores, que por otro ladocabe esperar que dada su edad y su permanencia en el rebaño sean interesantes desde el pun-to de vista productivo. Por último este estudio corrobora la importancia de la transmisión ho-rizontal del VMV, la necesidad de profundizar en el conocimiento de la misma y de momen-to a efectos prácticos justifica el empleo de medidas que reduzcan el hacinamiento de losanimales.


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01 TESIS 56 2/3/06 09:57 Página 95

4. CONTRIBUCIÓN RELATIVA DELCALOSTRO DE OVEJAS INFECTADAS

CON EL VIRUS MAEDI-VISNA (VMV)A LA SEROPREVALENCIA A VMV

EN CORDEROS

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4.1. INTRODUCCIÓN

El estudio sero-epidemiológico del VMV en rebaños lecheros infectados de VMV deraza Latxa del País Vasco presentado en el capítulo anterior demostró que en este sistema pro-ductivo basado en el aprovechamiento del pasto con periodos de estabulación variables de 2-6 meses al año durante los meses de invierno, la seroconversión a VMV depende del gradode contacto horizontal directo e indirecto, con animales infectados y es independiente delconsumo de calostro y leche de ovejas seropositivas durante el periodo de lactancia. Se llegóa esta conclusión porque el riesgo de seroconversión fue similar en ovejas que durante la lac-tancia se criaron de forma natural con la madre hasta los tres meses de vida que en ovejas cria-das artificialmente con calostro de vaca durante las primeras 24 horas de vida y con lacto-re-emplazante hasta el destete a las 6-7 semanas de vida para evitar la infección por VMV víalactógena. Los ovinos criados artificialmente tuvieron ocasión de contagiarse vía horizontaldurante el primer año de vida porque se criaron en corrales separados en la misma cuadra queel resto del rebaño infectado durante los meses de estabulación y a partir del primer año devida cuando entraron a formar parte del rebaño adulto.

Los ganaderos que criaron a la reposición artificialmente durante la lactancia coinci-dieron en que el encalostramiento artificial supuso un trabajo añadido importante y uno de losganaderos se quejó de haber padecido elevada mortalidad perinatal en los corderos que aso-ció con la administración a los corderos de calostro de vaca deficiente. Sin embargo, la lac-tancia artificial aumentó la disponibilidad de leche en el rebaño para la fabricación de quesoen la explotación y los ganaderos consideraron esto beneficioso.

A la vista de estos resultados se consideró necesario realizar un experimento para cuantifi-car la contribución del calostro de madres infectadas de VMV al riesgo de infección de VMV enlos corderos. Si se demostrase que la tasa de infección asociada a este calostro es relativamentebaja podría plantearse la recomendación de dejar a la reposición con la madre durante las prime-ras 24 horas de vida para asegurar un encalostramiento adecuado de los corderos en rebaños queno dispongan de calostro libre de VMV de buena calidad antes de aprovechar los beneficios po-tenciales de la lactancia artificial a partir de entonces. Nunca se ha descrito un estudio de estascaracterísticas en la literatura nacional o internacional aunque como ya se ha mencionado ante-riormente, diversos autores han demostrado la presencia de VMV en leche (De-Boer, 1970, men-cionado por Houwers 1990; Sihvonen 1980; Lerondelle & Ouzrout 1990) y Schipper y colegas.(1983) infectaron 2 de 9 corderos tras administrarles calostro de vaca con lentivirus ovino no aso-ciado a células (Schipper et al. 1983). Más aún, De-Boer (1979) observó que los corderos cria-dos con madres infectadas se infectaron en las primeras 10 horas de vida aunque no fue posibleestablecer si el origen de la infección fue por consumir el calostro, por contacto horizontal con lamadre o ambas (De-Boer & Houwers 1979). También se ha aislado el VAEC de la leche de ca-bras infectadas y Adams y colegas (1983) y Ellis y colegas. (1986) demostraron infección porVAEC en cabritos separados de la madre y criados en aislamiento con calostro de cabra infecta-da (Adams et al. 1983; Ellis et al. 1986). Sin embargo, la cantidad de calostro que recibieron fuemuy superior a los 210-280 ml/kg que se recomiendan para que el neonato adquiera suficienteinmunidad pasiva y nutrientes durante el primer día de vida (Mellor & Murray 1986).

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En este capítulo se describe un estudio experimental longitudinal a gran escala en elque se investiga la relación entre la seroprevalencia a VMV de los corderos desde el naci-miento hasta los diez meses de edad y la ingestión de calostro procedente de ovejas seropo-sitivas a VMV, y las implicaciones en el control del VMV en el rebaño.


4.2.1. Población y diseño del estudio

Los corderos que entraron a formar parte del estudio nacieron en el mes de enero de tresaños consecutivos de 2000 a 2002, de 60-80 ovejas de raza Latxa pertenecientes al rebaño ex-perimental de NEIKER en Arkaute (Álava). El tamaño de este rebaño varió entre 218-271ovejas según el año, y las ovejas que participaron en el experimento fueron las que parieronen los diez días posteriores al primer parto de grupos de 100 ovejas que anualmente se sin-cronizó su estro y se inseminaron artificialmente. El rebaño tiene un sistema de producciónsemiintensivo típico de los rebaños lecheros de raza Latxa del País Vasco, con un parto al añoen enero, cinco meses de ordeño, pastoreo de praderas propias colindantes y estabulación unmes antes del parto y durante el periodo de ordeño. El tiempo que permanecieron estabuladasfue de 24 h/día desde mediados de diciembre a mediados de marzo y a partir de entonces seredujo de forma gradual hasta pasar todo el día fuera del establo a partir de mayo.

Los corderos que nacieron de las madres seleccionadas se asignaron inmediatamentedespués del parto a cinco grupos experimentales de acuerdo con el estado serológico de VMVde la madre y el tratamiento durante las primeras 24 horas de vida. El tratamiento en las pri-meras 24 horas de vida varió según: (i) el tipo y modo de administración del calostro que fue:de vaca con biberón o de oveja seropositiva con biberón o mamado directamente de la madrey (ii) el lugar de cría, en la nave del rebaño principal o en una nave separada libre de otrosovinos. A partir de las 24 horas de vida y hasta los 300 días de edad todos los corderos se cria-ron juntos en la nave separada del rebaño principal. En el siguiente apartado se detallan losgrupos experimentales y otras pautas de manejo.

Se emplearon las técnicas ELISA y PCR para el diagnóstico de anticuerpos y VMV enmuestras de sangre de los corderos obtenidas al nacimiento, antes de tomar calostro y a los 15,30, 90, 180 y 300 días de edad durante los dos primeros años y a los 90, 180 y 300 días de edadel tercer año en que se dispuso de menos recursos. Además anualmente se analizó medianteELISA la seroprevalencia de VMV en el rebaño en diciembre, 4-6 semanas antes del inicio delos partos, y en las madres del estudio 10 días después del comienzo de los partos.

4.2.2. Grupos experimentales y tratamiento

Se supervisaron todos los partos de las ovejas del estudio y tras el nacimiento, se pesóy se tomó una muestra de sangre de todos los corderos antes de asignar los corderos a uno


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de cinco grupos experimentales. Los corderos de madres seronegativas formaron el grupoNSB y los corderos de madres seropositivas se distribuyeron aleatoriamente a los gruposPSB, PSO, PFB y PFO (Tabla 12), evitando que corderos de la misma madre estuviesen enel mismo grupo experimental, excepto el tercer año que se asignaron a los grupos PSB yPFO. Los corderos de los grupos PFO y PFB permanecieron con su madre en el seno delrebaño adulto y si bien a los corderos PFO se les permitió mamar normalmente de su ma-dre, a los PFB se les impidió mamar de su madre (se cubrió la ubre con una bolsa de algo-dón) y se les administró calostro de vaca en biberón. Por el contrario, los corderos de losgrupos PSO, PSB y NSB se separaron de su madre y se llevaron al edificio separado del re-baño principal y a los corderos PSO se les administró calostro de oveja seropositiva con bi-berón y a los PSB y NSB calostro bovino con biberón (Tabla 12). La dosis de calostro ad-ministrada con biberón fue 200 ml/kg de peso vivo al nacimiento, repartida en cuatro tomasen las primeras 18 horas de vida. La primera dosis de calostro ovino se administró tras or-deñar la oveja poco después del parto y para el resto se calentó el calostro a 30-40°C pocoantes de la toma.

A partir de las 24 horas de vida y hasta el fin de la lactancia a las 5-6 semanas de edad,se criaron los corderos en dos corrales separados dentro de la misma nave, uno para los quehabían tomado calostro ovino (PFO y PSO) y otro para los de calostro bovino (PFB, PSB,NSB). Al destete y en dos ocasiones más antes del final del experimento, los corderos se re-agruparon en los dos cubículos en función del peso.

4. CONTRIBUCIÓN RELATIVA DE CALOSTRO DE OVEJAS INFECTADAS CON EL VIRUS MAEDI-VISNA (VMV)...

101

Tabla 12. Características diferenciales de los grupos experimentales y número de corderos en cadagrupo según el año

Año Grupos experimentales Total

Criterio PFO PFB PSO PSB NSB

Serología de + + + + -VMV materna

Lugar de Rebaño Rebaño Nave Nave Naveencalostrado*

Tipo de Ovino Bovino Ovino Bovino Bovinocalostro

Modo de Mamado Biberón Biberón Biberón Biberónencalostrado

1 22 22 30 26 16 1162 17 16 24 29 12 983 21 – – 29 12 62

Total 60 38 54 84 40 276

* Lugar de cría durante las primeras 24 horas de vida: en la cuadra en el seno del rebaño adulto o en una nave separada delrebaño adulto y libre de otros ovinos.

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4.2.3. Estabulación y manejo de los animales

Las características estructurales y el nivel de exposición a animales infectados con elVMV fueron distintas en los edificios empleados en el estudio. La cuadra del rebaño adulto,donde se mantuvo a los corderos PFO y PFB durante las primeras 24 horas de vida, tenía unasdimensiones de 35 x 13 x 4m3, y el tamaño del rebaño y la seroprevalencia de VMV varió se-gún el año (ver resultados). Se emplearon dos naves separadas del rebaño principal que nuncase habían usado antes para albergar ovejas. Una de ellas medía 10 x 4 x 3m3 y se usó durantelas 4 primeras semanas de vida de los corderos del primer año experimental, y la otra emplea-da el resto del tiempo y construida ex profeso para el experimento era de 20 x 9 x 4-m3 y esta-ba bien ventilada.

A las 24 horas de vida se colocó a los machos gomas de castración y todos los corderosse criaron con leche en polvo reconstituida en agua y pienso compuesto hasta las 5-6 sema-nas de vida y con forraje y pienso de cereal dos veces al día a partir de entonces hasta los 10meses de vida. A los 10 meses de edad, la mayoría de los corderos se vendieron para mata-dero excepto las hembras que se integraron al rebaño adulto como reemplazo y 44 machosnacidos en 2001, que permanecieron en la nave hasta finales del año 2003. Las ovejas y cor-deros se vacunaron contra enfermedades clostridiales y se realizó la necropsia de todos loscorderos muertos durante el estudio.

4.2.4. Toma de muestras de sangre y obtención de suero y plasma

Se empleó la punción yugular para obtener muestras de sangre en tubos de vacío (Ve-noject) de 10 ml con anticoagulante EDTA excepto antes del parto que se emplearon tubossin anticoagulante. Las muestras con EDTA se centrifugaron a 664 g (Jouan, B3.11) durante10 minutos para separar el plasma del resto de la sangre y las muestras sin anticoagulante sedejaron coagular a temperatura ambiente para separar el suero. Se alicuotaron muestras indi-viduales de 1 ml de suero y plasma en viales “eppendorf” de 1,5 ml para realizar los ELISAsde anticuerpos de VMV según se describe en el siguiente apartado y se emplearon 5 ml delresto de muestra de sangre con EDTA para purificar leucocitos y llevar a cabo las PCRs deVMV según se describe en el capítulo siguiente de esta tesis.

4.2.4.1. Detección de anticuerpos de VMV mediante ELISA

Se empleó un ELISA indirecto comercial para detectar anticuerpos de VMV (Innotest,Inogenetics) cuyo fundamento se esquematiza en la Figura 6. Los anticuerpos anti-VMV pre-sentes en la muestra problema se unen al antígeno fijado en los pocillos de la placa ELISAformando complejos antígeno-anticuerpo, después se añade un antisuero ovino de conejomarcado con la enzima peroxidasa que se une al antígeno-anticuerpo y se visualiza el com-plejo añadiendo un sustrato que al ser degradado por la enzima cambia el color de la reaccióny su intensidad se mide a una determinada longitud de onda.


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El citado kit ELISA fue desarrollado por Saman y colegas (1999) y emplea como antí-genos un péptido sintético derivado de la proteína transmembrana (gp46) y una proteína re-combinante (p25) de la cápside del VMV. El ensayo tiene una especificidad de 99,3% (98,7-99,6) y una sensibilidad de 99,4% (98,4-99,8) (Saman et al. 1999).

