La vitamina D est presente en los alimentos en concentraciones muy bajas, por lo que su anlisis resulta difcil. Los mtodos originales eran mtodos biolgicos en las cuales se administraban extractos liposolubles a animales (ratas o pollos). Las pruebas medan la mejora (prueba curativa) o el desarrollo (prueba profilctica) de la deficiencia de vitamina D en trminos del grado de raquitismo producido. Estos mtodos son difciles de aplicar y su precisin era escasa.El principal problema con el anlisis de la vitamina D es que casi todas las fuentes de los alimentos contienen otros lpidos que tienden a interferir. Por ello en la actualidad se han venido desarrollando diversos mtodos de anlisis de los metabolitos de la vitamina D. La mayora comprende tres pasos:1. Separacin de componentes de la vitamina D de los lpidos que interfieren con su deteccin. Esto se hace mediante la extraccin con disolventes orgnicos (por ejemplo, acetonitrilo) y marcaje con marcadores radiactivos para la identificacin y recuperacin.2. Separacin cromatogrfica de los metabolitos de la vitamina D. Con cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC).3. La identificacin de los diferentes metabolitos de la vitamina D por medio de anlisis de radioreceptores o de protenas fijadoras.SAPONIFICACIN Y EXTRACCINSi ha de determinarse la vitamina D3, se agrega D2como estndar interno. Si ha de determinarse la vitamina D2, se agrega D3como estndar interno. La vitamina D2y la vitamina D3son extradas de los alimentos mediante saponificacin utilizando una solucin alcohlica de hidrxido de potasio seguida de una extraccin del solvente. La determinacin de vitamina D2y D3 en una solucin apropiada del extracto de la muestra se realiza mediante HPLC de fase normal semipreparativa seguida por HPLC de fase reversa analtica. La cromatografa se monitorea por UV y se logra la identificacin de los picos de acuerdo a los tiempos de retencin y la cuantificacin se realiza por el mtodo de estndar interno utilizando las reas o las alturas de los picos.De 10 a 30g de la muestra se saponifican preferentemente bajo nitrgeno utilizando una mezcla de etanol o metanol, agua, un antioxidante tal como cido ascrbico, hidroquinona, pirogalol o BHT e, hidrxido de potasio acuoso. El antioxidante debera agregarse a la muestra antes de la adicin de la solucin de hidrxido de potasio necesaria para la saponificacin. Si ha de determinarse vitamina D3, se pipetea una cantidad apropiada de estndar de vitamina D2en la solucin alcohlica dentro del frasco de saponificacin. La cantidad de estndar interno de vitamina D2agregada deber ser similar a la cantidad de vitamina D3esperada en la muestra y viceversa. En el Cuadro 5, se muestran ejemplos de la proporcin de reactivos utilizados para la saponificacin. El tiempo normal de saponificacin es de 20-45 minutos con temperaturas que fluctan de 80 a 100C (reflujo).La vitamina D2y D3son extradas de la mezcla enfriada de saponificacin por medio de un solvente adecuado, como ter dietlico, tertbutil metil ter, n-hexano, ter de petrleo o mezclas, de 3 a 4 veces con volmenes que fluctan de 50-150 ml. Los extractos combinados son lavados a pH neutro con agua (2-4 veces, 50-150 ml).Pesa de la muestraAlcoholAntioxidanteHidrxido de Potasio

16 g150 ml etanol1 g pirogalol30 g KOH + 75 ml H2O

8 g100 ml etanol1 g ascorbato sdico12 G KOH + 50 ml H2O

24 g90 ml etanol0.5 g cido ascrbico30 ml (60%)

Cuadro 5: Proporcin de reactivos para saponificacin)

