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XXX Jornadas Uruguayas de Buiatría

ENFERMEDAD CEREBELOSA EN BOVINOS OCASIONADA POR LA INGESTiÓNDE Solanum bonariensis

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Áreas Biofísica('!, Patología(§! y Toxicología('! y Br. Vel.(O!de la Facultad de Veterinaria, UdelaR, Montevideo,

Uruguay. Facultade de Veterinaria de Lugo, USC,España(,.l.Laboratorio Regional Diagnóstico, UFPel,

Pelotas, RS, Brasil(y).

RESUMEN

Se describe un desorden cerebeloso en bovinos,caracterizado por episodios de pérdida de equilibrio,aumento de la base de sustentación, extensión de lacabeza y de los miembros torácicos, opistótonos,nistagmo, caídas laterales y/o hacia atrás, atribuid? a laingestión natural o por suministro a través de fistularuminal de Solanum bonariensis. Las principalescaracterísticas patológicas halladas en los bovinosintoxicados fueron vacuolización y degeneración de lascélulas de Purkinje con presencia de esferoides axonalesen la capa granulosa y en la sustancia blanca delcerebelo. Se comprobó por histología cuantitativa unareducción del número de células de Purkinje en el casode intoxicación natural y una elevada presencia deesferoides en los bovinos intoxicados natural oexperimentalmente. A partir de los resultados ~e

establece una secuencia de lesiones que se iniCiarlacon la aparición de esferoides axonales en la sustanciablanca cerebelosa (síntomas leves), hasta llegar a ladesaparición de la capa de células de Purkinje delcerebelo (síntomas severos). Esta secuencia nos llevaa proponer un origen del daño celular en la alteración dela síntesis de elementos del citoesqueleto o de otrasproteínas específicas asociadas a éste, quedeterminarían la alteración del tráfico de organelosdesencadenando los daños encontrados en las etapasfinales de esta degeneración cerebelosa.

INTRODUCCiÓN

En diferentes regiones del mundo se ha reportado laocurrencia de síndromes cerebelosos asociados a laingestión de solanáceas 1,3.4". En Uruguay ocur:e undesorden cerebeloso similar asociado a la Ingestron deSolanum bonariensis (nombre común: "naranjillo") -Figura1-. No se ha reportado su reproducción experimental'.El presente trabajo describe la epidemiología, los signosclínicos, las principales lesiones microscópicasencontradas y la reproducción experimental de laenfermedad en el ganado bovino.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se observó la enfermedad en su forma natural en 2establecimientos agropecuarios de Soriano, Uruguay(Seccional 4ª, ruta 95, Km 25%). Se sacrificaron 2animales con síntomas nerviosos severos, procediendoa su necropsia. Se tomaron muestras del cerebro ycerebelo, las que fueron fijadas en formol neutro al1 0%,incluidas en parafina, cortadas a 5~m y coloreadas conHematoxilina y Eosina. Se seleccionaron cortes paracolorear con las técnicas de Azul de Toluidina y LuxolFast Blue. Una parte de las muestras fue procesadapara microscopía electrónica, fijada en glutaraldehido al2,5% en cacodilato de sodio, deshidratada en etanol eincluida en Epon. Los cortes semifinos fueron coloreadoscon azul de metileno y los ultrafinos fueron contrastadoscon acetato de uranilo y citrato de plomo y examinadospor microscopia electrónica de transmisión. Para lareproducción experimental se utilizaron 4 ternerosmachos, castrados, raza Holstein de 8 meses de edad.3 terneros fueron dosificados diariamente con 10 gr/KgPV de hojas frescas de la planta a través de una fístularuminal. Un ternero fue mantenido como testigo. Cuandocomenzaron los síntomas leves, se sacrificaron uno delos animales intoxicados y el testigo, procediendo a sunecropsia, extracción y procesamiento de muestras. Serealizó la cuantificación en los cortes histológicos decerebelo de los bovinos afectados (natural oexperimentalmente) y del testigo. Para esto se realizaroncortes seriados, tomándose uno de cada 5 cortes parasu observación, En 10 láminas así obtenidas se contaronlas células de Purkinje; 50 campos por lámina a 400aumentos, La planta utilizada para la reproducciónexperimental fue clasificada por E. Marchesi y J. Ren(Cátedra de Botánica, Facultad de Agronomía, UdelaR)y colectada en el predio de Sayago de la Facultad deAgronomía (UdelaR). Se realizó el estudio estadísticode las cuantificaciones de los cortes utilizando la pruebade igualdad de poblaciones (test de Kruskal-Wallis,programa Intercooled Stata™ v. 7.0 -gentileza de A. Gil­), utilizando como medida de tendencia central el valorde la mediana de las 500 observaciones en cada caso.