El kit incluye un suero control positivo y otro control negativo y en cada placa ELISAde 96 pocillos se incluyen dos muestras de cada uno procesadas en paralelo a las muestrasproblema según se describe a continuación. Con la muestra de suero o plasma y el kit a tem-peratura ambiente, se prediluyó a 1:100 10 ml de muestra, realizando dos diluciones seriadas1:10 con diluyente de muestra (Anexos). Tras dispensar en el pocillo de la placa ELISA 80 mlde diluyente de muestra (Anexos) se añadieron 20 ml de la muestra prediluida obteniendo asíuna dilución final de muestra 1:500. Tras 60 minutos de incubación a 37 °C para facilitar laformación de complejos antígeno-anticuerpo, se eliminó el sobrante de la reacción decantan-do la placa con un golpe seco y se lavó el pocillo añadiendo 250 ml de la solución de lavado(Anexos) cinco veces seguidas y finalmente se depositó la placa sobre varias zonas de papelsecante hasta conseguir que los pocillos quedasen secos. A continuación se añadió al pocilloel conjugado, previamente diluido a 1:100 con diluyente de conjugado (Anexos), consisten-te en anticuerpos de conejo frente a IgG ovina marcados con la enzima peroxidasa (HRP)(Anexos). Tras otra incubación de 60 minutos a 37 °C se decantó, lavó y secó la placa comoantes y se añadió al pocillo el sustrato tetrametil benzidina (TMB) disuelto en dimetil sulfó-xido y diluido 1:100 en diluyente de sustrato (Anexos). Tras incubar la placa durante 30 mi-nutos a Tª ambiente y en oscuridad se añadió al pocillo 100 ml de la solución stop (Anexos)de ácido sulfúrico para detener la reacción. Pasados 30 minutos se midió la densidad óptica


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Pocillo

Ag

Y

Ac MV

YY

Ac conejo

Peroxidasa

Incubación con

suero/plasma

Incubación

con

conjugado

Incubación

con

sustrato

YY

Figura 6. Fundamento de la técnica ELISA indirecto para la detección del anticuerpo del VMV

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(DO) de la solución en el pocillo a doble longitud de onda (450-570 nm) en un analizadorELISA PROCESSOR II (Behring).

La muestra se consideró positiva cuando su densidad óptica fue igual o mayor al puntode corte (PC) de la placa y negativa cuando su densidad óptica fue menor al PC. Para calcu-lar el PC de cada placa se dividió por cuatro la resta de las medias de DO de los controles ne-gativos (P) y positivos (N) y se sumó a lo anterior la media de DO de los controles negativossegún la fórmula:

4.2.5. Análisis estadístico

Se empleó la técnica chi-cuadrado de Yates y cuando fue necesario el método exacto deFisher para comparar proporciones en el paquete informático Epi-Info 6.04 (CDC, Atlanta).Para estudiar la relación entre el riesgo de seroconversión y la cantidad de calostro ingeridoy el peso al nacimiento (usado como una medida aproximada de la cantidad de calostro ma-mado por los corderos del grupo PFO), los corderos de los grupos PFO y PSO se subdividie-ron en 2 grupos cada uno de ellos. La diferencia de riesgos (DR) y la fracción atribuible esti-mada (FA

e) asociados al calostro ovino se calcularon de la forma descrita por Dohoo y colegas

(2003) (Dohoo et al. 2003).

Se usó la regresión logística multivariable de efectos aleatorios en el programa infor-mático SAS (macro GLIMMIX, SAS Institute) para investigar la relación entre el estado se-rológico ELISA a los 300 días de edad y el grupo de tratamiento ajustando para el año expe-rimental y teniendo en cuenta la correlación entre corderos nacidos de la misma madre y/omismo padre. Entre las variables independientes fijas se incluyeron tres categorías para el año(1, 2 y 3) y seis categorías de grupo de tratamiento incluyendo cuatro de los grupos origina-les (NSB, PSB, PFB y PFO) y dos categorías para los corderos del grupo PSO en función delvolumen de calostro ingerido: PSOL (menos que la mediana) y PSOH (igual o mas que la me-diana). La estrategia de análisis y el método de estimación fue igual al descrito en el capítu-lo anterior, se usó el test chi2 de razón de probabilidades para obtener el valor p y se conside-ró como nivel de significación el 5% (p<0,05) para un test doble.

4.3. RESULTADOS

4.3.1. Seroprevalencia en las ovejas experimentales y del rebaño y número y distribu-ción de los grupos de corderos

La seroprevalencia de VMV en el rebaño el mes antes de los partos descendió de 76%en el año 1 a 47% en el año 3 (p<0,05). Sin embargo, la seroprevalencia entre las ovejas que

PCP N

N=−( )

+4


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entraron a formar parte del estudio fue similar en los distintos años, variando entre un 79-84%, y antes y después del parto (p>0,05).


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Tabla 13. Seroprevalencia a VMV(%) en el rebaño y en las madresseleccionadas según el año experimental

Ovejas experimentalesAño Rebaño

Preparto Postparto

1 76 (218) 84 (94) 88 (88)2 65 (237) 90 (61) 87 (61)3 47 (271) 79 (53) NA

Total 62 (726) 85 (208) 87 (150)

NA: no analizadas(): número total de ovejas

En el estudio participaron 276 corderos, incluidas 180 hembras y 96 machos nacidos de30 hembras seronegativas y 178 hembras seropositivas, que se distribuyeron en los cinco gru-pos experimentales como se describe en la Tabla 12. El peso al nacimiento fue similar en loscorderos de todos los grupos y la media (y desviación estándar) fue 4,4 (0,9) kg.

Murieron 20 corderos antes de los 300 días de edad, 10 del grupo PSB, 6 del grupo PFO,3 del NSB y uno del PFB. Un cordero con parálisis de la pierna trasera derecha fue sacrifica-do por motivos humanitarios y de los 19 corderos restantes se diagnosticó la causa de la muer-te en doce corderos, que incluyó 7 casos de enterotoxemia clostridial, 3 casos de neumonía,1 caso de listeriosis y 1 caso de enteritis crónica y diarrea.

4.3.2. Prevalencia de corderos seropositivos

El porcentaje de muestras ELISA positivos en el estudio fue de un 24% (337/1398),siendo 29% (190/659) el año 1, 23% (127/556) el año 2 y 11% (20/183) el año 3 (p<0,05). Elporcentaje de corderos ELISA positivos por edades aparece en la Figura 7. Todas las mues-tras tomadas al nacimiento fueron ELISA negativas salvo una muestra de un cordero PFB delsegundo año. El porcentaje de corderos ELISA positivos en los grupos que tomaron calostroovino (PFO y PSO) fue >90% a los 15 y 30 días de edad y descendió gradualmente a 18% enel grupo PFO y hasta el 47% en el grupo PSO a los 180 días de edad (p<0,05) y fue 19% y55% a los 300 días de edad, respectivamente (p>0,05). Por el contrario, el porcentaje de cor-deros ELISA positivos en los grupos criados con calostro bovino permaneció bajo a lo largodel estudio, fue 0% en varios grupos y edades y alcanzó un máximo de 10% en el grupo PSBa los 300 días de edad. El porcentaje de corderos ELISA positivos a los 300 días de edad fuesignificativamente mayor en el grupo PSO que en otros grupos y en el grupo PFO compara-do con el PFB (p<0,05). Las diferencias en el porcentaje de corderos ELISA positivos entrelos otros grupos no fueron significativas (p>0,05).

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4.3.3. Relación entre el estado serológico frente a VMV a los trescientos días de edad yel volumen de calostro ovino de oveja seropositiva ingerido con biberón y el pesoal nacimiento de los corderos criados de forma natural por madres seropositivas

El porcentaje de corderos ELISA-positivos se asoció de modo positivo y significativoal volumen ingerido de calostro de ovejas seropositivas (p<0,05) y no se asoció con el pesoal nacimiento de los corderos criados de forma natural por ovejas seropositivas (Tabla 14).


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Figura 7. Seroprevalencia (%) de VMV por edades en 276 corderos en función del tipo y modo decalostro ingerido, lugar de cría y estado serológico materno de VMV

Tabla 14. Seroprevalencia (%) de los corderos a los trescientos días de edad en función del volumende calostro de oveja seropositiva ingerido por biberón y del peso al nacimiento de corde-ros criados de forma natural con ovejas seropositivas

Variable Grupo Número en riesgo% ELISA + a los300 días de edad

Volumen de calostro deovejas seropositivas (ml)

850-1.390 PSO 27 70190-830 PSO 26 390 PSB 74 10

Rango de pesos al nacimiento

4.400-6.600 PFO 28 182.500-4.300 PFO 26 19

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4.3.4. Diferencias de riesgo y fracciones atribuibles aproximadas de seroconversión alos trescientos días asociadas al amamantamiento y a la toma de biberón con ca-lostro de ovejas seropositivas

En la Tabla 15 se presentan las diferencias de riesgo (DR) y las fracciones atribuibles(FA

E) asociadas a la toma de calostro de oveja seropositiva de forma natural (PFO) y con bi-

berón (PSOL y PSOH) comparado con la toma de calostro bovino con biberón (PFB y PSB)a los 300 días. Las diferencias de riesgo indican que el 16% de los corderos del grupo PFO,el 29% de los PSOL y el 61% de los PSOH, fueron ELISA-positivos asociadas con habermamado de sus madres y tomado cantidades bajas y altas de calostro ovino con biberón, res-pectivamente. De todos los resultados seropositivos en los grupos PFO, PSOL y PSOH, el85%, 75% y 87% respectivamente, era atribuible a haber mamado de sus madres y tomadovolúmenes bajos y altos de calostro ovino mediante biberón, respectivamente.


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Tabla 15. Diferencia de riesgo (DR) y fracción atribuibble (FA) aproxima-das asociadas a la toma natural o mediante biberón del calostroovino de ovejas seropositivas

Grupo de exposición PFO PSOL PSOHGrupo control PFB PSB

Diferencia de riesgo (DR) 0,16 0,29 0,61Fracción atribuible (FA) 0,85 0,75 0,87

4.3.5. Relación ajustada entre el estado serológico de los corderos a los trescientos díasde edad y el tratamiento de los grupos

El análisis multivariable confirmó la fuerte asociación positiva entre la seropositividada los 300 días de edad de los corderos y la toma creciente de calostro ovino (Tabla 16). Ade-

Tabla 16. Estimaciones del modelo de regresión logística de la relación entre la seropositividad a VMVa los trescientos días de edad y el tipo y modo de calostro ingerido, el lugar de cría durante lasprimeras veinticuatro horas de vida y estado serológico de la madre frente a MV. (n=254)

Variable Odds ratios 95% IC Valor P

Efectos fijosGrupo experimentalPSB 1 – –NSB 0,31 0,10-0,95 0,3PFB 0,16 0,07-0,35 0,02PFO 3,13 1,86-5,27 0,03PSOL 10,06 5,76-17,58 <0,0001PSOH 69,39 37,19-129,5 <0,0001

Efectos aleatorios: varianza y errores estándarEntre machos 0,41 0,68 0,27Entre hembras 4,96 1,14 <0,0001Residual 0,37 0,05 <0,0001

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más, el riesgo fue menor para los corderos criados de forma natural con sus madres compa-rado con los que tomaron calostro ovino con biberón y en general para los corderos criadoscon sus madres en el edificio del rebaño principal que en los criados en la cuadra nueva conotros corderos. El riesgo de seroconversión no estuvo asociado con el estado serológico de lamadre de VMV aunque se observó variación aleatoria significativa entre ovejas (Tabla 16).

4.4. DISCUSIÓN

Este estudio indica que el calostro de ovejas seropositivas es un factor de riesgo im-portante en la infección por el VMV de los corderos recién nacidos y su efecto sobre la sero-prevalencia es alto si se toma en grandes cantidades con biberón pero relativamente bajo si sepermite a los corderos tomarlo de forma natural de sus madres durante las primeras 24 horasde vida. Esto es compatible con los resultados obtenidos en el estudio epidemiológico des-crito en el capítulo anterior, en el que se demostró que cuando la infección horizontal es efi-ciente, la cría natural de los corderos con sus madres durante la lactancia no influye en el ries-go de seroconversión en la población.

Desde el punto de vista del control de la enfermedad, el estudio confirma el escaso be-neficio de la cría artificial de los corderos con calostro bovino durante las primeras 24 horasde vida si no se puede prevenir la infección horizontal y por otro lado destaca el riesgo aña-dido que supone criar a corderos encalostrados con calostro bovino junto a corderos encalos-trados con calostro ovino en biberón en vez de con la madre y resto del rebaño seropositivo.

Es muy probable que la transmisión del VMV entre corderos fuese vía horizontal dadoque ninguno de los corderos criados con calostro bovino fue seropositivo a los 30 y a los 90días, lo que indica que no tenían cantidades significativas de anticuerpos calostrales. Los po-cos resultados seropositivos aislados obtenidos en este grupo de corderos antes de los 300días de edad estarían asociados a errores de muestreo y/o análisis laboratorial. La transmisiónentre corderos pudo haberse dado por contacto directo, por aerosoles, o indirectamente porcontacto con VMV presente en la cama, manos o ropa del personal que crió los corderos.