EVAPORACIN Y DILUCINSe agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto antes de la evaporacin utilizando un evaporador rotatorio bajo un vaco parcial y a una temperatura que no exceda 50C. Deben tomarse medidas para remover restos de agua tales como secar con sulfato de sodio, o destilacin azeotrpica con etanol o tolueno o el uso de papel filtro para separacin de fases.El residuo es redisuelto utilizando de preferencia la fase mvil del sistema HPLC semipreparativo u otro solvente compatible con HPLC de tal modo de obtener una concentracin apropiada para la inyeccin dentro de la columna de HPLC.HPLCSistema semipreparativo (fase normal). Un estndar mixto de vitamina D2y D3es cromatografiado en el sistema HPLC semipreparativo y la condiciones optimizadas de tal manera de obtener con un tiempo de retencin reproducible un slo pico de vitamina D y tambin tener una ptima separacin de otros componentes que interfieren. Esto permite una recoleccin precisa de la banda de la fraccin de vitamina D.Sistema analtico (fase reversa). Un estndar mixto de vitamina D2y D3deber ser cromatografiado en el sistema analtico de HPLC ajustando las condiciones cromatogrficas hasta que la resolucin de la vitamina D2y D3est al menos completada en un 98% y las vitaminas sean resueltas de todas las interferencias de matriz de los alimentos.Condiciones y cuantificacin deHPLC. Una alcuota del extracto de la muestra concentrada se inyecta en el sistema HPLC semipreparativo y la fraccin de la vitamina D es recogida va corte de bandas. La ventana de tiempo para el corte de banda debe haberse determinado previamente utilizando una mezcla estndar de vitamina D y debera ser lo ms angosta posible.La fraccin del corte de banda obtenida en la HPLC semipreparativa debe llevarse a sequedad y redisolverse en un solvente compatible con la fase mvil del sistema analticode HPLC analtico. Se inyectan alcuotas de la solucin obtenida y se identifican y cuantifican los picos de vitamina D2y D3utilizando el mtodo estndar interno. En el Cuadro 6 se presentan las condiciones de los dos sistemas:Los estndares y soluciones estndares deberan controlarse espectromtrica-mente en cuanto a la pureza y utilizar la concentracin corregida para el clculo.Es importante mencionar claramente las unidades utilizadas para informar los resultados, por ejemplo en g de vitamina D3/100 g de alimento.

Sistema de fase normal (FN)Sistema semipreparativoSistema de fase reserva (FR) Sistema analitico

ColumnaAcero inoxidable; 250 x 4.0 nmAcero inoxidable; 250 x 4.0 nm

Fase estacionariaLichrosorb SI 60 (Merck): 5 umVYDAC 201 TP 54

Fase mviln-Hexano: 2-Propanol (95:5)Acetonitrilo: Metanol(91:9)

Flujo1.0 ml/min0.8 ml min

Presin70 bar35 bar

Volumen de inyeccin500 ul10 ul

DeteccinUV: 265 nmUV: 265 nm

Tiempo de retencin (aprox en min)Fraccin de vitamina D: 17Vitamina D2: 18Vitamina D3: 21.5

EstndarAprox 0.18 u/ml

ClculoMtodo de estndar internoRecuento de rea o altura

RADIOINMUNOENSAYO (RIA)