RESULTADOS

Epidemiología: En los establecimientos visitados, laintoxicación es endémica desde 1980. La morbilidad variadependiendo del año, de la raza y del tipo de producción.La mortalidad es menor al 1%, estando asociadageneralmente a accidentes o al debilitamiento progresivode los afectados. Los animales consumen la plantadurante todo el año, incluso en épocas de abundanciade pastura de buena calidad. En el año 2000 laenfermedad tuvo una incidencia-densidad de 15-20% enun total de 1912 bovinos entre ambos establecimientos.El ganado lechero y sus cruzas fueron los más sensibles.Los animales con síntomas visibles siempre fueron

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mayores de 8 meses, afectando especialmente a lashembras buenas productoras y a los animales criadosartificialmente (de los animales con sintomatologra severase observaron 7 Holstein de ambos sexos, desdeterneros a vacas en ordeñe y 1 vaca cruza Normandocon ternero al pie).

Signos clínicos: Se caracterizaron por aparición deataques periódicos. Los animales afectados parecíannormales hasta que se excitaban (por ej. marcha forzada,agrupamiento, encierro de los animales y/o prueba deliberación súbita de la cabeza 4 -Head Release Test-).Los ataques típicos se manifestaron con rigidez delcuello y extensión de la cabeza, nistagmo, extensiónde los miembros torácicos, caídas laterales o hacia atráscon opistótonos y temblores musculares. Los animalesmenos afectados no llegaban a caerse, mostrando lacabeza y los miembros torácicos extendidos y balanceode la cabeza. También se observó un aumento de labase de sustentación durante el reposo y una marchaatáxica con movimientos hipermétricos. La duración delos signos fue desde algunos segundos a pocos minutos.Pasados estos episodios, los animales se incorporabanpermaneciendo aparentemente normales, sin quehubiera existido una etapa de pérdida de concienciadurante los ataques. En algunos animales, se observaronsignos clfnicos permanentes tales como marchadismétrica y/o mirada extraviada hacia arriba coninclinación de la cabeza y el cuello (Fig. 2).

Patología: En la necropsia, los animales no presentaronalteraciones macroscópicas evidentes. Las principaleslesiones histológicas se encontraron en el cerebelo,presentando desde alteración de las células de Purkinjehasta la desaparición de esta capa celular (Fig. 3). Lascélulas de Purkinje remanentes se mostrabantumefactas, pálidas, con perdida de la sustancia de Nissly una fina vacuolización de su citoplasma (Fig. 4). Otrascontenían una o más vacuolas grandes. El núcleo sehallaba picnótico o distendido y desplazado hacia laperiferia de la célula (Fig. 5). A continuación de estos

cambios degenerativos las células de Purkinjeaparentemente desaparecían dejando el espacio vacío.También se observaron esferoides axonales en lasustancia blanca y en la capa granulosa de la corteza ymicrocavitaciones en la sustancia blanca del cerebelo(Fig.6).

Intoxicación experimental en bovinos: Los datosresumidos sobre las cantidades de planta consumidasy los pesos de los animales hasta la observación de losprimeros signos clfnicos se muestran en la Tabla 1.

Los primeros signos clrnicos en los animales intoxicadosexperimentalmente fueron evidentes luego de 136 díasde haberles suministrado la planta diariamente,apareciendo síntomas leves en los 3 animales. El cuadrocerebeloso se provocó fácilmente al realizar el test deliberación de la cabeza en los animales, llegando acaerse, o mostrando la cabeza y los miembros torácicosextendidos y balanceo de la cabeza de un lado al otro.Los estudios histológicos mostraron numerosas célulasde Purkinje con cambios degenerativos y una delicadavacuolización citoplásmica similar a la observada en loscasos de intoxicación natural. No se encontrarondiferencias significativas en el número de células dePurkinje de este animal con el animal testigo (Tabla 2),aunque la sustancia blanca y la capa granulosa de lacorteza cerebelosa mostraban gran número d

Histología cuantitativa: El estudio de la cortezacerebelosa y de la sustancia blanca mostró: i. Conrelación a la mediana del número de células por campopara el animal intoxicado naturalmente, este valor fuede 1 célula/campo, mientras que para el testigo fue de 3células/campo. El test de Kruskal-Wallis rechazó laigualdad con una p=O.0001, mostrando una diferenciamuy significativa del número de células/campo en elanimal intoxicado naturalmente (con síntomas severos)con respecto al testigo y al intoxicado experimentalmente(con síntomas leves). El número de células/camposeparado por categorías se muestra en la Tabla 2.

Tabla 1: Intoxicación experimental con So/anum bonariensis en ternerosHolstein.