El elevado incremento del riesgo de infección en los corderos del grupo PSOH compa-rado con los PFO, podría sugerir que en condiciones naturales la mayoría de los corderos ma-man <200 ml/kg de calostro. Sin embargo, no está claro por qué el riesgo de infección fue ma-yor también en los PSOL que en los PFO y por qué en este último grupo el peso al nacimientono estuvo asociado con la seroprevalencia. Un aumento del contagio horizontal en los corde-ros separados de sus madres y alimentados con biberón podría ser una razón importante comose ha mencionado anteriormente. En este estudio no se pudo valorar si esta fue la única razóny es posible que hubiese otros factores involucrados. El calostro administrado mediante bi-berón puede incrementar el riesgo de inhalar calostro y algunos autores sugieren que esto po-dría facilitar la infección (Houwers 1990). La posibilidad de que la administración de calos-tro mediante biberón sea un factor de riesgo para la infección podría haberse estudiado en esteexperimento creando un grupo extra de corderos alimentados con calostro ovino administra-


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do mediante sonda gástrica. Más aún, la ingestión de calostro con biberón y otros métodos ar-tificiales como la sonda gástrica podrían estar asociados con una menor producción de salivay presencia de componentes salivares con actividad antiviral y esto aumentar el riesgo de in-fección en los corderos. En este sentido, un estudio de transmisión del retrovirus de la inmu-nodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) a través de la leche materna, demostró que niveles ba-jos del inhibidor de la proteasa leucocitaria (SLPI) en la saliva de bebés de 1 mes de edad seasociaron con mayor riesgo de transmisión del VIH-1 a través de la leche materna (Farquharet al. 2002). Aunque es menos probable, otros posibles factores de riesgo podrían ser una ma-yor carga viral y/o cepas más virulentas en el calostro tomado por biberón que en el calostromamado, que el calostro perdiese propiedades antivirales al ser administrado con biberóncomo en este estudio y que la separación de los corderos de sus madres al nacimiento hubie-se supuesto un estrés a los corderos que los predispuso a infectarse con VMV. No se sabe silos componentes antivirales del calostro pueden perder su habilidad para destruir el viruscuando éste se ordeña, se mete en un biberón y se calienta antes de ser administrado a los cor-deros y tampoco hay evidencia de que la separación de los corderos de sus madres al naci-miento sea una causa de inmunosupresión. En este estudio, la mayoría de los corderos queconsumieron calostro ovino fueron ELISA positivos a los 15 y 30 días de edad sugiriendoque habían recibido anticuerpos anti-VMV maternos. Es más, la mortalidad fue mucho me-nor que una media de mortalidad estimada en rebaños comerciales (Winter 2000) y similarpara los corderos criados tanto con calostro bovino como con calostro ovino, sugiriendo queno había diferencias en inmunocompetencia entre los corderos asociadas al tipo de calostroingerido.

No se observaron diferencias en el riesgo de seroconversión entre la descendencia deovejas seropositivas y seronegativas. Sin embargo, en el estudio anterior, el riesgo de sero-conversión fue mucho menor para la descendencia de ovejas seronegativas mayores de 4 añosde edad comparada con la descendencia del resto de ovejas sugiriendo la existencia de un fac-tor heredable de resistencia o susceptibilidad a la infección por VMV. Esto se podría explicarporque el número de ovejas utilizado en este estudio fue mucho menor que en el estudio an-terior y no fue posible crear dos grupos de corderos según la edad de las madres seronegati-vas para estudiar el efecto de la interacción entre la edad y el estado serológico de la madrefrente al VMV en la seroconversión de su descendencia.

Por último, este estudio investigó la transmisión del VMV usando la presencia de anti-cuerpos como una medida indirecta de la infección. Los anticuerpos se detectaron con unatécnica ELISA altamente sensible comparada con otras técnicas de anticuerpos incluidas laIDGA y el WB (Saman et al. 1999). La latencia serológica en las infecciones por SRLV escomún cuando se usa la IDGA y no ha sido investigada para los ELISAs recombinantes másrecientes. El análisis mediante PCR de las muestras de los animales de este estudio que se pre-senta en el siguiente capítulo, permitirá examinar este fenómeno y la relación entre la infec-ción y la seroprevalencia y las implicaciones sobre el control del VMV.


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5. DETECCIÓN POR PCR-LTRDE LA INFECCIÓN POR

EL VIRUS MAEDI-VISNA (VMV)ASOCIADA AL CONSUMO DE CALOSTRO

Y RELACIÓN CONEL ESTADO SEROLÓGICO

DE LOS CORDEROS

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5.1. INTRODUCCIÓN

La diferencia de riesgo de seroconversión a VMV durante el primer año de vida en corde-ros encalostrados de forma natural con madres seropositivas y artificialmente con calostro bovi-no libre de VMV fue solamente 16% (ver capítulo 4) indicando que en condiciones naturales, latransmisión de VMV vía calostro es relativamente poco eficiente e incapaz por sí misma de man-tener el VMV en la población. Como ya se ha mencionado este hallazgo es compatible con losresultados del estudio epidemiológico del capítulo 3 de esta tesis en el que se demostró que latransmisión lactógena de VMV no afecta el riesgo de seroconversión a largo plazo en ovino le-chero semiintensivo estabulado varios meses al año. Sin embargo, el número de animales que se-roconvirtieron durante el estudio fue inferior al número de animales que se eliminaron del reba-ño por desvieje, siendo la tasa de desvieje de los rebaños de 14-25%, normal en los rebaños deesta zona, con lo que hubiese sido posible reducir gradualmente la seroprevalencia de VMV cen-trando el desvieje en animales seropositivos. Estos hallazgos representan un avance importanteen el conocimiento de la transmisión y control de VMV pues tradicionalmente se ha considera-do que la fuente principal de contagio de VMV es el consumo de calostro y leche de ovejas in-fectadas y que para reducir la prevalencia de VMV en el rebaño son necesarias soluciones drás-ticas como detección y eliminación periódica de todos los animales seropositivos del rebaño ycrear un rebaño nuevo separado del rebaño infectado. Sin embargo, es importante tener en cuen-ta que la medida de infección empleada en los estudios presentados en los capítulos anterioresfue la seroconversión y no la evidencia directa de la infección viral por el VMV.

Los ensayos serológicos para la detección del VMV tienen alta especificidad (Es), loque implica que la probabilidad de falsos positivos es muy baja y un animal seropositivo aVMV se considera infectado de por vida (Knowles 1997). Por el contrario, la sensibilidad(Se) de los ensayos serológicos y en particular la de la técnica de IDGA es solo el 76% (Va-rea y cols. 2001) con lo que cabe esperar obtener un 24% de falsos negativos cuando se em-plea esta técnica. Se sospecha que la Se limitada de la IDGA es en parte responsable del fe-nómeno de latencia serológica, por el cual los animales infectados pueden tardar meses oincluso años en seroconvertir o pueden incluso no seroconvertir nunca, que es una caracte-rística conocida de los lentivirus de los pequeños rumiantes (SRLV) y de otras infeccioneslentivirales (Sihvonen 1980; Houwers & Van der Molen 1987; Johnson et al. 1992; Rimstadet al. 1993). La latencia serológica también se considera relacionada con la patogenia de lainfección de los lentivirus, su baja presencia en sangre y habilidad de integrarse en el ADNde las células diana y no expresarse durante mucho tiempo (Radostits et al. 2000).

Para superar las limitaciones diagnósticas de la IDGA y la latencia serológica se han de-sarrollado técnicas de diagnóstico alternativas de detección de anticuerpos como los ELISAsrecombinantes y de detección del virus mediante PCR (Peterhans et al. 2004). Los ELISAsrecombinantes se consideran altamente sensibles, pero los ensayos de validación se han he-cho en referencia a otras técnicas serológicas incluidas la IDGA y el WB (Saman et al. 1999).Por otro lado, aunque se han desarrollado numerosas PCR para el diagnóstico, la gran mayo-ría no se han validado adecuadamente y se desconoce su Se y Es real. Entre las PCRs valida-das con un número razonablemente alto de muestras se encuentra la publicada por Extramia-

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na y colegas (2002) que amplifica una secuencia de la región LTR del provirus MV integra-do. Comparada con el ELISA y la IDGA la PCR-LTR (pLTR) presentó una sensibilidad de90% y 78% en leucocitos de sangre periférica (LSP) de ovejas adultas con infección clínicay subclínica, respectivamente y una especificidad del 100% (Extramiana et al. 2002)

En este capítulo se describen e interpretan los resultados de analizar la dinámica de lainfección en los corderos del experimento del capítulo empleando la pLTR y su relación conlos resultados serológicos obtenidos. No existen estudios previos de la relación entre la in-fección detectable por PCR y el consumo de calostro de ovejas seropositivas y el contacto ho-rizontal con animales infectados de VMV y tampoco se ha investigado con anterioridad lasensibilidad comparada del ELISA y la PCR en animales durante el primer año de vida.


5.2.1. Población y diseño del estudio

El diseño experimental ha sido descrito en detalle en el capítulo anterior. Brevemente, se in-vestigó la infección en 276 corderos asignados a cinco grupos diferentes tras su nacimiento, se-gún el manejo durante las primeras 24 horas de vida que varió en función de: el tipo de calostroconsumido (de vaca y de oveja seropositiva), del modo de toma (mamado o en biberón) y del lu-gar de cría (en el seno del rebaño o separados) (Tabla 17). A partir de las 24 h de vida y hasta los300 días de edad todos los corderos se criaron juntos en un edificio separado del rebaño principal.


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Tabla 17. Características diferenciales de los grupos experimentales y número de corderos en cadagrupo según el año

Año Grupos experimentales Total

Criterio PFO PFB PSO PSB NSB

Serología de + + + + -VMV materna

Lugar de Rebaño Rebaño Nave Nave Naveencalostrado*

Tipo de Ovino Bovino Ovino Bovino Bovinocalostro

Modo de Mamado Biberón Biberón Biberón Biberónencalostrado

1 22 22 30 26 16 1162 17 16 24 29 12 983 21 – – 29 12 62

Total 60 38 54 84 40 276

* Lugar de cría durante las primeras 24 horas de vida: en la cuadra en el seno del rebaño adulto o en una nave separada delrebaño adulto y libre de otros ovinos.

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5.2.2. Toma de muestras y técnicas de laboratorio

5.2.2.1. Obtención de células blancas de sangre

Se empleó el método del cloruro de amonio para purificar las células blancas de la san-gre según describen Extramiana y colegas (2002) (Extramiana 2002). Se partió de 5 ml de san-gre entera con EDTA por muestra y tras dispensar la muestra en un tubo estéril de polipropile-no de 15 ml, se repitió dos veces el procedimiento de lisis de los glóbulos rojos y recuperaciónde las células blancas de la sangre que consiste en añadir a la muestra el doble de volumen(10 ml) de cloruro amónico estéril 0,83%, dejar reposar la mezcla durante 15 minutos a tem-peratura ambiente, centrifugar a 306 g durante 10 m en una centrífuga Digtor (rotor T204) ydecantar el sobrenadante de hematíes lisados. A continuación se lavó el sedimento de célulasblancas dos veces añadiendo en cada ocasión 10 ml de PBS (Anexos), centrifugando a 306 gdurante 10 minutos y decantando el sobrenadante. Tras el lavado final, se resuspendió el sedi-mento en 3 ml de PBS, se alicuotó en dos volúmenes iguales en viales eppendorf de 1,7 ml li-bres de nucleasas, se centrifugaron los viales durante 2 minutos a 13.600 g en una centrífugaBiofuge fresco (Heraeus), se decantaron los sobrenadantes y se congelaron los sedimentos decélulas blancas a –20°C hasta que se procedió a la extracción del ADN de uno de ellos.

5.2.2.2. Extracción y purificación de ácidos nucleicos

Se procesaron las muestras de células blancas congeladas para extraer y purificar suADN empleando el método de fenol-cloroformo-isoamílico (PCI) (Sambrook et al. 1989) yen cada lote de muestras se incluyó un control negativo consistente en Tris-EDTA (TE) (Ane-xos) pH 8, con el fin de detectar posibles contaminaciones cruzadas entre muestras. Tras sudescongelación se homogeneizó el sedimento de células blancas en 400 µl de TE estéril apH 8, se añadió 200 µg/ml proteinasa K y 1% de SDS (dodecil sulfato sódico) y se incubó lamezcla en un baño seco a 56°C durante 1 hora, agitando suavemente las muestras cada 15 mi-nutos. A continuación se inactivó la enzima a 95°C durante 10 minutos, se añadió un volu-men igual de PCI (25:24:1), se homogeneizó la mezcla agitando el vial suavemente, se cen-trifugó la mezcla a 13.600 g durante 10 minutos, se recogió la fase acuosa superior con losácidos nucleicos y se transfirió a un nuevo vial. A esto se añadió un volumen igual de cloro-formo-isoamílico (24:1) y se repitieron los pasos anteriores hasta recoger de nuevo la faseacuosa con los ácidos nucleicos en otro vial. A continuación los ácidos nucleicos se precipi-taron añadiendo dos volúmenes de etanol 100% y 1/10 del volumen de acetato sódico 3M ymanteniendo la muestra durante al menos 1 hora a –20°C y se sedimentaron mediante centri-fugación a 13.600 g durante 20 minutos. Tras decantar el sobrenadante se lavaron los ácidosnucleicos 3 veces añadiendo etanol 70%, centrifugando a 13.600 g durante 10 minutos y de-cantando el sobrenadante en cada ocasión. Tras el último lavado, se secó el sedimento a tem-peratura ambiente durante una hora y se resuspendieron los ácidos nucleicos en 100 µl deagua ultrapura estéril en un baño seco a 56°C durante 10 minutos.