Esta tcnica fue desarrollada por Berson y Yalow en 1960 para determinar la concentracin de insulina en el plasma sanguneo. Hoy en da, esta tcnica se utiliza para detectar y cuantificar sustancias que se encuentran en cantidades muy pequeas y mezcladas con muchas otras.El fundamento es:Se mezcla una cantidad constante de antgeno marcado radioactivamente y una cantidad constante de un anticuerpo para ese antgeno.Se produce la reaccin entre antgeno (Ag) y anticuerpo (Ac)Se separa la fraccin de antgeno que se ha unido de la que permanece libre.Se determina la radioactividadSi la muestra contiene adems antgeno no marcado, ste competir con el marcado para unirse al anticuerpo, y se observar un descenso en la medida de la radioactividadEste descenso es proporcional a la concentracin de antgeno no marcado en la muestraLos procedimientos de radioinmunoensayo son extensiones de las observaciones de Berson y Yalow de que concentraciones bajas de una hormona antignica pueden detectarse determinando la capacidad de estos antgenos para unirse a anticuerpos especficos. Adems, la competicin de molculas de hormona no marcadas con las marcadas radiactivamente por los mismos lugares de unin en el anticuerpo origina una disminucin de la entidad desconocida (tal como la insulina en el plasma de un paciente) debido a que ofrece una competicin por el anticuerpo similar a la de la molculas de hormona marcada. A medida que aumentan las cantidades de antgeno no marcado presente, los limitados lugares de unin del anticuerpo se van saturando progresivamente. En consecuencia, se une menos antgeno marcado. La incubacin de los componentes del sistema (antgeno no marcado, antgeno marcado y anticuerpo) permite que ocurra una reaccin de equilibrio. La separacin subsiguiente de las formas unidas de las no unidas, o libres y la medida de la cantidad de radiactividad de una o de ambas fases permite la cuantificacin de la reaccin que ha tenido lugar.Los componentes utilizados en el anlisis aparecen en la figura 1 son una sustancia marcada que es idntica esencialmente a la sustancia desconocida que se medir mas tarde. A esto le llamaremos antgeno marcado. Se introduce una cantidad conocida de este antgeno marcado en una disolucin que contenga un anticuerpo para el antgeno. A la vez, tambin se introduce una cantidad conocida del duplicado del antgeno no marcado en la disolucin. Entonces hay una disolucin compleja que contiene antgeno marcado, antgeno no marcado y anticuerpo. Estos componentes se dejan que interaccionen, unindose con el anticuerpo tanto las molculas de antgeno marcadas como las no marcadas. La disolucin resultante contiene por sonsiguiente dos sustancias ms, el antgeno marcado complejado (o unido) as como el antgeno no marcado unido. Se efecta despus una separacin de los componentes unidos de los no unidos (algunos de ellos estn marcados y no marcados) por una variedad de medios. Tal como la adicin de un material que se una a los antgenos libres que quedan. Entonces puede medirse la radiactividad presente en ambas formas de la sustancia, unida o no unida.Como se observa en el panel inferior de la figura 1, aadiendo cantidades mayores (o menores) de la disolucin de antgeno original, de concentracin conocida, dar lugar a la formacin de menos (o ms) forma unida marcada de una sustancia. El exceso de forma no marcada compite satisfactoriamente contra la menor cantidad de antgeno marcado por los lugares de unin en el anticuerpo. Entonces es fcil ver que cuanto ms antgeno original se aade al anticuerpo, menos radiactividad tendr la forma unida resultante y, cuando se separa de la forma no marcada libre puede medirse esta diferencia. Puesto que pueden aadirse series de cantidades conocidas, puede construirse una curva patrn de la cantidad conocida presente comparada con la cantidad de radiactividad medida en el componente unido para casa cantidad conocida. la figura 2