Día inidal Primeros 9.9nosremero N-o-P esoQ<gP~Peso(Kg PV"")""'=p-'-la-nt'-a-oo-nsu-m-.(K~g'-) -:K'·'g-p"'la-nt7 a""¡K"'g-=P V1 133 240 247.8 1.0322 141 210 217.1 1.0343 11 2 180 180.9 1.005Promedio 1.024 + 0.0163

(Obseryaciones: La cantidad de planta consumida se refiere al peso de la plantarecién cosechada. El animal N° 1 fue sacrificado cuando aparecieron los primerossignos. Los animales N° 2 Y 3 continúan actualmente dentro del diseño experimentalsin ser sacrificados para correlacionar la mayor cantidad de planta suministrada conla evolución del cuadro y el grado de degeneración cerebelosa)

Tabla 2: Histología cuantitativa de la corteza cerebelosa en bovinos intoxicadosnatural (IN) y experimentalmente (lE) comparados con un animal testigo.

NO de célu las de IN lE TestigoPurkinje/campo N°campos (%) N°campos (%) N°eampos (%)Oa2 446 (89.2) 162 (32.4) 160 (32)3a4 49 (9.8) 250 (50) 210 (42)5 a 11 5 (1 ) 88 (17.6) 130 (26)

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DISCUSiÓN

Tabla 3: Histología cuantitativa de la sustancia blancadel cerebelo en bovinos intoxicados natural (IN) yexperimentalmente (lE) comparados con un animaltestigo.

AGRADECIMIENTOS

SUMMARY

esferoides axonales, sin una disminución significativadel número de células de Purkinje y con signos leves deenfermedad cerebelosa, nos indujo a pensar que estaalteración del axón representaría una etapa inicial en laevolución de esta enfermedad; siendo la desapariciónde las células de Purkinje una etapa posterior de lamisma. Esta secuencia de daño celular nos llevó aformular la hipótesis de que el daño primario podríadeberse a la alteración de la síntesis de elementos delcitoesqueleto o de otras proteínas específicas asociadasa éste en la célula de Purkinje, modificando así el tráficode vesículas y mitocondrias. El resultado sería laacumulación de estos organelos en los axones de lascélulas afectadas. Esta hipótesis coincide con loplanteado porotros autores en procesos de degeneraciónascendente de axones sin evidencias claras de lesióndel soma. En el sistema nervioso, en células de axoneslargos -como lo son las células de Purkinje-, algunasinjurias neuronales que afectan principalmente el pericariopueden traer como consecuencia una lesión en laporción distal del axón, que se expande en dirección alcuerpo neuronal. Esto ocurre debido a que estos axonesdependen para su mantenimiento de las proteínassintetizadas en el soma y que son transportadas endirección anterograda hacia la periferia. Estos procesosson frecuentes en intoxicaciones crónicas,principalmente en humanos 6. Otros autores sugierenque podría ser una enfermedad de almacenamientolisosomal, probablemente un tipo de gangliosidosis dadala gran similitud entre las alteraciones patológicashalladas en este tipo de intoxicaciones y el de lasenfermedades de almacenamiento lisosomal descriptasen otras intoxicaciones por plantas. Los mismos autoresplantean la gran especificidad sobre la célula de Purkinjeque presenta la intoxicación ocasionada por estassolanáceas, siendo esta una diferencia importante conlos otros tipos de gangliosidosis ocasionadas por plantas2.5. s. En el futuro, se deberán abordar estudioscomplementarios de inmunohistoquímica,lectinohistoquímica, identificación del/los principio/sactivo/s, estudios "in vivo" e "in vitro" de unión de la/ssustancia/s responsable/s a estructuras específicas dela célula de Purkinje que puedan confirmar o rebatir lashipótesis planteadas.

Este trabajo fue financiado por CIDEC (Fac. Vet.,UdelaR), CSIC (UdelaR). Al Dr. N. Duclós (h), a la Lic.A. Román (Técnica en Microscopia Electrónica, USC) ya la Flia. Morixe (Establecimientos Asencio y San Juande Asencio) por su gentil colaboración con este trabajo

A bovine cerebellar disorder of periodic seizurescharacterized by loss of equilibrium, head and thoraciclimbs extension, opisthotonus, nystagmus and fallingto the side or backward caused by natural ingestion orruminal cannula administration of Solanum bonariensisis described. The main pathological features were

(%)(824)

(17.6)41288

(88.4 )(10.6)

C%)N" EAlcam po

Oa23a7

ii. Con relación a la presencia de esferoides axonalespor campo en la sustancia blanca (EA/campo), seconstató que la mediana en ambos animales intoxicados(IN y lE) fue de 1 EA/campo, mientras que no sedetectaron esferoides en el animal testigo. Lacategorización por n° de EA/campo se muestra en laTabla 3.