5. DETECCIÓN POR PCR-LTR DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS MAEDI-VISNA (VMV) ASOCIADA AL CONSUMO...

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5.2.2.3. Medición de la concentración y pureza del ADN

Se midió la concentración de ácidos nucleicos y proteínas y otros contaminantes en lasmuestras empleando un espectrofotómetro (Kontron UVikon 930 y Biorad SmartSpecTM

3000) y longitudes de onda de 260 nm y 280 nm, respectivamente (Sambrook et al. 1989).Antes de realizar las mediciones se diluyeron la muestras 1/20 con agua destilada o más cuan-do la concentración de ADN a esta dilución fue superior al rango de lectura del espectrofotó-metro. Se estimó la concentración de ADN en la muestra original multiplicando la absorban-cia obtenida a 260 nm por 50 ya que un valor de 1 en densidad óptica a 260 nm implica laexistencia de 50 µg/ml de ADN en la muestra y por la dilución que se usó para medir. El gra-do de pureza del ADN se calculó mediante el cociente A260/A280 y se consideró que valo-res de este cociente próximos a 1,8 o superiores eran indicativos de una pureza de ADN ade-cuada para la PCR y las muestras con valores inferiores indicaban un exceso de proteína enlas mismas (Sambrook et al. 1989).

5.2.2.4. Análisis de PCR

Se siguió el protocolo de pLTR descrito por Extramiana (1999, 2002) con dos repeti-ciones por muestra, empleando los cebadores diseñados por Rosati y colegas (1995) (Rosatiet al. 1995) 5’ TGA CAC AGC AAA TGT AAC CGC AAG 3’ y 3’ CCA CGT TGG GCGCCA GCT GCG AGA 5’, que generan un producto de amplificación de 291 pb. en un proce-so de termociclado con 1 paso inicial de desnaturalización del ADN a 96°C durante 3 minu-tos, seguido de 50 ciclos cada uno con procesos consecutivos de desnaturalización a 94°C du-rante 30 segundos e hibridación y extensión a 70°C durante 1 minuto y medio, y un últimopaso de extensión a 72°C durante 10 minutos (Figura 8).


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1 ciclo96°C / 3min__________desnaturalización

50 ciclos94°C / 30”___________desnaturalización70°C/1’ 30”__________hibridación y extensión

1 ciclo72°C /10 min_________extensión

Figura 8. Ciclos de la reacción de PCR

Cada reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 25 µl incluyendo 500 ngde ADN en 5 µl de muestra y 20 µl de premezcla. Los reactivos y sus concentraciones utili-zadas en la premezcla se indican en la Tabla 18.

En cada sesión de termociclado se incluyó un control positivo de ADN, un control ne-gativo de agua destilada ultrapura y un control celular de ADN de una oveja seronegativa. El

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Tabla 18. Reactivos utilizados en la PCR, sus concentraciones y volúmenes a añadir

Reactivos Concentración original Concentración en PCR Cantidad

H2O – – 14,85µl

DNTP’s 25mM/dNTP 200µM/dNTP 0,2µlBuffer 10x Buffer (Gibco) 20mM Tris HCl 2,5µl

50mM KClCl

2Mg 50mM 2,5 mM 1,25µl

LTR 2s 25µM 0,5µM 0,5µlLTR 2ª 25µM 0,5µM 0,5µlTaq polimerasa 5U/µl 1U 0,2µlTotal – – 20µl

control positivo de ADN fue obtenido de células blancas de sangre periférica de una ovejaque resultó ser pLTR-positiva en ensayos anteriores.

Se visualizaron los productos amplificados mediante electroforesis en gel de agarosa al2% teñido con bromuro de etidio 0,25 µg/µl. Para preparar el gel se disolvió agarosa ultra-pura (Gibco) en TBE 0,5X (Anexos) calentando la mezcla en un microondas, se esperó a quebajara la temperatura de la solución, se añadió el bromuro de etidio, se vertió la solución enuna bandeja de electroforesis con un peine de electroforesis que se extrajo al enfriarse el gel,dejando los pocillos para depositar las muestras. Antes de cargar las muestras de ADN en elgel se mezcló 12 µl de muestra con 5 µl de Orange G 0,35% (Anexos) sobre una lámina depapel de parafina (Parafilm ® M, SPI Supplies, EE.UU.). A continuación se recogieron lasmuestras individualmente con una micropipeta y se dispensaron en los pocillos del gel pre-viamente sumergido en la cubeta de electroforesis con una solución tampón de TBE 0,5x. Encada gel se incluyeron controles positivos y negativos y un marcador de peso molecular de1kb de ADN a ambos lados del gel. Una vez dispensadas las muestras se realizó la electrofo-resis a 120V durante 45 minutos aproximadamente y finalmente se visualizaron los produc-tos de amplificación en un equipo de rayos UV (Imagestore 7500, versión 7.12, UltravioletProducts Limited, England).

Siguiendo el criterio de Extramiana y colegas (2002), se consideraron positivas lasmuestras con producto amplificado en una o en las dos reacciones realizadas por muestra ynegativas aquellas en las que no se apreció producto amplificado en ninguna de las dos PCRs.

5.2.3. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos univariante y bivariante fueron llevados a cabo con el progra-ma informático Epi Info 6.04 (CDC, Atlanta). Para comparar proporciones se usó el test chi-cuadrado de Yates y cuando fue necesario el método exacto de Fisher y para comparar me-dias se empleó el análisis de la varianza no paramétrico de Kruskal-Wallis. El grado deconcordancia entre las técnicas se estimó con el coeficiente kappa descrito por Thrusfield(1995) (Thrusfield 1995).

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Se empleó la regresión logística multinivel en SAS (GLIMMIX macro, SAS Institute),para investigar la relación entre la positividad a pLTR y el grupo de tratamiento de los cor-deros, ajustado para el año experimental y la edad de los corderos y teniendo en cuenta la co-rrelación entre observaciones en el mismo individuo y entre hermanos del mismo padre y ma-dre. El resultado de pLTR fue la variable dependiente con dos posibles valores (positivo onegativo) y las variables independientes incluidas como variables categóricas fijas fueron elaño (3 niveles:1, 2 y 3), edad en días (5 niveles: 15, 30, 90, 180 y 300) y grupo de manejoconsiderando 7 niveles incluidos 5 grupos originales (NSB, PSB, PFB, PFO y PSO) y dos ni-veles para el grupo PSO: el PSOL para los corderos que consumieron menos calostro que lamediana y PSOH para los que tomaron más que la mediana.

En el modelo inicial se incorporaron todas las variables independientes y se empleó elmétodo de eliminación progresiva de variables no asociadas a la seroconversión y cuya eli-minación no cambió los coeficientes de regresión del “grupo experimental” en al menos un5% (Kleinbaum et al. 1998). Se confirmó la bondad del ajuste de los modelos con diferentesestructuras de correlación entre-corderos usando el criterio de información de Akaike (CIA)y el criterio Bayesiano de Schwarz (CBS). Se usó el método de estimación de máxima vero-similitud para comparar los modelos con diferentes variables fijas (SAS Institute). Los valo-res de p estimados a partir del test chi-cuadrado del ratio de probabilidades se consideraronsignificativos en el 5% (p<0,05) para un test doble.

5.3. RESULTADOS

5.3.1. Porcentaje de corderos pLTR-positivos

El porcentaje global de resultados positivos a la PCR-LTR fue 12,8% (177/1388) yfue 14,9% el primer año, 13,4% el segundo y 2,8% el tercero (p<0,05). Trece de 204 (6,4%)corderos de madre seropositiva fueron pLTR-positivos al nacimiento (Figura 9), incluidos4,6% en 2000 y 8,4% en 2001. El porcentaje de resultados pLTR-positivos después del na-cimiento varió según los grupos y fue 34% en los corderos PSO, 12% en los corderos PFOy varió entre 5-8% en el resto de grupos (p<0,05). El porcentaje de corderos pLTR-positi-vos en el grupo PSO incrementó progresivamente desde un 23% a los 15 días de edad has-ta un 53% a los 180 días de edad y fue similar a partir de entonces (Figura 9). La variaciónen el porcentaje de p-LTR-positivos según la edad en los demás grupos fue menor y varióentre 0-11% en los grupos NSB y PFB, 1-16% en el grupo PSB y 8-15% en el grupo PFO(p>0,05).

5.3.2. Porcentaje acumulado según la edad de corderos pLTR-positivos

Los corderos pLTR-positivos al nacimiento se excluyeron de este análisis. El porcenta-je acumulado de pLTR-positivos en el grupo PSO aumentó gradualmente hasta el 66% a los


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Figura 9. Porcentajes y errores estandar de corderos pLTR-positivos según la edad y grupo experimen-tal. Los grupos se formaron en función del estado serológico materno y el tipo y modo de calostro inge-rido y lugar de cría durante las primeras 24 horas de vida. Ver la tabla 17 para la definición de los grupos

Figura 10. Porcentajes acumulados y errores estandar de corderos pLTR-positivos según la edad ygrupo experimental Los grupos se formaron en función del estado serológico materno y el tipo y modode calostro ingerido y lugar de cría durante las primeras 24 horas de vida. Ver la tabla 1 para la defi-nición de los grupos

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180 días de edad. Por el contrario, el porcentaje de pLTR-positivos en los otros grupos au-mentó significativamente durante los primeros 30 días de vida y no varió a partir de entoncesoscilando entre 23% en el grupo NSB a los 90 días de edad y 26% en el grupo PFO a los 300días de edad (p<0,01) (Figura 10).

Entre los 13 corderos pLTR-positivos al nacimiento, 8 no volvieron a ser pLTR-positi-vos, 3 fueron pLTR-positivos una vez más antes del fin del experimento y 2 fueron pLTR-po-sitivos en otras tres ocasiones antes del final del estudio.

5.3.3. Frecuencia de resultados positivos en corderos pLTR-positivos al menos en unaocasión

La mayoría de corderos pLTR-positivos no fueron pLTR-positivos en todas las ocasio-nes siguientes al primer diagnóstico pLTR-positivo y se observaron diferencias significativasen la frecuencia de resultados pLTR-positivos según los grupos. La tabla 3 muestra la media,el máximo, el mínimo y los valores cuartiles del número y porcentaje de veces que los cor-deros fueron pLTR-positivos desde la primera vez que se diagnosticaron pLTR-positivos, sincontar los corderos pLTR-positivos al nacimiento. Al menos 50% de los corderos pLTR-po-sitivos del grupo PSO fueron positivos 3-5 veces y al menos 25% de los positivos lo fueronde forma continuada ya que los valores del tercer cuartil y el máximo fueron 100%. De modosimilar, al menos 25% de los corderos pLTR-positivos del grupo PFO fueron pLTR-positivos3-4 veces y de forma continuada (Tabla 19). En cambio, los corderos pLTR-positivos del gru-po NSB sólo fueron pLTR-positivos una vez y todos excepto un cordero fueron pLTR-nega-tivos al menos una vez después de tener un diagnóstico pLTR-positivo. El número y porcen-taje de veces que los corderos de los otros grupos fueron pLTR-positivos osciló entre losvalores observados en los grupos NSB y PFO (Tabla 19).


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Tabla 19. Número y porcentaje de resultados pLTR-positivos y porcentaje medio de veces que re-sulta positivo el cordero desde el primer resultado positivo

Media Mínimo Cuartiles Máximo25% 50% 75%

PSO N° 2,6 1 1 3 4 5% 75 20 50 80 100 100

PFO N° 1,8 1 1 1 3 4% 62 20 25 67 100 100

PSB N° 1,4 1 1 1 2 3% 43 20 25 42 60 100

PFB N° 1,1 1 1 1 1 2% 36 20 20 29 37 100

NSB N° 1 1 1 1 1 1% 37 20 25 33 33 100

Total N° 1,9 1 1 1 3 5% 58 20 25 50 80 100

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5.3.4. Relación entre resultados de ELISA y PCR

Como se describió en el capítulo anterior, más del 90% de los corderos que tomaron ca-lostro ovino de ovejas seropositivas al VMV fueron positivos a la técnica ELISA entre los 15y 30 días de edad, como resultado de la inmunidad pasiva en el calostro y las muestras de es-tos corderos antes de los 300 días de edad no se usaron para comparar el ELISA y la pLTR, ylos ensayos se compararon en 785 muestras. El porcentaje de corderos pLTR positivos fuesignificativamente superior al porcentaje de corderos ELISA positivos a los 30 días de edad(p<0,05) y marginalmente superior en el resto de edades salvo a los 300 días en que el por-centaje de corderos ELISA positivos fue superior al de corderos pLTR positivos, aunque nosignificativamente. Igualmente, la proporción de muestras con resultados discordantes variócon la edad. De los 15 a los 180 días de edad hubo 1-3% de muestras ELISA positivas y PCRnegativas y 5-11% de muestras ELISA negativas y PCR positivas y el grado de concordanciaentre las técnicas hasta los 180 días de edad fue bajo. Sin embargo, a los 300 días de edad seobservó un 8,3% de muestras ELISA positivas-PCR negativas frente a un 2,8% ELISA nega-tivas-PCR positivas y el grado de concordancia entre ambas técnicas fue moderado (kappa yerror estándar = 0,58 ±0,06).