En el anlisis por radioinmunoensayo de los metabolitos de la vitamina D se sustituye la protena ligadora por un anticuerpo especifico producido contra cada uno de los metabolitos de la vitamina D conjugados con la albumina serica bovina. Tiene la ventaja sobre el mtodo anterior de no necesitar una purificacin previa, estando mas al alcance de los laboratorios clnicos tradicionales. RADIOCOMPETICION PROTEICA (PB)El anlisis por unin competitiva proteica aprovecha la existencia de protenas especificas presenten en el suero (DPB) o en clulas diana como receptoras, con una afinidad alta por la vitamina D y sus metabolitos, afinidad que no es especifica por lo que no es necesaria su purificacin previa. As, se han utlizado como protenas especificas tanto las DPB de sueros humanos de pacientes osteomalcicos y sin exposicin al sol, como el receptor proteico de intestino de pollo. Aunque la CPBA o los radioensayos de unin competitiva parecen ser muy similares al radioinmunoensayo, el ligando en el anlisis de unin competitiva de protenas (CPBA) se une a una protena el lugar de a un anticuerpo. En consecuencia, no estamos tratando con el ligando como un antgeno como tal, sino como una sustancia qumica. Hay protenas de unin especfica para muchas hormonas, tales como la globulina que une corticolesteroides y la globulina que une tiroxina. Los principios de saturacin y unin competitiva, no obstante, son exactamente los mismos que los de radioinmunoensayo presentados antes. Hay pocas diferencias tcnicas bsicas entre el radioinmunoensayo y los anlisis de unin competitiva de protenas. Debido a que los sistemas de RIA generalmente tienen constantes de afinidad ms altas comparadas con las CBPA, los sistemas RIA tienen mayor sensibilidad para medir niveles bajos de la sustancia. Tambin los anticuerpos son altamente especficos, pero las protenas de reaccin cruzada u otros receptores que interfieren en el CBPA pueden eliminarse. HPLC (Cromatografia liquida de alta resolucin)En laHPLC el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de lafase estacionaria(normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas con ciertas caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido (fase mvil) aalta presina travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase mvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denominatiempo de retenciny se considera una propiedad identificativa caracterstica de un compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria. La utilizacin de presin en este tipo de cromatografas incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la columna y reduce as su difusin dentro de la columna mejorando la resolucin de la cromatografa. Los disolventes ms utilizados son elagua, elmetanoly elacetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como elcido trifluoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos.Una mejora introducida a la tcnica de HPLC descrita es la variacin en la composicin de la fase mvil durante el anlisis, conocida comoelucin en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografa de fase reversa puede empezar a un 5% deacetonitriloy progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado vara en funcin de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una funcin de la afinidad del compuesto por la fase mvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos ms hidroflicos eluirn a mayor concentracin de agua, mientras que los compuestos ms hidrofbicos eluirn a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separacin de los compuestos.

Es el mtodo mas til disponible, consta de una fase preliminar en la cual se elimina gran parte de interferencias de otros lpidos. La muestra de alimento se saponificaVENTAJAS Y DEVENTAJAS DE LOS METODOS

El ensayo de unin de protenas competitivo ensayo evala los niveles circulantes de25-hidroxivitamina Dusando una protena de unin a la vitamina D (vitamin Dbinding proteino DBP). Aunque este mtodo es vlido y til para investigacin, es complicado para utilizar como mtodo de deteccin clnica de deficiencia de vitamina D. La muestra debe ser extrada en un solvente orgnico, secada con nitrgeno y purificada mediante cromatografa. Las caractersticas liposolubles de la molcula hacen que su medicin sea an ms complicada mediante ensayos de unin a protenas, adems la hace vulnerable a los efectos de la matriz donde se realiza el ensayo. Los factores de la matriz cambian la habilidad de la protena de unin para unirse a la vitamina D, disminuyendo as la validez del ensayo.

Los mtodos de medicin directa para la deteccin de 25-hidroxivitamina D incluyen los procedimientosHPLC, basados en el uso de cromatografa lquida. HPLC se refiere a un mtodo de separacin mediante cromatografa lquida de alto rendimiento, que separa y cuantifica lasfracciones D2y D3y la posterior deteccin medianteluz U.V. Este mtodo es altamente reproducible y es considerado actualmente como un buen patrn de oro para deteccin de vitamina D. Sin embargo, es dispendioso y requiere muestras muy grandes como estndar internacional.

Los inmunoensayos son ms fcilmente automatizados, con tiempo ms corto para la obtencin de resultados y los equipos estn disponibles a menor costo. En contraste, los mtodos cromatogrficos son ms complejos, arrojan resultados en un mayor tiempo y requieren personal entrenado para su manejo, as como equipos ms costosos. Adicionalmente, los inmunoensayos detectan los niveles totales de 25-hidroxivitamina D y estn sujetos a problemas relacionados con la matriz, mientras que los mtodos cromatogrficos cuantifican por separado las fraccionesD2y D3con alta precisin. Finalmente, los inmunoensayos requieren calibradores, mientras que los mtodos cromatogrficos utilizan estndares primarios.Los inmunoensayos son ms ampliamente usados por laboratorios clnicos por las ventajas mencionadas, mientras que los mtodos cromatogrficos son ms utilizados en grandes laboratorios de referencia.