Los estudios de ME se centraron en la corteza y lasustancia blanca cerebelosa. La corteza cerebelosa delos animales con síntomas severos presentó pocascélulas de Purkinje reconocibles en los cortes semifinosy sus mitocondrias aparecían tumefactas con cuerposelectrondensos en su interior. Dentro de la sustanciablanca se encontraron axones dilatados con un contenidovesicular (esferoides), algunos de ellos con la pérdidade su envoltura mielínica. En el interior de estosesferoides se encontraron mitocondrias y un gran númerode vesículas electrondensas (Fig. 6).

Los signos clínicos y las lesiones cerebelosas halladasen este síndrome bovino que ocurre en el litoral delUruguay fueron muy similares a las descritas por otrosautores con otras especies de solanáceas 1,3,4.,. Lareproducción experimental de los signos clínicos y loshallazgos patológicos demostraron de maneraconcluyente la etiología de esta enfermedad. Losestudios experimentales confirmaron que los animalesdebieron consumir grandes cantidades de la planta antesde manifestar signos clínicos. De acuerdo con nuestrosdatos de campo y la opinión de los productoresconsultados, el consumo de la planta se mantieneincluso en épocas de abundancia de forraje a diferenciade lo reportado con otras solanáceas 5. El consumo deS. b. no fue ocasionado por sobrepastoreo. Nuestrosresultados en cuanto a un menor número de células dePurkinje en el caso de intoxicación natural (síntomasseveros) frente a lo hallado en el animal intoxicadoexperimentalmente (inicio de síntomas) coinciden conlos reportados por otros autores 5, aunque en ambosanimales (intoxicación natural y experimental) seencontraron gran número de esferoides axonales en lasustancia blanca cerebelosa. El patrón histopatológicodescripto coincidió con el reportado por otros autores 1.

3,4,5, tanto en el daño específico de la célula de Purkinjecomo en la presencia de esferoides axonales en lasustancia blanca. Las lesiones halladas en las célulasde Purkinje, indicaron una lesión irreversible de dichacélula (tumefacción celular, tumefacción mitocondrial concuerpos electrondensos en su interior). En el animalintoxicado experimentalmente, la presencia de

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vacuolalion. degeneration and Ioss 01 Purkinje cells withaxonal spheroids in cerebellar granular layer and whitemaner. Cuantitative histological analysis confirmed adecreasa in the amount of Purkinje cells in naturallypoisoned. and a significant presenceofaxonal spheroklsin both natural and experimental!y intoxicated bovines.Our resulls suggested a lesionar sequence lhat couldstart with axonal spheroids appearance in cerebellarwhi!e maner (mild disease), andoould linish wilh Pul1dnjecells layer disappearance in cerebellar cortel( (severedisease). The pathological evolutiOn proposad suggestsa ffiOdification in Ihe synlhesis 01 cytosquelelal elemenls(ofolhers cytosqueleton associated proteins) thal coulddetermine a milhocondrial and vesicular traflic disruplion.We suggasl Ihal milhocondrial and vesicular trafficalleralion inducad by the intoxicalion may lead lhe bodycel! damage found in severa slages 01 Ihe cerebellardisease.

BIBLlOGRAFlA

l. Bourke CA Ausl. VeL J. (1997) 5:363·365.2. de Barros SS. Riet·Correa F, Andujar MB. Lombardode

Barros CS, Méndez MC. and Sehild AL. PesquisaVeterinaria Brasileira (1987) 7: 1·5.

1 Menzies JS. Bridges CH, and Bailey EM. TIte SouthWeSlem Veterinarian (1979) 32:45-49.

4. Pienaar JG. Kellerman TS. Basson PA. Jenkins WL.Vahrmeijer J. Ondel'$poon J. Ve!. Res. (1976) 43:67·74.

5. Riel-Correa F, Mendcz Me. Schild AL, Summel'$ BA, and01iveira lA. Comell VeL (1983) 73:240·256.

6. Summers BA, Cummings JF. de Lahunla A (I99S) en:Velcrinary Ncuropalhology, Mosby· Ycar Bock, Inc. SI.Louis.527p.

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Figura 1.~ boaariensjs ('naranjilla').Figura 2. Vaca con tipica inclinación de cabeza y aumento de base desustentación.

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Figura 3, Disminución del número de células de Purkinje en la corteza cerebelosa enanimal intoxicado naturalmente (azul de toluidina) X200.Figura 4. Células de Purkinje pálidas con liria vacuolización en su ciloplasma enanimal intoxicado naturalmente (azul de toluidirla) X400.Figura 5. Célula de Purkinje vacuolada con núdeo excéntrico en animal intoxicadonaluralmente (HE) X400.

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Figura 6. A. Esleroides axonales en la sustancia blanca (!lechas negras) ymicrocavitaciones (estrella negra) en animal intoxicado naturalmente (HE) X400. B.Esferoides axonales en la sustancia blanca (flechas negras) en animal intoxicadoexperimentalmente (ME) X2000.