A pesar del bajo grado de concordancia entre las técnicas, la probabilidad de ser ELI-SA positivo a los 300 días aumentó al aumentar el número de veces que los corderos fueronpLTR-positivos durante el estudio (Tabla 20).


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Tabla 20. Relación entre el número de veces pLTR-positivo entre los 0-300 días de edad y el estadoELISA a los trescientos días

N° de veces LTR positivo entre los 0 y 300 días

0 1 2 3 4 5 Total

Positivo 15 7 6 10 8 3 49ELISA a los 300 días

Negativo 150 42 9 3 1 0 205

Total 165 49 15 13 9 3 254

Sin embargo, 15 (6%) corderos fueron seropositivos a los 300 días de edad y nunca fue-ron pLTR-positivos, y 55 (19%) corderos fueron pLTR-positivos entre una y cuatro veces ysin embargo no seroconvirtieron a los 300 días, incluyendo los ocho corderos que fueron po-sitivos al nacimiento por PCR.

Finalmente, el porcentaje de corderos ELISApositivos a los 300 días y/o positivos a LTR-PCR a cualquier edad, excluyendo los corderos LTR positivos al nacimiento, fue de un 69%(37/54) para los corderos del grupo PSO y en otros grupos varió entre un 38% (23/60) en el gru-po PFO y el 26% (10/38) en el grupo PFB. La proporción de corderos positivos en el grupo PSOfue superior a la de otros grupos y no hubo diferencias entre los demás grupos (p>0,05).

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5.3.5. Relación ajustada entre los resultados de PCR y los grupos experimentales

El riesgo de obtener un resultado pLTR positivo fue mayor para los corderos que to-maron calostro de oveja seropositiva con biberón (PSO) y se asoció positivamente con el vo-lumen de calostro ingerido (Tabla 21). El riesgo de ser pLTR-positivo fue también mayor encorderos criados de forma natural con la madre y el resto del rebaño adulto (PFO) que en cor-deros criados también con la madre y el resto del rebaño adulto pero con calostro bovino(PFB). Sin embargo, no hubo diferencias en el riesgo de ser pLTR-positivo entre los corde-ros criados naturalmente con la madre y el resto del rebaño adulto (PFO) y los criados con ca-lostro bovino y otros corderos separados del rebaño adulto (PSB y NSB) (Tabla 21).


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Tabla 21. Estimación de los modelos de regresión logística de efectos ale-atorios investigando la relación entre los resultados LTR-PCRpositivos y el estado materno frente a MV, fuente y modo de ad-ministración del calostro y lugar de cría durante las primerasveinticuatro horas de vida (n=254)

Variable OR IC 95% P

Grupo experimentalPFO 1 – –PSB 0,69 0,35-1,37 0,29NSB 0,56 0,22-1,43 0,22PFB 0,38 0,15-0,95 0,04PSOL 2,96 1,53-5,74 0,002PSOH 4,07 2,00-8,28 <0,0001

5.4. DISCUSIÓN

El estudio de la infección por el VMV mediante la técnica de PCR permitió estimar laproporción de infección presente en los corderos y el grado de viremia detectable por PCRasociado a la ingestión de calostro procedente de ovejas infectadas. Los resultados de este es-tudio confirman las conclusiones obtenidas en el estudio presentado en el segundo capítuloexperimental de esta tesis de que el calostro es una fuente importante de infección por elVMV sobre todo cuando se administra con biberón, pero que son relativamente pocos los cor-deros criados con la madre que se infectan. Más aún los beneficios de prevenir la infecciónlactógena pueden verse reducidos por una eficiente infección horizontal entre corderos, queocurrió principalmente durante el primer mes de vida, probablemente coincidiendo con unafase de viremia temprana típica de los lentivirus (Leroux et al. 2004; Juste et al. 1998). Sinembargo, los corderos que tomaron calostro ovino fueron PCR positivos más frecuentemen-te que los que tomaron calostro bovino y esto podría afectar a la dinámica de la enfermedada largo plazo en las ovejas infectadas y en el resto del rebaño. Se observó correlación positi-va entre el número de veces que los corderos fueron positivos a la PCR y la seroconversión,sin embargo la concordancia entre los resultados de la PCR y el ELISA fue relativamente bajo

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y el 19% de los corderos positivos a la PCR nunca seroconvirtieron. Entre estos se incluye-ron 5-8% corderos pLTR-positivos al nacimiento. Un resultado similar fue descrito por Bro-die y colegas en 1994 (Brodie et al. 1994), lo cual cuestiona la opinión general de que la trans-misión prenatal del VMV es rara (Peterhans et al. 2004; Blacklaws et al. 2004).

Otros estudios sobre el VMV han descrito una coincidencia similar, de moderada a baja,de los métodos de detección de virus y anticuerpos y como se mencionaba en la introducción,esto probablemente esté relacionado con la patogénesis del VMV y la validez de las técnicasde diagnóstico. Dado que el ELISA utilizado en este estudio tiene una especificidad >98% yla pLTR tiene una sensibilidad del 78% (Extramiana 2002), es probable que la mayoría de loscorderos ELISA-positivos y pLTR-negativos estuvieran infectados. También es improbableque los resultados pLTR-positivos en corderos seronegativos fuesen falsos-positivos ya quela técnica, desarrollada y validada en nuestro laboratorio, es 100% específica (Extramiana2002).

Existen pocos estudios longitudinales sobre la infección por el VMV y en el estudiopreviamente citado, Juste y colegas (1998), demostraron que en infecciones experimentalescon una sola dosis infectiva, la viremia alcanzó su pico más alto de 2 a 6 semanas después dela infección y el posterior descenso en la viremia coincidía con un incremento en el títulode anticuerpos frente a la proteína transmembrana (TM). Los intervalos de tiempo entremuestreos en este estudio fueron mayores y el ensayo de PCR empleado no permitió un aná-lisis cuantitativo de la viremia y por ello los resultados de ambos estudios no son estricta-mente comparables. Sin embargo, la mayoría de los corderos alimentados con calostro bovi-no fue pLTR-positivo una sola vez durante el primer mes de vida y la proporción de corderospositivos permaneció estable o disminuyó a partir de entonces. En cambio, la mayoría de loscorderos criados con calostro ovino de oveja seropositiva fueron pLTR-positivo repetida-mente y la proporción de positivos aumentó con la edad. La viremia persistente es una ca-racterística de algunas infecciones lentivirales como la infección por el Virus de la inmuno-deficiencia de los simios (VIS) en poblaciones naturales de simios en África (Hirsch 2004).Además como el grado de exposición a VMV fue similar a partir de las primeras 24 horas devida en todos los corderos las diferencias entre los que tomaron calostro ovino y los que to-maron calostro bovino se debe al tipo y modo de ingestión de calostro y no fueron resultadode reinfecciones horizontales durante el primer año de vida. El aumento de la proporción depLTR-positivos con la edad en los grupos que tomaron calostro ovino podría estar asociadoa la desaparición progresiva de los anticuerpos anti-VMV con la edad y este fenómeno es ca-racterístico por ejemplo en las infecciones por pestivirus (Houe 1995).

Las ovejas con viremia persistente podrían tener un mayor riesgo de desarrollar la en-fermedad comparadas con otras ovejas y aumentar el grado de transmisión del virus dentrodel rebaño y cambiar la dinámica de la infección en la población, aunque esto no ha sido in-vestigado previamente. En infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) yel virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS) hay correlación positiva entre la viremiaen plasma y la progresión de la enfermedad (Hirsch 2004). Sin embargo, los simios natural-mente infectados con cepas autóctonas del VIS muestran niveles persistentes de moderados


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a altos de viremia en plasma y no desarrollan el síndrome de inmunodeficiencia adquirida,por lo que la viremia por sí sola no es un buen indicador del pronóstico de la enfermedad entales poblaciones (Hirsch 2004).

De la existencia de ovejas que fueron esporádicamente pLTR-positivas y seronegativasal final del estudio surge la duda sobre la capacidad de algunas ovejas para superar la infec-ción y en general sobre su papel en la epidemiología del VMV. La infección por el VMV seconsidera fatal, ya se ha dicho en la introducción que los anticuerpos anti-VMV no protegende la enfermedad (Pepin et al. 1998), pero los linfocitos T pueden destruir los lentivirus (Rey-burn et al. 1992; Lee et al. 1994; Paxton & Koup, 1997).

Finalmente y como conclusión, el presente estudio tiene importantes consecuencias enel diagnóstico y control del VMV. La existencia de animales pLTR-positivos y ELISA-nega-tivos, sobre todo antes de los seis meses de vida justificaría el empleo de esta técnica para eldiagnóstico de la infección por VMV en animales jóvenes y sobre todo en animales con an-ticuerpos calostrales. De cara al control del VMV, si bien se confirma que la tasa de infecciónde VMV asociada al consumo de calostro de modo natural de la madre es relativamente baja,el mayor grado de viremia detectable por pLTR en estos corderos comparado con los corde-ros criados artificialmente con calostro bovino indica que sería importante llevar a cabo nue-vos estudios de la evolución de la infección en estos animales.


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6. CONCLUSIONES GENERALES

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ESTUDIO DE LA TRANSMISIÓN DEL VIRUS MAEDI-VISNA Y POSIBILIDADESDE CONTROL EN REBAÑOS DE OVINO LATXO DEL PAIS VASCO

1. En ovejas lecheras de raza Latxa en régimen semiintensivo con periodos de estabu-lación de uno a seis meses al año, criar los corderos artificialmente durante la lac-tancia con calostro y leche libre de VMV para evitar la transmisión lactógena del vi-rus, sin prevenir el contagio horizontal, no afecta al riesgo de seroconversión aVMV.

2. El contagio con VMV está positivamente asociado al grado de contacto con anima-les seropositivos —el cual depende de la seroprevalencia en el rebaño y el tiempode estabulación—, aumenta gradualmente hasta los cuatro años de edad y es menorpara las hijas de ovejas seronegativas de cuatro o más años de edad que para las hi-jas de otras ovejas.

3. La aparente asociación entre la seroconversión y la edad podría estar relacionadacon la sensibilidad del ensayo, las características productivas de los animales, elcontacto acumulado con el virus y otras características inherentes a la edad que sedesconocen.

4. El menor riesgo de seroconversión de la descendencia de ovejas mayores seronega-tivas podría ser debido a la existencia de un componente heredable de resistencia ysusceptibilidad a la infección por VMV.

5. El riesgo de seroconversión en ovejas lecheras latxas en régimen semiintensivo esrelativamente bajo y la tasa de seroconversión es similar o menor que las tasas nor-males de desvieje y reposición en este sistema productivo.

6. Según lo expuesto, en el sistema de ovino latxo sería posible reducir gradual y pro-gresivamente la seroprevalencia de forma poco drástica, centrando el desvieje en se-ropositivos y la reposición en hijas de ovejas seronegativas >4 años de edad.

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CONTRIBUCIÓN RELATIVADELCALOSTRO DE OVEJAS INFECTADAS CON ELVIRUS MAEDI-VISNA (VMV) A LA SEROPREVALENCIAA VMV EN CORDEROS

1. El calostro ovino infectado con el VMV es una buena fuente de infección para loscorderos, particularmente cuando se administra en grandes dosis mediante biberón.

2. Sin embargo, cuando los corderos toman el calostro de forma natural de la madresolo el 16% de los hijos de ovejas seropositivas seroconvierten como consecuenciade ello frente a 29-61% de los que tomaron calostro de ovejas seropositiva con bi-berón.

3. El riesgo asociado al modo de ingestión —con biberón o naturalmente— podría es-tar relacionado con la cantidad de calostro ingerido, el riesgo de aspiración de ca-lostro, la producción de saliva con propiedades antivirales y otras causas.

4. La transmisión horizontal entre corderos neonatos es eficiente y el riesgo de infec-ción al año de vida fue similar para corderos criados durante las primeras 24 h devida de forma natural con la madre en el seno de un rebaño infectado que en corde-ros críados con calostro bovino en contacto con otros criados con calostro de ovejasinfectadas.

5. Desde el punto de vista del control de VMV los resultados de este estudio son com-patibles con los del estudio epidemiológico anterior, refuerzan la importancia de latransmisión horizontal del VMV en ganado en contacto estrecho y el escaso benefi-cio que se obtiene evitando el encalostramiento artificial de corderos con calostro li-bre de VMV.


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DETECCIÓN POR PCR-LTR DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS MAEDI-VISNAASOCIADA AL CONSUMO DE CALOSTRO Y RELACIÓN CON EL ESTADOSEROLÓGICO DE LOS CORDEROS

1. El análisis de la infección por VMV mediante PCR confirma los resultados anterio-res sobre la relación entre la infección, el tipo y modo de consumo de calostro y elcontacto horizontal entre corderos.

2. Sin embargo, la PCR-LTR permitió detectar la infección a edades más tempranasque el ELISA de anticuerpos incluidos un 5-8% de corderos recién nacidos, apor-tando más evidencia de que la transmisión transplacentaría podría ser más impor-tante de lo que se considera.

3. La correlación entre la PCR y el ELISA mejoró con la edad y la probabilidad de serPCR-positivo fue mayor para los corderos que tomaron calostro de oveja seroposi-tiva que para los que tomaron calostro bovino.

4. De cara al control del VMV, la PCR podría tener utilidad para detectar la infecciónen edades tempranas y en presencia de anticuerpos calostrales frente a VMV.

6. CONCLUSIONES GENERALES

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7. RESUMENSUMMARY

LABURPENA

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RESUMEN

En esta tesis se presentan los resultados de estudios epidemiológicos y experimentalescon el objetivo de investigar la transmisión y el control del virus maedi-visna (VMV) en re-baños ovinos lecheros de raza Latxa del País Vasco.

La investigación comenzó con un análisis retrospectivo de los resultados de un estudioserológico anual de anticuerpos frente a VMV, detectados con la técnica de Inmunodifusión enGel de Agar (IDGA), llevado a cabo entre 1994 y 1999 en diez rebaños comerciales infecta-dos. Entre los rebaños, cuatro criaron la reposición artificialmente con calostro bovino me-diante biberón y lactoreemplazante con nodriza para evitar la transmisión lactógena de VMVy, seis lo hicieron de forma natural con la madre. El riesgo de seroconversión no dependió deltipo de cría durante la lactancia y se asoció significativa e independientemente al grado de con-tacto horizontal con animales infectados, a la edad del animal y al estado de seropositividad yedad de la madre. Sin embargo, la transmisión de VMV en este sistema productivo fue relati-vamente baja y similar o inferior a las tasas de desvieje y reposición de los rebaños, que fue-ron 14-25%. Además, los pastores que realizaron lactancia artificial señalaron que esto au-mentó la cantidad de leche disponible para la fabricación de queso y consideraron estobeneficioso, aunque señalaron que el encalostramiento con biberón supone un trabajo añadidoimportante y un ganadero se quejó de haber sufrido un aumento de la mortalidad perinatal encorderos criados con calostro de vaca, presumiblemente por mal encalostramiento.

Más concretamente, la seroconversión aumentó al incrementarse el grado de contactocon ovinos seropositivos y se observó una interacción entre estas variables y la edad de losanimales de manera que, para un mismo grado de contacto, el riesgo de seroconversión au-mentó hasta los cuatro años de edad. Se desconocen las razones de este hallazgo y podría es-tar relacionado con diferencias en la sensibilidad de la IDGA según la edad y con diferenciasen susceptibilidad propias de la edad y relacionadas con el estadío productivo de los anima-les, la exposición acumulada a VMV y con otras razones. Además, el riesgo de seroconver-sión fue menor para las hijas de ovejas seronegativas >4 años de edad que para las hijas deotras ovejas y esto sugiere que existe un componente de resistencia y susceptibilidad asocia-do a la infección por VMV como se ha descrito para otras infecciones por lentivirus.

Los resultados de esta investigación son útiles en la instauración de programas de con-trol del VMV de modo que: (i) la cría artificial de corderos durante la lactancia no parece ven-tajosa para reducir el riesgo de infección por VMV si posteriormente no se puede prevenir elcontagio horizontal (ii) es interesante dejar para reposición las hijas de madres mayores sero-negativas, que por otro lado si permanecen en el rebaño cabe esperar que sean interesantes des-de el punto de vista productivo, (iii) es recomendable esclarecer los mecanismos de transmi-sión horizontal del VMV y a priori cabría recomendar reducir en lo posible el tiempo y elhacinamiento de los animales en estabulación y por último, (iv) el hecho de que en la mayoríade los rebaños el número de animales que seroconvirtió fue menor o similar al número de ove-jas eliminadas por desvieje revela la posibilidad de reducir gradualmente la seroprevalencia sinaumentar la tasa de desvieje del rebaño centrando el desvieje en animales seropositivos.

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A raíz de los resultados del estudio epidemiológico quedó patente la necesidad de lle-var a cabo un estudio para cuantificar la transmisión de VMV asociada al calostro, ya que sise demostrase baja sería posible recomendar a los ganaderos que dejasen la reposición con lamadre durante las primeras 24 h de vida. Con este fin, se realizó un estudio experimental entres años consecutivos en 276 corderos nacidos en enero de grupos de ovejas de celo sincro-nizado del rebaño infectado de VMV de NEIKER. Al nacimiento se crearon cinco grupos decorderos según el estado de seropositividad de la madre y el tratamiento durante las primeras24 horas de vida, que varió según el tipo de calostro que se les administró, de oveja seropo-sitiva o de vaca, el modo en que se tomaron el calostro, de forma natural de la madre o conbiberón, y el lugar donde se ubicaron los corderos, con su madre en el rebaño adulto o en navelibre de otros ovinos. A partir de las primeras 24 h de vida, todos los corderos se criaron jun-tos en la nave separada del rebaño principal hasta los 300 días de edad. Se analizó la presen-cia de anticuerpos y provirus VMV con un ELISA y una PCR-LTR al nacimiento y a los 15días, 30 días, 90 días, 180 días y 300 días del comienzo de los experimentos anuales. El aná-lisis mediante PCR y ELISA llevó a las mismas conclusiones e indicaron que, si bien el ca-lostro es una buena fuente de infección cuando se administra en grandes cantidades median-te biberón, relativamente pocos animales amamantados de modo natural con la madre seinfectaron como consecuencia de ello. Además, se demostró que la transmisión horizontal en-tre corderos neonatos puede ser muy eficiente y que a los 300 días de edad el riesgo deinfección fue similar en corderos criados con calostro bovino que de forma natural con lamadre.

De este modo, a los 300 días de edad sólo el 16% de los corderos que mamaron el ca-lostro de madre seropositiva seroconvirtió, mientras que el porcentaje de seroconversión en-tre los corderos que tomaron calostro de oveja seropositiva con biberón fue 29-61%, según elvolumen ingerido, que se asoció positivamente al riesgo de seroconversión. Entre otras razo-nes por las que la toma de calostro mediante biberón aumentó el riesgo de infección estarían,la posibilidad de aspiración de calostro y la menor producción de saliva con propiedades an-tivirales de los corderos amamantados con biberón. Otras causas menos probables incluiríanque el calostro de estos animales tuviese mayor carga viral y cepas víricas más patógenas, queel calostro ordeñado y administrado en biberón perdiese propiedades antivirales y que la se-paración de los corderos de sus madres supusiese un estrés que redujese la inmunocompe-tencia de los corderos.

A pesar de la coincidencia entre el ELISA y la PCR en las conclusiones generales, laPCR fue más sensible que el ELISA en animales jóvenes y en consecuencia el grado de con-cordancia de los ensayos fue bajo hasta los 180 días de edad y moderado a los 300 días deedad. Un 6% de ovinos seroconvirtió a pesar de no haber sido nunca PCR-positivos y un 19%de corderos fue PCR-positivo en algún momento de su vida y seronegativos al final del estu-dio. Entre estos últimos, se incluyen la mayor parte de los 5-8% de corderos de madres sero-positivas que fue PCR-positivo al nacimiento, que es similar a lo hallado por otros autores yque sugiere que la transmisión transplacentaria podría ser más importante de lo que se ha con-siderado hasta ahora. La falta de concordancia entre el ELISA y la PCR, podría estar relacio-nada con el hecho de que miden procesos biológicos distintos y que la probabilidad de vire-


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mia detectable por PCR y la presencia de anticuerpos aumenten con la edad. Sin embargo, lacorrelación entre ambos ensayos fue mayor en corderos que tomaron calostro ovino que enlos que tomaron calostro bovino y los primeros fueron PCR-positivos con más frecuencia quelos últimos. La mayor proporción de resultados PCR-positivos en los corderos que tomaroncalostro ovino podría tener consecuencias en la evolución de la infección en el animal y en laepidemiología del VMV en el rebaño, pero esto nunca se ha estudiado. De cara al control dela enfermedad el empleo de la PCR facilitaría la identificación de animales jóvenes infecta-dos y a diferencia del ELISA puede emplearse en animales con anticuerpos calostrales. Sinembargo, es un ensayo mucho más caro que el ELISA y es posible que la detección de ani-males infectados a partir de los seis meses de edad mediante ELISA sea suficiente para llevara cabo un programa de reducción de la prevalencia como el expuesto anteriormente. Además,el hecho de que algunos animales fuesen PCR-positivos a edad temprana y no seroconvirtie-sen antes del fin del experimento plantea la duda sobre la posibilidad de que algunos anima-les sean capaces de superar la infección.

Según lo expuesto el trabajo de esta tesis demuestra que en ovino lechero latxo en ré-gimen semiintensivo, el calostro de ovejas infectadas contribuye relativamente poco al man-tenimiento de la infección en la población mientras que la transmisión horizontal juega un pa-pel fundamental en la misma. Sin embargo, el hecho de que el contagio horizontal no eselevado, probablemente porque el periodo de estabulación no es largo, y el hallazgo de queparece existir un componente heredable de resistencia al VMV, permite plantear la elimina-ción del VMV de la cabaña sin necesidad de recurrir a los métodos caros y poco factibles enmuchos rebaños españoles, que permitieron eliminar el VMV de Islandia y de otros rebañoseuropeos.

7. RESUMEN, SUMMARY, LABURPENA

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SUMMARY

This work presents results from epidemiologic and experimental studies with the aimsof investigating the transmission and control of maedi visna virus (MVV) in dairy-sheepflocks of the Latxa breed in Basque Country in Spain.

The investigation began with a retrospective epidemiological analysis of the resultsfrom an annual serological study using the Agar Gel Immunodifussion (AGID), in sheep fromten infected commercial flocks between 1994 and 1999. Four flocks raised replacementlambs artificially with bovine colostrum and milk replacement to avoid lactogenic MVV in-fection and the remaining six flocks raised replacement lambs naturally with the mother. Therisk of seroconversion was independent from the type of rearing during lactation and it wassignificantly and independently associated with increasing contact with infected sheep, withthe age of the animal and with lifetime MV-serological status and age of the dam. However,the transmission of MVV in this productive system was relatively low and similar or lowerto the culling and reposition rates of the flocks, which were 14-25%, suggesting that it wouldhave been possible to reduce MVV-prevalence without increasing flock culling rates. Fur-thermore, the shepherds who raised the lambs artificially pointed out that this practice in-creased the disponibility of milk to make cheese and considerated this as beneficial. Howev-er, they indicated that artificial lambing is an important extra work and one shepherdcomplained about the growth of perinatal mortality in lambs raised with bovine colostrum,presumably from inadequate colostrum intake.

More specifically, seroconversion in study flocks increased with the interaction betweenincreasing contact with seropositive sheep and the age of animals, so that for the same contact,the risk of seroconversion increased until 4 years old. The explanation for this finding is notclear and could be related with age related differencies in the sensitivity of the AGID and inMVV susceptibility, possibly related to the productive stage of the animals, the acumulated ex-posure to MVV and other unknown reasons. Moreover, the risk of seroconversion was lowerfor ewe-lambs born to dams that were seronegative and >4 years old than for ewe-lambs bornto other sheep and this suggests there is an inheritable component of MVV-infection resistanceand susceptibility, as has been described for other lentiviral infections.

The results described so far are useful in terms of MVV control and it can be conclud-ed that (i) artificial lambing during lactation doesn’t seem advantageous in reducing the riskof infection by MVV if subsequently it is not possible to prevent horizontal transmission (ii)it is interesting to select offspring from older seronegative dams as replacement sheep. Thesesheep are also likely to be interesting from a production point of view, (iii) it is necessary tofurther investigate the mecanisms of MVV horizontal transmission and farmers should be ad-viced that horizontal infection can be reduced by reducing housing time and stocking densi-ty of sheep (iv) culling should be focused on seropositive animals.

The results of the epidemiological study justified carrying out an experimental study tocuantify MVV transmission asociated to colostrums. If such a study demonstrated that colostralMVV transmission was relatively low then it would be possible to recommend shepherds to


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raise lambs with the dam during the first 24 hours of life. An experimental study was carried outin 3 consecutive years with 276 lambs born in January to a group of oestrus synchronized ewesfrom the MVV infected flock belonging to NEIKER. Lambs were allocated to five treatmentgroups at birth, according to the seropositivity state of the dam and the treatment received dur-ing the first 24 hours of life. The latter varied according to the type of colostrum ingested, eitherfrom a seropositive sheep or bovine, the way of taking the colostrum, naturally suckled from thedam or by bottle-feeding, and the place where the lambs were reared, with their dam in the adultflock building or in a place free of another ovines. After the first 24 hours of life, all lambs wereraised together in the shed separate from the adult flock until 300 days-old. The presence ofMVV-antibodies and provirus was tested with an ELISA and a LTR-PCR, respectively, at birthand 15 days, 30 days, 90 days, 180 days and 300 days from the start of the annual experiments.Results obtained with both tests allowed to reach the same conclusions and indicated that, al-thought colostrum is a good source of infection, particularly when administrated in great quan-tities by bottle, relatively few naturally raised lambs were infected as a result of it. Even more,it was demonstrated that horizontal transmission between neonatal lambs can be very efficientand that at 300 days-old the risk of infection was similar in bovine colostrum bottle-fed lambsthan in dams-suckled lambs. So, at 300 days-old only 16% of lambs that suckled their dams se-roconverted compared to 29-61% of seroconversion lambs raised with bottle-fed ovinecolostrums. The latter proportion was positively associated with the risk of seroconversion. Theingestion of bottle-fed colostrum may increase the risk of infection by increasing the chances ofinhaling colostrum or by reducing saliva production, which could have antiviral properties. Oth-er reasons that are less likely could be that a larger viral load and/or more virulent strains mighthave been present in bottle-fed compared to naturally raised lambs, that colostrum might loseanti-viral properties when colostrum is given by bottle and that separating lambs from dams atbirth is a stressful practice that might reduce the lambs immunocompetence.

Despite the similar conclusions from ELISA and PCR results, the PCR was more sen-sitive than the ELISA in young animals and in consequence the rate of agreement betweenboth tests was low until 180 days old and moderate at 300 days old. 6% of ovines serocon-verted although they had never been PCR positive and 19% of lambs were PCR positive atsome stage and seronegative at the end of the study. Among the latter most of 5-8% of lambsborn to seropositive dams and that were PCR positive at birth. This percentage is similar tothe finding of other authors in the USA and suggests that transplacental transmission couldbe more important than has been considered until now. The lack of concordance betweenELISA and PCR could be related to the fact that these techniques measure different biologi-cal processes and that the probability of viremia detectable by PCR and the presence of anti-bodies increases with age. However, the correlation between two assays was higher in lambsthat took ovine colostrum than in lambs that took bovine colostrum and the former were PCRpositive more frequently than the latter. The higher proportion of PCR positive results inlambs taking ovine colostrum could have consequences in the evolution of infection in theanimal and in the flock, although this has never been studied before.

In terms of control the PCR could be useful in facilitating the identification of young in-fected animals and, unlike the ELISA, it can be used in animals with colostral antibodies.


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However, PCR is much more expensive than ELISA and it is possible that detection of infect-ed animals older than six months by ELISA is sufficient to stablish a control program like men-tioned before. Furthermore, the fact that some animals were PCR positive at an early age andnot seroconverted before the end of the experiment raises the question about the possibility thatsome animals might be capable of overcoming infection. Moreover, the work of this thesisdemonstrates that in Latxa dairy ewe flocks raised in semiintensive conditions, seropositivesheep colostrum has a low contribution to the maintenance of infection in the flock, while hor-izontal transmission plays a fundamental role in it. However, as emphasised before, the factthat horizontal transmission in this rearing system is not very high (probably because sheep arenot confined for long) and that there seems to be an inheritable component of resistance toMVV, should allow to control MVV and eliminate infection gradually without the need to im-plement the more expensive and less practical methods described by other authors.


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LABURPENA

Tesi honetako helburua Euskal Herriko esnetarako Latxa arrazako artaldeetan emandaitekeen Maedi Visna birusaren (MVB) transmisioa eta kontrola ikertzea izanik, ikerketaepidemiologiko eta esperimentaletan lorturiko emaitzak ematen dira aditzera.

MVB-ren aurkako antigorputzak detektatzeko teknika serologiko batean lorturikoemaitzen atzera-begirako analisi bidez eman zitzaion hasiera ikerketari. Agarrezko gelean bu-ruturiko inmunodifusio (IDGA) teknika erabili zen 1994tik 1999 arte urtero jasotako kutsa-turiko 10 artaldeetako laginetan. Artalde hauetatik lauk, MVB-ren transmisio laktogenikoaeragozteko, aurrerakoen hazkundea behi-oritzaren bidez eta amaorde makina bidezko lakto-ordezkapenaren bidez burutu zuten, seik berriz era arruntean amarekin. Hala ere, serokon-bertsio arriskua ez zen laktantzian jasotako hazkunde araberakoa izan, kutsatutako animalie-kin jasotako harreman horizontalaren estutasuna, animaliaren adina, amaren seropositibitatemaila eta adinaren araberakoa baizik. Bestalde, MVB-ren transmisioa ekoizpen sistema ho-netan nahiko baxua izan zen, kentzeko animalia eta artaldeen aurrerako animalia tasen an-tzekoa edo baxuagoa izanik (%14-25). Bukatzeko, laktantzia era artifizialean burututako ar-tzaiek, gazta egiteko esne gehiago izatearen alde ona aldarrikatzen bazuten ere, biberoiarenbitartez eman beharreko oritzak suposatzen zuen lanaz kexu ziren. Artzai batek arazoak izanzituen ere heriotz perinatalaren igoerarekin behi-oritza jasotako bildotsen artean, bildotsekbeharreko oritza gaizki jasotzeagatik ziurrenik.

Gehiago zehaztuz, serokonbertsioa kutsaturiko ardi seropositiboekin pairatutako harre-man estutasunaren arabera areagotu zen, aldagai hauen eta animalien adinaren arteko inte-rakzioa ikusiz. Honela, harreman estutasun berean serokonbertsio arriskua adinaren araberaareagotzen zen 4 urte arte. Aurkikuntza honen arrazoiak ez daude argi baina adinaren arabe-ra IDGA-k duen sensibilitate diferentzietan, adinak berak eragiten duen sentikortasunean,animalien ekoizpen garaian eta MVB-ren esposizio mailan leudeke ziurrenik. Gainera, 4 urtebaino gehiagoko ardi seronegatiboen bildotsetan serokonbertsio arriskua txikiago izan zengainerantzekoetan baino. Honek MVB-ren kutsaduran ere erresistentzi eta sentikortasun ego-era bat dagoela defendatzen du beste lentibirus infekzio batzutan deskribitu den bezala.

Ikerketa honen emaitzak MVB-ren aurka burutuko diren etorkizuneko kontrol progra-metan erabilgarriak izango dira oso, honela MVB-ren bidezko infekzioaren arriskua jeisteko(i) bildotsen hazkunde artifiziala ez da erabilgarria gerora dagoen kutsadura horizontala eki-din ezin badaiteke behintzat (ii) ama seronegatibo nagusien bildotsak aurrerako uztea inte-resgarria litzateke, artaldean jarraituz gero ziurrenik ekoizpenerako interesgarriak liratekee-larik ere (iii) ondo legoke MVB-ren transmisio horizontalaren mekanismo gora-beherakargitzea eta printzipioz errekomendagarria litzateke denboran ikuiluratze eta pilaketa murriz-tea eta azkenik, (iv) artalde gehienetan serokonbertsioa jasan zuten animalien kopurua, haue-tan kentzeko ardien kopuruaren antzekoa edo txikiagoa izanik, nahikoa litzateke animaliahauek seropositiboak izatea seroprebalentzia jeisteko.

Ikerketa epidemiologikoaren arabera oritz bidezko MVB-ren transmisioa kuantifika-tzeko beharra argi ikusi zen, honen eragin baxua egiaztatuz, bildotsak lehen 24 ordutan ame-


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kin uztearen gomendioa egingo bailitzaieke artzaiei. Helburu honekin, NEIKER-rek MVB-rekin kutsaturik duen artaldean urtarrilero jaiotako 276 bildotsekin ikerketa esperimental batburutu zen 3 urtetan zehar. Bildotsak jaiotzearekin bat, bost talde osatu ziren amaren seropo-sitibotasun maila eta bizitzako lehen 24 ordutan jasotako tratamenduaren arabera. Azken hau,jasotako oritzaren, ardi seropositibo edo behiarena, oritza hartzeko moduaren, amarengandikzuzenean edo biberoiaz eta bildotsak ezarri ziren lekuaren araberakoa, bere amarekin artaldehelduan edo beste ikuilu batean litzateke. Bizitzako lehen 24 ordu igaro ondoren, bildots guz-tiak 300 eguneko adina izan arte batera hazi ziren artalde nagusitik kanpo beste ikuilu bate-tan. Antigorputz eta probirusaren agerpena ELISA eta PCR-LTR tekniken bidez, urrenezurren, jaiotzean, 15, 30, 90, 180 eta 300 egunetara aztertu ziren urtero burututako esperimen-duetan. Ondorio berdinak ahalbideratu zituzten PCR eta ELISA bidezko analisiek, honela,oritza biberoi bitartez kantitate handitan hartuz gero, kutsatzeko iturri egokia bada ere, ama-ren bitartez oritza jasotako bildots gutxi izan ziren kutsaturikoak. Gainera bildots neonatoenarteko transmisio horizontala efizientzia handikoa izan daitekeela frogatu zen eta 300 egune-ko adinarekin behi-oritzaz hazitako bildotsen infekzio arriskua amarekin hazitakoen parekoazela.

Gisa honetan, 300 egunetara ama seropositiboaren oritza jaso zuten bildotsen %16-ksoilik serokonbertsioa jasan zuten, biberoi bidez ardi seropositiboen oritza jaso zutenetan be-rriz, serokonbertsioa %29-61-ekoa izan zen, jasotako bolumenak positiboki eragin zuelarikserokonbertsio honetan. Infekzio arriskuaren handitzea biberoia erabiltzerako orduan, oritza-ren asnarketan eta listuaren produkzio murrizketan eta honek duen ezaugarri antibiraletan le-goke. Sustapen gutxiagoko aukeren artean, animalia hauen oritzak birus gehiago eta patoge-noagoak izatean, jetsitako eta biberoiaz emandako oritzak ezaugarri antibiralak galtzean etabildotsak amarengandik baztertzean eragindako estresak inmunokonpetentzia murrizteanleudeke.

Nahiz eta ondorio nagusietan ELISA eta PCR-aren arteko bateratasuna aipagarria izan,PCR-a animalia gazteetan sentikorragoa izan zen ELISA teknika baino eta ondorioz teknikenarteko konkordantzia maila baxua izan zen 180 egun arte eta neurrizkoa 300 egunetara. PCRpositiboa inoiz ez izan arren, ardien %6-ak serokonbertsioa jasan zuten, ardien %19-aPCR positiboa izan zen bere bizitzako momenturen batean, baina seronegatiboa ikerketa bu-kaeran. Azken hauetan, ama seropositiboen bildots gehientsuenak %5-8 barneratzen dira,hauek PCR positiboak izan zirelarik jaoitzean. Beraz, honek beste autore batzuek aldarrika-tutakoa uzten du agerian, karena zeharreko transmisio uste baino garrantzitsuagoa izan dai-tekeela. Bestalde, ELISA eta PCR arteko konkordantzia ezak bi arrazoi izan ditzake: teknikabiek prozesu biologiko desberdinak neurtzen dutela edo/eta PCR bidez biremia detektatzekoprobabilitatea eta antigorputzak detektatzekoa adinarekin areagotzen dela. Hala ere, entsegubiren arteko korrelazioa ardi-oritza hartutakoetan handiagoa izan zen behi-oritza hartutakoe-tan baino eta lehenak PCR positibo ugariagoak izan ziren. Ardi-oritza hartutakoen PCR emai-tza positiboa ugariagoa izateak animaliak pairatutako infekzioren eboluzioan eta artaldekoMVB-ren epidemiologian eragina luke baina hau ikasteke dago. Gaitzaren kontrola bidera-tzeko orduan, PCR teknikak infektaturiko animalia gazteen identifikazioa erraztuko luke etaELISA teknika ez bezela, oritz-antigorputzdun animalietan erabili daiteke. Haatik PCR tek-


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nika ELISA teknika baino askoz garestiagoa denez, agian nahikoa litzateke teknika honen bi-tartez sei hilabete baino helduagoak diren kutsaturiko animalien detekzioa burutzea, preba-lentzia jeisteko programa bat bideratzeko. Gainera, adin gutxiko hainbat animalia PCR posi-tibo izatea eta entsaiuaren bukaeran serokonbertsioa jasan ez izateak, zenbait animaliainfekzioa gainditzeko posibilitatea dutela ondoriozta daitekeela dirudi.

Esandakoaren arabera, erdi-intentsiboki hazitako esnetarako Latxa arrazako ardietan,kutsatutako ardien oritzak gutxi xamar eragiten du populazioan infekzioaren mantenuan, al-diz, transmisio horizontalaren papera aski garrantzitsua da. Hala ere, kutsadura horizontalahandia ez izateak (ikuiluratze garaiak luzeak ez direlako) eta heredentziaz jaso daitekeen bi-rusarekiko erresistentzia eman ahal izateak, garesti liratekeen metodoak ekidinez, MVB ar-taldeetatik eliminatzea ahalbideratzen du.


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8. ANEXOS

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SOLUCIONES EMPLEADAS

1. Soluciones contenidas en el kit innotest (innogenetics) de ELISA

– Diluyente de muestra

• Tampón fosfato

• Cloruro sódico

• Tritón (marca registrada de Rohm and Haas Co.)

• Estabilizadores de proteína

• Kathon CG al 0,05% para su conservación

– Solución de lavado

• Tampón fosfato

• 1,25% Tween 20

Diluir 1:25 en agua destilada antes de su uso

– Conjugado

• Anticuerpos de conejo frente a cadenas H+L de IgG de oveja, marcados con peroxi-dasa

Diluir 1:100 en diluyente de conjugado (tampón fosfato con estabilizadores de la pro-teína y del enzima, y Kathon CG al 0,05% para su conservación).

– Sustrato TMB

• Tetrametil benzidina

• Dimetil sulfóxido

Diluir 1:100 en tampón sustrato (tampón citrato fosfato con 0,006% de peróxido de hi-drógeno)

– Solución STOP

• Ácido sulfúrico

2. PBS pH 7,2 (1 litro)

– 8 g Cl Na (Panreac Química; España)

– 0,2 g Cl K (Panreac Química; España)

– 0,2 g fosfato monopotásico (PO4H

2K) (Prolabo, Francia)

– 1,15 g fosfato bisódico (PO4HNa

2) (Panreac Química; España)

– 1 litro de agua destilada

147

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3. Fenol cloroformo isoamílico (25:24:1)

– Solución comercializada por Sigma Aldrich, EE.UU.

4. Cloroformo isoamílico (24:1) (50 ml)

– 48 ml cloroformo (Merck, EE.UU.)– 2 ml alcohol isoamílico (Panreac Química; España)

5. TE (Tris 10 mM EDTA 1 mM) pH 8 (1 litro)

– 1,570 g tris ácido (TRIZMA ® Hydrochloride, Sigma Aldrich, EE.UU.)– 0,3722 g EDTA (Calbiochem, Alemania)– 1 litro de agua destilada

6. Dodecil Sulfato Sódico (SDS) 10%

– 5 g SDS (BDH chemicals; England)– 50 ml agua destilada

7. Acetato Sódico 3M

– 12,3 g acetato sódico (Sigma Aldrich, EE.UU.)– 50 ml agua destilada

8. Tris Borato EDTA (TBE) (1 litro) Concentración 5X

– 54 g tris base 1M (TRIZMA base de Sigma Aldrich, EEUU)– 27,5 g ácido bórico 1 M (Panreac Química; España)– 20 ml EDTA 0,5 M pH 8 (Calbiochem, Alemania)– 1 l de agua destilada

9. Orange G

– 3 g sucrosa (Probus, Barcelona)– 0,035 g Orange G (Sigma Aldrich, EE.UU.)– 10 ml agua destilada


148

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9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ZANONI,R., NAUTA,I.M., PAULI,U. & PETERHANS,E. (1991) “Expression in Escheri-chia coli and sequencing of the coding region for the capsid protein of Dutch Maedi-Visna virus strain ZZV 1050: application of recombinant protein in Enzyme- LinkedImmunosorbent Assay for the detection of Caprine and Ovine Lentiviruses”. J Clin Mi-crobiol, 29, pp. 1290-1294.

ZANONI,R., PAULI,U. & PETERHANS,E. (1990a) “Caprine arthritis-encephalitis (CAE)and Maedi-Visna viruses detected by the Polymerase Chain Reaction (PCR)”. Vet Mi-crobiol, 23, pp. 329.

ZANONI,R., PAULI,U. & PETERHANS,E. (1990b) “Detection of caprine arthritis-encep-halitis- and maedi-visna viruses using the polymerase chain reaction”. Experientia, 46,pp. 316-319.

ZANONI,R., VOGT,H.R., POHL,B., BOTTCHER,J., BOMMELI,W. & PETERHANS,E.(1994) “An ELISA based on whole virus for the detection of antibodies to small-rumi-nant lentiviruses”. Zentralbl Veterinarmed [B], 41, pp. 662-669.

ZHANG,Z., GUO,J., NI,Y., BAZER,F.W., GIAVEDONI,L. & CONCHA-BERMEJILLO,A.(2003) “Construction and characterization of a recombinant ovine lentivirus carryingthe optimized green fluorescent protein gene at the dUTPase locus”. Arch.Virol., 148,pp. 1485-1506.

ZHANG,Z., HARKISS,G.D., HOPKINS,J. & WOODALL,C.J. (2002) “Granulocyte ma-crophage colony stimulating factor is elevated in alveolar macrophages from sheep na-turally infected with maedi-visna virus and stimulates maedi-visna virus replication inmacrophages in vitro”. Clin Exp Immunol, 129, pp. 240-246.

ZHANG,Z., WATT,N.J., HOPKINS,J., HARKISS,G. & WOODALL,C.J. (2000) “Quantita-tive analysis of maedi-visna virus DNA load in peripheral blood monocytes and alveo-lar macrophages”. J Virol Methods, 86, pp. 13-20.

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TESIS DOCTORALES PUBLICADAS

1. La raza Latxa: Sistemas de producción y características reproductivas. EDUARDO URIAR-TE EGURCEGUI

2. Estudio y puesta a punto de un método simplificado de control lechero cualitativo en la razaovina Latxa y su inclusión en el plan de selección. GUSTAVO ADOLFO MARÍIA LEVRINO

3. Implicaciones tecnológicas de la composición química del pescado con especial referen-cia a los lípidos. ROGELIO POZO CARRO

4. Estudio de suelos de Vizkaia. MARGARITA DOMINGO URARTE

5. El Maedi o neumonía progresiva en el conjunto de las enfermedades respiratorias cróni-cas del ganado ovino en la Comunidad Autónoma Vasca. LORENZO GONZÁLEZ ANGULO

6. Estudio experimental de las fases iniciales de la paratuberculosis ovina. RAMÓN A. JUS-TE JORDAN

7. Identificación, origen y factores fisicoquímicos que condicionan la contaminación porelementos metálicos de sedimentos de ríos. ESTILITA RUIZ ROMERA

8. Análisis financiero de proyectos de inversión en repoblaciones forestales. ÁLVARO AU-NOS GÓMEZ

9. Desarrollo y evaluación del sistema integrado de diagnóstico y recomendación (DRIS)para la fertilización de las praderas permanentes. MARTA RODRÍGUEZ JULIA

10. Estudio de las mieles producidas en la Comunidad Autónoma del País Vasco. MARÍA TE-RESA SANCHO ORTIZ

11. La biomasa microbiana como agente de las transformaciones de nitrógeno en el suelo trasel enterrado de la paja de cereal. JESÚS ÁNGEL OCIO ARMENTIA

12. Análisis jurídico y económico de la implementación de la política agraria comunitaria enla Comunidad Autónoma del País Vasco. BEATRIZ PÉREZ DE LAS HERAS

13. Nemátodos formadores de quistes (Globodera spp.) en patata (Solanum tuberosum L.):caracterización taxonómica, reproducción y actividad de las formas juveniles. AZUCENA

SALAZAR BAYONA

14. Ensayo comparativo de tres métodos de tratamiento antihelmítico estratégico en rebañosde ovejas latxas. ANA LUISA GRACIA PÉREZ

15. Estudio sobre una encefalitis vírica similar al Louping-ill en el ganado ovino de la Co-munidad Autónoma Vasca. DANIEL FERNÁNDEZ DE LUCO MARTÍNEZ

16. Análisis de caracteres involucrados en la selección y mejora de Lupinus hispanicusBoiss. et Reuter. VERÓNICA ARRIETA PICO

17. Contribución al estudio de fermentaciones artesanales e industriales de Rioja Alavesa.MILAGROS VIÑEGRA GARCÍA

18. Estudio del manejo de la alimentación en los rebaños ovinos de raza Latxa y su influen-cia sobre los resultados reproductivos y de producción de leche. LUIS Mª. OREGUI LIZA-RRALDE

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19. El sector pesquero vizcaíno, 1800-1960. Análisis de la interacción de los elementos am-biental, extractivo y comercial en la pesquería. JOSÉ AGUSTÍN MAIZ ALCORTA

20. Epidemiología, diagnóstico y control de la paratuberculosis ovina en la Comunidad Au-tónoma del País Vasco. J.J. ADURIZ RECALDE

21. Agrupación de poblaciones locales de maíz (Zea mays L.) mediante caracteres morfoló-gicos y parámetros ambientales. JOSÉ IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GÓMEZ

22. Estudio del potencial melífero de Bizkaia. AMELIA CERVELLO MARTÍNEZ

23. Influencia de los procesos de salado y ahumado sobre las características fisicoquímicasdel queso Idiazabal (compuestos nitrogenados). FRANCISCO C. IBAÑEZ MOYA

24. El Euskal Artzain Txakurra (el perro pastor vasco) descripción y tipificación racial. Ma-riano GÓMEZ FERNÁNDEZ.

25. Evaluación de diferentes ciclos de selección recurrente en dos poblaciones sintéticas demaíz. GOTZONE GARAY SOLACHI

26. Valoración agronómica de la gallinaza: Compostaje. ADOLFO MENOYO PUELLES

27. Relación clima-vegetación en la Comunidad Autónoma del País Vasco. AMELIA ORTU-BAY FUENTES

28. Influencia de los procesos de salado y ahumado tradicional sobre las características mi-crobiológicas y organolépticas del queso Idiazabal. FRANCISO J. PÉREZ ELORTONDO

29. Mastitis en la oveja Latxa: epidemiología, diagnóstico y control. JUAN C. MARCO MELERO

30. Contribución al conocimiento anatomopatológico y diagnóstico de la tuberculosis capri-na y ovina por Mycobacterium bovis. Mª MONTSERRAT GUTIÉRREZ CANCELA

31. Estudio de factores que pueden influir en la calidad de la pluma de gallos Eusko-oiloa(Variedad Marradune) para la fabricación de moscas artificiales utilizadas en la pesca dela trucha. ROSA Mª ECHARRI TOMÉ

32. Estudio de la fracción lipídica durante la maduración del queso Idiazabal. Influencia delos procesos tecnológicos del tiempo de permanencia en salmuera y ahumado. ANA ISA-BEL NÁJERA ORTIGOSA

33. Influencia del tipo de cuajo y adición de cultivo iniciador sobre los compuestos nitroge-nados durante la maduración del queso Idiazabal. Mª SOLEDAD VICENTE MARTÍN

34. Estudio de la infección por Borrelia burgdorferi, grupo Ehrlichia phagocytophila y vi-rus de la encefalitis ovina en las poblaciones de ixódidos de la Comunidad AutónomaVasca. MARTA BARRAL LAHIDALGA

35. Lipolisis en el queso Idiazabal: efecto de la época de elaboración, del cultivo iniciador,de la pasteurización y del tipo de cuajo. FELISA CHAVARRI DÍAZ DE CERIO

36. Aspectos inmunopalógicos de la paratuberculosis de los pequeños rumiantes. Respuestainmune asociada a la vacunación. JUAN MANUEL CORPA ARENAS

37. Desarrollo y evaluación de nuevas técnicas de diagnóstico del Maedi-Visna. ANA BELÉN

EXTRAMIANA ALONSO

38. Estudios sobre Patogenia y Diagnóstico de la Adenomatosis Pulmonar Ovina. MARÍA

MERCEDES GARCÍA GOTI

39. Análisis de los factores de explotación que afectan a la producción lechera en los reba-ños de raza Latxa de la CAPV. ROBERTO J. RUIZ SANTOS

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40. Crecimiento y producción de repoblaciones de Pinus radiata D. Don en el Territorio His-tórico de Gipuzkoa (País Vasco). LUIS MARIO CHAUCHARD BADANO

41. Puesta a punto de técnicas PCR en heces y de Elisa para el diagnóstico de la Paratuber-culosis. Estudio de prevalencia en ganado bovino. JOSEBA M. GARRIDO URKULLU

42. Epidemiología y diagnóstico de la leptospirosis y la neosporosis en explotaciones de bo-vino lechero de la CAPV. RAQUEL ACHAERANDIO GALDOS

43. Relaciones aire-agua en sustratos de cultivo como base para el control del riego. Meto-dología de laboratorio y modelización. VALENTÍN TERÉS TERÉS

44. Zonas endémicas de enfermedad de Lyme en la CAPV: estudio del papel de los micro-mamíferos en el mantenimiento de Borrelia burgdorferi sensu lato en el medio natural.HORACIO GIL GIL

45. Optimización del esquema de mejora de la raza Latxa: análisis del modelo de valoracióne introducción de nuevos caractéres en el objetivo de selección. ANDRÉS LEGARZA ALBIZU

46. Influencia de las condiciones de almacenamiento, reimplantación y lluvia ácida en la via-bilidad de Pinus radiata D. Don. MIREN AMAIA MENA PETITE

47. Estudio sobre encefalopatías en peces: patogenicidad del nodavirus causante de la enfer-medad y retinopatía vírica (ERV) y transmisión experimental del prión scrapie a peces.RAQUEL ARANGUREN RUIZ

48. Enfermedades transmitidas por semilla en judía-grano (Phaseolus vulgaris L.): detec-ción, control sanitario y mejora genética. ANA MARÍA DÍEZ NAVAJAS

49. Pastoreo del ganado vacuno en zonas de montaña y su integración en los sistemas de pro-ducción de la CAPV. NEREA MANDALUNIZ ASTIGARRAGA

50. Aspectos básicos de la mejora genética de patata (Solanum tuberosum L.) a nivel diploi-de. LEIRE BARANDALLA URTIAGA

51. El cuajo de cordero en pasta: preparación y efecto en los procesos proteolíticos y lipolí-ticos de la maduración del queso de Idiazabal. Mª. ÁNGELES BUSTAMANTE GALLEGO

52. Dinámica de la población de atún blanco (Thunnus alalunga Bonnaterre 1788) del Atlán-tico Norte. Josu Santiago Burrutxaga

53. El pino radiata (Pinus radiata D.Don) en la historia forestal de la Comunidad Autónomade euskadi. Análisis de un proceso de forestalismo intensivo. MARIO MICHEL RODRIGUEZ

54. Balance hídrico y mineral del pimiento de Gernika (Capsicum annuum L., “cv Derio”)en cultivo hidropónico. Relaciones con la producción. HUGO MACÍA OLIVER

55. Desarrollo de Métodos Moleculares y su Aplicación al Estudio de la Resistencia Genéti-ca y Patogenia Molecular del Scrapie. DAVID GARCÍA CRESPO

56. Estudio epidemiológico y experimental de la transmisión y control del virus Maedi-Vis-na en ovino lechero de raza latxa del País Vasco. VEGA ALVAREZ MAIZTEGUI

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